CN113956375A - 一种熟地黄均一多糖及其制备方法和抗抑郁作用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种熟地黄均一多糖及其制备方法和抗抑郁作用，涉及医药技术领域。该熟地黄均一多糖由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖按照摩尔比38.1：56.6：5.3组成，制备方法：采用乙醇回流对熟地黄进行脱脂，通过水煎煮得到熟地黄多糖提取液，经醇沉处理，得到醇沉粗多糖；将醇沉粗多糖利用Sevag法除蛋白，将得到的熟地黄总多糖依次经离子交换柱、凝胶柱层析进行分离纯化，然后浓缩、冷冻干燥，即得熟地黄均一多糖。本发明的熟地黄均一多糖为首次发现的新均一多糖化合物，小鼠抑郁模型证明该均一多糖具有抗抑郁作用，从而为开发用于抑郁症的潜在新药提供了依据；本发明的制备方法适合工业化生产，同时拓宽了熟地黄多糖的应用范围。

Description

一种熟地黄均一多糖及其制备方法和抗抑郁作用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种熟地黄均一多糖及其制备方法和抗抑郁作用。

背景技术

熟地黄是由玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的干燥块根(生地黄)经酒炖法炮制的加工品，是临床常用的大宗药材，河南的道地药材，习称“怀地黄”。始载于《神农本草经》，被列为上品，其味甘，性微温，归肝、肾经，具有补血滋阴、益精填髓功效，用于肝肾阴虚、须发早白等。

抑郁症，是一种以持久的心境低落状态为表现的情感性精神障碍性疾病，主要以心境低落，情绪消沉，悲观，情绪激越等为临床表现，严重者可出现幻觉、妄想等精神病性症状。有研究表明，鲜地黄中的多糖和梓醇具有抗焦虑的作用，但当前尚未有关于熟地黄成分抗焦虑、抑郁的研究报道。因此，若能开发具有抗抑郁活性的熟地黄成分及其制备方法，将会极大的推动熟地黄产业化进程及其应用范围。

发明内容

本发明的目的是提供一种熟地黄均一多糖及其制备方法和抗抑郁作用，以解决上述现有技术存在的问题，从而为开发用于抑郁症的潜在新药提供依据，同时推动熟地黄产业化进程。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种熟地黄均一多糖，所述熟地黄均一多糖由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖按照摩尔比38.1：56.6：5.3组成；所述熟地黄均一多糖的结构如下：

本发明还提供一种上述熟地黄均一多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用乙醇回流对熟地黄进行脱脂，然后通过水煎煮得到熟地黄多糖提取液，将所述熟地黄多糖提取液进行醇沉，得到醇沉粗多糖；

(2)将所述醇沉粗多糖利用Sevag法除蛋白，得到熟地黄总多糖；

(3)将所述熟地黄总多糖依次经离子交换柱、凝胶柱层析进行分离纯化，然后浓缩、冷冻干燥，即得所述熟地黄均一多糖。

所述乙醇回流的温度为100℃，回流时间为4h。

进一步地，所述水煎煮的温度为80～100℃，时间为0.5～2h。

进一步地，醇沉时溶液中醇浓度为80～95％。

进一步地，Sevag法除蛋白时，采用氯仿与正丁醇的混合液进行萃取；所述氯仿与正丁醇的体积比为3:1～5:1。

进一步地，所述离子交换柱填料为DEAE-琼脂糖凝胶FF，所述凝胶柱填料为Superdex-200。

进一步地，所述离子交换柱层析的洗脱梯度为0mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、2.0mol/L NaCl。

进一步地，将离子交换柱洗脱浓度为0～2mol/L NaCl的洗脱液，经Superdex-200凝胶柱纯化，收集155-170min峰对应的溶液。

本发明进一步提供上述熟地黄均一多糖在制备治疗精神类疾病药物中的应用。

进一步地，所述精神类疾病为抑郁症。

宋《证类本草》对熟地黄炮制品的质量提出了“光黑如漆，味甘如饴”的要求，现代研究认为此种变化与美拉德反应有关，地黄含有的大量糖的水解产物如果糖、葡萄糖以及大量游离氨基酸以及炮制过程中环烯醚萜苷类成分的水解均可参与美拉德反应，使熟地黄中多糖类成分含量升高，从而积累了丰富的多糖类成分，含量可达30％。

糖类是熟地黄的重要活性成分，较多研究表明熟地黄后其补血、益精填髓等作用增强与其关系密切。国内外诸多学者对地黄中分离得到的多糖类成分进行药效学研究，发现地黄的多糖类成分具有提高机体免疫力，抗肿瘤，抗疲劳，神经保护等生物活性。

本发明中所述的熟地黄均一多糖具体为SDH-WA。所述熟地黄均一多糖SDH-WA来自于玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的干燥块根(生地黄)经酒炖法炮制的加工品，产地为河南焦作的怀地黄。

本发明中所述的熟地黄均一多糖SDH-WA，为首次发现的新均一多糖化合物，其含量为原药材熟地黄的1.8％～2.0％，HPGPC图显示SDH-WA的呈现对称的洗脱峰，说明为均一多糖；离子色谱图显示，均一多糖SDH-WA是由阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)组成，摩尔比率分别为38.1％、56.6％、5.3％，分子量为9.62KDa。

本发明公开了以下技术效果：

本发明的熟地黄均一多糖为首次发现的新均一多糖化合物，该均一多糖由阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)组成，摩尔比率分别为38.1％、56.6％、5.3％，分子量为9.62KDa；本发明还提供了该熟地黄均一多糖具体的制备方法及参数，该制备方法适合工业化生产，为熟地黄均一多糖的质量控制及规范化生产提供了依据，拓宽了熟地黄多糖的应用范围。

本发明制备得到的均一多糖SDH-WA具有抗抑郁作用，为开发用于抑郁症的潜在新药提供了依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为熟地黄均一多糖SDH-WA的洗脱曲线；

图2为熟地黄均一多糖SDH-WA的凝胶纯化图；

图3为熟地黄均一多糖SDH-WA的HPGPC图；

图4为熟地黄均一多糖SDH-WA的HH-COSY图谱；

图5为熟地黄均一多糖SDH-WA的HSQC图谱；

图6为熟地黄均一多糖SDH-WA的HMBC图谱；

图7为熟地黄均一多糖SDH-WA的红外图谱。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1熟地黄均一多糖SDH-WA的制备方法

(1)熟地黄总多糖提取具体方法如下：将熟地黄5kg切碎，100倍量的80％乙醇浸泡0.5h，浸泡结束后，100℃回流提取4h，取药渣，乙醇挥干，完成脱脂；脱脂后的样品加入100倍量蒸馏水，继续100℃煎煮1h，冷却，过滤，取滤液，得熟地黄多糖提取液，提取液采用旋转薄膜蒸发仪浓缩，得流浸膏，使用蒸馏水1L水分散溶解流浸膏，加入95％工业乙醇至90％醇浓度，静置24h，离心，得沉淀，挥干乙醇，得醇沉粗多糖；

将获得的醇沉粗多糖，加入1倍体积蒸馏水，按Sevag法，加入1/5溶液量的氯仿-正丁醇(体积比4:1)混合液萃取，置摇床震摇20min，转移至分液漏斗中，静置，取上层液体，离心1min除去残余蛋白质沉淀。重复3～5次，得到除蛋白后的熟地黄粗多糖溶液，减压浓缩干燥，得熟地黄总多糖1.2kg。

(2)均一多糖的分离、纯化:采用DEAE-Sepharose FF柱，并与流分收集器和蠕动泵相连。依次用蒸馏水、0.2、0.4和2mol/L NaCl以50mL/h的流速对熟地黄总多糖进行洗脱，10mL试管收集洗脱液标号，用苯酚-硫酸法在490nm处测吸光度值，绘制散点图，收集0-20Tube的洗脱液(0～0.2mol/L NaCl的洗脱液)，浓缩，3500Da透析袋透析，冷冻干燥，得到洗脱部位Fr.A，质量235g；

取Fr.A多糖组分100mg，蒸馏水3mL溶解，离心机离心(12000rpm)10min，上清液通过葡聚糖凝胶Superdex-200柱进一步分离纯化，示差检测器在线检测收集155-170min峰，合并溶液通过旋转蒸发仪进行浓缩，冷冻干燥，得到的组分命名为SDH-WA，质量40mg。

图1为熟地黄均一多糖SDH-WA的洗脱曲线；

图2为熟地黄均一多糖SDH-WA的凝胶纯化图。

实施例2熟地黄均一多糖SDH-WA的结构鉴定

(1)采用HPGPC测定多糖分子量，优化条件为：岛津LC-10A高效液相色谱仪，RI-502示差检测器，串联凝胶色谱柱(8×300mm)；流动相为0.05M NaCl溶液，流速：0.6mL/min，柱温：40℃；进样量：20μL。以不同分子量葡聚糖标准品建立回归曲线，计算分子量。葡聚糖标准品(1152、5000、11600、23800、48600、80900、148000、273000)分别用流动相临用前配制成浓度5mg/mL溶液，以分子量的lg值为横坐标，以保留时间RT为纵坐标作标准曲线，lgMp-RT校正曲线方程为：Y＝-0.1933X+12.336(R²＝0.9968)；lgMw-RT校正曲线方程为：Y＝-0.2064X+13.013，(R²＝0.9971)；lgMn-RT校正曲线方程为：Y＝-0.178X+13.033，(R²＝0.9969)；SDH-WA同法制备，由标准曲线回归方程计算SDH-WA的分子量。SDH-WA重均分子量为9.62KDa。

图3为熟地黄均一多糖SDH-WA的HPGPC图。

(2)用离子色谱法分析SDH-WA单糖组成：

a.以鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、岩藻糖、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸混合单糖标准品作为对照。

b.分别取4mg多糖样品，加入1mL的2M三氟乙酸溶液(TFA)，用氮气密封混合物，120℃水解3h。精密吸取200μL酸水解液于1.5mL EP管中，用氮气吹干。向EP管中加入1mL蒸馏水，并涡旋溶解。上清液以12000rpm离心5min，用离子色谱仪(ICS5000)进行检测分析。色谱条件为：DionexCarbopacTMPA20色谱柱(3×150mm)，柱温30℃，进样量5μL，流速：0.3mL/min，流动相：A:H₂O；B:250mM NaOH；C:50mM NaOH&500mM NaOAC，检测器：电化学检测器。

结果显示：熟地黄均一多糖SDH-WA主要由阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)组成，摩尔比率分别为38.1％、56.6％、5.3％。

(3)通过甲基化和糖醛酸还原分析，以及红外光谱、¹H NMR谱、¹³C NMR谱、DEPT135一维图谱和二维图谱，对多糖的糖苷键信号进行归属；推测存在→6)-α-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1→的糖苷键链接，存在糖苷键→6)-α-D-Galp-(1→5-α-L-Araf-(1→，以及α-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1→的链接方式。综合确定主链连接方式为→→6)-α-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1→5-α-L-Araf-(1→3，5-α-L-Araf-(1→的糖苷键，而端基α-L-Araf-(1→通过→5-α-L-Araf-(1→的O-3键连接在主链上。解析结果如表1-2所示：

表1 SDH-WA的甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析

表2 SDH-WA的氢，碳信号归属

本发明还进行了一系列结构表征，包括：利用红外图谱分析熟地黄均一多糖的糖苷键构型和官能团信息，甲基化试验分析其糖残基，并对其进行核磁图谱解析，确定糖苷键连接方式。

图4为熟地黄均一多糖SDH-WA的HH-COSY图谱；图5为熟地黄均一多糖SDH-WA的HSQC图谱；图6为熟地黄均一多糖SDH-WA的HMBC图谱；图7为熟地黄均一多糖SDH-WA的红外图谱。

制备得到的熟地黄均一多糖SDH-WA的结构为：

熟地黄均一多糖SDH-WA的抗抑郁实验：

仪器与材料：

昆明小鼠，SPF级，雄性(18-22g)，10只/组，自由觅食、饮水，自然光照。

动物给药剂量换算：SDH-WA为从熟地黄中提取分离得到，提取率约为2.0％。熟地黄每天临床用量0.25g/kg，按等效剂量折算小鼠给予SDH-WA用量为0.005g/kg，设置低、中、高剂量组，分别为0.01g/kg、0.1g/kg、0.2g/kg。

溶液配置：使用前生理盐水配置SDH-WA低、中、高浓度药液，分别为1g/L、10g/L、20g/L。

实施例3小鼠悬尾实验

取昆明小鼠(18～22g)60只，随机分为5组：正常组、阳性对照药组(百忧解，给药剂量0.01g/kg)、SDH-WA低、中、高组(0.01g/kg、0.1g/kg、0.2g/kg)。灌胃给予相应药物，正常组同体积生理盐水，给药体积为0.01mL/g，每日1次，连续给药7d。末次给药1h后，参考文献方法，将单个小鼠尾端用医用胶带粘贴，距尾尖部约2cm，倒立悬挂在水平棒上，小鼠头部离台面约5cm，置于不封盖的纸箱中，采用纸板隔开，间隔约30cm，防止彼此看到对方。悬挂2min后，开始计时观察，记录4min内悬尾累计不动时间。期间，小鼠为了克服不正常体位而挣扎活动，但活动一段时间出现间断性不动，显示失望状态，即不动时间，小鼠停止挣扎不动或仅有细小的肢体运动。实验结果如表3所示。

表3 小鼠悬尾4min内不动时间结果(

n＝12)

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

实施例4小鼠强迫游泳实验

取昆明小鼠(18-22g)60只，随机分为5组：正常组、阳性对照药组(百忧解，给药剂量0.01g/kg)、SDH-WA低、中、高组(0.01g/kg、0.1g/kg、0.2g/kg)。灌胃给药，正常组给予等体积的生理盐水(0.01mL/g)，每日1次，连续给药7d。末次给药1h后，参考文献方法，将小鼠放入透明水箱中(56L，长57cm，宽38cm，高30cm)，水深10cm，温度(25±2℃)，一次1只，入水2min后，开始计时观察，记录4min内游泳累计不动时间，即小鼠在水中停止挣扎或动物呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动以保持漂浮装。实验结果如表4所示。

表4 小鼠强迫游泳4min内不动时间结果(

n＝12)

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

实施例5小鼠利血平拮抗实验

取昆明小鼠(18-22g)72只，随机分为6组：正常组、模型组(利血平，2mg/kg)、阳性对照药组(百忧解，给药剂量0.01g/kg)、SDH-WA低、中、高组(0.01g/kg、0.1g/kg、0.2g/kg)。灌胃给药，正常组给予等体积的生理盐水(0.01mL/g)，每日1次，连续给药7d。末次给药1h后，腹腔注射利血平。注射利血平1h后，分别记录在规定的时间内各组小鼠的出圈和闭眼数量。首先，在黑色水平台上铺设直径7.5cm的圆形白纸，将动物放在白纸中央，观察0.5min内各组小鼠未出圈的数量。接着将小鼠放于水平台上，观察2min，记录各组动物中眼睑至少关闭50％的动物数量。实验结果如表5所示。

表5 利血平致抑郁模型小鼠行为学结果

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

熟地黄均一多糖SDH-WA的抗抑郁实验统计分析采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。计量资料通过单因素方差(one-way ANOVA)分析进行组间比较，计数资料采用Ridit检验。所有数据以Mean±SD表示，P<0.05表示与对照组相比有显著性差异，P<0.01表示有极显著性差异。

通过抗抑郁行为学小鼠悬尾和强迫游泳实验结果表明(表3、表4)，与正常小鼠相比，均一多糖SDH-WA中、高剂量可显著克服不正常体位，缩短4min悬尾不动时间(P＜0.05)，显著降低小鼠强迫游泳4min内不动时间(P＜0.05)。表明SDH-WA在中、高剂量下，表现明显的镇静作用，提示具有一定的抗抑郁效果。

利血平可抑制神经末梢内囊泡对递质的再摄取，最终导致5-HT、NE和多巴胺(DA)等的降低，引起行为和生理上的变化，与抑郁症表现的行为异常较为相似。通过利血平拮抗实验，表5，给药SDH-WA后，高剂量组出圈动物数显著增加、闭眼动物数显著降低(P＜0.05)，低、中剂量组的出圈动物数升高，闭眼动物数明显降低。说明SDH-WA在高剂量下，对利血平所致小鼠行为异常有显著的拮抗作用，提示具有抗抑郁效果。综合以上3种抑郁症模型，说明SDH-WA具有潜在的抗抑郁作用。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种熟地黄均一多糖，其特征在于，所述熟地黄均一多糖由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖按照摩尔比38.1：56.6：5.3组成；所述熟地黄均一多糖的结构如下：

2.一种如权利要求1所述熟地黄均一多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用乙醇回流对熟地黄进行脱脂，然后通过水煎煮得到熟地黄多糖提取液，将所述熟地黄多糖提取液进行醇沉，得到醇沉粗多糖；

(2)将所述醇沉粗多糖利用Sevag法除蛋白，得到熟地黄总多糖；

(3)将所述熟地黄总多糖依次经离子交换柱、凝胶柱层析进行分离纯化，然后浓缩、冷冻干燥，即得所述熟地黄均一多糖。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述水煎煮的温度为80～100℃，时间为0.5～2h。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，醇沉时溶液中醇浓度为80～95％。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，Sevag法除蛋白时，采用氯仿与正丁醇的混合液进行萃取；所述氯仿与正丁醇的体积比为3:1～5:1。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述离子交换柱填料为DEAE-琼脂糖凝胶FF，所述凝胶柱填料为Superdex-200。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述离子交换柱层析的洗脱梯度为0mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、2.0mol/L NaCl。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将离子交换柱洗脱浓度为0～2mol/LNaCl的洗脱液，经Superdex-200凝胶柱纯化，收集155-170min峰对应的溶液。

9.如权利要求1所述的熟地黄均一多糖在制备治疗精神类疾病药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述精神类疾病为抑郁症。

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