CN103239467B - 姬松茸多糖及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种姬松茸多糖及其制备方法，包括总多糖的提取、纯化、均一分子量姬松茸多糖的制备及结构确认、质量控制方法。本发明还公开了该药物组合物药剂的制备方法。

Description

姬松茸多糖及其制备方法

技术领域：

本发明涉及一种姬松茸多糖的提取纯化方法及其质量控制方法，本发明还涉及该多糖药物的制备方法。 

背景技术：

姬松茸(又名巴西蘑菇)，学名为Agaricus blazei murrill，原产巴西、秘鲁，有些直销业者称之为巴西蘑菇，姬松茸是一种来源于自然生长在巴西圣保罗郊外山间的菌类，属名贵食用菌，具药用价值。巴西蘑菇的神奇早在一九六○年就被巴西日裔移民古本隆寿发现，由于当地的居民疾病罹患率极低，古本隆寿推测是长期食用巴西蘑菇的结果，因此将这种菇菌引进日本，送到日本三重试岩出菌学研究所，请所长岩亥之助研究，后来经由多项实验证实确有抗癌、提升免疫力的效果，因而声名大燥。姬松茸新鲜子实体含水分85％-87％，可食部分每100克干品中含粗蛋白40-45克、可溶性糖类38-45克、粗纤维6-8克、脂肪3-4克、灰分5-7克；蛋白质组成中包括18种氨基酸，人体的8种必需氨基酸齐全，还含有多种维生素和麦角甾醇。其所含甘露聚糖对抑制肿瘤(尤其是腹水癌)、医疗痔瘘、增强精力、防治心血管病等都有疗效。其所含甘露聚糖对抑制肿瘤(尤其是腹水癌)、医疗痔瘘、增强精力、防治心血管病等都有疗效。 

姬松茸具有多种生物功能，增强免疫系统功能，降血糖、降血脂、调节血压、改善肝功能、抗过敏反应等。抗肿瘤及增强免疫功能主要来自多糖体，姬松茸含有活性多糖体，具有扶正固体、增强人体免疫力等功效。姬松茸的多糖体含量高达6.55g/100g，是灵芝的5倍。独特的β-(1-6)-D-葡萄糖结构直接作用于免疫力，可快速提升自然免疫细胞的生长活性，辅助提高治疗效果。姬松茸的保健作用是日本多家医疗单位的试验结果所证明的。姬松茸的多糖体能与许多氨基酸结合，容易被人体的消化器官所吸收。 

姬松茸含有多种活性多糖，其组份比灵芝高出5倍。目前已知在姬松茸的菌丝体中发现约10多种多糖。用动物实验比较各种多糖的作用，表明其中不少多糖均有抗瘤作用，以B-D-葡聚糖和蛋白结合的复合体作用最强，对S180抑制率达99％，而a-葡聚糖及β半乳糖葡聚糖也达90％以上。如与丝裂霉素C合并应用，可达100％。此外，除多糖外，姬松茸的脂肪酸，类固醇亦有提高免疫力作用。动物实验表明，在10多种菌类(包括灵芝，猪苓等)中，姬松茸的作用最为显著。 

姬松茸所含β-(1-6)-D-葡聚糖蛋白复合体是其它菌类所没有的，它对癌症抑制率是99.4％，痊愈率达90％，高于灵芝的功效4.5倍。姬松茸对多种肿瘤细胞有明显的抑制作用，如白血病、胃癌、肝癌、食道癌、结肠癌、肺癌、骨癌、乳腺癌、子宫癌、前列腺癌、膀胱癌、脑癌等。它还被作为保健品被人们服用。在日本、美国、巴西等国有大量的与姬松茸有关的保健食品，如从姬松茸子实体中提取的多糖制成的胶囊和将子实体进行粉碎后制成的代茶冲泡饮料等，在国际市场销路都很好。我国对姬松茸的研究起步很晚，近年来，我国一些学者也开始对姬松茸多糖的提取方法、液体发酵和生物活性进行初步研究，并开发出口服液、 颗粒剂等产品，但种类较少。 

为了更好的开发利用姬松茸的药用价值，本发明对其活性多糖体的提取和分离纯化进行了深入研究，提供了一种均一分子量姬松茸多糖及其制备方法、质量控制方法。能够更有效的保障姬松茸多糖产品的质量稳定和开发利用。 

查阅专利数据库，未见有与本发明相类似的姬松茸均一分子量多糖的制备方法和质量控制方法。 

发明内容：

本发明的目的之一是提供一种姬松茸多糖药物组合物。 

本发明的另外一种目的是提供该药物组合物的制备方法。 

本发明的目的还在于提供该药物组合物的一种质量控制方法。 

本发明所述的药物组合物是由药效成分或药效成分和药学上可接受的载体组成，其中制备所述药效成分的原料为： 

姬松茸总多糖： 

制备过程为：姬松茸子实体除杂，称量，粉碎，预处理，回流提取，滤过，滤渣复提，浓缩，醇沉，滤过离心，醇沉物加水复溶，即得姬松茸总多糖。具体操作为姬松茸粉碎过筛(10-20目)加入8倍量水，沸石10粒，物料提取前用微波预处理8-12分钟提高得率，煮沸回流，1小时，过滤，提取2次，提取液合并，加入提取液体积2/3的95％乙醇，真空浓缩，过滤并进行高效离心，沉淀物在50℃干燥，干燥物在280nm，260nm测定吸收度，发现有紫外吸收，说明有蛋白存在。多糖用Sevage法除蛋白，条件为：振荡时间为30min，氯仿∶正丁醇＝3∶1，样品∶氯仿∶正丁醇＝3∶[V(氯仿)∶V(正丁醇)]＝4∶1，离心，水溶液用紫外光谱检测，不含蛋白质，然后，30％H₂O₂脱色，得到姬松茸总多糖。 

优选： 

均一分子量的姬松茸多糖，制备过程为：取上述姬松茸总多糖，稀释，膜超滤纯化，阴阳离子交换树脂法脱蛋白，分级醇沉和凝胶过滤层析，冷冻干燥，即得均一分子量的姬松茸多糖。具体为取姬松茸总多糖稀释15倍，5×10⁴相对分子质量膜超滤，压力为0.4M Pa，取相对分子质量小于5×10⁴部分，依次上DEA E Sepharose柱和Sephadex G25柱，不同浓度的NaCL水洗脱，苯酚-硫酸法检测，合并峰位，收集流出物为单一色谱峰的物质，冷冻干燥，即得均一分子量的姬松茸多糖。 

所述药效成分可以与药学上可接受的载体或赋形剂制成各种药学剂型，如丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、胶囊、软胶囊、注射液、粉针剂等，片剂包括普通片剂、塑制片、分散片等。其中所述的药学上可接受的载体或赋形剂根据不同的剂型而选择。 

姬松茸多糖的结构鉴定 

采用旋光度法和凝胶过滤法来检测多糖组分的纯度，HPLC法测定组分的分子量，用柱后荧光衍生化方法、酸水解法、红外光谱和核磁共振等方法来测定多糖组分的结构。见附图1 

1.1姬松茸多糖组分的纯度检测方法： 

将多糖样品溶于适量的水，置于电磁搅拌器上，在搅拌下滴加乙醇，使溶液中的乙醇浓度为20％，再搅拌片刻，使沉淀完全，离心得到沉淀。上清液中继续滴加乙醇，使溶液中乙醇浓度达到40％，离心得到沉淀。前后两次沉淀分别经干燥后在相同条件下测定其水溶液的旋光度。 

将多糖组分配制成一定浓度的溶液，用示旋光仪测定溶液的旋光度。按下式计算比旋度：[a]Dt＝100a/Lc式中，[a]为比旋度；D为钠光谱的D线，589.44nm；t为测定时温度；c为每100ml溶液中含有多糖组分的质量(g，按干品或无水物计算)；L为测定管长度(cm)。 

1.2姬松茸多糖分子量鉴定方法： 

用高效液相色谱法测定，色谱条件：色谱柱为C18；流动相为水；流速为1mL/min；检测器为示差检测器。 

取不同分子量的多糖标准品测定，用保留时间和已知分子量作标准曲线。得线性方程为：W＝98.3t+1980(r＝0.9993)，确定姬松茸多糖的分子量为5×10⁴。 

1.3姬松茸多糖单糖成分鉴定 

1.3.1柱后荧光衍生化方法、酸水解法 

1.3.1.1测定方法 

用柱后荧光衍生化方法测定。色谱柱：Lichrosorb NH₂柱串联Hypersil APS柱；流动相：85％乙腈水溶液；体积流量：016mL/min；衍生化试剂：50mmol/L盐酸胍的0.2mol/L NaOH溶液，流速：0.3mL/min；柱温：室温；反应温度：80℃。 

1.3.1.2样品处理方法 

姬松茸多糖经0.05mol/L三氟乙酸(TFA)110℃封管水解2、3、4、5或6h，或2mol/LTFA 110℃封管水解2h，水解液减压浓缩至干，再加甲醇3mL，蒸干，重复3次，以除尽TFA。加少量水溶解水解产物，过0.45μm微孔滤膜，取滤液20μL用于液相分析，与果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖对照品的色谱图比较确定单糖的种类。 

当水解条件为0.05mol/L TFA 110℃封管水解5h时，Shodex Sugar KS-802凝胶柱分析表明姬松茸多糖已完全水解，所得水解产物仅略显淡黄色，此时的色谱峰高比可近似地代表果糖和葡萄糖在姬松茸多糖的中所占的比例，经计算得姬松茸多糖中果糖与葡萄糖的摩尔比为 6∶1，可见该姬松茸多糖为均一分子量多糖。 

1.3.2红外光谱 

溴化钾压片，傅里叶红外检测。通过红外光谱图和甲基化分析可知，具有多糖特征：在3500～3200cm^-1出现的峰是O-H键的伸缩振动，2900cm^-1出现的峰为C-H键的伸缩振动，2100cm^-1出现的峰为C三C键的伸缩振动，1850cm^-1出现的峰为C＝C键的伸缩振动峰，1650cm^-1出现的峰为C＝O键的伸缩振动峰，1400cm^-1出现的峰为C-H的变角振动，它和C-H键的伸缩振动构成了糖类的特征吸收峰，1200～1000cm^-1之间的吸收峰是由两种伸缩振动形成的，一种是C-O-H，另一种是C-O-C，890cm^-1处的吸收峰是β-吡喃糖苷键的特征吸收峰，840cm^-1处有吸收峰表明该多糖具有β型糖苷键，800cm^-1处无吸收峰表明该多糖不含甘露糖。特征波长集中在832～833cm^-1，878～900cm^-1，1200～1000cm^-1，1634～1639cm^-1，1848～1852cm^-1和2184～2190cm^-1这些波段，可以基本确定含有果糖和葡萄糖，后经水解验证为果糖与葡萄糖摩尔比为6∶1为主组成的均一多糖。 

1.3.3核磁共振 

姬松茸多糖溶解于含有少量的DMSO的水溶液中，¹H NMR谱中在异头氢区无强信号，这再次说明该多糖为果聚糖，因为果糖是酮糖，其2位异头碳上没有质子。氢谱中有一个较弱的异头信号，来源于姬松茸多糖中的微量葡萄糖基。 

姬松茸子实体多糖均一组分的¹HNMR谱异头氢区域δ4.5-5.4只含有一个质子信号，位于δ4.69；¹³CNMR谱的异头碳区域在δ103.30有一强的碳信号。由于在碳谱中δ179.8、182.3出现可能是羰基的共振吸收峰，δ39.1、39.5处出现多键的信号峰。所以判定其由葡萄糖和果糖残基构成。 

姬松茸多糖的药剂学实验 

根据姬松茸多糖的理化性质，进行了片剂和胶囊剂的研究。首先对填充剂、崩解剂、粘合剂及润滑剂进行筛选，通过崩解时限、溶出度确定处方，以片剂为例如下： 

2.1处方如下： 

2.2制备工艺及工艺流程图 

(1)工艺 

原辅料准备：姬松茸多糖、羟丙甲基纤维素、微晶纤维素和乳糖分别过100目筛，硬脂酸锌过80目筛，备用； 

混料：称取处方量的姬松茸多糖、乳糖、羟丙甲基纤维素、微晶纤维素按等量递增法混匀，然后再与硬脂酸锌混匀，备用； 

制粒：将混料用干法制粒机压大片，再用18目筛制粒，备用； 

压片：测定中间体含量，分别用 浅凹冲压片； 

包装：成品检验合格后，双铝包装。 

(2)工艺流程(见图2) 

2.3质量标准和稳定性研究 

根据《中药质量控制分析方法验证技术指导原则》及《中药质量标准建立的规范化过程技术指导原则》中的基本要求，对姬松茸多糖片的外观、片重差异、溶出度、含量等进行了系统研究试验，并初步确定各相应的质量标准及相应控制指标，为以后有效控制产品质量提供科学依据。 

姬松茸多糖的溶出和含量测定均选用目前比较成熟的蒽酮-硫酸比色法(以葡萄糖为对照品，采用蒽酮-硫酸比色法，在580nm处测定姬松茸多糖的含量)同时进行了必要的方法学验证内容。 

2.3.1方法学验证内容 

(1)对照品溶液储备液的制备 

精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品约25mg，置于25mL容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，制成约1mg/mL的对照品储备液。 

(2)供试品溶液储备液的制备 

精密称取姬松茸多糖片(相当于姬松茸多糖100mg)置100mL圆底烧瓶中，加水50mL，超声溶解，放冷，稀释到刻度，作为储备液。 

(3)检测波长的选择 

精密吸取对照品溶液储备液和供试品溶液储备液各1.0mL分置10mL棕色具塞试管中，分别加入0.2％蒽酮-硫酸溶液4.0mL，混匀，迅速置冰水浴中冷却6min后，置100℃水浴中加热10min，取出置冰水浴5min后室温放置10min，于400～800nm范围内进行光谱扫描，结果表明：对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为580nm。 

(4)标准曲线的绘制 

精密吸取对照品储备液1、2、3、5、10mL分别置于10mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。精密吸取上述各溶液1.0mL置10mL棕色具塞试管中，照检测波长项下操作，580nm处测定吸光度值。以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标绘制标准曲线，求得回归方程为A＝6.2136C+0.0326，r＝0.9998。线性范围0.010～0.100mg/mL。 

(5)精密度试验 

取浓度为0.050mg/mL的标准品溶液，重复测定6次，记录其吸光度值，RSD为0.032％，结果表明仪器的精密度良好。 

(6)稳定性试验 

精密吸取样品储备液溶液1.0mL置10mL棕色具塞试管中，照检测波长选择项下操作，分别于0、2、4、6、8h测定其吸光度值，RSD为0.763％，结果表明：本法所测样品在8h内稳定。 

(7)重复性试验 

分别精密称姬松茸多糖片平行6份，按检测波长选择项下操作，测定吸光度值，计算姬松茸多糖的百分含量，得平均含量为93.2％，RSD为0.97％，结果所测样品的重复性良好。 

(8)精密度试验 

精密称取姬松茸多糖按照处方量100％、80％和120％加入相应的辅料，分别取样3份，按照检测波长选择项下操作，测定9份样品吸光度值并计算回收率，得平均回收率为99.06％，RSD＝1.03％ 

2.3.2样品含量测定 

取姬松茸多糖片按“供试品溶液储备液”项下方法制得供试品溶液。精密吸取上述各供试品溶液1.0mL置10mL棕色具塞试管中，照检测波长选择项下操作，测定吸光度值，按标准曲线法计算姬松茸多糖的标示含量。 

2.3.3姬松茸多糖片的溶出度测定 

姬松茸多糖溶出度方法学验证参照姬松茸多糖含量测定法进行了溶出度方法学验证内容的研究，并确定溶出度方法为：篮法100转/分，在30分钟取样，溶出均大于85％。 

2.3.4姬松茸多糖片稳定性研究 

按照上述处方和工艺，分别制备3批，每批500片的姬松茸多糖片，进行影响因素试验、加速和长期稳定性研究。 

影响因素试验结果表明：该制剂为湿和热比较敏感，高湿(相对湿度92.5％)和高热(60℃)，样品的外观有些变黄，硬度明显增大，溶出相对减慢，但是在相对湿度75％和40℃条件下，经过10天影响因素试验研究样品的质量未发生明显的变化，提示该品种需要低温密封保存。 

目前进行完加速和长期试验3个月，样品的各项检测指标均未发生明显的变化。 

同期我们也进行了姬松茸多糖胶囊的研究和考察。结果显示：姬松茸多糖两种制剂的处方、工艺可行，质量标准可控，可用于工业化大生产。 

附图说明

图1是姬松茸总多糖的HPLC图谱 

图2是姬松茸多糖片的制备工艺流程图。 

Claims (1)

1.一种含均一分子量的姬松茸多糖的药物组合物，所述均一分子量的姬松茸多糖是一种含p-毗喃型葡萄糖的蛋白聚糖，为果糖与葡萄糖的多聚体，其中果糖与葡萄糖的摩尔比为6∶1，相对分子质量为50000，其制备方法如下： 

姬松茸粉碎过10-20目筛，加入8倍量水，沸石10粒，物料提取前用微波预处理8-12分钟提高得率，煮沸回流，1小时，过滤，提取2次，提取液合并，加入提取液体积2/3的95％乙醇，真空浓缩，过滤并进行高效离心，沉淀物在50℃干燥，干燥物在280nm，260nm测定吸收度，发现有紫外吸收，说明有蛋白存在，多糖用Sevage法除蛋白，条件为：振荡时间为30min，试剂氯仿∶正丁醇＝3∶1，样品∶试剂＝4∶1，离心，水溶液用紫外光谱检测，不含蛋白质，然后，30％H₂O₂脱色，得到姬松茸总多糖； 

取姬松茸总多糖稀释15倍，5×10⁴相对分子质量膜超滤，压力为0.4MPa，取相对分子质量为5×10⁴部分，依次上DEAE Sepharose柱和Sephadex G25柱，不同浓度的NaCl水洗脱，苯酚-硫酸法检测，合并峰位，收集流出物为单一色谱峰的物质，冷冻干燥，得均一分子量的姬松茸多糖。