CN114805622A - 一种具有促进糖尿病足溃疡愈合的太子参均一多糖及其制备方法 - Google Patents

一种具有促进糖尿病足溃疡愈合的太子参均一多糖及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有促进糖尿病足溃疡愈合的太子参均一多糖及其制备方法，该太子参均一多糖促进糖尿病足溃疡愈合药效优于太子参粗多糖，其机制与提高足溃疡面VEGF的表达，促进溃疡面微血管的新生相关。

Description

一种具有促进糖尿病足溃疡愈合的太子参均一多糖及其制备 方法
技术领域
本发明属于一种具有促进糖尿病足溃疡愈合的太子参均一多糖及其制备方法。
背景技术
糖尿病足是糖尿病慢性致残性并发症，又叫糖尿病肢端坏疽；即糖尿病患者合并各种不同程度末梢血管病变和神经病变导致下肢感染、溃疡和/或深部组织破坏。目前，全球糖尿病患者高达4.25亿。糖尿病足部溃疡(DFU)，是糖尿病常见严重并发症，糖尿病患者患有血管病变、神经病变等并发症，如周围神经炎、周围血管病变和胶原异常，导致皮肤创伤难治性，往往发展为慢性难愈性溃疡。此即糖尿病患者残疾，非创伤性下肢截肢的主要原因。
太子参多糖是太子参中具有多种生物活性的一类生物大分子物质。已有研究表明，黄芪多糖、灵芝多糖、白及多糖等天然多糖水凝胶等能促进糖尿病足溃疡愈合，促进溃疡部位成纤维细胞的增殖。太子参多糖具有降血糖、改善糖耐量、促进胰岛素分泌、降血脂、保湿、抗衰老、皮肤组织修复等作用，同时可提供湿性愈合环境加速创面愈合。本发明人以大鼠糖尿病足溃疡创面愈合率为指标，应用柘参2号太子参提取的粗多糖进行治疗，证实了太子参多糖治疗大鼠糖尿病足溃疡的药效；进而对太子参抗糖尿病足溃疡活性多糖部位进行凝胶色谱分离纯化，波谱分析解析化学结构，发现了一种具有促进糖尿病足溃疡愈合药效且优于粗多糖的结构新颖的均一多糖，其机制与提高足溃疡面VEGF的表达，促进溃疡面微血管的新生相关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有促进糖尿病足溃疡愈合的太子参均一多糖及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种具有促进糖尿病足溃疡愈合的太子参均一多糖，其结构如下：
Figure 752255DEST_PATH_IMAGE001
其中x+y=34，n=86-89。
一种具有促进糖尿病足溃疡愈合的太子参均一多糖的制备方法，包括以下步骤：
（1） 柘参2号太子参粗多糖有效部位提取
将太子参干品，粉碎成粗粉，过40目筛。用8重量倍量的90wt%乙醇溶液连续回流提取3次，每次2小时，过滤，药渣加适量蒸馏水连续回流提取3次，每次2小时，过滤合并滤液，浓缩至适量，备用。
提取药液用Sevage法除去蛋白，药液：氯仿：正丁醇=25:5:1（v : v : v），振摇5min，静置分层，4000r/min离心5min，收集上清液。上清液用终浓度90wt%乙醇溶液沉淀，静置24h，离心5min，分离沉淀获得粗多糖，冷冻干燥备用。
采用40wt%的乙醇溶液沉降分级，获得分子量在50～200 kDa范围的多糖，命名为PF40，经药理实验具有治疗大鼠糖尿病足溃疡的药效，是抗DFU有效部位。
（2）分离纯化
称取样品PF40 5-10g，溶解于100-200 mL蒸馏水中，80 ℃水浴助溶，12000r/min离心15min，取上清液；沉淀加纯水50mL，80 ℃水浴加热10min，12000r/min，15min，取上清液。
合并上清液，上DEAE-Cellulose 52型层析柱，以0.8 mL/min流速，用1500mL H2O洗脱，再用0.2mol/L NaCl溶液洗脱（0.8 mL/min，15 min/管），经苯酚-硫酸法每隔1管检测多糖含量；合并收集80-94管，80 ℃水浴真空旋转蒸发浓缩至30 mL，用排阻为3500 Da的透析袋透析24h，冻干后命名为0.2M-1。
称取5g 0.2M-1，溶解于150mL 0.2mol/L NaCl溶液中，30℃加热溶解，12000r/min离心15min。取上清液，上Sephacryl S-400柱，用0.2mol/L NaCl溶液洗脱（0.3mL/min，15min/管），经苯酚-硫酸法每隔1管检测多糖含量，收集73-75管；经真空旋转蒸发浓缩至30mL，用排阻为3500 Da的透析袋透析24h。冻干后命名为0.2M-1-3。
称取3g 0.2M-1-3，溶解于60mL 0.2mol/L NaCl溶液中，30℃加热溶解，12000r/min离心15min。取上清液，上Sephacryl S-300柱，用0.2mol/L NaCl溶液洗脱（0.3mL/min，15min/管），经苯酚-硫酸法每隔1管检测多糖含量，收集45-60管；经真空旋转蒸发浓缩至30mL，用排阻为3500 Da的透析袋透析24h。冻干后命名为0.2M-1-3-1，即为所述的太子参均一多糖。
本发明的优点在于：
本发明涉及的是从中药太子参抗糖尿病足溃疡多糖有效部位中分离得到的1个结构新颖的均一多糖的制备及其化学结构，其能提高糖尿病大鼠足溃疡创面组织VEGF mRNA的表达，促进溃疡面微血管的新生，从而促进大鼠糖尿病足溃疡创面愈合。其促进大鼠糖尿病足溃疡创面愈合的效果优于太子参粗多糖，可为将来在开发抗糖尿病足溃疡药物中的应用提供依据。
附图说明
图1为0.2M-1-3-1多糖HPGPC图；
图2为0.2M-1-3-1多糖IR分析图；
图3为0.2M-1-3-1多糖的单糖组成分析；
图4为0.2M-1-3-1多糖核磁共振1H谱；
图5为0.2M-1-3-1多糖核磁共振13C谱；
图6为均一多糖0.2M-1-3-1的结构式（x+y=34），n=86-89。
具体实施方式
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本发明的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
一、太子参均一多糖制备及结构表征
1. 柘参2号太子参粗多糖有效部位提取
将太子参干品，粉碎成粗粉，过40目筛。用8重量倍量的90wt%乙醇溶液连续回流提取3次，每次2小时，过滤，药渣加适量蒸馏水连续回流提取3次，每次2小时，过滤合并滤液，浓缩至适量，备用。
提取药液用Sevage法除去蛋白，药液：氯仿：正丁醇=25:5:1（v : v : v），振摇5min，静置分层，4000r/min离心5min，收集上清液。上清液用终浓度90wt%乙醇溶液沉淀，静置24h，离心5min，分离沉淀获得粗多糖，冷冻干燥备用。
采用40wt%的乙醇溶液沉降分级，获得分子量在50～200 kDa范围的多糖，命名为PF40，经药理实验具有治疗大鼠糖尿病足溃疡的药效，是抗DFU有效部位。
分离纯化
称取样品PF40 10g，溶解于200 mL蒸馏水中，80 ℃水浴助溶，12000r/min 离心15min，取上清液；沉淀加纯水50mL，80 ℃水浴加热10min，12000r/min，15min，取上清液。
合并上清液，上DEAE-Cellulose 52型层析柱，以0.8 mL/min流速，用1500mL H2O洗脱，再用0.2mol/L NaCl溶液洗脱（0.8 mL/min，15 min/管），经苯酚-硫酸法每隔1管检测多糖含量；合并收集80-94管，80 ℃水浴真空旋转蒸发浓缩至30 mL，用排阻为3500 Da的透析袋透析24h，冻干后命名为0.2M-1。
称取5g 0.2M-1，溶解于150mL 0.2mol/L NaCl溶液中，30℃加热溶解，12000r/min离心15min。取上清液，上Sephacryl S-400柱，用0.2mol/L NaCl溶液洗脱（0.3mL/min，15min/管），经苯酚-硫酸法每隔1管检测多糖含量，收集73-75管；经真空旋转蒸发浓缩至30mL，用排阻为3500 Da的透析袋透析24h。冻干后命名为0.2M-1-3。
称取3g 0.2M-1-3，溶解于60mL 0.2mol/L NaCl溶液中，30℃加热溶解，12000r/min离心15min。取上清液，上Sephacryl S-300柱，用0.2mol/L NaCl溶液洗脱（0.3mL/min，15min/管），经苯酚-硫酸法每隔1管检测多糖含量，收集45-60管；经真空旋转蒸发浓缩至30mL，用排阻为3500 Da的透析袋透析24h。冻干后命名为0.2M-1-3-1。
均一多糖化学结构表征
高效凝胶色谱法（HPGPC）分析表明0.2M-1-3-1多糖为均一多糖组分(图1)，根据标准葡聚糖校正的标准曲线，测得分子量为7.4×104Da，比旋光度[α]D 25+172.31º(c 0.505，H2O)。紫外光谱显示280mm处无明显吸收，表明该多糖不含肽或蛋白质。
红外光谱显示了典型的多糖类吸收特征峰，在3423.49、2930.25、1415.30、1021.35 cm-1的强吸收峰分别来自于羟基-OH、C-H、环外C-O及糖环内C-O的伸缩振动；1645.91 cm-1为结合水-OH的吸收峰；854.80 cm-1处吸收峰它是吡喃环式葡萄糖异头C-H的特征吸收峰，表明多糖中的葡萄糖残基具有α-异头构型。1730cm-1 无糖醛酸的吸收峰，提示0.2M-1-3-1可能为中性糖(图2)。
通过液相单糖组成分析，0.2M-1-3-1多糖不含糖醛酸，是由D-葡萄糖聚合而成的中性糖。该多糖对碘呈阳性反应，呈蓝色，说明可能具有类似淀粉的化学结构，这与其具有较大的正比旋光度一致(图3)。
0.2M-1-3-1多糖完全甲基化后经完全水解后，转为部分甲基化的糖醇乙酸酯，用GC-MS分析。甲基化的结果表明该多糖含有非还原末端（T-）、1,4-及1,4,6-连接三种葡萄糖连接方式。T-和1,4,6-连接葡萄糖的存在表明该糖具有分支。在各种连接方式中，1,4-连接残基比例达94,1%，1,4,6-连接有3.8%，这说明该糖可能以1,4-连接为主链，部分主链的6位发生取代，形成分支(表1)。
表1. 0.2M-1-3-1多糖甲基化结果
Figure DEST_PATH_IMAGE002
根据葡聚糖以往的NMR研究报道，α-吡喃型糖残基在氢谱中的异头氢的化学位移＞5ppm，碳谱中的异头碳的化学位移＜103ppm，反之β-吡喃型糖残基在氢谱中异头氢的化学位移＜5ppm，碳谱中的异头碳的化学位移＞103ppm；在0.2M-1-3-1的1HNMR谱中，有两组异头氢信号：δ5.46和5.02ppm，表明糖残基呈α异头构型，前者较强，可能对应1,4-连接葡萄糖，而后者可能对应1,4,6-连接的葡萄糖(图4、图5)。
在0.2M-1-3-1的13CNMR谱中，异头碳区显示两个信号δ100.87和98.81ppm，其化学位移均＜δ103ppm，说明该多糖中的糖残基异头碳为α型，进一步验证了IR和1HNMR的结果推论。δ100.87ppm的信号归属于含量较高的1,4-连接葡萄糖，δ 98.81ppm的归属于1,4,6-连接葡萄糖。在DEPT135谱中，δ 61.65ppm处有组倒峰，归属于T-和1,4-连接葡萄糖的C6。其他13C NMR和1H信号归属见表2。
表2. 0.2M-1-3-1多糖13C和1H谱化学位移
Figure 325187DEST_PATH_IMAGE003
以上表征结果显示，对应的均一多糖中n=88。
二、药理学实验（太子参均一多糖对Ins-1细胞分泌胰岛素的影响）
1. 大鼠糖尿病足溃疡模型的制备
4周龄Wistar雄性大鼠40只，体重180±20g，清洁级，适应性饲养3天后用于实验。大鼠禁食不禁水12h后，称重，尾静脉采血测大鼠基础血糖。随机选取32只大鼠，以40 mg/kg的剂量，给予1%STZ溶液左下腹注射，制备大鼠高血糖模型。剩余8只作为空白对照组，给予等剂量0.1mmol/Ｌ枸橼酸钠缓冲溶液腹腔注射。注射72h后 连续3天监测空腹血糖，血糖值在10-25mmol/L为高血糖模型成功大鼠。
采用腹腔注射10%水合氯醛溶液0.3mL/100g麻醉大鼠后，于大鼠的足背皮肤，用印章作一3mm×7mm矩形标记，切除全层皮肤，75%酒精棉球消毒创面，形成缺损性足部皮肤溃疡大鼠模型。
动物分组及给药
40只Wistar雄性大鼠分为5组，其中空白对照组8只，其余32只高血糖模型大鼠随机分为模型组、金因肽外用阳性组、PF40多糖外用组、0.2M-1-3-1均一多糖外用组，每组8只。
（1）空白对照组大鼠给予等体积生理盐水外用。
（2）模型组大鼠给予等体积生理盐水外用。
（3）金因肽外用阳性组大鼠给予重组人表皮细胞生长因子外用溶液局部均匀喷湿创面，每日一次，约4000IU/10
Figure DEST_PATH_IMAGE004
10cm2。
（4）PF40多糖外用组大鼠足溃疡创面给予0.20 g/mL浓度的PF40外涂，每次0.5mL，每天2次，连续治疗14天。
（5）太子参均一多糖外用组大鼠足溃疡创面给予0.20 g/mL浓度的0.2M-1-3-1外涂，每次0.5 mL，每天2次，连续治疗14天。
大鼠糖尿病足溃疡创面愈合结果
造足部溃疡模型后，各组大鼠溃疡创面鲜红，可见明显的炎性脓液渗出。造模后第7天，空白组创面结痂脱落，伤痕收缩红活；模型组创面结成黄褐色痂，且创面仍有稀薄脓性分泌物；阳性组、多糖组和均一多糖组创面结成红褐色痂，创面收缩，均一多糖组创面愈合率高于阳性组和多糖组。造足部溃疡模型后第14天，空白组创面全部愈合，足部留有淡淡的伤痕；阳性组、多糖组和均一多糖组创面大多愈合，创面有干燥皮屑脱落；模型组创面大都留有红褐色结痂。各组愈合率见表3。
表3 各组大鼠给药后创面愈合率测定结果(%)
Figure 963979DEST_PATH_IMAGE005
注：*P＜0.05，与模型组相比有统计学意义
**P＜0.01，与模型组相比有显著差异
3. 大鼠足溃疡创面组织中血管生长因子（VEGF）基因的表达
取50mg足溃疡部皮肤组织，液氮预冷研钵后将足溃疡组织研至粉末状。收集粉末至离心管，加入 1mLTrizol Reagent，混匀使足溃疡组织裂解充分，放置5min完成核酸蛋白复合物分离。吸入氯仿200μL，摇匀15s，放置2 min。4℃，12000rpm离心10min，上层无色液体(RNA)转移至新的RNA-Free 离心管中。加入等体积70%乙醇(无RNase水配制)，颠倒混匀。溶液加入吸附柱中，12000 rpm离心20s。弃去收集管中液体。依次加入700μL Buffer RW1、500μL RW2、500μL RW2除蛋白，1200rpm离心2min，吸附柱室温晾干后，加入40μL RNase-FreeWater，放置1min以充分溶解，12000 rpm离心1min后， 得RNA溶解液，-80℃存用。
qPCR 法检测对各组大鼠创面组织中 VEGF mRNA的表达，以 GAPDH 为内参基因，采用 2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。VEGF是增进伤口愈合的关键生长因子，给予均一多糖后第14天，给药各组大鼠足溃疡创面局部VEGF mRNA表达量高于模型组表达，p<0.01，差异具有统计学意义。太子参均一多糖可能通过提高糖尿病大鼠足溃疡创面组织VEGF mRNA的表达，从而促进大鼠足溃疡创面的愈合。结果见表4。
表4 各组大鼠给药后创面组织VEGF mRNA表达（，n=8）
Figure DEST_PATH_IMAGE006
注：与模型组比较* P＜0.05 ，**P＜0.01
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种具有促进糖尿病足溃疡愈合的太子参均一多糖，其特征在于，其结构如下：
Figure 11761DEST_PATH_IMAGE002
其中x+y=34，n=86-89。
2.根据权利要求1所述的一种具有促进糖尿病足溃疡愈合的太子参均一多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）柘参2号太子参粗多糖有效部位提取
将太子参干品，粉碎成粗粉，过40目筛，用8重量倍量的90wt%乙醇溶液连续回流提取3次，每次2小时，过滤，药渣加适量蒸馏水连续回流提取3次，每次2小时，过滤合并滤液，浓缩至适量，备用；
提取药液用Sevage法除去蛋白，药液：氯仿：正丁醇=25:5:1体积比，振摇5min，静置分层，4000r/min离心5min，收集上清液，上清液用终浓度90wt%乙醇溶液沉淀，静置24h，离心5min，分离沉淀获得粗多糖，冷冻干燥备用；
采用40wt%的乙醇溶液沉降分级，获得分子量在50～200 kDa范围的多糖，命名为PF40；
（2）分离纯化
称取样品PF40 5-10g，溶解于100-200 mL蒸馏水中，80 ℃水浴助溶，12000r/min 离心15min，取上清液；沉淀加纯水50mL，80 ℃水浴加热10min，12000r/min，15min，取上清液；
合并上清液，上DEAE-Cellulose 52型层析柱，以0.8 mL/min流速，用1500mL H2O洗脱，再用0.2mol/L NaCl溶液洗脱，流速为0.8 mL/min，以15 min/管收集含NaCl的洗脱液，经苯酚-硫酸法每隔1管检测多糖含量；合并收集80-94管，80 ℃水浴真空旋转蒸发浓缩至30mL，用排阻为3500 Da的透析袋透析24h，冻干后命名为0.2M-1；
称取5g 0.2M-1，溶解于150mL 0.2mol/L NaCl溶液中，30℃加热溶解，12000r/min离心15min，取上清液，上Sephacryl S-400柱，用0.2mol/L NaCl溶液洗脱，流速为0.3mL/min，15min/管收集洗脱液，经苯酚-硫酸法每隔1管检测多糖含量，收集73-75管；经真空旋转蒸发浓缩至30 mL，用排阻为3500 Da的透析袋透析24h，冻干后命名为0.2M-1-3；
称取3g 0.2M-1-3，溶解于60mL 0.2mol/L NaCl溶液中，30℃加热溶解，12000r/min离心15min，取上清液，上Sephacryl S-300柱，用0.2mol/L NaCl溶液洗脱，流速为0.3mL/min，15min/管收集洗脱液，经苯酚-硫酸法每隔1管检测多糖含量，收集45-60管；经真空旋转蒸发浓缩至30 mL，用排阻为3500 Da的透析袋透析24h，冻干后得到所述的太子参均一多糖。
3.根据权利要求1所述的太子参均一多糖在制备抗糖尿病足溃疡药物中的应用。
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