CN109021135A

CN109021135A - 一种素花党参多糖制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN109021135A
Application number: CN201810843896.8A
Authority: CN
Inventors: 邹元锋; 付羽萍; 陈兴福; 殷中琼; 贾仁勇; 朱忠铠; 李丽霞; 宋旭
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2018-12-18

Abstract

本发明公开了一种素花党参多糖制剂及其制备方法，将素花党参药材以浓度为90%的乙醇除杂后，热水浸提，并对水提液进行浓缩，以终浓度为80%的乙醇沉淀，将沉淀物烘干、研磨成粉即得。本发明制得的多糖制剂能作为一种可以调节肠道菌群的生物饲料添加剂用于雏鸡，可以在显著提高雏鸡肠道益生菌‑双歧杆菌的数量，减少致病菌在肠道的定植能力，调节肠道菌群稳态。且制备工艺简单，成本低廉，适口性好，可作为一种促生长生物饲料添加剂在畜禽中使用。

Description

一种素花党参多糖制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种多糖制剂的制备方法，生产工艺和应用，具体涉及一种具有促进雏鸡生长、提高免疫力、调节肠道菌群的素花党参多糖制剂的制备方法和应用。

背景技术

随着禽畜养殖产业日渐突起，养殖规模也与日俱增，养殖过程中使用抗生素的情况也越来越普遍，药物残留、耐药性降低动物本身以及人类造成了难以恢复的负面影响，故而寻找天然环保、绿色无残留的新型治疗剂和饲料添加剂，是生产安全卫生食品和防治动物疾病的迫切需要。

素花党参又名纹党、刀党、西党等，是药典收录的三种党参之一，属于党参中的优良品种，药理作用与人参相似，常作为人参替代品使用，同时也可作为补品用于保健汤羹、保健食品。党参多糖为党参干燥根的水溶性多糖，具有广泛的药理作用，主要包括调节机体免疫，清除自由基，抗衰老，抗肿瘤，降血糖和抑制中枢神经系统等作用。素花党参多糖（WCP）含量普遍较高，毕红艳等以党参中多糖含量评价了素花党参的品质，素花党参因多糖含量高于白条党，被认为是党参中的优良品种。素花党参多糖具有天然、无毒副作用、无抗药性、无残留等优点。有报道指出，WCP可使正常小鼠脾质量增加，胸腺质量减轻，还可以逆转地塞米松所致免疫受抑小鼠的脾质量减轻。党参也被用于畜禽饲养业：霍书英等研究表明，一定剂量的党参多糖可以明显促进雏鸡脾淋巴细胞增殖反应以及IL-2的分泌，这为党参多糖作为免疫增强剂应用于饲养业提供了理论依据。

目前，党参多糖提取技术主要有水提离心分离法、水提醇沉法等，但现有提取方法由于技术参数选择不合理，导致提取物中党参多糖含量低。如专利号为200410012172.7的中国专利公开了一种采用水提离心分离法制备党参多糖的方法，提取物中党参多糖含量只在15％以上；专利申请号为200510012557.8的中国专利也公开了一种党参多糖的制备方法，得到的黄色粉末状的提取物中，党参多糖含量在60％以上。同时，现有的提取方法得到的提取物都是党参多糖的粗品，由于提取未经进一步纯化，提取物杂质多、外观性状不佳、多糖组分不明确。此外，现有提取方法通常仅以多糖含量为指标对提取工艺进行监测，不考察提取率，因而不能很好地体现工艺的科学性和先进性。

基于上述分析，一种纯化浓度高、杂质含量少、提取率高、加工工艺科学简单，用于禽畜养殖产业绿色环保无污染的素花党参多糖制剂及其制备方法是行业内急需的。

发明内容

鉴于上述不足，本发明通过大量的研究和实践，提供一种多糖粉制剂及其制备方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案，实现适口性、提高生产产量，达到新饲料添加剂的标准，具体如下：

一种素花党参多糖制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）乙醇回流脱色除杂：称取200 g的素花党参干燥药材剪碎，置于电热套中，用90%（V/V）的乙醇加热回流脱脂，并除去小分子杂质，过滤后药渣置于室温下干燥备用；

（2）水提浓缩：将蒸馏水按料液比1：40加入药渣中，水提浓缩2次，合并浓缩液至原浓缩液体积的1/20，滤过备用；

（3）醇沉：浓缩后的滤液加入4倍量的无水乙醇（V/V），4℃静置过夜，离心收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮洗涤后，离心分离；

（4）烘干磨粉：沉淀物置于干燥箱中40℃烘干后研磨成粉，得素花党参多糖；

（5）制剂：素花党参多糖加上药学上常用的辅料或辅助性成分制备粉剂即得一种素花党参多糖制剂。

进一步的，步骤（2）所述水提浓缩是以100℃热水提取，每次2.4 h。

进一步的，步骤（3）所述无水乙醇浓度为95%。

本发明还提供了一种素花党参多糖制剂在制备增强雏鸡免疫力药物和调节雏鸡肠道菌群生物饲料中的用途。

本发明的优势在于：

1、本发明的制备只需要电热套（或其余加热设备）、低速离心机、干燥箱以及旋转蒸发仪等基本仪器，工艺简单可靠，方便易行，仪器方便购置，无场地要求；相关化学试剂为乙醇和丙酮，均为可回收循环利用的化学试剂，回收率可达到95%以上，成本低廉，且无污染物产生，环保健康。

2、本发明经试验证实在最佳的温度、料液比和提取时间条件下获得了素花党参多糖的最佳提取率，所得多糖水提液的多糖提取率为21%，且得到的多糖制剂多糖含量达51%。

3、本发明所制备的多糖粉适口性好，是一种天然、绿色的生物饲料添加剂，用于雏鸡的长期饲养不会出现耐药性或其他副作用，同时能促进雏鸡的生长发育。

4、本发明经药效学研究表明，对肠道菌群失调的雏鸡具有一定程度促进生长，增强雏鸡免疫以及恢复抗生素导致的肠道菌群失调的作用，既可用于改善生产中饲料中抗生素添加造成的肠道菌群紊乱状态，亦可作为促生长、免疫增强以及益生元作用的饲料添加剂用于禽畜生产实践。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1：不同提取条件（温度）对素花党参多糖提取率的影响。

图2：不同提取条件（料液比）对素花党参多糖提取率的影响。

图3：不同提取条件（时间）对素花党参多糖提取率的影响。

图4：X1-X3相互作用响应面图。

图5：X1-X2相互作用响应面图。

图6：X2-X3相互作用响应面图。

具体实施例

实施例1

本发明以素花党参多糖含量为指标，对多糖粉制剂的制备工艺进行优化，具体实施如下：

将200 g党参药材烘干，称取粉末倒入3 L圆底烧瓶中，以90%乙醇回流提取5次，每次2h，除去色素甾醇、单糖和低聚糖等杂质，过滤，待残渣中溶剂挥干后，烘干至质量稳定，称重，进行工艺优化研究。其中多糖检测方法为苯酚-浓硫酸法，以0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL无水葡萄糖对照品溶液，在波长490 nm处测定吸光度，制作标准曲线；各个样品蒸馏水稀释后以同样方法检测。

分别以1.0 g 除杂后党参残渣，筛选温度、时间、料液比三个因素对多糖含量的影响，即分别在固定料液比为30 mL/g时，分别在50，60，70，80，90，100℃下回流提取2次，每次1.5 h，得到最佳提取温度；在液料比20、30、40、50、60下以最佳温度水提2次，每次1.5 h，得到最佳料液比；在最佳温度，最佳料液比下提取2次，每次分别提取0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0h、2.5 h、3.0 h，得到最佳提取时间。根据Box -Benhnken的中心组合实验设计原理，综合单因素影响实验结果，以SAS.JMP Software（Version 13.0）对总多糖提取率影响最大的三个因素，在单因素实验的基础上采用3因素3水平的响应面分析方法进行实验设计，其中X₁=（提取温度-90）/10；X₂=（液料比-40）/40；X₃=（提取时间-2.0）/0.5，共计15个组合，按照上述方法提取后定容检测多糖含量，得到拟合模型，预测得出最佳提取工艺，并验证。

结果显示，以不同温度提取党参后，测定水提液中多糖含量，得到多糖提取率绘制曲线，结果表明提取温度对多糖提取率影响相对较大，且在一定提取范围内，随着温度的升高提取率从12.13%到19.98%，最终100℃提取率达到最高，故最佳提取温度为100℃；随着溶剂体积的增加，多糖得率也随之上升，料液比1:40以及之后提取率变化不大，得到最佳液-料比为40 mL/g；随着提取时间的增加多糖得率也逐渐升高，直到提取2.0 h时多糖含量上升显著，提取2.5 h和3.0 h得率与2 h相差不大，故最佳提取时间为2.0 h，具体见图1-图3。

利用SAS.JMP 13.0软件对数据进行回归分析，得到素花党参多糖得率的回归方程为：

对该模型进行方差分析，表明该模型R²=0.97 ，R² _Adj=0.90，F=15.546，p=0.0038（p＜0.01），表明模型极显著，因变量与全体自变量之间的多元回归关系显著；模型的失拟项p=0.1899＞0.05，表明失拟不显著，说明该模型受外界因素影响较小，说明该该方法可靠。模型一次项X₁（p=0.00016）及X₃（p=0.008）均极显著（p＜0.001），说明提取温度和时间对素花党参多糖提取率影响较大；二次项中X₃ ²差异显著（p=0.03174），说明提取温度对多糖提取率影响最大；其余二次项以及交互项均不显著（p>0.05），具体见表1。对提取方法和对应多糖得率进行二次多元回归拟合，以等高线图分析3个因素之间交互作用对多糖得率的影响可知X₂即液料比对提取率影响相对于X₁提取温度和X₃提取时间来说较小，但三个因素相互交互作用对提取率均有很大影响，见图4-图6。

最终通过软件分析得出最大提取率时X₁=1.0，X₂=0.0176，X₃=0.8156，即以100℃、液料比40.176 mL/g、提取2次，每次2.4078 h时多糖得率达到最大，为20.6025%，结合实际操作便利，得出最佳提取工艺条件最终确定为提取温度100℃、液料比40 mL/g、提取2次，每次2.4 h，预测提取率为20.6077%。以上述得到的最佳提取工艺进行提取方法的验证，检测提取液中多糖含量，重复3次。结果表明在提取温度100℃、液料比40 mL/g、提取2次，每次2.4 h下多糖提取率为20.08%，预测提取率为20.6077%，说明模型可以较好预测素花党参多糖得率，得到的最佳工艺可靠。

综合以上数据，我们得出素花党参多糖粉制剂前期水提方法的最佳提取方法为提取温度100℃、液料比40 mL/g、提取2次，每次2.4 h。

表1.回归模型方差分析

注：X1=提取温度；X2=液料比；X3=提取时间

*表示差异显著性为0.05水平（p<0.05）

**表示差异显著性为0.01（p<0.01）

***表示差异显著性为0.001水平（p<0.001）。

实施例2

（2）水提浓缩：以响应面法筛选的到的最佳提取工艺，即将蒸馏水按料液比1：40加入药渣中，100℃下水提浓缩2次，每次2.4 h，合并浓缩液至原浓缩液体积的1/20，滤过备用；

（3）醇沉：浓缩后加入4倍量的浓度为80%的无水乙醇（V/V），4℃静置过夜，离心收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮洗涤后，离心分离；

（4）烘干磨粉：沉淀物置于干燥箱中以40℃烘干后研磨成粉，加上药学上常用的辅料或辅助性成分制备粉剂即得一种素花党参多糖制剂。

试验例

本发明将素花党参多糖用于肠道菌群失调雏鸡中，对其生长性能，免疫功能以及肠道菌群的影响进行了下述功效试验：

选取1日龄杂种乌鸡120只，预饲7d后随机分成分为6组，每组20只，6组分别为自然恢复组、阳性对照组、空白对照组以及素花党参多糖粉高、中、低剂量组。其中自然恢复组和空白对照组于造模后第1d灌胃以生理盐水0.5mL；阳性对照组灌胃黄芪多糖粉溶液0.5 mL（100mg/kg）；素花党参多糖粉溶液灌胃0.5mL，其中高剂量：200 mg/kg，中剂量：100mg/kg，低剂量：50mg/kg。6组乌鸡于预饲7天后在饮水中连续添加氟苯尼考200mg/L，自由饮水，连续用药6d，用于造模，造模结束后按照上述方法给药。给药组连续饲喂至29日龄，即给药15天，分别于14日龄（给药0天，空白检测）、19日龄（给药5天）、21日龄（给药10天）、29日龄（给药15天）上午8:00定时每组取肉鸡3只称重、采血后检测血常规变化；断颈处死后5%新洁尔灭浸泡5 min全身消毒，无菌取免疫器官检测免疫器官指数；无菌条件下将盲肠肠道取出，结扎两端，转移至无菌操作台，并采集盲肠内容物，用于肠道菌群的检测；饲喂过程中严格记录饲料质量和雏鸡体重变化，计算平均日均重、平均日采食量和料重比，评价生长性能。

检测结果表明，造模结束后，雏鸡生长性能相比正常组无显著变化；而15-29日龄造模后给药素花党参多糖生理盐水溶液，两周后高剂量中剂量增重比模型对照组和正常组高（p＞0.05），中剂量组料重比比正常组和模型恢复组小（p＞0.05），但均不如阳性对照组。综合可知，以100 mg/kg素花党参多糖灌胃雏鸡，具有提高其生长性能的功效，见表2。

表2. 素花党参多糖对乌鸡生长性能的影响

造模结束后脾脏指数和法氏囊指数均降低，可能饲喂抗生素氟苯尼考后导致肠道菌群紊乱，进而影响免疫功能。以100 mg/kg素花党参多糖给药后，雏鸡脾脏指数相比模型组均有所提高（p＞0.05），其中给药10-15 d效果最佳，超过正常水平。给药素花党参多糖组法氏囊指数均比自然恢复组高（p＞0.05），说明起到一定增强机体免疫的效果，其中100 mg/kg给药后其法氏囊指数超过正常水平（p＞0.05）；随着时间的推移作用效果亦高于黄芪多糖（p＞0.05）。故中剂量组对肠道菌群失调雏鸡具有较好增强机体免疫的作用，见表3。

表3. 素花单身多糖对乌鸡免疫器官指数的影响

血常规结果显示，素花党参多糖可以提高服用抗生素造成的中性粒细胞比例、血红蛋白含量、红细胞压积以及血小板总数偏低的情况，且高剂量中剂量效果相差不大，其中100mg/kg对上述生理变化恢复作用较好，尤其对中性粒细胞和血小板总数的恢复能力最好，已经超过正常水平（p＞0.05），见表4。

表4. 素花党参多糖对乌鸡免疫器官指数的影响

造模结束后，双歧杆菌数量降低，沙门氏菌显著升高，大肠杆菌和乳酸杆菌有所升高，可见氟苯尼考对肠道益生菌伤害较大，导致致病菌滋生，肠道菌群紊乱。给药素花党参多糖后，相比自然恢复组，高剂量组四种细菌均有所增加，其中双歧杆菌增加显著（p < 0.05）；中剂量组双歧杆菌数量增加，其余三种菌数量降低（p＞0.05）；低剂量组双歧杆菌亦升高，沙门氏菌和大肠杆菌均升高（p＞0.05）。综合上述实验结果，高剂量组双歧杆菌数量虽然升高显著，但致病菌数量均有所升高，无法起到改善肠道菌群稳定的作用；低剂量组可能由于剂量过低，双歧杆菌增加不显著，无法将紊乱的肠道菌群调节到正常水平；而中剂量组虽然双歧杆菌升高不显著，但其余致病菌有降低的趋势，有助于肠道稳态的恢复。故以100 mg/kg 素花党参多糖饲喂雏鸡对肠道菌群恢复能力较好，见表5。

表5. 素花党参多糖对乌鸡肠道菌群的影响（lgCFU/g）

表中数据为3次重复的平均值±标准误，同列数据后凡是有一个相同小写字母者，表示差异不显著（Duncan’s法，P>0.05）。

Claims

1.一种素花党参多糖制剂的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

乙醇回流脱色除杂：称取200 g的素花党参干燥药材剪碎，置于电热套中，用90%（V/V）的乙醇加热回流脱脂，并除去小分子杂质，过滤后药渣置于室温下干燥备用；

水提浓缩：将蒸馏水按料液比1：40加入药渣中，水提浓缩2次，合并浓缩液至原浓缩液体积的1/20，滤过备用；

醇沉：浓缩后的滤液加入4倍量的无水乙醇（V/V），4℃静置过夜，离心收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮洗涤后，离心分离；

烘干磨粉：沉淀物置于干燥箱中40℃烘干后研磨成粉，得素花党参多糖；

制剂：素花党参多糖加上药学上常用的辅料或辅助性成分制备粉剂即得一种素花党参多糖制剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述水提浓缩是以100℃蒸馏水提取浓缩，每次2.4 h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述无水乙醇浓度为80%。

4.一种如权利要求1-3任意一项所述方法所制得的素花党参多糖制剂。

5.权利要求4所述的素花党参多糖制剂在制备增强雏鸡免疫力药物和调节雏鸡肠道菌群生物饲料中的用途。

6.根据权利要求4或5所述的用途，所述素花党参多糖制剂用于增强雏鸡免疫力时剂量为每千克鸡饲喂100mg素花党参多糖。

7.根据权利要求4或5所述的用途，所述素花党参多糖制剂用于调节雏鸡肠道菌群时剂量为每千克鸡饲喂100mg素花党参多糖。