CN103169737B - 樟芝子实体与破壁灵芝孢子粉的组合物及其在免疫调节中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有樟芝子实体与灵芝孢子粉的组合物。该组合物由樟芝子实体粉与破壁灵芝孢子粉的混合物以及药学或食品学上接受的辅料组成。组合物中灵芝孢子粉与樟芝子实体，以质量比计，两者的比例范围为1:1至4:1，质量控制指标为总三萜和总多糖，以质量比例计，其中总三萜和总多糖含量均不低于1.0%，可制备成固体制剂等。本发明的组合物具有确切的体液免疫调节和细胞免疫调节作用，可用于免疫类疾病的防治和保健。

Description

樟芝子实体与破壁灵芝孢子粉的组合物及其在免疫调节中的应用

技术领域

本发明属于食品医药技术领域，具体涉及一种含有樟芝子实体粉与破壁灵芝孢子粉的组合物，以及所述组合物在制备免疫调节用药物或保健食品中的应用。

背景技术

几十年来，我国国民经济以前所未有的速度发展，社会生活已经并继续发生着深刻的变化。在经济高速发展、生活条件显著改善的社会条件下，身体健康逐渐成为全社会关注的焦点。一些与健康相关的影响因素受到广泛关注：例如，随着社会经济的发展，社会生活节奏迅速加快，公民教育水平和知识技能显著提升，社会竞争由此加剧；而由于生活水平的提高、健康意识普及以及医药技术的发展，人口老龄化的趋势也随之出现。与竞争压力相关联的“亚健康”状态及其与人口老龄化趋势相关联的老年健康已经成为健康保健医疗的重要议题。

免疫系统是机体防卫病原体入侵的有效武器，它能发现并清除异物、外来病原微生物等引起内环境波动。免疫系统功能失调会影响人体健康。免疫功能低下的人易受病原体侵害、感染；免疫系统自我稳定能力异常，可引发自身免疫疾病；免疫监视功能降低，则易发某些慢性疾病以及肿瘤。

“亚健康”以及老年性健康问题均与免疫功能降低密切相关。所谓“亚健康”状态是介于健康与疾病之间的机体功能低下的一种健康状态，西方国家称之为第三状态。处于“亚健康”状态的人群多伴有免疫功能降低。亚健康状态具有很高的发生率，社会竞争加剧和生活压力增加是亚健康的重要诱因。除了运动、心理调节外，健康/功能饮食是改善亚健康人群的健康状态、预防疾病发生的重要途径之一。

在现代医学中，随着感染性疾病等急性病症的诊疗措施日渐成熟，慢性疾病成为影响人类身体健康的危险因素，这些疾病重在预防，预防医学由此成为重要的医学分支。中医药传统医学素有预防疾病的传承，所谓“上工不治已病治未病”就是强调高明的医生不在于治疗已发疾病而在于预防疾病发生，其中，食疗保健是预防疾病的重要途径之一，由食疗发展而来的保健功能食品已经成为广为接受的调节身体状态的保健手段。

灵芝（Ganoderma Lucidum）又称“仙草”、“长生草”、“灵草”，在我国是享有盛誉和具有悠久药用历史的补益类药食两用品种。古人认为灵芝是一种神药仙草，《神农本草经》将其列为上品，《本草纲目》记载灵芝“甘温无毒”“益精气，坚筋骨，好颜色，疗虚劳”。现代研究则将灵芝的补益作用主要归结为免疫调节活性。灵芝孢子是灵芝的精华，如子实体一样，其富含大量生物活性物质，其多种功效成分含量高于子实体。资料显示灵芝孢子粉具有广泛的医用功效，例如，心血管保护、肝损伤保护、调节血糖、调节免疫功能等，其中以免疫调节活性的研究资料最为丰富，且与灵芝补益作用的传统认识相一致（张伟,等.中西医结合学报.2004;2(6):463-465；陈亚非,陈金显.中国食品添加剂,2002;(4):36-41；林志彬,王鹏云.北京大学学报(医学版).2006;l38(5):541-547）。

樟芝（Antrodia camphorata）别名牛樟芝、牛樟菇，是台湾地区习用的珍稀药食两用真菌。资料显示，樟芝疗效流传甚久，早期台湾原住民发现生长于牛樟树上的樟芝由解毒护肝和强健体魄的作用。现代研究资料显示，樟芝具有解毒保肝、消除肿瘤、补肾强心、增强免疫等作用，其中仍以免疫调节作用的相关研究较为深入和系统，并且，一般认为其护肝、抗肿瘤等功效作用源于其免疫调节活性或与免疫调节活性密切相关（陈菲,等.中药材.2011;34(11):1804-1807；浦跃武,等.中国医院药学杂志.2004;24(7):430-432；Madamanchi Geethangili and Yew-Min Tzeng.Evidence-Based Complementaryand Alternative Medicine.2011,2011:1-17;Huang CC,et al.Evidence-BasedComplementary and Alternative Medicine.2012;2012:1-9.）。

灵芝和樟芝均为具有补益功效的药食两用真菌，前者是传统中医药学上传承数千年、被称之“神药仙草”、可以“补气安神”、“益精气、坚筋骨”的经典品种，后者则为台湾地区习用、被称之“药中之王”、可以“解毒保肝、补肾强心”的地方品种。现代研究表明，灵芝和樟芝均具有抗氧化、护肝抗毒、调节代谢、抗癌抗炎等功效活性，而其“调节免疫”功效活性则是研究深入、特点明确，能够体现补益功效的典型功效特点。而功效成分研究表明，灵芝和樟芝均含有丰富的功效和营养成分，其中与免疫调节活性相关的功效成分均主要包括多糖类和三萜类（Madamanchi Geethangili and Yew-Min Tzeng.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.2011,2011:1-17;Huang CC,etal.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.2012;2012:1-9）。

鉴于灵芝和樟芝同属具有“补益作用”的“药食两用”真菌，现代研究显示其活性成分类型以及功效活性相近而又存在差异，根据传统中医药组方原则，“相须”、“相使”理论，“性能功效相似的药物配合应用，可增强其原有功效”，所谓“当用相须、相使者良”《神农本草经》，“有相须者，二药相宜，可兼而用之”《本草蒙筌》，“相须者，同类不可离也《本草纲目》”（姚峥燕.实用中医内科杂志.2006;20(1):95;胡小勤.中华中医药杂志.2012;27(7):1896-1898）。本发明以破壁灵芝孢子粉和樟芝子实体组方，其目的在于通过相须用药的“相加”与“互补”性，增强其“补益”功效。

目前，国内已获准上市的以灵芝孢子粉为主要原料并且以免疫调节为功效的保健食品已达几十种，其中不少产品已经产生良好的社会和经济效益。这些产品均以单味灵芝孢子粉或破壁灵芝孢子粉组方。

樟芝类食品和保健食品主要生产和行销于我国港澳台地区，并且拥有广泛和重要的影响力；大陆地区尽管有不少单位开展了樟芝人工培养研究和实践，并且开展了一定的功效学及安全性实验研究。然而，迄今尚无以灵芝和樟芝共同组方的公开研究报告或相关产品上市的报道。

发明内容

针对现有技术中尚无以灵芝和樟芝共同组方的报道，基于灵芝和樟芝具有广泛的影响力和认可度，本发明的目的旨在以破壁灵芝孢子粉与樟芝子实体组方，利用其“相须”和“协同”功效研发保健食品，提供一种含有樟芝子实体粉与破壁灵芝孢子粉的组合物，以及所述组合物在制备免疫调节用药物或保健食品中的应用。本发明组方新颖、特点明确，有利于获得公众认可和接受。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

本发明首先提供一种含有樟芝子实体粉与破壁灵芝孢子粉组合物，所述组合物可含有药学上或食品学上可接受的辅料。

所述组合物中破壁灵芝孢子粉与樟芝子实体粉，以质量比计，两者的比例范围为1:1至4:1。

本发明所述破壁灵芝孢子粉为担子菌纲多孔菌科（Polyporaceae）灵芝属（Ganodelma）真菌赤芝（G.lucidum）和/或紫芝（G．sinense）的孢子经破壁处理获得的破壁孢子粉末。未破壁的灵芝孢子具有坚硬皮壳，直接食用不易消化吸收，与之相比，破壁孢子粉所含营养活性成分则更容易被消化吸收。本发明中，所述破壁灵芝孢子粉是指破壁率不低于90%的灵芝孢子粉（NY/T1677-2008，中华人民共和国农业行业标准，破壁灵芝孢子粉破壁率的测定）。

本发明所述樟芝子实体粉是指野生和/或椴木栽培的樟芝生物子实体经粉碎加工获得的粉末状物质。樟芝又称牛樟芝，为担子菌纲多孔菌科薄孔菌属（Antrodia）的樟芝（Antrodia camphorata）。野生樟芝较稀少。目前，液体发酵以及固体培养基培养获得的樟芝菌丝体的三萜类活性成分含量较低，因此并不适合用于本发明所述组合物的制备。椴木栽培获得的樟芝子实体含有近似于野生樟芝的三萜类和多糖类活性成分，因此可选择用于本发明所述的具有免疫调节活性的组合物。本发明组合物中，采用粉碎粒度细至40目以上的樟芝子实体粉制备所述药用和/或食用组合物。

本发明所述组合物的质量控制指标为总三萜和总多糖，在所述破壁灵芝孢子粉、樟芝子实体粉以及破壁灵芝孢子粉樟芝子实体粉混合物中，以质量计，其中总三萜和总多糖含量均分别不低于1.0%。

本发明所述组合物中，其所述破壁灵芝孢子粉、樟芝子实体粉以及破壁灵芝孢子粉—樟芝子实体粉混合物的性状为粉末状，其粉碎粒度为不低于40目，优选的粉碎粒度是不低于60目。

所述组合物中樟芝子实体来源于樟科树木的椴木栽培。

所述组合物中樟芝子实体来源于牛樟树（Cinnamomum kanehirai）的椴木栽培。栽培方法为业内技术人员所熟知，一般地，经母种菌种培养、接种、培养、采收等工艺过程。

本发明所述组合物具有确切的调节免疫活性，因此具有明确的药用或保健价值。本发明组合物可以选择胃肠给药剂型，优选为固体口服剂型，例如片剂、胶囊剂、锭剂、冲剂、袋泡剂等，其制剂制备可以按照本领域内熟知的技术方法进行。

因此，本发明提供一种保健食品用或药用组合物，所述组合物包括本发明所述组合物以及医药或食品行业可接受的辅料。本发明所述组合物具有强效的免疫调节活性，因此可以用于不同程度的免疫性疾病的保健和预防。因此，本发明可提供所述组合物在治疗和预防免疫性疾病的药物或保健食品制备中的应用。

现代药理学中，对于物质基础不同的功效物质，药理学效应相近、药理学机制有所差异是产生“协同作用”功效的基本条件，灵芝和樟芝的功效成分（主要包括结构近似而又有不同的“多糖类”和“三萜类”）和功效活性（“免疫调节”活性）符合产生协同功效作用的机制特点。

本发明研究发现，含有本发明所述樟芝子实体的组合物给小鼠灌胃30天后，小鼠的半数溶血值HC₅₀呈现不同程度的升高，与同期正常对照组相比，具有显著性差异（p<0.001）；并且药效呈剂量性增加；提示它们具有确切的补体免疫调节作用。

本发明还发现，含有本发明所述樟芝子实体的组合物能够显著地促进刀豆球蛋白（ConA）诱导的小鼠脾脏内的T淋巴细胞增殖与转化，提示它们具有较好的细胞免疫调节作用。

同时，本发明惊奇的发现，以樟芝子实体和破壁灵芝孢子粉两者组合配方，由于同时具有补体免疫调节和细胞免疫调节作用，可以协同实现“调节免疫功能”的医用或保健功效。适当比例的破壁灵芝孢子粉和樟芝子实体粉配伍可产生显著的协同调节免疫作用：与单用等剂量的破壁灵芝孢子粉或樟芝子实体粉相比，适当比例使用的破壁灵芝孢子粉或樟芝子实体粉不仅可以显示增强的免疫调节活性，而且显示出更全面的调节体液免疫和细胞免疫的活性。

具体实施方式

以下实施例用于详细说明本发明内容，而对本发明范围不构成任何限制。

【实施例1】

樟芝子实体粉的制备：

选取Ф20～40cm牛樟木材，将其裁截成长度约20～30cm的椴木。将椴木装袋后，在灭菌柜中120～122℃温度下灭菌14h。

在培养室中，将樟芝（Antrodia camphorata）母种无菌接种于原种培养瓶，培养基为洋菜培养基，在温度为25～29℃、湿度为75%～85%下培养7～10天。然后，将原种无菌接种于栽培种培养瓶，培养基为洋菜培养基，在温度为25～29℃、湿度为75%～85%下培养7～10天，获得栽培种；将栽培种无菌接种于牛樟椴木。接种部位为椴木表面。接种量按3-5mm的菌球200-300粒植在椴木上。

已接种樟芝菌种的椴木转移至已灭菌处理的樟芝培养室内，以空间间距50～70cm排列于多层培养架。樟芝培养条件：温度25～29℃；湿度75%～85%；光照强度与周期：暗培养；培养周期：半年以上。环境控制与养殖管理：定期给培养室消毒，发现有感染杂菌的椴木及时清理出培养室，观察培养室的温度、湿度有无异常，是否需要调节。

樟芝子实体采收时机：半年以上，子实体有一定的厚度。采收方法：用采收工具将牛樟芝从椴木上刮取下来。

采收的樟芝子实体经干燥（电热恒温干燥箱40～50℃烘干）、振动式粉碎（SQW—6A型三清微粉机），过60目筛，即得到樟芝子实体粉。

【实施例2】

樟芝子实体与破壁灵芝孢子粉组合物的制备：

2.1材料

按照实施例1提供的方法制备得到的樟芝子实体粉；破壁灵芝孢子粉为市售破壁孢子粉。

2.2方法

2.2.1组合物的制备

精密称取破壁灵芝孢子粉三份，其质量分别为1.00g、2.00g和4.00g；另精密称取樟芝子实体粉三份，其质量均为1.00g。将破壁灵芝孢子粉三份分别于另三份樟芝子实体粉混合均匀，得到三个组方的破壁灵芝孢子粉与樟芝子实体组合物。以质量比计，破壁灵芝孢子粉与樟芝子实体粉的比例分别为：1:1、2:1、4:1，记为LZ-1，LZ-2，LZ-4。并按照以下方法测这三个组合中的总多糖和总三萜含量。

2.2.2组合物中总多糖含量检测

方法选择：本发明所述组合物中的总多糖含量检测方法参考《中国药典》2010版一部，通过实验研究确认采用硫酸蒽酮法检测。

检测步骤：本发明所述组合物中的总多糖含量检测步骤包括：

样品处理：精密称取所述组合物2.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水90ml，至水浴中加热回流提取4小时，过滤，滤液转移至100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取10ml，加入乙醇150ml，摇匀，4℃放置12小时，取出，离心，弃去上清液，沉淀加水溶解，转移至50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

标准曲线绘制：精密称取葡萄糖对照品约10mg,置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4ml，置15ml试管中，准确补充水至2.0ml，分别精密加入硫酸蒽酮溶液6ml，在旋转混匀器上混匀，置沸水浴中加热15分钟，取出，放入冰浴中冷却15分钟，取出，放置室温。照紫外—可见分光光度法（中国药典2010年版一部附录ⅤA）在625nm波长处以0号管溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2.3组合物中总三萜含量检测

方法选择：本发明所述组合物中的总三萜含量检测方法参考《保健食品检验与技术规范》中保健食品中总皂甙的测定和DB44/T496-2008灵芝中三萜类物质的测定方法并通过实验研究确认采用香草醛—冰醋酸法检测。

检测步骤：本发明所述组合物中的总三萜含量检测步骤包括:

样品处理：精密称取所述组合物0.2g，置圆底烧瓶中，加30ml三氯甲烷，置60℃水浴回流提取2小时，常压过滤，滤渣加30ml三氯甲烷再提取1小时，常压过滤，合并滤液，常压水浴蒸干。加入无水乙醇40ml，70℃水浴加热，并摇动至其完全溶解。冷却至室温后用无水乙醇定容至50ml，作为皂苷测定溶液。

标准曲线绘制：精密称取齐墩果酸对照品约10mg,置50ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4ml，置15ml试管中，水浴蒸干，分别加入0.2ml5%香草醛-冰醋酸溶液，溶解后，再加入0.8ml高氯酸溶液，混匀，至60℃水浴保持15分钟，取出，冰浴放置5分钟，自来水至室温，分别加入5.0ml冰醋酸，在旋转混匀器上混匀，照紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版一部附录ⅤA），在545nm波长处以0号管溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以齐墩果酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.3结果

按照上述方法中绘制的标准曲线计算所述三种组合物中的总多糖和总三萜含量见表1。结果显示，所述组合物中总多糖和总三萜含量的均不低于1.0%。

表1  三种组合物中的总多糖和总三萜含量

组合物	LZ-1	LZ-2	LZ-4
				总多糖	1.72	1.41	1.17
总三萜	2.05	2.46	2.80

【实施例3】

免疫调节活性实验及结果：

3.1材料

3.1.1试验药物：

破壁灵芝孢子粉单一配方（以下简称“灵芝”），棕色粉末，室温保存；樟芝子实体粉单一配方（以下简称“樟芝”），土黄色粉末，室温保存；破壁灵芝孢子粉/樟芝子实体粉1:1配方（以下简称“灵樟1:1”），棕色粉末，室温保存；破壁灵芝孢子粉/樟芝子实体粉2:1配方（以下简称“灵樟2:1”），棕色粉末，室温保存；破壁灵芝孢子粉/樟芝子实体粉4:1配方（以下简称“灵樟4:1”），棕黄色粉末，室温保存；阳性对照药：某公司产破壁灵芝孢子粉保健食品，棕黑色粉末，室温保存，批号：120901-2。

3.1.2试剂及药品：

绵羊红细胞（批号121218），购于广州蕊特生物科技有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT，sigma公司）（批号20121128），购于广州艾斯金生物科技有限公司，Amresco进口分装；台盼蓝，Sigma T6146，广州市博理生物科技有限公司进口分装；胰蛋白酶（批号0747B514），广州市威佳科技有限公司；RPMI1640培养基（批号785914），Invitrogen Co.提供；青霉素（批号01108118）和硫酸链霉素（批号1108105），华北制药股份有限公司生产；胎牛血清（批号121112），杭州四季青生物工程材料有限公司生产；刀豆蛋白ConA（Sigma）（批号20101018），广州市博理生物科技有限公司经销；氯化钠、氰化钾、铁氰化钾、二甲基亚砜（DMSO）、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等化学试剂为市售分析纯。

3.1.3实验装置：

BS110S电子天平，北京塞多利斯天平有限公司生产；ACS-1A1电子计量秤，深圳爱华衡器有限公司生产；UV2102-PC可扫描紫外可见光分光光度计，龙尼柯（上海）仪器有限公司生产；TG型高速离心机，上海安亭仪器厂生产；GS-15R型离心机，德国BECNIHAN生产；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司；DK-600型水浴锅，上海精宏实验设备有限公司生产；CO₂培养箱，2123TC，美国SHELDONMANUFACTURING,INC生产；37XB-Z型倒置显微镜，上海光学仪器六厂生产；MK-3型酶标仪，Thermo Labsystems生产。

3.1.4试验动物：

NIH小鼠，SPF级，体重18～22g，购于广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证：SCXK（粤）2008-0002。豚鼠：普通级，体重250～350g，购于广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证：SCXK（粤）2008-0002。

3.2实验方法

3.2.1剂量设置

表2   按体表面积等效系数换算给药剂量

组别	成人剂量	相当于成人	小鼠剂量
				灵芝组	1.8	10	300
樟芝组	1.8	10	300

灵樟1:1组	1.8	10	300
				灵樟2:1低剂量组	1.8	6.7	200
灵樟2∶1中剂量组	1.8	10	300
				灵樟2:1高剂量组	1.8	15	450
灵樟4:1组	1.8	10	300
				市售灵芝保健食品	1.4	10	233

按照表2给出的剂量进行体内动物实验。

3.2.2对正常小鼠血清溶血素的影响

选择健康NIH小鼠，体重18～22g，全为雄性，共90只，随机分成9组，分别为正常对照组、灵芝组、樟芝组、灵樟1:1组、灵樟4:1组、灵樟2:1组低、中、高剂量组和阳性对照市售灵芝保健食品组，每组10只小鼠。实验前各组小鼠先灌胃给药，每天1次，正常对照组小鼠灌胃给予等体积纯净水，受试样品及阳性对照组小鼠给药剂量按表2所示，连续给药30d。

于末次给药30min后，各组小鼠腹腔注射3:5（V/V）SRBC悬液0.2ml进行免疫，5天后小鼠摘眼取血，分离血清，用生理盐水稀释200倍后进行溶血素测定。

取上述稀释的血清1ml，依次加入10%SRBC悬液0.5ml、1ml1:10稀释的豚鼠血清，对照管取1ml生理盐水，加入0.5ml10%SRBC悬液，1ml1:10稀释的豚鼠血清，然后37℃恒温水浴中保温10分钟，孵毕即放入冰水中终止反应，用2000r/min离心10min，取1ml上清液，加入3ml都氏试剂混匀，放置10min后，以对照管作为试剂空白（扣除补体的影响），于540nm波长处比色，测定OD值。另取0.25ml10%SRBC悬液，用都氏试剂稀释至4ml,，摇匀放置10min后，于540nm测定SRBC半数溶血时的OD值。按下式计算样品的半数溶血值（HC₅₀）。

3.2.3对正常小鼠T淋巴细胞增殖和转化实验的影响

选择健康NIH小鼠，体重18～22g，全为雄性，共90只，随机分成9组，分别为正常对照组、灵芝组、樟芝组、灵樟1:1组、灵樟4:1组、灵樟2:1组低、中、高剂量组和阳性对照市售灵芝保健食品组，每组10只小鼠。实验前各组小鼠先灌胃给药，每天1次，正常对照组小鼠灌胃给予等体积纯净水，受试样品及阳性对照组组小鼠给药剂量按表2所示，连续给药30d。

分三批进行下述实验：于末次给药30min后，将小鼠脱颈椎处死，无菌取每只小鼠脾的同一部位，置于灭菌的1.5mlEP管内，加入1mlPBS液，用眼科剪先轻轻剪碎组织，再用吸管吹打，制备单细胞悬液。经200目筛网过滤2次，PBS洗涤2次，每次1000rpm离心5min，弃上清，悬浮于2mlRPMI1640培养液中，用台盼兰染色计数活细胞数（存活率应在95%以上），调整细胞浓度为1×10⁷个/ml后，将细胞悬液分成2孔转移至24孔培养板中，每孔1ml，一孔立即加入75μlConA液(相当于7.5μg/ml)，另一孔作为对照，置于5%CO₂培养箱内，37℃培养72h。培养结束前4小时，将24孔板的悬浮液转移至96孔板内，作3个孔的平行样，每孔100μl，加入50μlRPMI1640培养液，再加入MTT液（5mg/ml）50μl/孔，继续培养4h。培养结束后，板式离心机1000rpm离心10min，小心吸去上清，每孔加入100μlDMSO溶液，轻轻振荡使结晶溶解并混合均匀，酶标仪450nm测定OD值，进行统计学处理并比较组间差异。

3.2.4实验数据处理软件

实验数据均采用Microsoft Excel2010进行统计学处理，结果以表示，并进行TTEST分析，t值法比较组间差异的显著性。

3.3实验结果

3.3.1对正常小鼠血清溶血素实验结果

灵芝、樟芝及各配比样品对小鼠血清溶血素实验结果见表3所示。

表3数据显示，给药30d后，测定各组小鼠的HC₅₀呈现不同程度的升高，其中樟芝组、灵樟1:1组、灵樟2:1低中高剂量组的HC₅₀值与同期正常对照组相比，具有显著性差异（p<0.05、p<0.01、p<0.001）；樟芝组、灵樟1:1组的HC₅₀值提高率分别为40.8%、24.9%；灵樟2:1低中高剂量组的HC₅₀值提高率分别为47.7%、58.6%和73.3%；阳性市售灵芝保健食品对照组的HC₅₀值明显升高，与同期正常对照组相比，具有显著性差异（p<0.01）；与其临床应用效果相符合。

表3  受试样品对正常小鼠血清溶血素结果(n=10)

注：与同期正常对照组比较^*p<0.05、^**p<0.01、^***p<0.001。

3.3.2对正常小鼠T淋巴细胞增殖和转化实验结果：

灵芝、樟芝及各配比样品对小鼠T淋巴细胞增殖和转化实验结果见表4。

T淋巴细胞与刀豆球蛋白（ConA）等有丝分裂原或特异性抗原一起体外培养时，可转化成淋巴母细胞，并出现旺盛的分裂现象，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将MTT分解为紫红色结晶而显色，其光密度值能反映细胞的增殖情况。

表4  受试样品对正常小鼠T淋巴细胞增殖和转化实验结果(n＝10)

组别	给药剂量(mg/kg)	OD差值	提高率(％)
				正常对照组	等体积	0.190±0.113	-
灵芝组	300	0.377±0.172**	98.4
				樟芝组	300	0.253±0.169	33.2
灵樟1:1组	300	0.239±0.076	25.8
				灵樟2∶1低剂量组	200	0。247±0.111	30.0
灵樟2:1中剂量组	300	0.331±0.119*	74.2
				灵樟2∶1高剂量组	450	0.379±0.149**	99.5
灵樟4:1组	300	0.408±0.195**	114.7
				市售灵芝保健食品对照组	233	0.292±0.153	53.7

注：与同期正常对照组比较^*p<0.05、^**p<0.01、^***p<0.001。

由表4实验结果可知，正常对照组小鼠光密度差值最小，灵芝、樟芝及各配比样品和市售灵芝保健食品对照组的光密度差值均不同程度地提高，其中灵芝组、灵樟2:1中、高剂量组、灵樟4:1组的OD差值与同期正常对照组相比，具有显著性差异（p<0.05、p<0.01）；灵芝组、灵樟4:1的提高率分别为98.4%、114.7%；灵樟2:1中、高剂量组的提高率分别为74.2%、99.5%；市售灵芝保健食品对照组的OD差值与同期正常对照组相比，无显著性差异（p>0.05）；其提高率为53.7%；由此提示：灵芝、灵樟2:1中高剂量和灵樟4:1配方能够显著地促进ConA诱导的小鼠脾脏内的T淋巴细胞增殖与转化，提示它们具有较好的细胞免疫调节作用。

3.4结论

综合上述，破壁灵芝孢子粉、樟芝子实体粉及其不同比例配方能够提高正常小鼠的免疫力，免疫实验结果汇总见表5所示。显然，通过实验结果可见，适当比例配伍的破壁灵芝孢子粉、樟芝子实体粉可以产生协同免疫调节作用（配伍功效大于单用功效的简单加和），此外可以产生更为全面的免疫调节活性（调节体液免疫和细胞免疫活性）。

表5  受试样品的药效学实验效果汇总表

注：-表示阴性结果；+表示阳性结果。

【实施例4】

胶囊制剂：

4.1  材料

卵磷脂、聚维酮K30和硬脂酸镁等辅料均为市售，质量符合国家标准要求。破壁破壁灵芝孢子粉为市售，樟芝子实体粉为本发明实施例1制备得到。破壁破壁灵芝孢子粉和樟芝子实体粉（2:1）组合物按照实施例2制备得到。

4.2  处方：

4.3  制备工艺

按处方量称取破壁破壁灵芝孢子粉、樟芝子实体粉，过80目和65目筛备用。称取配方量的大豆卵磷脂，将处方量的破壁破壁灵芝孢子粉置于混合机中，加入处方量大豆卵磷脂，继续混合10min；加入处方量的樟芝子实体粉，继续混合20min；配制50%的食用酒精，将聚维酮K30溶于50%食用酒精制成3%浓度做为粘合剂，将混合粉末制成软材；制剂软材用30目筛网的摇摆式颗粒机制粒，采用热风循环干燥箱在50℃～60℃温度下烘干至水分≤3.5％，过30目筛网的颗粒机整粒（使颗粒更均匀，降低颗粒的休止角，提高颗粒的流动性，减少胶囊填充过程中的装量差异），加入配方量的硬脂酸镁于混合机上混合均匀，混合时间10min；混合均匀的颗粒置于全自动胶囊填充机中灌装胶囊，每粒胶囊的装量为0.31g。

【实施例5】

片剂：

5.1  材料

聚乙烯吡咯烷酮、干淀粉、硬脂酸镁等辅料均为市售，质量符合国家标准要求。破壁灵芝孢子粉为市售，樟芝子实体粉为本发明实施例1制备得到。破壁灵芝孢子粉和樟芝子实体粉（1:1）组合物按照实施例2制备得到。

5.2  处方

5.3制备工艺

将破壁灵芝孢子粉、樟芝子实体粉和过80目筛，与淀粉混匀，加3%聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液制成软材，用14目筛质粒后，置40～50℃干燥后用12目筛整粒，加入干淀粉及硬脂酸镁混匀后压片，即得。

Claims (9)

1.一种食用或药用组合物，由樟芝子实体粉与破壁灵芝孢子粉的混合物以及药学或食品学上接受的辅料组成，所述樟芝子实体粉与破壁灵芝孢子粉的混合物中，破壁灵芝孢子粉与樟芝子实体粉以质量比例计为1:1至4:1。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述樟芝子实体粉与破壁灵芝孢子粉的混合物中，其总三萜含量不低于1.0％，总多糖含量不低于1.0％。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述樟芝子实体粉与破壁灵芝孢子粉的混合物中樟芝子实体粉和破壁灵芝孢子粉的粒度均不低于40目。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中樟芝子实体为野生牛樟芝子实体或者是采用樟科椴木栽培获得的牛樟芝子实体。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中樟芝子实体粉是牛樟树椴木栽培获得的牛樟芝子实体经粉碎加工制得的粉末状物质。

6.如权利要求1所述的组合物，其含有有效免疫调节剂量的樟芝子实体粉与破壁灵芝孢子粉，以及医药用或保健食品用赋形剂。

7.如权利要求1或6所述的组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为固体制剂。

8.权利要求1-7任一项所述的组合物在制备调节免疫的保健食品或药物中的应用。

9.以权利要求1所述的组合物为有效成分的免疫调节剂。