CN110423286A

CN110423286A - 一种中药药渣多糖的提取方法及其用途

Info

Publication number: CN110423286A
Application number: CN201910811736.XA
Authority: CN
Inventors: 梁红宝; 马素茹
Original assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Current assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2019-11-08

Abstract

本发明提供了一种中药醇沉药渣中多糖的提取方法及其用途，尤其是提供了一种从人参固本口服液生产过程中产生的醇沉药渣中提取多糖的方法，即将药渣溶解、过滤，壳聚糖絮凝，过滤、烘干得到多糖提取物。本发明对中药药渣实现了再利用，减少了药材资源的浪费，并且研究发现该多糖提取物具有显著的改善肠道微生态、提高免疫力的作用，可以作为微生态调节剂、糖类营养成分添加到饲料中应用于畜牧业，提高动物抵抗力。

Description

一种中药药渣多糖的提取方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种中药醇沉药渣中多糖的提取方法及其用途，属于中药加工废弃资源再利用的技术领域。

背景技术

随着中医药产业的迅速发展，在带来巨大经济效益的同时，随之带来的中药药渣废弃量也在日渐增加，使得中药企业及社会将面临新的难题和压力。醇沉作为现代中药制备过程中一个重要环节，在2015班药典Ⅰ部所载的成方制剂和单味制剂中，140多种是经过醇沉工艺所得。醇沉法大大提高了中药的澄清度，但也可能会造成有效成分的损失，同时产生大量的废渣。鉴于中药药渣的资源化处理有较高的难度和复杂性，药企对醇沉废渣的处理往往是排入污水站后进行综合处理，不仅增加了成本，而且造成资源浪费。如何充分利用该废渣，降低运营成本，使未被利用的成分得到有效开发、变废为宝，已成为中药制药企业迫切需要解决的共性难题。

比如，人参固本口服液作为鲁南制药集团股份有限公司的独家品种，为甲类OTC药物，具有滋阴益气，固本培元的功效，主要用于阴虚气弱，虚劳咳嗽，心悸气短，骨蒸潮热，腰酸耳鸣，大便干燥等症。处方包括：人参、地黄、熟地黄、山茱萸、山药、牡丹皮、泽泻、茯苓、天冬、麦冬10味药材。这些药材按照处方量经煎煮、回流提取后浓缩至膏状，加入乙醇使醇含量达60%进行冷沉，其中沉淀上清进行后期加工成为口服液，而醇沉沉淀则被废弃。但是通过研究发现，该沉淀中含有大量多糖、蛋白等生物活性大分子，其中多糖含量在30%以上。如何实现该中药品种醇沉药渣的综合利用，变废为宝是企业需要解决的难题。

从药材醇沉药渣中回收多糖的技术已有报道，如CN108030089A涉及的一种丹参水提醇沉药渣回收利用的方法，先后通过溶解、过滤及中空纤维膜超滤处理，得到一种高活性丹参多糖。

此外，自改革开发以来，国内畜禽养殖业已从传统的庭院式养殖向集约化、规模化方向发展。集约化养殖容易造成动物机体的抵抗力下降，从而对不良环境的适应性减弱，极易爆发大规模病害，从而对畜禽养殖业造成巨大损失。目前在养殖业中一般通过在饲料中添加抗生素等方法来对畜禽进行疾病防治，这就容易导致抗生素过量使用以及由此带来畜禽产品抗生素残留，可能会威胁人类健康。因此，如何通过科学有效的，健康的方式实现畜禽的疾病防治是目前国内养殖业需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种自中药醇沉药渣中提取多糖的方法，尤其是针对自人参固本口服液生产过程中产生的醇沉药渣中提取多糖的方法。

本发明提供了一种中药药渣中多糖的提取方法，包括以下步骤：

（1）溶解、过滤：向药渣中加水，搅拌、过滤，得滤液Ⅰ；

（2）壳聚糖絮凝：向滤液Ⅰ中加入壳聚糖，絮凝，过滤，收集滤液Ⅱ；

（3）过滤、烘干：调节所得滤液Ⅱ的含醇量，静置过滤，滤饼烘干，即得。

优选的，步骤（1）中药渣与热水的质量体积比为1:10-20（Kg/L），所加水的温度为70-85℃；进一步优选的，药渣与水的质量体积比为1:15（Kg/L），所加水的温度为80℃。

优选的，步骤（2）中加入壳聚糖与滤液Ⅰ的质量体积比为1-5：1（g/L），絮凝温度为30-60℃，絮凝时间为20-120min；

进一步优选的，加入壳聚糖与滤液Ⅰ的质量体积比为3：1（g/L），絮凝温度为50℃，絮凝时间为60min。

优选的，步骤（3）中调节滤液Ⅱ的含醇量至75-85%；

进一步优选的，调节滤液Ⅱ的含醇量至80%。

上述提取方法中，所得多糖的含量在65%以上。

具体的，上述中药药渣中多糖的提取方法，具体操作如下：

（1）溶解、过滤：以1:15（Kg/L）质量体积比向药渣中加80℃的水，搅拌、过滤，得滤液Ⅰ；

（2）壳聚糖絮凝：以3：1（g/L）质量体积比向滤液Ⅰ中加入壳聚糖，在50℃下絮凝60min，过滤，收集滤液Ⅱ；

（3）过滤、烘干：想滤液Ⅱ中加入95%的乙醇，调节滤液Ⅱ的含醇量至80%，静置过滤，滤饼烘干，即得。

本发明目的之二在于提供上述所得多糖的用途，即该多糖在制备改善肠道微生态、提高免疫力饲料中的应用。所述的多糖具有显著的改善道微生态、提高免疫力的作用，可以作为微生态调节剂、糖类营养成分添加到饲料中应用于畜牧业。

本发明实施例5表明通过多糖提取物对盐酸林可霉素诱导的小鼠肠道微生态失调模型的试验研究发现，本发明的多糖提取物能够显著改善小鼠肠道菌群失调，双歧杆菌、乳酸杆菌数量明显上升，肠球菌、肠杆菌数量下降；明显好于自然恢复组。

本发明实施例6表明本发明的多糖提取物可促进淋巴细胞增殖，进一步表明其具有调节细胞免疫的作用；该复合提取物可增加抗体生成细胞的数量，表明其具有调节体液免疫的作用；该复合提取物还可增强NK细胞的活性。表明本发明的多糖提取物具有增强动物体液免疫功能和细胞免疫功能的作用，可作为增强免疫力饲料添加剂用于畜牧业。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

相比传统药渣处理方式，本发明具有工艺简单，操作简便，效率高的优点。本发明将醇沉药渣中的多糖成分进行纯化，利用其含有的糖类营养成分及具有的微生态调节、增强免疫力等作用开发成为饲料添加剂，提高动物健康水平、降低畜牧生产中抗生素等药品的用量，不仅可以有效解决中药药渣的资源浪费和环境污染问题，而且还可以为企业带来一定经济效益。

具体实施方式

下面将结合具体实施案例进一步说明本发明，本发明要求保护的范围并不局限于以下实施方式。

实施例1

取人参固本口服液生产过程中产生的醇沉药渣1Kg，向其中加入80℃热水15L，搅拌复溶、过滤，得滤液；将壳聚糖按3:1的质量体积比加入到所得滤液中，50℃下，絮凝60min，过滤，收集滤液；加入95%乙醇调节滤液的含醇量，使含醇量达80%，静置24h后过滤，滤饼烘干即得到多糖提取物，总多糖含量为70%。

实施例2

取人参固本口服液生产过程中产生的醇沉药渣1Kg，向其中加入70℃热水20L，搅拌复溶、过滤，得滤液；将壳聚糖按5:1的质量体积比加入到所得滤液中，60℃下，絮凝120min，过滤，收集滤液；加入95%乙醇调节滤液的含醇量，使含醇量达75%，静置24h后过滤，滤饼烘干即得到多糖提取物，总多糖含量为65%。

实施例3

取人参固本口服液生产过程中产生的醇沉药渣1Kg，向其中加入85℃热水10L，搅拌复溶、过滤，得滤液；将壳聚糖按1:1的质量体积比加入到所得滤液中，30℃下，絮凝20min，过滤，收集滤液；加入95%乙醇调节滤液的含醇量，使含醇量达85%，静置24h后过滤，滤饼烘干即得到多糖提取物，总多糖含量为67%。

实施例4

取人参固本口服液生产过程中产生的醇沉药渣1Kg，向其中加入82℃热水18L，搅拌复溶、过滤，得滤液；将壳聚糖按4:1的质量体积比加入到所得滤液中，40℃下，絮凝60min，过滤，收集滤液；加入95%乙醇调节滤液的含醇量，使含醇量达83%，静置24h后过滤，滤饼烘干即得到多糖提取物，总多糖含量为69%。

对比实施例

取人参固本口服液生产过程中产生的醇沉药渣1Kg，向其中加入80℃热水15L，搅拌复溶、过滤，得滤液；加入95%乙醇调节滤液的含醇量，使含醇量达80%，静置24h后过滤，滤饼烘干即得到多糖提取物，总多糖含量为55%。

实施例5 本发明多糖提取物对肠道微生态失调小鼠的调节作用

1.材料与方法

1. 1动物分组及给药 60只SPF级BALB/c小鼠，随机取出10只作为正常对照组，其余50只每天灌胃0.3g/ml的盐酸林可霉素，每日2次，每次0.3ml，连续3d，造成小鼠肠道微生态失调模型，正常对照组灌胃等量生理盐水。第4天，处死正常组小鼠和模型组小鼠各10只，进行指标检测，以判断模型是否构建成功。

模型成功后，将40小鼠随机分为4组，每组10只，分笼饲养，即本发明实施例1多糖提取物组、对比实施例多糖提取物组、丽珠肠乐组和自然恢复组。

实施例1多糖提取物组按150mg/Kg剂量灌胃给予本发明实施例1制备得到的多糖提取物，对比实施例多糖提取物组按150mg/Kg剂量灌胃给予本发明对比实施例制备得到的多糖提取物，丽珠肠乐组灌胃0.5亿活菌/ml的丽珠肠乐溶液，自然恢复组以等量生理盐水处理，每天2次，每次0.3ml，连续7d。

1.2 实验观察内容

小鼠肠道菌群测定参照文献（杨景云. 医用微生态学[M].北京:中国医药科技出版社，1997:86 -110），进行菌落计数。

计算公式:CFU/每克粪便=每一稀释度平均菌落数×稀释倍数/滴种体积(ml)。

1.3数据统计与分析

数据以s表示，采用SPSS17.0软件进行方差分析。

2.结果

2.1 小鼠经盐酸林可霉素连续灌胃3d，双歧杆菌和乳酸杆菌数量降低，肠球菌和肠杆菌数量升高，与正常组相比P<0.05，表明小鼠肠道已发生微生态失调。

表1 正常组与模型组各项指标检测结果

与正常组相比，^￥P<0.05。

2.2治疗后，小鼠肠道菌群失调症状得到缓解，各治疗组双歧杆菌、乳酸杆菌数量明显上升，肠球菌、肠杆菌数量下降，明显好于自然恢复组(P <0.05)，本发明多糖提取物组与丽珠肠乐组相比，差异有显著性(P<0.05)。

与对比实施例多糖提取物组相比，本发明的多糖提取物组双歧杆菌、乳酸杆菌数量明显上升，肠球菌、肠杆菌数量下降，差异有显著性(P<0.05)。

表2 药物治疗后肠道菌群定量检测结果(logN/g)

与自然恢复组相比，^￥P<0.05；与丽珠肠乐组相比，^#P<0.05；

与对比实施例组相比，^＆P<0.05。

本研究结果表明；本发明多糖提取物能改善小鼠肠道菌群失调状况。对于治疗肠道微生态失调，本发明多糖提取物的作用优于丽珠肠乐、优于对比实施例多糖提取物组。

实施例6 本发明多糖提取物对小鼠免疫功能的影响

1.材料与方法

1. 1动物分组及给药 40只SPF级雄性BALB/c小鼠，基础饲料(10%水分、20.5%粗蛋白质、4%粗脂肪、5%粗纤维、8%粗灰分、1.32%赖氨酸、0.78%蛋氨酸+胱氨酸)适应性喂养后，将小鼠随机分为4组，分别为阴性对照组、本发明实施例1多糖提取物组、本发明实施例2多糖提取物组、对比实施例多糖提取物组。

本发明实施例1多糖提取物组按150mg/Kg剂量灌胃给予本发明实施例1制备得到的多糖提取物，本发明实施例12多糖提取物组按150mg/Kg剂量灌胃给予本发明实施例2制备得到的多糖提取物，对比实施例多糖提取物组按150mg/Kg剂量灌胃给予对比实施例制备得到的多糖提取物。阴性对照组灌胃给予等体积的蒸馏水。每天1 次，连续灌胃给药30 d。

1.2 实验观察内容

1.2.1 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验

连续灌胃30 d 后，处死小鼠，在无菌条件下取出脾脏，用镊子将脾撕碎，过200目筛后，用Hank’s 液洗3次，用完全1640培养液配成3×10⁶/mL 细胞悬液。将每份脾细胞悬液加入24孔培养板中，1mL/孔，每份样品2个孔，一孔加75μL ConA液，另一孔作为对照，置于CO₂孵箱培养68 h后，取出培养板，每孔轻轻吸取0.7mL上清，加入0.7mL不含小牛血清的1640培养液和50μLMTT液，继续培养4h。取出培养板，每孔加入1mL酸性异丙醇，将紫色结晶完全溶解，用酶标仪在570nm波长处测定吸光度值(OD)，以ConA孔OD值减去未加ConA孔OD值代表淋巴细胞增殖能力。若受试组的光密度差值显著高于对照组，判断为阳性结果。

1.2.2 抗体生成细胞检测

在小鼠连续灌胃25d后给每只小鼠腹腔注射0.2mL2%SRBC免疫，继续灌胃5d后，处死小鼠取出脾脏，用镊子将脾撕碎后过200目筛，用Hank’s液洗3次，用完全1640培养液配成5×10⁶/mL脾细胞悬液。在含有0.5mL表层培养基的小试管中加入50μL 10%SRBC液及20μL脾细胞悬液，迅速混匀，加于挂膜玻片上，凝固后，将玻片扣放在片架上，置CO₂孵箱培养1.5h，在玻片架凹槽内加入用SA缓冲液稀释的补体，继续培养1.5h后，计算溶血抗体生成细胞数，以空斑数/10⁶脾脏细胞表示，受试组的空斑数显著高于对照组的空斑数，判断为阳性结果。

1.2.3 NK 细胞活性测定

连续灌胃30d后，处死动物，取出小鼠脾脏，剪碎，过200目筛，用Hank’s液洗3次，用完全1640培养液配成2×10⁷个/mL细胞悬液。在96孔培养板中加入小鼠细胞悬液，每只小鼠细胞悬液做平行3个孔，每孔加100μL，并加靶细胞液(YAC-1细胞，4×10⁵个/mL)100μL，同时做靶细胞自然释放孔(靶细胞100μL+培养液100μL)及最大释放孔(靶细胞100μL+1%NP-40 100μL)各3孔，在37℃、5%CO₂ 条件下培养4 h后取出1500 r/min离心5min。吸取各孔上清100μL置于另一培养板中，每孔再加入100μL基质液，10 min后加1mol/L HCl 30μL 终止反应，在492nm波长处测定OD值，按下面公式计算NK细胞活性率。

NK 细胞活性率(%)=(各反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100%

受试组的NK细胞活性显著高于对照组NK细胞活性，判断为阳性结果。

1.3数据统计与分析

数据以s表示，采用SPSS17.0软件进行方差分析。

2.结果

2.1 对ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化的影响

结果显示，与阴性对照组相比，实施例1多糖提取物组、实施例2多糖提取物组光密度差值显著增高(P<0.05)，可增强淋巴细胞的增殖能力。

与对比实施例多糖提取物组相比，实施例1多糖提取物组、实施例2多糖提取物组光密度差值显著增高(P<0.05)。结果见表3。

表3 本发明多糖提取物对ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化的影响

与阴性对照组相比，^￥P<0.05；

与对比实施例多糖提取物组相比，^＆P<0.05。

2.2 对抗体生成细胞的影响

结果显示，与阴性对照组相比，实施例1多糖提取物组、实施例2多糖提取物组抗体生成细胞显著增加(P<0.05)，可增强淋巴细胞的增殖能力。

与对比实施例多糖提取物组相比，实施例1多糖提取物组、实施例2多糖提取物组抗体生成细胞显著增加(P<0.05)。见表4。

表4 本发明多糖提取物对小鼠抗体生成细胞的影响

与阴性对照组相比，^￥P<0.05；

与对比实施例多糖提取物组相比，^＆P<0.05。

2.3 对小鼠NK 细胞活性的影响

结果显示，与阴性对照组相比，实施例1多糖提取物组、实施例2多糖提取物组NK 细胞活性率显著增高(P<0.05)，可增强淋巴细胞的增殖能力。

与对比实施例多糖提取物组相比，实施例1多糖提取物组、实施例2多糖提取物组NK 细胞活性率显著增高(P<0.05)。见表5。

表5 本发明多糖提取物对小鼠NK 细胞活性的影响

与阴性对照组相比，^￥P<0.05；

与对比实施例多糖提取物组相比，^＆P<0.05。

本发明实施例表明本发明的多糖提取物可促进淋巴细胞增殖，进一步表明其具有调节细胞免疫的作用；该多糖提取物可增加抗体生成细胞的数量，表明其具有调节体液免疫的作用；该多糖提取物还可增强NK细胞的活性。本发明的多糖提取物具有增强动物体液免疫功能和细胞免疫功能的作用，可作为增强免疫力饲料添加剂用于畜牧业。

Claims

1.一种中药药渣中多糖的提取方法，包括以下步骤：

（1）向中药药渣中加水搅拌、过滤，得滤液Ⅰ；

（2）向滤液Ⅰ中加入壳聚糖，絮凝，过滤，收集滤液Ⅱ；

（3）调节滤液Ⅱ的含醇量，静置过滤，滤饼烘干，即得。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中以Kg/L计算，药渣与水的比例为1:10-20，所加水的温度为70-85℃。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中以Kg/L计算，药渣与水的比例为1:15，所加水的温度为80℃。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中以g/L计算，壳聚糖与滤液Ⅰ的比例为1-5：1，絮凝温度为30-60℃，絮凝时间为20-120min。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中以g/L计算，壳聚糖与滤液Ⅰ的比例为3：1，絮凝温度为50℃，絮凝时间为60min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中调节步骤（2）所得滤液Ⅱ的含醇量达75-85%。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中调节步骤（2）所得滤液Ⅱ的含醇量为80%。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所得多糖的含量在65%以上。

9.一种如权利要求1-8所述的多糖在制备调节肠道微生态或增强免疫力的饲料中的应用。

10.一种如权利要求1-7任一项所述的方法在提取人参固本口服液药渣中多糖的用途。