CN111647091A - 一种太子参活性六碳醛低聚糖及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种太子参活性六碳醛低聚糖及其制备方法与应用。该太子参活性六碳醛低聚糖结构如式I所示，分子量为1476.6185Da，其单糖组成为：甘露糖、葡萄糖和半乳糖(摩尔比为0.076:0.814:2.600)。本发明还提供了该低聚糖的制备方法，通过醇提、水提、醇沉、酶‑Sevage法除蛋白、DEAE‑52阴离子交换柱分离纯化的方法，收集分子量在1000Da至2000Da区间的产物，获得该太子参活性六碳醛低聚糖。本发明中获得的低聚糖具有抗炎、抗氧化活性，以及具有较强的还原能力，并可以通过调控肠道菌群的种类及丰度从而具有显著拮抗炎性肠病。

Description

一种太子参活性六碳醛低聚糖及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于天然物质提取技术领域，特别涉及一种太子参活性六碳醛低聚糖及其制备方法与应用。

背景技术

太子参(Radix pseudostellariae，RP)是中国药典收载的常用中药之一，别名孩儿参，系石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根。太子参具有“益气健脾、生津润肺”之功效，临床常用于脾虚体倦、食欲不振、病后虚弱、气阴不足、自汗口渴、肺燥干咳等症状，民间常作为强壮滋补品。其性平，味微苦、甘；归脾、肺经。太子参成分复杂，药用活性物质富含氨基酸、多糖、皂苷、环肽、黄酮和挥发物等组分，同时临床药理结果表明太子参具有抗糖尿病、增强免疫力及改善机体组织器官功能等作用。

太子参多糖是太子参中一类十分重要的水溶性成分，研究发现其在提高免疫功能、抗疲劳、抗糖尿病等具有较好的功效。目前，太子参多糖提取工艺主要有水提、醇提和超临界提取等。因太子参产地和品种等条件差异导致多糖含量各异。太子参多糖含量约为25％～35％，游离的糖占太子参总多糖的9％～20％，而参须多糖含量低于块根多糖，约为15％～25％，动物试验结果表明太子参多糖是一种发挥营养调控和免疫保健功能的双效物质。太子参多糖主要是由半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖和鼠李糖7种单糖组成，其中葡萄糖占比例较高。

太子参的水提物也具有抗炎及抗氧化作用。研究发现，太子参水提物成分能够显著提高小鼠巨噬细胞RAW264.7的生理活性，减少巨噬细胞炎症因子NO的产生。脂氧合酶(LOX)和一氧化氮(NO)在内源性炎症发动的过程起到关键作用，太子参水萃取物和醇萃取物均具有显著抑制LOX活性，同时太子参水萃取物、超临界萃取物和醇萃取物均具有清除NO活性的能力，且优选太子参水萃取物，对机体损伤所致炎症反应具有抑制作用。同时，太子参提取物能够抑制炎症细胞mRNA表达水平，显著下调核因子的蛋白表达水平，通过调节Th1和Th2水平来抑制皮炎发生。实验还证实在断奶仔猪饲粮中添加太子参茎叶多糖可显著增加免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和补体C₃、C₄的含量，并可显著提升SOD酶活水平、能有效增重、降低腹泻率、改善机体抗氧化性能、改善血液生化指标以及能够降低盲肠大肠杆菌的数量并提高乳酸杆菌数量。

然而，由于作为水提物主要成分的活性多糖，其结构复杂，分离、纯化及表征是一个巨大挑战。而作为一种新型功能性糖源，低聚糖广泛应用于食品、饮料、保健品、医药及饲料添加剂等领域。其分子组成通常是由2-10个糖苷键聚合而成。低聚糖并不能被人体的胃酸破坏，也无法被消化酶分解。但可以被肠中的细菌发酵利用，转换成短链脂肪酸以及乳酸。太子参多糖多为水提物或者醇提物，如何利用其制备一种具有较好生物学活性的低聚糖尚有一定的挑战性。目前资料尚无太子参活性六碳醛低聚糖的报道。因此，深入探究太子参活性低聚糖，对于研发太子参这一珍贵中草药资源具有重要意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种太子参活性六碳醛低聚糖。

本发明的另一目的在于提供所述太子参活性六碳醛低聚糖的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述太子参活性六碳醛低聚糖的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种太子参活性六碳醛低聚糖，其结构如式I所示：

所述的太子参活性六碳醛低聚糖的分子量为1476.6185Da，其单糖组成为：甘露糖、葡萄糖和半乳糖，三者摩尔比为0.076:0.814:2.600。

所述的太子参活性六碳醛低聚糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)醇提：将太子参加入到5～8倍体积(优选为8倍体积)的浓度为体积百分比70～90％的乙醇溶液(优选为体积百分比70％的乙醇溶液)中，于60～90℃(优选为80℃)条件下进行提取(除去小分子化合物)，提取后，挥发去除乙醇，得到太子参药渣；

(2)水提：将太子参药渣加入到7～10倍体积(优选为8倍体积)的去离子水中，于70～100℃(优选为80℃)条件下进行提取，提取后浓缩、喷雾干燥，得到太子参水提物；

(3)醇沉：将太子参水提物加入到水中，超声溶解，得到太子参水提物溶液；然后将无水乙醇加入到太子参水提物溶液中使其终浓度为体积百分比70％～90％(优选为体积百分比为90％)，于4℃条件下进行醇沉，离心，收集沉淀，得到粗糖聚物；

(4)酶-Sevage法除蛋白：将粗低聚糖溶于水中，然后加入蛋白酶进行酶解，得到酶解液；再向酶解液中加入Sevage试剂进一步除蛋白，离心、取上清液，浓缩，冷冻冻干，得到除蛋白后的粗糖聚物；

(5)分离纯化：将除蛋白后的粗糖聚物溶于水中，然后用DEAE-52阴离子交换柱进行分离纯化，收集分子量在1000Da至2000Da区间的产物，得到所述的太子参活性六碳醛低聚糖。

步骤(1)中所述的太子参优选为太子参饮片。

步骤(1)和(2)中所述的提取的时间为1～3h。

步骤(1)和(2)中所述的提取的次数为1～3次。

步骤(3)中所述的太子参水提物溶液的浓度0.008～0.012g/mL；优选为0.01g/mL。

步骤(3)中所述的醇沉的时间为24～36h；优选为24h。

步骤(3)中所述的离心的条件为：4000～5000rpm离心5～10min；优选为：5000rpm条件下离心5min。

步骤(4)中所述的蛋白酶优选为木瓜蛋白酶。

步骤(4)中所述的蛋白酶的用量为按其在所述酶解体系的终浓度为1600～2000U/g添加计算；优选为按其在所述酶解体系的终浓度为1600U/g添加计算。

步骤(4)中所述的酶解的条件为：60℃酶解3～6h；优选为：60℃酶解5h。

步骤(4)中所述的Sevage试剂为正丁醇与氯仿按体积比1:4配比混合得到的试剂。

步骤(4)中所述的酶解液与Sevage试剂的体积比优选为5:1。

步骤(4)中所述的离心的条件为：4500～6000rpm离心2～10min；优选为：4500rpm条件下离心2min。

所述的太子参活性六碳醛低聚糖在制备抗炎或抗氧化产品中的应用；该太子参活性六碳醛低聚糖具有抗炎活性，并可以通过调控肠道菌群的种类及丰度从而具有显著拮抗炎性肠病；该太子参活性六碳醛低聚糖还具有抗氧化活性，并可以清除超氧阴离子自由基体系(O2-·)、羟基自由基体系(·OH)、二苯代苦味酰基自由基体系(DPPH·)，以及具有较强的还原能力。

所述的抗炎产品包括抗炎药物、食品，保健品或化妆品等；

所述的抗炎药物包括防治炎症性肠病的药物，抗肿瘤药物，防治肠道菌群紊乱及便秘的药物等。

所述的抗氧化产品包括抗氧化药物、食品、保健品或化妆品等。

所述的抗氧化药物包括抗肿瘤药物等。

所述的抗氧化化妆品包括美白、修复以及延缓皮肤衰老的化妆品。

所述的产品还可以含有一种或多种食品载体或药学上可接受的载体，再通过药学常规方法进一步制成片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、煎膏剂等剂型。

所述的载体包括缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

所述的太子参活性六碳醛低聚糖的有效浓度为0.5～2.5mg/mL。

一种含有太子参活性六碳醛低聚糖的口服液，包含上述太子参活性六碳醛低聚糖。

所述的含有太子参活性六碳醛低聚糖的口服液还含有食用防腐剂。

所述的含有太子参活性六碳醛低聚糖的口服液的制备方法，包括如下步骤：

将上述太子参活性六碳醛低聚糖溶解到去离子水中，然后调节pH值至5.5±0.2，再加入食用防腐剂，离心除去杂质，得到含有太子参活性六碳醛低聚糖的口服液。

所述的含有太子参活性六碳醛低聚糖的口服液中太子参活性六碳醛低聚糖的含量为70～80mg/L。

所述的食用防腐剂优选为山梨酸钾。

所述的食用防腐剂的添加量为占含有太子参活性六碳醛低聚糖的口服液质量的0.2％。

所述的离心的转速为10000～20000r/min。

所述的含有太子参活性六碳醛低聚糖的口服液的制备方法，还包括进一步将得到的含有太子参活性六碳醛低聚糖的口服液进行灌装和密封的步骤。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明首次从太子参中获得一种分子量在1000Da至2000Da区间的低聚糖，其糖含量为95％以上；高分辨质谱结果显示其分子量为1476.6185Da，二级质谱碎片信息表明该低聚糖的单糖单元均为六碳醛糖；其单糖组成包括：甘露糖、葡萄糖和半乳糖，它们之间的摩尔比为：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝0.076:0.814:2.600；该低聚糖具有五种类型的糖键：Glup-(1→、Galp-(1→、→3)-Glup-(1→、→6)-Manp-(2→、→4,6)-Galp-(1→。

(2)本发明通过体外细胞和分子学实验，观察了该太子参活性低聚糖对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症模型的影响，实验结果发现，与对照组相比，模型组炎症相关指标水平显著升高，说明炎症模型造模成功；与模型组相比，太子参活性低聚糖组细胞中炎症相关指标水平均显著降低，说明该低聚糖具有明显的抗炎作用，具备开发成抗炎药物或者保健品的前景。

(3)本发明通过构建DSS肠炎小鼠模型，通过太子参活性低聚糖干预后模型小鼠肠道菌群的变化以及其他炎症指标的检测，发现了该低聚糖在动物水平上具有抗炎效果；将其制备成药物制剂或应用于保健品、特殊用途食品及普通食品，人服用后能够有效的预防或治疗肠道菌群紊乱及便秘，或者因肠道菌群紊乱带来的炎性肠病、结肠癌等，即其在预防、改善和治疗炎性肠病的保健品或者抗炎药物制剂方面具有应用潜力。

(4)本发明提供的具有调节肠道菌群结构作用的太子参活性低聚糖，通过实验验证，能有针对性地改变肠道菌群，调节肠道菌群结构，改善肠道健康，对多种原因导致的肠道菌群紊乱均显示出了很好的调节作用，取得了非常好的技术效果。

(5)申请人通过体外细胞和分子学实验，通过清除超氧阴离子自由基、羟基自由基、二苯代苦味酰基自由基以及还原能力的测定，说明提取的太子参活性低聚糖具有良好的抗氧化活性，尤其清除羟自由基、超氧阴离子自由基体、二苯代苦味酰基自由基体系能力良好，具备开发成抗氧化药物、化妆品、抗肿瘤药物的前景。

附图说明

图1是实施例1中太子参活性低聚糖生产方法及每部分得率流程图。

图2是太子参活性低聚糖的单糖组成及分子量测定结果图；其中，a为正离子模式下混合标品(1:甘露糖、2：鼠李糖、3：葡萄糖醛酸、4：半乳糖醛酸、5：葡萄糖、6：半乳糖、7：阿拉伯糖、8：岩藻糖)以及太子参活性低聚糖完全酸水解的TIC图；b为负离子模式下太子参活性低聚糖的质谱图。

图3是太子参活性低聚糖的红外光谱分析图。

图4是太子参活性低聚糖的核磁共振波谱分析图；其中，a为¹H NMR谱；b为¹³C NMR(图中A-E分别表示残基A(α-D-Glcp-(1→)、残基B(α-D-Galp-(1→)、残基C(→3)-α-D-Glup-(1→)、残基D(→6)-α-D-Manp-(2→)、残基E(→4,6)-α-D-Galp-(1→)的端基碳信号)；c为HSQC图谱(图中A-E分别表示残基A-E的H-1和C-1的相关信号)；d为HSBC图谱(500MHz，D₂O)(图中E4-A1,E4-B1,E6-B1,D2-C1分别表示残基E的C-4与残基A的O-1相连，残基E的C-6与残基B的O-1连接，残基E的C-4与残基B的O-1连接，残基D的C-2与残基C的O-1连接)。

图5是太子参低聚糖预测结构图。

图6是太子参活性低聚糖对炎症因子TNF-α表达的影响图。

图7是太子参活性低聚糖对炎症因子IL-1β表达的影响图。

图8是太子参活性低聚糖对小鼠肠炎模型中肠道菌群紊乱的调节作用图。

图9是太子参活性多糖清除·OH能力图。

图10是太子参活性多糖清除DPPH·的作用图。

图11是太子参活性多糖清除O2-·的作用图。

图12是太子参活性多糖还原能力图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1太子参活性低聚糖的提取

(1)取太子参干燥饮片(广州至信药业股份有限公司)300克置于4L圆底烧瓶中，加入2.4L体积百分比70％的乙醇溶液于80℃提取三次，每次1h。提取后，药渣挥去乙醇，加入2.4L去离子水于80℃提取三次，每次1h，合并三次水提液，浓缩后喷雾干燥，得到太子参水提物，其得率为31.20±3.89％。

(2)将上述太子参水提物加入水中，使其浓度为1g/100mL，超声溶解后，缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌使最终醇浓度为90％(体积百分数)，4℃冰箱中醇沉24h，将醇沉后的溶液在5000rpm条件下离心5min，收集下层沉淀，即得90部位太子参粗糖聚物(即用90％乙醇体系醇沉得到的多糖，CPF90)，得率为39.98％(以太子参水提物换算得率)(图1)；

(3)我们使用酶-Sevage法联用的方法除蛋白，将上述得到的90部位粗糖聚物加适量去离子水溶解，加木瓜蛋白酶(索莱宝生物科技有限公司)使酶活性为1600U/g，60℃酶解5h。酶解后加去离子水使药液浓度达到1g/100mL，按照药液：Sevage试剂(正丁醇：氯仿＝1:4，体积比)＝5:1(体积比)的比例加入一定量的Sevage试剂，用力震荡5min，以4500rpm的转速离心2min，合并上清液浓缩至50mL左右，分放在培养皿中减压冷冻冻干，得率为34.37％(以太子参水提物换算得率)(图1)；

(4)称取除蛋白后的粗糖聚物30mg，溶于1mL去离子水中，12000rpm离心5min，吸取上清液上样于DEAE-52阴离子交换柱(2.5×40cm的中压柱)，用去离子水洗脱，每5min收集一管，每管8mL，硫酸苯酚法测其显色反应，分管收集，经HPGFC-ELSD法(高效凝胶渗透色谱-蒸发光散射检测：取收集的样品1mL，0.22μm滤膜过滤；其中，色谱条件：色谱柱为Polysep-GFC-P4000(300×7.8mm)、Polysep-GFC-P4000(35×7.8mm)；流动相：纯水；流速：0.4mL/min；进样量：20μL；柱温：30℃；增益值：10；载气(N2)压力：30psi；雾化器温度和漂移管温度分别为60℃、100℃)检测其纯度(是否为单一对称峰)，合并收集纯度高的馏分后得到一种分子量在1000Da至2000Da区间的太子参低聚糖，其糖含量为95％以上，得率为5.63％(以太子参水提物换算得率)(图1)。

实施例2太子参活性低聚糖的结构表征

(1)单糖组成及分子量测定：向实施例1中得到的太子参活性低聚糖中加入0.5mL4mol/L的三氟乙酸于120℃条件下油浴2h使其完全酸水解，完全酸水解后的样品加0.5ml浓氨水(质量浓度25％)，震摇使内容物完全溶解，再加0.5ml浓度为0.5mol/L的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液，进行PMP衍生化后经液质分析；其中，液质分析(UPLC/Q-TOFMS分析)条件如下：

流动相：水相(A)：0.05％(v/v)乙酸，20mM乙酸铵；有机相(B)：乙腈。

色谱柱：CORTECS C18 PFP柱(2.1×100mm)进样量5μL柱温：30℃，

其梯度洗脱程序见下表1。

表1梯度洗脱程序

质谱使用ESI离子源，正离子模式下在m/z400～600范围内进行数据采集。雾化气(N2)和脱溶气体(N2)的流速分别为50L·h^-1和500L·h^-1，源温度为100℃，溶剂温度为300℃。毛细管电压为3.0kV，锥电压为30V，实时校正溶液为亮氨酸脑啡肽(m/z：556.2771，500ng/mL)，在0.01mL·min^-1流速下，以保证分子质量的准确性和重现性。Lock spray频率设定为10s。使用MassLynx 4.1软件进行所有数据采集和处理。

根据对比单糖标品(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖)的保留时间和分子量等信息(图2a)可知该低聚糖的单糖组成。

该低聚糖含有的单糖有甘露糖、葡萄糖和半乳糖，它们之间的摩尔比为：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝0.076:0.814:2.600。根据质谱图(图2b)，可知其分子量为1476.6185Da，由质谱信息可知每次断裂的碎片均为162.05Da，碎片信息表明其单糖单元均为六碳醛糖，与单糖组成结果相一致。

(2)红外光谱分析：红外光谱是化学物进行结构鉴定的重要手段，可以用来确定化合物中存在的官能团。

图3是该低聚糖的红外图谱，3410.07cm^-1是O-H的伸缩振动吸收峰，2921.83cm^-1是C-H的伸缩振动吸收峰，1633.77cm^-1是C＝O的伸缩振动吸收峰，1445.55cm^-1是C-H的变角振动吸收峰。1153.06cm^-1、1078.61cm^-1、1018.21cm^-1是吡喃型单糖的C-O吸收特征峰。这些特征吸收峰均为糖聚物的特征吸收峰，并且854.10cm^-1处的吸收峰表明α型糖残基，608.03cm^-1处是吡喃糖的特征吸收。

(3)甲基化结果分析：为了确定相邻糖基残基之间的连接类型，采用GC-MS技术对该低聚糖进行了甲基化分析。GC-MS测定条件：EI离子源，色谱柱型号为DB-5，进样量：5μL，进样口温度：200℃，检测器温度：300℃，载气流速：1.0mL/min，质量扫描范围：m/z 50～500，气相色谱程序升温条件：起始温度为160℃，保持1min；以4℃/min升至280℃，保留10min。结果表明，太子参活性低聚糖具有五种类型的糖键：Glup-(1→、Galp-(1→、→3)-Glup-(1→、→6)-Manp-(2→、→4,6)-Galp-(1→(见表2)。

表2太子参活性低聚糖的甲基化分析结果

保留时间(min)	甲基化糖	糖苷键类型
			12.67	2,3,4,6-Me4-Glup	Glup-(1→
13.5	2,3,4,6-Me4-Galp	Galp-(1→
			15.19	2,4,6-Me3-Glup	→3)-Glup-(1→
15.68	1,3,4-Me3-Manp	→6)-Manp-(2→
			16.59	2,3,-Me2-Galp	→4,6)-Galp-(1→

(4)核磁共振波谱分析：太子参活性低聚糖的¹H NMR，¹³C NMR，¹H-¹³C HSQC和¹H-¹³CHMBC光谱如图4所示。¹H NMR谱大多集中在3至5ppm的狭窄区域，这是多糖的典型特征。在4.70ppm附近的没有发现信号表明该低聚糖不存在的β-糖苷键，而在5.00-5.50ppm处的强峰表明它主要包含α-糖苷键。在5.24ppm处的信号是α-D-Glcp特征峰的典型信号。通过99.74-100.52ppm的信号可以确认α-Galp糖残基的存在。氢原子信号在δ5.04和碳信号在δ99.44对应于→1)-α-D-Glup-(3→糖残基的H-1和C-1信号。因为碳信号严重重叠很难从¹³C谱中确定所有碳信号，因此进一步使用HMQC和HMBC进行判断。在HSQC谱中，δ5.24ppm处的氢原子信号与δ100.39ppm处的碳信号相关(图4c)，是α-D-Glcp-(1→的相关信号，在太子参活性低聚糖的HSQC光谱异头物区域中清楚地观察到其他四个相关位移，分别为4.97/98.26ppm，5.04/99.44ppm，5.17/101.61ppm，5.50/91.19ppm(分别以B，C，D表示)这些相关位移表明该低聚糖由五个糖残基组成，其结果与GC-MS结果一致。在二维谱HMBC(图4d)中，在δ5.24/68.65ppm，δ4.97/69.12ppm，δ4.97/70.60ppm，δ5.04/70.48ppm处有四个强交叉峰，证明存在四个不同的连接位置，残基B的O-1具有两种碳连接方式。残基E的C-4与残基A的O-1相连，残基E的C-6与残基B的O-1连接，残基E的C-4与残基B的O-1连接，残基D的C-2与残基D的O-1连接。

根据上述结构表征可知，该太子参低聚糖的结构如图5所示。

实施例3太子参活性多糖对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型的影响

(1)细胞培养取出保存于液氮冷冻的RAW264.7细胞(中科院上海细胞库)株，迅速置于37℃水浴中振荡至细胞融化后，转入已加入培养基的离心管中，以1000rpm离心5min，弃去上清液，加入少量培养基并轻轻吹吸均匀，培养基为含有10％(v/v)胎牛血清、1％(v/v)双抗(青霉素的终浓度为100μg/mL，链霉素为50μg/mL)的1640培养基，将细胞悬液移入培养皿，在37℃、5％(v/v)CO₂、饱和湿度条件下培养；

(2)用含10％(v/v)FBS胎牛血清的1640培养基培养将RAW264.7细胞配成单个细胞悬液，以每孔10⁴个细胞的浓度接种到96孔板，每孔体积100μL；

(3)在5％(v/v)CO₂，37℃条件下孵育12h，届时细胞单层铺满孔底。设置空白组、阳性对照组(布洛芬，300μg/mL)，炎症模型组(脂多糖(LPS)造模)，太子参活性低聚糖干预组(300μg/mL)，每组均设置6个复孔；太子参活性低聚糖(实施例1制得)干预1h后，炎症模型组与太子参活性低聚糖干预组加入适量LPS，使得LPS终浓度为0.5μg/mL，对照组加入等量的PBS后继续培养24h；

(4)24h后取细胞培养基上清液，4℃，1000×g/min，离心15min，取上清液，测定上述炎症因子TNF-α、IL-1β的生成量。

结果如图6和图7所示，实验组各组RAW264.7细胞的上清液样品经TNF-α、IL-1β细胞因子的ELISA试剂盒检测，得到各组RAW264.7细胞的上清液样品中的TNF-α、IL-1β含量，与模型组相比，多糖干预组的TNF-α、IL-1β表达量著性降低。本实验结果提示太子参活性低聚糖有可能通过抑制炎症因子的表达从而发挥抗炎活性。

实施例4太子参活性多糖对DSS诱导的小鼠肠炎模型的影响

本研究采用3％(w/v)DSS(硫酸葡聚糖钠，Mw 5,000)溶液诱导结肠炎小鼠模型。具体方法如下：

(1)从广东省医学实验动物中心购买6周龄的，体重为16～20g的雌性C57BL/6小鼠36只(合格证明：NO.44007200056309；许可证号：SCXK(粤)2013-0002)在SPF环境中适应性喂养一周后随机分为4组：空白组、模型组、美沙拉嗪组、太子参活性低聚糖组；

(2)第1至7日，除空白组外，其余组小鼠自由饮用3％(w/v)DSS溶液；第2至5日，空白对照组与模型组小鼠每日口服灌胃无菌水，美沙拉嗪组小鼠每日口服灌胃300mg/kg美沙拉嗪，太子参活性低聚糖组每日口服灌胃400mg/kg的太子参活性低聚糖(实施例1制得)；

(3)实验过程中，每日观察小鼠大便、活动、饮食等情况，记录小鼠体重，隔日更换DSS溶液。实验第6日将3％(w/v)DSS水溶液均换成无菌水，在无菌条件下收集各实验组小鼠粪便，每组粪便混匀后经液氮处理存放于-80℃冰箱中；

(4)提取实验组小鼠粪便DNA，通过16sRNA测序后，结合生物信息学的分析比较相关肠道菌群结构特征。

结果如图8所示：由图8可知，基于门水平上，各组共有的门类为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)、ε-变形菌(Epsilonbacteraeota)。拟杆菌门与厚壁菌门是肠道中的优势菌群，结肠炎模型中的厚壁菌门与拟杆菌门的丰度比值(F/B)偏高，而图8显示太子参活性低聚糖干预组的F/B有所降低具体数值，并且疣微菌门的相对丰度降低。说明通过太子参活性低聚糖可以干预模型小鼠肠道菌群的变化而具备抗炎效果，可有效的预防或治疗肠道菌群紊乱及便秘，或者因肠道菌群紊乱带来的炎性肠病等。

实施例5太子参活性低聚糖糖的·OH清除试验

取2mL不同浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg·mL^-1)的太子参活性低聚糖(实施例1制得)样品与2mL 9mM的FeSO₄，2mL 3mM的H₂O₂混合，摇匀，静置10min，再加入9mM的水杨酸乙醇溶液2mL、摇匀，37℃水浴30min后，4 000r/min离心10min，上清液于510nm波长处测定吸光值Ai，用2mL水代替样品测定吸光值A0，用2mL水代替水杨酸乙醇溶液测定吸光值Aj。太子参活性低聚糖糖的·OH的清除率＝[1－(Ai－Aj)/A0]×100％。以抗坏血酸(Vc组)为阳性对照。

结果如图9所示：由图9可知，太子参活性低聚糖浓度在0.5～2.5mg/mL浓度范围内，有较强的清除·OH自由基的能力，随着低聚糖浓度的增加，清除率也随之提高，具有浓度依赖性关系。Vc和太子参活性低聚糖清除·OH自由基的EC₅₀值依次为1.023mg/mL、1.891mg/mL，说明这种太子参活性低聚糖具有明显的清除·OH的作用。

实施例6太子参活性低聚糖的DPPH·清除试验

取2.0mL的不同浓度的太子参活性低聚糖溶液(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg·mL^-1)样品混合2.0mL 10％(w/w)的2，2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)乙醇溶液。混合液30℃水浴30min，用蒸馏水为对照品，在517nm波长处测定其吸光度。按下列公式计算DPPH·清除率，实验以抗坏血酸(Vc组)为阳性对照品重复3次。

DPPH·清除率(％)＝[A1－(A3－A2)]/A1×100％；

公式中，A1为2.0mL蒸馏水+2.0mL DPPH溶液的吸光度值；

A2为2.0mL样品+2.0mL蒸馏水溶液的吸光度值；

A3为2.0mL样品+2.0mL DPPH的吸光度值。

结果如图10所示，在实验浓度范围0.5～2.5mg/mL内，三种太子参活性多糖对DPPH·的清除活性均具有浓度依赖性关系。Vc和太子参活性低聚糖的EC₅₀值分别为0.203mg/mL、2.142mg/mL。

实施例7太子参活性低聚糖的O2-·的清除作用试验

取2mL不同浓度的太子参活性低聚糖溶液(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg·mL^-1)样品，加5ml Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液，37℃孵育10min后加入2ml(9mM)37℃预热的邻苯三酚溶液，迅速混匀，精确反应5min，加0.5mL质量浓度为37％的浓盐酸终止反应，于320nm波长下测定吸光度(A)，以水代替样品测定吸光度A0。太子参活性低聚糖的O2-·清除率＝(1－A/A0)×100％。以抗坏血酸(Vc组)为阳性对照。

结果如图11所示，我们的太子参活性低聚糖具有清除O2-·的能力，并且具有浓度依赖性，但其抑制作用整体来说不是很强。Vc和太子参活性低聚糖的EC₅₀值分别为0.191mg/mL、1.012mg/mL。

实施例8太子参活性低聚糖的还原能力试验

将抗坏血酸作为参照试剂。1mL不同浓度的太子参活性低聚糖溶液(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg·mL^-1)混合2.5mL磷酸盐缓冲液(pH 6.6)和1％(w/v)铁氰化钾溶液2.5mL。混合液50℃水浴20min，然后加入10％(v/v)三氯乙酸溶液2.5mL，混匀，置于离心机内4 000r/min离心10min，取2.5mL上清液，加入2.5mL蒸馏水和10％(w/v)三氯化铁溶液0.5mL，混匀后在700nm测定溶液吸光度。抗氧化剂提供电子，使Fe³⁺还原成Fe²⁺，Fe²⁺进一步和三氯化铁反应生成普鲁士蓝(Fe₄[Fe(CN)₆]₃)，通过测定700nm下吸光度的高低直接表明样品的还原力。

结果如图12所示，在0.5～2.5mg/mL的浓度范围内，太子参活性低聚糖样品具有随浓度增大吸光度值增大的趋势。多糖的还原能力说明其能作为一种良好的电子供体，这与其化学结构有关，一般认为多糖的还原性与醛基或者能够在水溶液中转化为醛基的异构体有关。

实施例9含有太子参活性六碳醛低聚糖的口服液

将实施例1中制备的太子参低聚糖加去离子水完全溶解后，调pH值至5.5，多糖含量为70～80mg/L，然后加入防腐剂山梨酸钾(加入量是0.2％(w/w))，充分溶解后，10000～20000r/min离心除去杂质，灌装、密封，得到含有太子参活性六碳醛低聚糖的口服液。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种太子参活性六碳醛低聚糖，其特征在于，结构如式I所示：

2.根据权利要求1所述的太子参活性六碳醛低聚糖，其特征在于：

所述的太子参活性六碳醛低聚糖的分子量为1476.6185Da，其单糖组成为：甘露糖、葡萄糖和半乳糖，三者摩尔比为0.076:0.814:2.600。

3.权利要求1所述的太子参活性六碳醛低聚糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)醇提：将太子参加入到5～8倍体积的浓度为体积百分比70～90％的乙醇溶液中，于60～90℃条件下进行提取，提取后，挥发去除乙醇，得到太子参药渣；

(2)水提：将太子参药渣加入到7～10倍体积的去离子水中，于70～100℃条件下进行提取，提取后浓缩、喷雾干燥，得到太子参水提物；

(3)醇沉：将太子参水提物加入到水中，超声溶解，得到太子参水提物溶液；然后将无水乙醇加入到太子参水提物溶液中使其终浓度为体积百分比70％～90％，于4℃条件下进行醇沉，离心，收集沉淀，得到粗糖聚物；

(4)酶-Sevage法除蛋白：将粗低聚糖溶于水中，然后加入蛋白酶进行酶解，得到酶解液；再向酶解液中加入Sevage试剂进一步除蛋白，离心、取上清液，浓缩，冷冻冻干，得到除蛋白后的粗糖聚物；

(5)分离纯化：将除蛋白后的粗糖聚物溶于水中，然后用DEAE-52阴离子交换柱进行分离纯化，收集分子量在1000Da至2000Da区间的产物，得到所述的太子参活性六碳醛低聚糖。

4.根据权利要求3所述的太子参活性六碳醛低聚糖的制备方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶；

步骤(4)中所述的蛋白酶的用量为按其在所述酶解体系的终浓度为1600～2000U/g添加计算；

步骤(4)中所述的Sevage试剂为正丁醇与氯仿按体积比1:4配比混合得到的试剂。

5.根据权利要求3所述的太子参活性六碳醛低聚糖的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的太子参为太子参饮片；

步骤(1)和(2)中所述的提取的时间为1～3h

步骤(1)和(2)中所述的提取的次数为1～3次；

步骤(3)中所述的醇沉的时间为24～36h；

步骤(3)中所述的离心的条件为：4000～5000rpm离心5～10min；

步骤(4)中所述的酶解的条件为：60℃酶解3～6h；

步骤(4)中所述的离心的条件为：4500～6000rpm离心2～10min。

6.权利要求1或2所述的太子参活性六碳醛低聚糖在制备抗炎或抗氧化产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的太子参活性六碳醛低聚糖在制备抗炎或抗氧化产品中的应用，其特征在于：

所述的抗炎产品包括抗炎药物、食品，保健品或化妆品；

所述的抗炎药物为防治炎症性肠病的药物，抗肿瘤药物，或防治肠道菌群紊乱及便秘的药物；

所述的抗氧化产品包括抗氧化药物、食品、保健品或化妆品；

所述的抗氧化化妆品为美白、修复以及延缓皮肤衰老的化妆品。

8.根据权利要求7所述的太子参活性六碳醛低聚糖在制备抗炎或抗氧化产品中的应用，其特征在于：

所述的产品还含有一种或多种食品载体或药学上可接受的载体；

所述的载体包括缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

9.一种含有太子参活性六碳醛低聚糖的口服液，其特征在于：包含权利要求1或2所述的太子参活性六碳醛低聚糖。

10.权利要求9所述的含有太子参活性六碳醛低聚糖的口服液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1或2所述的太子参活性六碳醛低聚糖溶解到去离子水中，然后调节pH值至5.5±0.2，再加入食用防腐剂，离心除去杂质，得到含有太子参活性六碳醛低聚糖的口服液；

所述的含有太子参活性六碳醛低聚糖的口服液中太子参活性六碳醛低聚糖的含量为70～80mg/L；

所述的食用防腐剂为山梨酸钾。

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