JP6034293B2 - イカリソウの多糖、その画分、及びワクチンアジュバントとしてのその使用 - Google Patents
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Description
1)イカリソウの葉を用意し、水を添加し、浸漬し、水抽出を行なって水抽出物溶液を取得し(水抽出の時間は1〜72時間であり、この時間は抽出温度に依存する。室温では24〜48時間が好ましく、本発明の一実施態様では48時間である);
2)ステップ1)で得られたその水抽出物溶液に対してエタノール沈殿を行ない、沈殿部を採取し、水を添加して溶かし、遠心分離し、上清を採取し、透析を実行し;
3)透析によって得られた透析物を採取し、凍結乾燥させてイカリソウの多糖を得る、
方法である。
イカリソウの葉を用意し、蒸留水を添加し、撹拌を続けながら浸漬し;濾過し、濾液を遠心分離し;抽出されたイカリソウの葉を用いて同じ条件下で2回目の抽出を実行し;その2回の抽出による水抽出物溶液を1つにまとめ、減圧下で濃縮し、次いで3〜4倍の体積のエタノールを添加してエタノール沈殿を実行し;そのエタノール沈殿による溶液を遠心分離し、沈殿部に水を添加して撹拌しながら溶かし、遠心分離し、沈殿物に対して同じ操作を2回実行し;可溶性の上清を1つにまとめ、分子量カットオフが1,000超の透析バッグの中に入れ、水で透析を実行し;得られた透析物を減圧下で濃縮し、小さな瓶の中に入れ、凍結乾燥を実行してイカリソウの多糖を得る。
イカリソウの葉を用意し、石油エーテルを添加して浸漬し;濾過し、減圧下で濾液から抽出物を回収し;抽出されたイカリソウの葉を自然揮発によって乾燥させ、蒸留水を添加し、撹拌を続けながら浸漬し;次いで濾過し、濾液を遠心分離し;抽出されたイカリソウの葉を用いて同じ条件下で2回目の抽出を実行し;その2回の抽出による水抽出物溶液を1つにまとめ、減圧下で濃縮し、次いで3〜4倍の体積のエタノールを添加してエタノール沈殿を実行し;そのエタノール沈殿による溶液を遠心分離し、沈殿部に水を添加して撹拌しながら溶かし、遠心分離し、沈殿物に対して同じ操作を2回実行し;可溶性の上清を1つにまとめ、分子量カットオフが1,000超の透析バッグの中に入れ、水で透析を実行し;得られた透析物を減圧下で濃縮し、小さな瓶の中に入れ、凍結乾燥を実行してイカリソウの多糖を得る。
(1)糖類の含量が(グルコースで計算して)25〜45%であり、グルクロン酸の含量が(ガラクトース-ウロン酸で計算して)5〜20%であり;そして/または、
(2)図1と図2に示した特徴を有する、
ことを特徴とする。
ラムノース、フコース、アラビノース、キシロース、マンノース、グルコース、ガラクトース、ガラクトース-ウロン酸を含んでいて;分子量が6,000〜20,000である、
ことを特徴とする。
(1)糖類の含量が(グルコースで計算して)45〜65%であり、グルクロン酸の含量が(ガラクトース-ウロン酸で計算して)5〜15%であり;そして/または、
(2)単糖組成が、ラムノース、フコース、アラビノース、キシロース、マンノース、グルコース、ガラクトース、ガラクトース-ウロン酸であり、ラムノース:フコース:アラビノース:キシロース:マンノース:グルコース:ガラクトースのモル比が1.00:0.33:4.44:0.38:0.64:0.87:5.26である、
ことを特徴とする。
イカリソウの葉1kgを石油エーテルに添加し、室温にて24時間にわたって浸漬し、濾過した。減圧下で30〜35℃にて濾液から抽出物を回収した。石油エーテルで抽出したイカリソウの葉を自然揮発によって乾燥させ、15リットルの蒸留水を添加し、撹拌を続けながら室温(20〜30℃)で48時間にわたって浸漬し;続いて濾過し、濾液を10分間遠心分離し(回転速度は3000回転/分であった)、抽出されたイカリソウの葉に同じ条件下で2回目の抽出を実施した。その2回の抽出による水抽出物溶液を1つにまとめ、減圧下で50〜55℃にて濃縮して1,000mlにした。その後、95%エタノールを3回に分けて添加し(3000ml)、48〜72時間にわたってエタノール沈殿を実行した。エタノール沈殿による溶液を10分間遠心分離した(回転速度は3000回転/分であった)。沈殿部を1,000mlの水に添加し、撹拌して溶かし、遠心分離した。得られた沈殿物に同じ操作を2回実施した。可溶性の上清を1つにまとめ、透析バッグ(分子量カットオフが1,000超)の中に入れた。水道水を用いて透析を48時間実行し、次いで蒸留水を用いて透析を24時間実行した。透析物を減圧下で50〜55℃にて濃縮することにより約200mlにして小さな瓶の中に入れ、凍結乾燥させることで、茶色の粉末、すなわちイカリソウの全多糖を得た(収率は0.74%であった)。
イカリソウの葉1kgを室温の蒸留水15リットルに添加し、撹拌を続けながら室温(20〜30℃)で48時間にわたって浸漬し;次いで濾過した。濾液を10分間遠心分離した(回転速度は3000回転/分であった)。抽出されたイカリソウの葉に同じ条件下で2回目の抽出を実施した。その2回の抽出による水抽出物溶液を1つにまとめ、減圧下で50〜55℃にて濃縮して1,000mlにした。その後、95%エタノールを3回に分けて添加し(3000ml)、48〜72時間にわたってエタノール沈殿を実行した。エタノール沈殿による溶液を10分間遠心分離した(回転速度は3000回転/分であった)。沈殿部を1,000mlの水に添加し、撹拌して溶かし、遠心分離した。得られた沈殿物に同じ操作を2回実施した。可溶性の上清を1つにまとめ、透析バッグ(分子量カットオフが1,000超)の中に入れた。水道水を用いて透析を48時間実行し、次いで蒸留水を用いて透析を24時間実行した。透析物を減圧下で50〜55℃にて濃縮することにより約200mlにして小さな瓶の中に入れ、凍結乾燥させることで、茶色の粉末、すなわちイカリソウの全多糖を得た(収率は0.81%であった)。
イカリソウの葉1kgを55〜60℃の蒸留水15リットルに添加し、撹拌を続けながら48時間にわたって浸漬し;次いで濾過した。濾液を10分間遠心分離した(回転速度は3000回転/分であった)。抽出されたイカリソウの葉に同じ条件下で2回目の抽出を実施した。その2回の抽出による水抽出物溶液を1つにまとめ、減圧下で50〜55℃にて濃縮して1,000mlにした。その後、95%エタノールを3回に分けて添加し(3000ml)、48〜72時間にわたってエタノール沈殿を実行した。エタノール沈殿による溶液を10分間遠心分離した(回転速度は3000回転/分であった)。沈殿部を1,000mlの水に添加し、撹拌して溶かし、遠心分離した。得られた沈殿物に同じ操作を2回実施した。可溶性の上清を1つにまとめ、透析バッグ(分子量カットオフが1,000超)の中に入れた。水道水を用いて透析を48時間実行し、次いで蒸留水を用いて透析を24時間実行した。透析物を減圧下で50〜55℃にて濃縮することにより約200mlにして小さな瓶の中に入れ、凍結乾燥させることで、茶色の粉末、すなわちイカリソウの全多糖を得た(収率は1.9%であった)。
室温での抽出によって得た(実施例1で調製した)1gのイカリソウの全多糖YYH-Gを50mlの蒸留水に添加して溶かした。得られた溶液をDEAE-セルロース・カラム(φ8cm×35cm)に装填し、水、0.25モル/lのNaHCO3、0.5モル/lのNaHCO3、0.1モル/lのNaOHの順番で連続的に溶離させた。流速は1ml/分であり、回収量は10ml/チューブであった。多糖画分YYH-G0(490nmの吸収、H2O)、YYH-G1(490nmの吸収、0.25モル/lのNaHCO3)、YYH-G2(490nmの吸収、0.5モル/lのNaHCO3)、YYH-G3(490nmの吸収、0.1モル/lのNaOH)、非糖画分YYH-G4(280nmの吸収、0.25モル/lのNaHCO3)、YYH-G5(280nmの吸収、0.5モル/lのNaHCO3)、YYH-G6(280nmの吸収、0.1モル/lのNaOH)が順番に得られた。
イカリソウの全多糖YYH-Gを実施例1〜3で調製し、酸性多糖画分YYH-G1と非糖画分YYH-G4を実施例4で調製した。
(実施例1で調製した)室温で抽出したイカリソウの全多糖YYH-Gをアジュバントとして使用した。オボアルブミン(OVA)を抗原として使用した。そのアジュバントとOVAを1つにまとめ、マウスに筋肉内注射し、生じた抗体力価を測定した。具体的な実験方法は以下の通りであった。
(実施例1で調製した)室温で抽出したイカリソウの全多糖YYH-Gに対してDEAE-セルロース・カラム・クロマトグラフィを実施して酸性多糖画分YYH-G1と非糖画分YYH-G4を得た。YYH-G1とYYH-G4を別々にアジュバントとして使用した。オボアルブミン(OVA)を抗原として使用した。そのアジュバントと抗原を1つにまとめ、マウスに筋肉内注射し、生じた抗体力価を測定した。具体的な実験方法は実施例6と同じであった。
(実施例3で調製した)55〜60℃で抽出したイカリソウの全多糖YYH-GをDEAE-セルロース・カラム・クロマトグラフィによって分離し、酸性多糖画分YYH-G1と非糖画分YYH-G4を得た。抗原としてH1N1ウイルスのライセートを用いて両方の糖画分の活性を決定した。
(実施例2で調製した)室温で抽出したイカリソウの全多糖YYH-GをDEAE-セルロース・カラム・クロマトグラフィによって分離し、酸性多糖画分YYH-G1と非糖画分YYH-G4を得た。抗原としてH1N1ウイルスのライセートを用いて両方の糖画分の活性を決定した。具体的な実験法は、実施例8と同じであった。その結果から、室温で抽出したYYH-G1とYYH-G4をH1N1抗原と組み合わせると、最初の免疫化の後に比較的大きな力価の抗体が産生することがかわった(図12)。
Claims (14)
2)ステップ1)で得られた水抽出物溶液をエタノール沈殿に供し、沈殿部を採取し、水を添加して溶かし、遠心分離し、上清を採取し、透析を実行し;
3)透析によって得られた透析物を採取し、凍結乾燥させてイカリソウの多糖を得る、方法によって得られる、イカリソウの多糖を含む抽出物であって、糖類の含量がグルコースで計算して25〜45%であり、グルクロン酸の含量がガラクトース-ウロン酸で計算して5〜20%である、抽出物。
(1)ステップ1)イカリソウの葉が、抽出されていないイカリソウの葉、または有機溶媒(石油、酢酸エチル、クロロホルム、エチルエーテル、n-ヘキサン、シクロ-ヘキサン、n-ブタノール、エタノール、メタノールなど)を用いた抽出後に得られる残りの葉である;
(2)ステップ1)では、水が蒸留水または脱イオン水である;
(3)ステップ1)では、水抽出の温度が20〜60℃である;
(4)ステップ1)では、抽出後に得られるイカリソウの葉に対して同じ条件下で抽出が1回以上実行され、水抽出物溶液が混合される;
(5)ステップ1)では、水の量が、イカリソウの量(l/kg)の5〜20倍である;
(6)ステップ1)では、抽出の間、撹拌される;
(7)ステップ1)では、得られた水抽出物溶液が減圧下で50℃〜55℃で濃縮され、濃縮された水抽出物溶液が得られる;
(8)ステップ2)では、エタノール沈殿の条件が、エタノール沈殿の後にエタノールの最終濃度が60〜80%になるというものであり;エタノール沈殿の時間は12時間超である;
(9)ステップ2)では、エタノール沈殿の後の遠心分離によって得られた沈殿物に対してさらに1回以上エタノール沈殿が実施され、上清が混合される;
(10)ステップ2)では、透析に用いる透析バッグが、分子量カットオフが1,000超である;
(11)ステップ2)では、水道水および/または蒸留水を用いて透析が行われる;
(12)ステップ2)では、透析が1回以上実施される;
(13)ステップ3)では、得られた透析物が減圧下で50℃〜55℃にて濃縮され、凍結乾燥される、
のうちの任意の1つ以上を特徴とする、請求項1に記載の抽出物。
ステップ2)では、エタノール沈殿の条件が、エタノール沈殿の後にエタノールの最終濃度が70〜75%になり、エタノール沈殿の時間が48〜72時間である、
ことを特徴とする、請求項2に記載の抽出物。
硫酸-フェノール着色によって490nmの波長に吸収を有する画分を取得する、
を含むイカリソウの酸性多糖画分を調製する方法。
ラムノース、フコース、アラビノース、キシロース、マンノース、グルコース、ガラクトース、及びガラクトース-ウロン酸を含み
分子量が6,000〜20,000であり、
、イカリソウの酸性多糖画分。
グルクロン酸の含量がガラクトース-ウロン酸で計算して5〜15%である、請求項5に記載のイカリソウの酸性多糖画分。
280nmの波長に吸収を有する画分を取得する、
を含む、イカリソウの非糖画分を調製する方法。
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