WO2014173057A1 - 一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

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WO2014173057A1
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polysaccharide protein
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polysaccharide
preparation
sophora
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徐无为
陆正鑫
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启东盖天力药业有限公司
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to a polysaccharide protein of cockroach and a preparation method and use thereof. Background technique
  • Decayed wood rot fungus This product is bitter, spicy, and non-toxic. It has the effects of "governing the wind”, “breaking the blood” and “Yi Li”. It is clinically used to treat various diseases. Due to the scarcity of old Chinese cockroaches, the resources of medicinal herbs are depleted, and it is difficult to meet the demand for clinical drugs, and it is even unable to meet the needs of industrial production. In order to solve the resource problems of the ear, Qidong Gaitian Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the extract has been developed into a raw material such as ⁇ ⁇ granules and ⁇ ⁇ granules, which meets the demand for clinical use.
  • the present invention provides a scorpion polysaccharide protein, a preparation method thereof and use thereof.
  • the present invention provides a polysaccharide protein (also referred to as “the ear polysaccharide protein of the present invention”), wherein the monosaccharide composition of the polysaccharide protein is arabinose, galactose, glucose, xylose and mannose, Quality The ratio is 7.4: 4.5: 2.7: 9.4: 1.9.
  • the weight average molecular weight proteoglycans 7.0x l0 5 -2.0x l0 6 Da, preferably 1.86x l0 6 Da.
  • the method for preparing the polysaccharide protein comprises the following steps:
  • the aqueous solution of the fungus extract (for example, eucalyptus) at a concentration of 2%-20% (mass/volume), preferably 8% (mass/volume), is subjected to Sevage removal of free protein to collect sugar.
  • the extract of the ear fungus includes an aqueous extract of the ear fungus, especially hot water.
  • the aqueous extract of the ear fungus can be used as it is or after concentration.
  • the concentrated water extract of the ear fungus (i.e., the ear cream) or the water extract of the unconcentrated ear fungus can be prepared or purchased by a conventional method.
  • the method for preparing the polysaccharide protein further comprises the step of dialysis and desalting of the product eluted by the NaCl solution.
  • the method for preparing the polysaccharide protein further comprises the step of separating and purifying the product after dialysis and desalting using a Sepharose CL-6B agarose gel column.
  • the present invention provides a method for preparing the above polysaccharide protein, the preparation method comprising the following steps:
  • the aqueous solution of the fungus extract (for example, eucalyptus) at a concentration of 2%-20% (mass/volume), preferably 8% (mass/volume), is subjected to Sevage removal of free protein to collect sugar.
  • the preparation method further comprises the step of dialysis and desalting of the product eluted by the NaCl solution.
  • the preparation method further comprises the step of separating and purifying the dialysis and desalted product using a Sepharose CL-6B agarose gel column.
  • the preparation method comprises the following steps:
  • step (3) Weighing the appropriate amount of the precipitate obtained in step (2), dissolving it in 150 ml of distilled water, filtering, and concentrating under reduced pressure to a volume of 50 ml; dialysis collecting the inner part of the bag, and
  • step (3) The inner part of the bag collected in step (3) was separated by DEAE-52 ion exchange column chromatography, eluted with 0.5 Mol/L NaCl solution, and the eluted part was concentrated and dialyzed to remove salt.
  • the dialysis process was Dialysis water for three days, distilled water for two days;
  • step (4) The product obtained in the step (4) was separated and purified using a Sepharose CL-6B agarose gel column until it was detected as a pure product by high performance liquid chromatography.
  • the present invention provides the use of the above polysaccharide protein for the preparation of a medicament for treating a tumor.
  • the polysaccharide protein of the present invention has remarkable antitumor activity and is expected to be an active component of a novel antitumor drug.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an agaric acid protein and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the composition comprises 0.01% to 99.5% by weight of a polysaccharide protein as an active ingredient, and
  • the auricular polysaccharide protein contains 90% by weight to 100% by weight of the auricular polysaccharide protein according to the first aspect of the present invention, based on the total weight of the polysaccharide protein.
  • the pharmaceutical composition preferably contains 0.1% to 99.9% by weight of the polysaccharide protein as an active ingredient, preferably 0.1% to 99.5% by weight of the polysaccharide protein as an active ingredient, more preferably a weight ratio. It is 0.5%-95% active ingredient.
  • the pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of the polysaccharide protein of the present invention, has significant antitumor efficacy.
  • the mixture of the polysaccharide protein of the ear and the pharmaceutically acceptable carrier, diluent and the like can be orally administered in the form of a tablet, capsule, granule, powder or syrup or non-oral in the form of an injection. Dosing.
  • the above formulations can be prepared by conventional pharmaceutical methods.
  • useful pharmaceutically acceptable carriers include excipients (e.g., saccharide derivatives such as lactose, sucrose, glucose, mannitol, and sorbitol; starch derivatives such as corn starch, potato starch, dextrin, and carboxymethyl Starch; cellulose derivative Such as crystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose, calcium carboxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose; gum arabic; dextran; silicate derivatives such as magnesium aluminum metasilicate; Derivatives such as calcium phosphate; carbonate derivatives such as calcium carbonate; sulfate derivatives such as calcium sulfate, etc., binders (such as gelatin, polyvinylpyrrolidone and polyethylene glycol), disintegrants (such as fibers) Derivatives such as sodium carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, lubricants (eg talc, calcium stearate, magnesium stearate, cetyl,
  • a safe and effective amount of the polysaccharide protein of the present invention is administered to a mammal, wherein the safe and effective amount is usually at least about 1 microgram per day, and in most cases no more than about 10 mg per kilogram of body weight. .
  • the dosage is from about 1 microgram per day to about 3 milligrams per kilogram of body weight.
  • specific doses should also take into account factors such as the route of administration, the health of the patient, etc., which are within the skill of the skilled physician.
  • polysaccharide protein of the present invention may be used as a single drug or in combination with other drugs.
  • Preferred combinations include: in combination with surgery, in combination with one or more western medicines, in combination with Chinese herbal medicines, in combination with radiation therapy.
  • the administration route of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and includes, but is not limited to, oral administration, injection administration, intratumoral administration, implantation administration, intraluminal administration, anal administration, transdermal administration.
  • Administration, internal and external application; preferred injection administration includes: intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intraluminal injection, intratumoral administration.
  • the present invention has at least the following beneficial effects:
  • the present invention uses a system of water extraction, alcohol precipitation, deproteinization, dialysis small molecule, ion exchange chromatography and gel molecular size exclusion chromatography to obtain a uniform polysaccharide protein component from the fungus of the fungus, and Comprehensive application of molecular weight analysis, monosaccharide composition and amino acid composition analysis, infrared spectrum analysis and methylation analysis, etc., confirmed the chemical structure characteristics, and defined its weight average molecular weight, monosaccharide composition and ratio, amino acid composition and The ratio, and the way in which the sugar residues are attached.
  • Such a polysaccharide component with clear structure and uniform molecular weight is an ideal molecular model for studying the active constituents and biological activities of polysaccharides from Auricularia auricula, in order to elucidate the immunomodulatory and antitumor active components of Auricularia auricula polysaccharides and their effects.
  • the mechanism lays a foundation, and the present invention will provide a scientific basis for the further development and utilization of the fungus and the quality control of related preparations.
  • Figure 1 is a flow chart of the alcohol precipitation of the ear extract of the ear fungus
  • Fig. 2 is a flow chart of purification of TCP-40 column chromatography of 40% ethanol precipitation site of the ear fungus extract of the ear fungus;
  • Figure 3 is a standard curve for determining the molecular weight (Mw) of polysaccharide protein TP-2;
  • Figure 4 is an ion chromatogram of the reference solution in the analysis of the monosaccharide component of the polysaccharide protein TP-2;
  • Figure 5 is a UPLC-GPC chromatogram of the polysaccharide protein TP-2;
  • Figure 6 is an ion chromatogram of the composition analysis of the sugar polysaccharide protein TP-2 monosaccharide
  • Figure 7 shows the proliferation of mouse spleen cells by 1H-TdR tragic assay, in which: TCP: crude polysaccharide; TP-1: polysaccharide protein-1; TP-2: polysaccharide protein-2; TP-3: ⁇ Ear polysaccharide protein-3; TP-4: polysaccharide protein-4; To-1: low molecular weight component-1; ⁇ -2: low molecular weight component-2; ⁇ -3 : low ear Molecular weight component-3; ⁇ -4: ⁇ ear low molecular weight component-4; TFP: ⁇ ear coarse total protein fraction;
  • Figure 8 shows the proliferation of sputum and sputum lymphocytes in mice by 1H-TdR tragic assay.
  • Fig. B is CD19+ cells
  • Fig. B is CD3+ cells
  • Fig. C is mouse T lymphocytes
  • Fig. D is mouse B lymphocytes
  • Dex dextran
  • TCP crude polysaccharide
  • TP-1 polysaccharide protein-1
  • TP-2 polysaccharide protein-2
  • TP-3 polysaccharide protein-3
  • TP-4 ⁇ Auricular polysaccharide protein-4
  • LPS lipopolysaccharide
  • Fig. 9 shows changes in the ratio of T and sputum lymphocytes in mice and humans after sputum agitation, wherein Fig. B is mouse T lymphocytes; Fig. B is mouse B lymphocytes; Fig. C is human T lymphocytes; D is human B lymphocytes; Dex: dextran (Dextran); TCP: crude polysaccharide; TP-1: polysaccharide protein-1; TP-2: polysaccharide protein-2; TP-3: polysaccharide Protein-3; TP-4: polysaccharide protein-4; LPS: lipopolysaccharide;
  • Fig. 10 shows the expression of CD69 on the surface of T and sputum lymphocytes after sputum agglutination
  • Fig. B shows the expression of CD69 on the surface of T lymphocytes after sputum aglycone.
  • Dex Dextran
  • TCP crude polysaccharide
  • TP-1 Polysaccharide protein-1
  • TP-2 Polysaccharide protein-2
  • TP-3 Polysaccharide protein-3
  • TP-4 polysaccharide protein-4
  • LPS lipopolysaccharide
  • Figure 11 shows changes in NO release in peritoneal macrophages of mice after sputum agglutination, in which Dex: Dextran; TCP: crude polysaccharide; TP-1: Polysaccharide protein-1; TP-2: ⁇ Auricular polysaccharide protein-2; TP-3: auricular polysaccharide protein-3; TP-4: auricular polysaccharide protein-4; To-1: low molecular weight component-1; To-2: low molecular weight group ⁇ -2; ⁇ -3: ⁇ ear low molecular weight component-3; ⁇ -4: ⁇ ear low molecular weight component-4; TFP: ⁇ ear coarse total protein fraction; LPS: lipopolysaccharide; Figure 12: Inhibition of tumor angiogenesis endothelial cell proliferation by polysaccharide protein of the ear, wherein TP-2: polysaccharide protein-2. detailed description
  • Example 1 Method for separating and purifying polysaccharide protein (TP-2)
  • the appropriate amount of absolute ethanol is added to the supernatant to 80% by volume of ethanol, and after standing at 4 ° C for 24 hours, 3000 Centrifuge at 10 minutes per minute, the precipitate number is TCP-80, and dry under reduced pressure for further separation and purification.
  • the dialysis process was dialysis for three days, and the dialyzed water was dialyzed for two days. Then, each section was separated and purified by Sepharose CL-6B agarose gel column until it was pure by high performance liquid chromatography. After the above column chromatography, the chromatogram was separated from TCP-40 ion exchange column by 0.1 Mol/L. Purification of the eluted fraction of NaCl obtained UPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) as a homogeneous component of the polysaccharide protein TP-1 (397 mg) and a homogeneous polysaccharide protein TP-2 (1212 mg) from the elution site of 0.5 Mol/L NaCl. ), the separation flow chart is shown in Figure 2.
  • UPLC Ultra High Performance Liquid Chromatography
  • the dialysis was dialyzed against convection water for three days, and distilled water was dialyzed for two days. Then, each section was separated and purified by Sepharose CL-6B agarose gel column until it was pure by high performance liquid chromatography. After the above column chromatography, it was separated from TCP-60 ion exchange column by 1.0 Mol/L. Purification of the eluted fraction of NaCl obtained UPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) as a homogeneous component of the polysaccharide protein TP-3 (12.
  • UPLC Ultra High Performance Liquid Chromatography
  • Ultra Performance Liquid Chromatography-Evaporation Light Scattering Detector (UPLC-GPC-ELSD) Instrument Configuration and Chromatographic Conditions: US Waters UPLC, TSK-3000 GPC Column, Autosampler, Millipore Ultrapure Water Ion Exchanger High purity water (0.45 ⁇ cellulose acetate membrane filtration) was prepared; the flow rate was 0.3 ml/min.
  • Sample solution preparation Weigh a certain amount of the polysaccharide protein TP-2 prepared in Example 1, add appropriate amount of deionized water, prepare it into a solution with a concentration of lmg/ml, Millipore 0.22 ⁇ water filter to filter, injection detection .
  • Instrument configuration and chromatographic conditions Dionex ICS 3000 ion chromatography, CarboPac PA20 analytical column, 150x3mm, S/N 002823, CarboPac PA20 guard column, 50*3mm, S/N 002652, eluent composition and flow rate l-25min, Im Mol/L KOH; 25.1-32 min, 30 m Mol/L KOH, ; 32.1-35 min, lm Mol/L KOH; 0.45 mL/min, 10 L injection.
  • Preparation of reference solution Take appropriate amount of arabinose, galactose, glucose, xylose, mannose reference substance, dissolve it into 10.0 mg/L of reference solution with deionized water, shake well, and obtain.
  • Standard curve preparation Accurately draw the appropriate amount of reference stock solution, and dilute it into 0.5 mg/L, lmg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L standard solution with deionized water, 0.45 After filtration through ⁇ microporous membrane, the chromatographic conditions were determined by ion chromatography.
  • the peak area integral value is plotted on the ordinate (Y) and the standard concentration is plotted on the abscissa ( ⁇ ).
  • the standard curve of each reference is plotted and the regression equation is calculated. The results are shown in Table 1 and Figure 4.
  • Partially methylated Aldiol acetyl ester preparation The sample which has been completely methylated is dissolved in 3 mL of 90% by volume formic acid solution, sealed, depolymerized at 100 ° C for 6 h, and added to the reaction flask 2 ⁇ 3 mL of methanol, concentrated and evaporated to dryness under reduced pressure at 40 ° C. The above operation was repeated three times to remove excess formic acid, and then 4 mL of 2 Mol/LTFA solution was added to the depolymerized sample, sealed and hydrolyzed at 110 ° C for 2 h.
  • the solution in the bottle was evaporated to dryness under reduced pressure at 40 ° C, then 2 to 3 mL of methanol was added, and evaporated to dryness, and the above operation was repeated several times to remove excess TFA.
  • the hydrolyzed sample was dissolved in 3 to 4 mL of distilled water, and then reduced by adding about 20 mg of NaB at room temperature for 3 hours. Then, the pH was adjusted to about 5 with glacial acetic acid, and 1 to 2 mL of methanol and a drop of glacial acetic acid were added thereto, followed by evaporation under reduced pressure. The above operation was repeated several times to remove excess acetic acid.
  • the sample treated above was placed in a P 2 O 5 vacuum desiccator and dried under reduced pressure for one day.
  • Temperament conditions are: starting temperature 50 ° C, temperature program 40 ° C / min, to 215 ° C, hold 40 min, detector temperature 250 ° C, DB-5 capillary GC-MS column detection.
  • TP-2 is a dark brown powdery substance, soluble in water, DMSO, insoluble in high concentration of methanol, B An organic solvent such as alcohol, the UPLC-GPC-ESLD pattern of the polysaccharide protein exhibits a symmetric narrow peak, suggesting that it is a pure polysaccharide protein material compared with a molecular weight standard, the molecular weight of the polysaccharide protein is 1.86 x l 0 6 Da (Fig. 5), the Lowry reaction was positive, and there was a weak absorption at 280 nm in the UV scan, indicating that the substance contained protein.
  • TP-2 7.4 4.5 2.7 9.4 1.9 It can be seen from the monosaccharide composition analysis that the polysaccharide protein TP-2 contains five kinds of monosaccharides, among which the highest content of arabinose and xylose, followed by glucose, galactose and mannose. Less in content.
  • TP-2 was methylated by Needs method, and after three methylation, it was depolymerized with 90% formic acid to 2 Mol/L TFA completely. Acid hydrolysis, reduction of NaBH 4 and acetylation of acetic anhydride were carried out to prepare an alcohol derivative of alditol, and GC-MS analysis was carried out. The results are shown in Table 3.
  • the 1,3,6-linked galactose 3% methylation analysis showed that the structure of the polysaccharide protein-2 was very complicated.
  • the residue forms a glycosidic bond to form a linkage
  • mannose forms a glycosidic bond with the other sugar residue at the 1-, 1, 6-, and 1, 3, 6-position hydroxyl groups
  • the glucose is in the 1-position, 1, 3-position
  • the 4th and 1,6th hydroxyl groups form a glycosidic bond with other sugar residues to form a linkage
  • the galactose forms a glycosidic linkage with other sugar residues at the 1, 1, 3, 1, 3, and 6 hydroxyl groups.
  • TP-2 chain structure In order to further confirm the TP-2 chain structure, it was partially subjected to acid hydrolysis (0.3 Mol/L TFA, 8 hours), and the hydrolyzate was dialyzed. After lyophilization, the degradation product of TP-2 was obtained, which was named TP. -2-in, as with TP-2, analyzed the monosaccharide composition and methylation of TP-2-in. The results are shown in Table 4.
  • TP-2-in 1,3,6-linked galactose 9% monosaccharide composition analysis found that TP-2-in consists of mannose: glucose: galactose in a ratio of 4.1: 4.3: 1.6, indicating the xylose contained in TP-2
  • the arabinose is distributed in the branch chain.
  • the main chain of TP-2 is composed of three kinds of six carbon sugars.
  • the methylation analysis found that TP-2-in is mainly composed of five sugar residues, which are non-reducing ends.
  • the galactose residue may form a branch through the O-3 position, but not at the O-6 position, and the increase in the proportion of 1,3,6 linked galactose residues indicates The site is located in a position that is not easily hydrolyzed.
  • a comprehensive analysis of the methylation analysis of TP-2 and TP-2-in revealed that the main chain of the polysaccharide protein ⁇ -2 was linked by 1,4 to a glucose residue, 1,6 to a mannose residue, 1, 3,6 is linked to a mannose residue, and 1, 3, and 6 are linked to a galactose residue, and are formed by 1,3,6 linked mannose residues and 1,3,6 linked galactose residues at the ⁇ -3 position.
  • Branches, branches are composed of a variety of five carbon sugar and six carbon sugar residues.
  • sample source ⁇ is provided by Qidong Gaitian Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Crude polysaccharide TCP, homopolysaccharide TP-1, ⁇ -2, ⁇ -3, ⁇ -4, low molecular weight components ⁇ -1, ⁇ -2, ⁇ -3, ⁇ -4 were prepared from Example 1.
  • the polysaccharide components extracted from the ear cream can stimulate small Mouse spleen cell proliferation; low molecular weight components except ⁇ -3 can not stimulate spleen cell proliferation.
  • Polygonum polysaccharide can stimulate the proliferation of mouse sputum cells, not sputum cells
  • T and sputum cells were obtained by magnetic bead sorting. After incubation with the polysaccharides of the ear, the results of 3 H-TdR showed that the polysaccharide components TP-1, TP-2, TP-3, TP- 4. TCP stimulates sputum cells, not sputum cells. And this stimulation is dose dependent.
  • Reagents M199 medium, double antibody, fetal bovine serum (FBS), basic fibroblast growth factor (bFGF), gelatin (gelatin).
  • FBS fetal bovine serum
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • gelatin gelatin
  • TP-2 Auricular polysaccharide protein -2
  • M199 medium containing 1%-5% FBS, 10-100 ng/ml bFGF was prepared.
  • (7.) Remove the 96-well plate, aspirate the medium with a lance, add M199 with 1%-5% FBS and bFGF and the drug, 100 ⁇ l per well, and set the control group and the zero group. And add the samples to be tested, which are TCP, TP-1, TP-2, TP-3 and ⁇ -4. Set 4 concentrations for each sample, respectively (1 g / L, 10 ( ⁇ g / L, 50 ( ⁇ g / L, and 100 ( ⁇ g / L. Then at 37 ° C, 5% CO2) Continuous incubation.

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Abstract

本发明提供了一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途，本发明的槐耳多糖蛋白的单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其质量比为7.4:4.5:2.7:9.4:1.9，该多糖蛋白的重均分子量为7.0X105-2.0X106Da，优选为1.86X106Da。本发明的多糖蛋白可以用于制备治疗肿瘤的药物。

Description

一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途。 背景技术
槐耳为多孔菌科真菌槐栓菌 Trametes robiniopMa J 的子实体， 是一种 重要的民间药用真菌， 在中国具有 1600余年的用药历史。 Ainsworth真菌分类系 统将其归属于真菌门、 担子菌亚门、 层菌纲、 多孔菌科、 栓菌属。 槐耳子实体中 等至较大， 木栓质， 无菌柄， 生于槐、 剌槐等阔叶树的树干上， 分布于河北、 陕 西、 辽宁、 湖南、 广西、 福建等地， 是一种可以导致树木心材腐朽的木腐菌。 本 品味苦、 辛， 性平无毒， 有"治风"、 "破血"、 "益力" 的功效， 临床上用于治疗多 种疾病。 由于老龄中国槐日益稀少， 槐耳药材资源濒于枯竭， 难以满足临床用药 需求， 更无法满足工业化生产需求。 为了解决槐耳的资源问题， 启东盖天力药业 有限公司经过长期的研究和实践， 攻克了槐耳菌丝体大规模发酵难题， 实现了菌 丝体的工业化生产， 并以槐耳菌质 （槐耳菌丝体发酵物） 提取物为原料开发了槐 耳颗粒和槐杞黄颗粒等药品， 满足了临床用药需求。
近年来大量的化学成分及药理活性研究资料证实槐耳菌质提取物的有效成分 为槐耳多糖蛋白， 其主要功效是治疗或辅助治疗肿瘤性疾病。 然而， 目前对于槐 耳多糖蛋白的组成、 结构及其制备方法研究很少， 在化学成分研究方面仅有粗多 糖的单糖组成及比例分析的文献报道， 缺乏对其均一多糖的分离纯化和结构研究， 如均一多糖蛋白所含的糖残基种类、 比例、 在主链中的排列次序等信息， 而这些 信息对于阐明槐耳菌质真正的药效成分、 槐耳多糖蛋白的作用机制及构效关系等 至关重要。 同样在槐耳多糖蛋白的生物活性研究方面， 多以粗多糖作为研究对象， 缺乏应用均一多糖组分获得的体内、 体外药理学研究数据， 从而无法深入了解槐 耳多糖蛋白与人体免疫细胞或肿瘤细胞表面相关多糖受体的作用过程， 因而无法 深入的阐明其作用原理。 发明内容
为了克服现有技术的缺陷， 本发明提供一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和 用途。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的。
第一方面， 本发明提供一种槐耳多糖蛋白 (又称为 "本发明槐耳多糖蛋白"）， 该多糖蛋白的单糖组成为阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄糖、 木糖及甘露糖， 其质量 比为 7.4： 4.5： 2.7： 9.4： 1.9。
优选地， 所述多糖蛋白的重均分子量为 7.0x l05-2.0x l06 Da , 优选为 1.86x l06Da。
优选地， 该多糖蛋白的制备方法包括如下步骤：
( 1 ) 将浓度为 2%-20% (质量 /体积）， 优选为 8% (质量 /体积） 的槐耳菌 质提取物（例如槐耳清膏）水溶液采用 Sevage法去除游离蛋白， 收集糖类部分； ( 2 ) 将步骤 （1 ) 得到的糖类部分加入无水乙醇中， 使其形成醇浓度为 30%-80% (体积）， 优选 30%-50% (体积）， 最优选为 40% (体积） 的糖溶液， 离心， 得到沉淀物；
( 3 ) 将步骤 （2) 得到的沉淀物加水溶解， 过滤， 浓缩、 透析收集袋内部 分； 以及
(4) 使用离子交换柱色谱对步骤 （3 ) 收集到的袋内部分进行分离， 其中 使用的洗脱液为水、 0.4 Mol/L-0.8 Mol/L NaCl水溶液，优选为 0.5 Mol/L的 NaCl 水溶液。
在本发明中， 槐耳菌质提取物包括槐耳菌质的水提取物， 尤其是热水
( 60-100°C ) 提取物。 所述槐耳菌质的水提取物可直接使用或浓缩后使用。 浓 缩的槐耳菌质的水提取物 （即槐耳清膏） 或未浓缩的槐耳菌质的水提取物可用 常规方法制备或购买得到。
优选地，所述多糖蛋白的制备方法还包括对 NaCl溶液洗脱得到的产品进行 透析除盐的步骤。
优选地，所述多糖蛋白的制备方法还包括采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶 柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。
第二方面， 本发明提供一种上述多糖蛋白的制备方法， 该制备方法包括如 下步骤：
( 1 ) 将浓度为 2%-20% (质量 /体积）， 优选为 8% (质量 /体积） 的槐耳菌 质提取物（例如槐耳清膏）水溶液采用 Sevage法去除游离蛋白， 收集糖类部分； ( 2 ) 将步骤 （1 ) 得到的糖类部分加入无水乙醇中， 使其形成醇浓度为 30%-80% (体积）， 优选 30%-50% (体积）， 最优选为 40% (体积） 的糖溶液， 离心， 得到沉淀物；
( 3 ) 将步骤 （2) 得到的沉淀物加水溶解， 过滤， 浓缩、 透析收集袋内部 分； 以及
(4) 使用离子交换柱色谱对步骤 （3 ) 收集到的袋内部分进行分离， 其中 使用的洗脱液为水、 0.4 Mol/L -0.8 Mol/LNaCl水溶液，优选为 0.5 Mol/L的 NaCl 水溶液， 即得。 优选地，所述制备方法还包括对 NaCl溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的 步骤。
优选地，所述制备方法还包括采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对透析除 盐后的产品进行分离纯化的步骤。
在一个具体实施方案中， 所述制备方法包括如下步骤：
( 1 )准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏 300g， 加入适量蒸馏水将其稀释为 浓度约为 8% (质量 /体积） 的稀溶液， 之后采用 Sevage 法去游离蛋白， 重复操 作 5次， 收集糖类部分；
(2) 向步骤 （1 ) 得到的槐耳菌质糖类部分中缓缓加入无水乙醇使其成为 醇浓度为 40% (体积） 的糖溶液， 4°C静置 24小时后， 以 3000转 /分钟的速度 离心 10分钟， 沉淀， 得到沉淀物；
( 3 ) 称取适量步骤 （2) 得到的沉淀物， 将其溶解于 150ml蒸馏水中， 过 滤， 减压浓缩至体积 50ml; 透析收集袋内部分， 以及
(4) 使用 DEAE-52离子交换柱色谱对步骤 （3 ) 收集到的袋内部分进行分 离，采用 0.5 Mol/L NaCl溶液进行洗脱， 洗脱部分在浓缩后进行透析除盐， 透析 过程为对流水透析三天， 蒸馏水透析两天； 以及
( 5 )采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对步骤（4)得到的产品进行分离 纯化， 直至高效液相色谱法检测为纯品为止。
第三方面， 本发明提供上述多糖蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的用途。 本 发明槐耳多糖蛋白， 具有显著抗肿瘤活性， 有望成为一种新型抗肿瘤药物的活 性成分。
第四方面， 本发明提供包含槐耳多糖蛋白和药学上可接受的载体的药物组 合物， 其中， 所述组合物中含有重量比为 0.01%-99.95%的槐耳多糖蛋白作为活 性成分， 并且以槐耳多糖蛋白的总重量计， 所述槐耳多糖蛋白中含有 90wt%-100wt%的本发明第一方面所述的槐耳多糖蛋白。
该药物组合物优选含有重量比为 0.1%-99.9%的槐耳多糖蛋白作为活性成 分， 较佳地， 含有重量比为 0.1%-99.5%的槐耳多糖蛋白作为活性成分， 更优选 含有重量比为 0.5%-95%的活性成分。
该药物组合物， 含有治疗有效量的本发明槐耳多糖蛋白， 具有显著的抗肿 瘤功效。 可将槐耳多糖蛋白与可药用赋形剂、 稀释剂等药学上可接受的载体的 混合物以片剂、 胶囊、 颗粒剂、 散剂或糖浆剂的形式口服给药或以注射剂的形 式非口服给药。 上述制剂可通过常规制药方法制备。 可用的药学上可接受的载 体的例子包括赋形剂 (例如糖类衍生物如乳糖、 蔗糖、 葡萄糖、 甘露糖醇和山梨 糖醇； 淀粉衍生物如玉米淀粉、 土豆淀粉、 糊精和羧甲基淀粉； 纤维素衍生物 如结晶纤维素、 羟丙基纤维素、 羧甲基纤维素、 羧甲基纤维素钙、 羧甲基纤维 素钠； 阿拉伯胶； 右旋糖酐； 硅酸盐衍生物如偏硅酸镁铝； 磷酸盐衍生物如磷 酸钙； 碳酸盐衍生物如碳酸钙； 硫酸盐衍生物如硫酸钙等)、 粘合剂 (例如明胶、 聚乙烯吡咯垸酮和聚乙二醇)、崩解剂 (例如纤维素衍生物如羧甲基纤维素钠、聚 乙烯吡咯垸酮)、 润滑剂 (例如滑石、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁、 鲸蜡、 硼酸、 苯甲酸 钠、 亮氨酸)、 稳定剂 (对羟基苯甲酸甲酯、 对羟基苯甲酸丙酯等)、 矫味剂 (例如 常用的甜味剂、 酸味剂和香料等)、 稀释剂和注射液用溶剂 (例如水、 乙醇和甘油 等)。
使用药物组合物时， 是将安全有效量的本发明槐耳多糖蛋白施用于哺乳动 物， 其中该安全有效量通常至少约 1微克 /天， 而且在大多数情况下不超过约 10 毫克 /千克体重。 较佳地， 该剂量是约 1微克 /天-约 3毫克 /千克体重。 当然， 具 体剂量还应考虑给药途径、 病人健康状况等因素， 这些都是在熟练医师技能范 围之内的。
此外， 本发明槐耳多糖蛋白可以单药使用， 也可以与其它药物联合使用。 优选的联合使用包括： 与外科手术联合使用， 与一种或多种西药联合使用， 与 中草药联合使用， 与放射性治疗联合使用。
本发明的药物组合物的给药途径没有特别限制， 其中包括但并不限于： 口 服给药， 注射给药， 瘤内给药， 植入给药， 腔内给药， 肛门给药， 透皮给药， 内外敷； 优选的注射给药包括： 静脉注射， 肌肉注射， 皮下注射， 腔内注射、 瘤内给药。
与现有技术相比， 本发明至少具有以下有益效果：
本发明首次采用系统的水提取、 醇沉淀、 去蛋白、 透析小分子、 离子交换 色谱及凝胶分子量排阻色谱分离的手段从槐耳菌质中分离获得了一个均一的多 糖蛋白组分， 并综合应用分子量分析、 单糖组成及氨基酸组成分析、 红外光谱 分析及甲基化分析等手段， 对其进行了化学结构特点的确认， 明确了其重均分 子量、 单糖组成及比例、 氨基酸组成及比例， 以及所含糖残基的连接方式。 这 样一个结构特点明晰、 分子量均一的槐耳菌质多糖组分， 是研究槐耳多糖有效 成分及其生物活性的理想分子模型， 为阐明槐耳多糖的免疫调节及抗肿瘤的有 效成分及其作用机制奠定了基础， 本发明将为槐耳菌质进一步开发利用和相关 制剂的质量控制提供科学依据。 附图说明
以下， 结合附图来详细说明本发明的实施方案， 其中：
图 1为槐耳菌质提取物槐耳清膏分级醇沉淀流程图； 图 2为槐耳菌质提取物槐耳清膏 40%乙醇沉淀部位 TCP-40柱色谱纯化流程 图；
图 3为槐耳多糖蛋白 TP-2分子量 （Mw) 测定标准曲线；
图 4为槐耳多糖蛋白 TP-2单糖组分分析中对照品溶液的离子色谱图； 图 5为槐耳多糖蛋白 TP-2的超高效液相-凝胶色谱 （UPLC-GPC) 图 谱；
图 6为槐耳多糖蛋白 TP-2单糖组成分析离子色谱图；
图 7为 1H-TdR惨入法检测小鼠脾细胞增殖， 其中， TCP: 粗多糖； TP-1 : 槐耳多糖蛋白 -1 ; TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2; TP-3 : 槐耳多糖蛋白 -3 ; TP-4: 槐耳 多糖蛋白 -4; To-1 : 槐耳低分子量组分 -1 ; Το-2: 槐耳低分子量组分 -2; Το-3 : 槐耳低分子量组分 -3 ; Το-4: 槐耳低分子量组分 -4; TFP: 槐耳粗总游离蛋白部 分；
图 8为 1H-TdR惨入法检测小鼠 Τ、 Β淋巴细胞增殖， 其中， 图 Α为 CD19+ 细胞； 图 B为 CD3+细胞； 图 C为小鼠 T淋巴细胞； 图 D为小鼠 B淋巴细胞； Dex: 葡聚糖； TCP: 粗多糖； TP-1 : 槐耳多糖蛋白 -1 ; TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2; TP-3 : 槐耳多糖蛋白 -3 ; TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4; LPS: 脂多糖；
图 9为槐耳多糖剌激后小鼠及人 T、 Β淋巴细胞比例变化， 其中， 图 Α为 小鼠 T淋巴细胞； 图 B为小鼠 B淋巴细胞； 图 C为人类 T淋巴细胞； 图 D为 人类 B淋巴细胞； Dex: 葡聚糖 （Dextran) ; TCP: 粗多糖； TP-1 : 槐耳多糖蛋 白 -1 ; TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2; TP-3: 槐耳多糖蛋白 -3; TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4; LPS: 脂多糖；
图 10为槐耳多糖剌激后 T、 Β淋巴细胞表面 CD69的表达， 图 Α为槐耳多 糖剌激后 T淋巴细胞表面 CD69的表达， 图 B为槐耳多糖剌激后 B淋巴细胞表 面 CD69的表达， 其中 Dex: 葡聚糖 （Dextran); TCP: 粗多糖； TP-1 : 槐耳多糖 蛋白 -1 ; TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2; TP-3: 槐耳多糖蛋白 -3; TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4; LPS: 脂多糖；
图 11 为槐耳多糖剌激后小鼠腹腔巨噬细胞 NO释放变化， 其中 Dex: 葡聚 糖 （Dextran); TCP: 粗多糖； TP-1 : 槐耳多糖蛋白 -1 ; TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2; TP-3 : 槐耳多糖蛋白 -3 ; TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4; To-1 : 槐耳低分子量组分 -1 ; To-2: 槐耳低分子量组分 -2; Το-3: 槐耳低分子量组分 -3; Το-4: 槐耳低分子量 组分 -4; TFP: 槐耳粗总游离蛋白部分； LPS: 脂多糖； 图 12槐耳多糖蛋白对肿瘤血管形成内皮细胞增殖的抑制作用， 其中 TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2。 具体实施方式
下面通过实施例详细说明本发明， 应当理解， 下述实施例仅用于说明本发 明， 而不以任何方式限制本发明的范围。 实施例 1: 槐耳多糖蛋白 （TP-2) 的分离纯化方法
准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏（由启东盖天力药业有限公司提供 )300g， 加入适量蒸馏水将其稀释为浓度约为 8% (质量 /体积）的稀溶液，之后采用 Sevage 法去游离蛋白， 重复操作 5 次， 分别收集糖类部分 （TCP) 及槐耳粗总游离蛋 白部分 （TFP)， 槐耳粗总游离蛋白部分真空干燥备用， 槐耳菌质糖类物质部分 ( TCP)在减压浓缩去除残存的氯仿及正丁醇后， 进行分级醇沉淀。首先向 TCP 中缓缓加入无水乙醇使其成为醇体积浓度为 40% (体积） 的糖溶液， 4°C静置 24小时后， 3000转 /分钟离心 10分钟， 沉淀编号为 TCP-40, 减压干燥以备进一 步分离纯化， 之后向上清液中继续加入适量无水乙醇使其成为含醇 60% (体积） 的糖溶液， 4°C静置 24小时后， 3000转 /分钟离心 10分钟，沉淀编号为 TCP-60, 减压干燥以备进一步分离纯化， 在此之后继续向上清液中加入适量无水乙醇至 乙醇浓度达到 80% (体积）， 4°C静置 24小时后， 3000转 /分钟离心 10分钟， 沉 淀编号为 TCP-80, 减压干燥以备进一步分离纯化， 具体分级醇沉淀流程图见图 l o
称取适量的槐耳清膏 40% (体积）乙醇沉淀部位 TCP-40,将其溶解于 150ml 蒸馏水中， 过滤， 减压浓缩至体积 50ml， 透析收集袋内部分及袋外部分， 袋外 部分为槐耳低分子量组分 -1 ( TO-1 ) , 袋内部分通过 DEAE-52 离子交换柱色谱 分离，分别采用蒸馏水及 O. lM NaCl溶液、 0.5M NaCl洗脱，每个部位收集 3.0L， 水洗脱部分直接浓缩至干， 氯化钠洗脱部分均在浓缩后进行透析除盐， 透析过 程为对流水透析三天， 蒸馏水透析两天。然后各段分别采用 Sepharose CL-6B琼 脂糖凝胶柱进行分离纯化， 直至高效液相色谱法检测为纯品为止， 经过上述柱 色谱分离过程， 分别从 TCP-40 离子交换柱色谱 0.1 Mol/L NaCl 洗脱部位纯化 获得了 UPLC (超高效液相色谱） 验证为均一组分的多糖蛋白 TP-1 ( 397mg) 以及从 0.5 Mol/L NaCl洗脱部位获得了均一多糖蛋白 TP-2 ( 1212 mg) ， 分离流 程图见图 2。
称取适量的槐耳清膏 60% (体积）乙醇沉淀部位 TCP-60,将其溶解于 150ml 蒸馏水中， 过滤， 经减压浓缩至体积 50ml， 透析收集袋内部分及袋外部分， 袋 外部分为槐耳低分子量组分 -2 ( TO-2)， 袋内部分通过 DEAE -52 离子交换柱色 谱分离， 分别采用蒸馏水及 1.0 Mol/LNaCl溶液洗脱， 每个部位收集 3.0L， 水 洗脱部分直接浓缩至干， 氯化钠洗脱部分均在浓缩后进行透析除盐， 透析过程 为对流水透析三天， 蒸馏水透析两天。然后各段分别采用 Sepharose CL-6B琼脂 糖凝胶柱进行分离纯化， 直至高效液相色谱法检测为纯品为止， 经过上述柱色 谱分离过程， 分别从 TCP-60 离子交换柱色谱 1.0 Mol/L NaCl 洗脱部位纯化获 得了 UPLC (超高效液相色谱） 验证为均一组分的多糖蛋白 TP-3 ( 12.1g) o 称取适量的槐耳清膏 80% (体积）乙醇沉淀部位 TCP-80,将其溶解于 150ml 蒸馏水中， 过滤， 减压浓缩至体积 50ml， 透析收集袋内部分及袋外部分， 袋外 部分为槐耳低分子量组分 -3 ( TO-3 ) , 袋内部分通过 DEAE -52 离子交换柱色谱 分离， 分别采用蒸馏水及 1.0 Mol/L NaCl水洗脱， 每个部位收集 3.0L， 水洗脱 部分直接浓缩至干， 氯化钠洗脱部分均在浓缩后进行透析除盐， 透析过程为对 流水透析三天， 蒸馏水透析两天。然后各段分别采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝 胶柱进行分离纯化， 直至高效液相色谱法检测为纯品为止， 经过上述柱色谱分 离过程， 分别从 TCP-80 离子交换柱色谱 1.0 Mol/LNaCl 洗脱部位纯化获得了 UPLC (超高效液相色谱） 验证为均一组分的多糖蛋白 TP-4 ( 10.0g) , 收集 槐 耳清膏 80% (体积） 乙醇沉淀上清液部分得 槐耳低分子量组分 -4 ( TO-4) (图 2)。 实施例 2: 槐耳多糖蛋白 （TP-2) 化学结构的研究
本实施例研究了实施例 1制备的槐耳多糖蛋白 TP-2的化学结构。
一、 槐耳多糖蛋白 （TP-2) 化学结构研究方法
1、 纯度及分子量的测定
超高效液相-凝胶色谱 -蒸发光散射检测器 （UPLC-GPC-ELSD) 仪器配置及 色谱条件： 美国 Waters UPLC, TSK-3000 GPC色谱柱， 自动进样器， Millipore 超纯水离子交换器制备高纯水 （0.45μιη醋酸纤维素膜过滤）； 流速 0.3 ml/min。
标准曲线的制备： 分别称取适量的右旋糖苷标准品， 加入去离子水， 将其 配置成浓度 0.5mg/ml 的对照品溶液， 之后逐一进行 UPLC检测， 结果见图 3。
样品溶液制备： 分别称取一定量的实施例 1制备的多糖蛋白 TP-2， 加入适 量去离子水， 将其配制成浓度为 lmg/ml 的溶液， Millipore 0.22μιη水系滤膜过 滤， 进样检测。
2、 单糖组成分析
完全酸水解： 精密称取实施例 1制备的多糖蛋白 ΤΡ-2 (10 mg) 放入厚壁耐 压瓶中， 加入 4ml的 2 Mol/L三氟乙酸 （TFA)， 充氮气， 封管后， 100°C水解 2 小时， 减压蒸干。
样品的离子色谱分析
仪器配置及色谱条件： Dionex ICS 3000型离子色谱， CarboPac PA20分析 柱， 150x3mm， S/N 002823 , CarboPac PA20保护柱， 50*3mm， S/N 002652, 淋洗液组成及流速 l-25min， Im Mol/L KOH; 25.1-32 min, 30m Mol/L KOH, ; 32.1-35 min, lm Mol/L KOH; 0.45mL/min, 进样 10 L。
对照品溶液的制备： 取阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄糖、 木糖、 甘露糖对照品 适量， 用去离子水溶解成各含 10.0 mg/L的对照品溶液， 摇匀， 即得。
标准曲线制备： 精密吸取对照品混合贮备液适量， 分别用去离子水将其稀 释成 0.5 mg/L 、 lmg/L、 5 mg/L、 10 mg/L、 15 mg/L 的标准溶液， 0.45 μιη微 孔滤膜过滤后， 依次进行离子色谱测定， 离子色谱条件为： Dionex ICS 3000型 离子色谱， CarboPac PA20分析柱， 150x3mm， S/N 002823 , CarboPac PA20保 护柱， 50*3mm， S/N 002652，淋洗液组成及流速 l-25min， lm Mol/L KOH ; 25.1-32 min, 30m Mol/L KOH, ; 32.1-35 min, lm Mol/L KOH; 0.45mL/min, 进样 10 L。 以峰面积积分值为纵坐标 （Y)、 以各标准品浓度为横坐标 （Χ)， 绘制各对照品 标准曲线并计算回归方程， 结果见表 1和图 4。
表 1 线性关系考察结果 对照品名称 相对保留时间 回归方程 相关系数 (R) 阿拉伯糖 0.67 Υ=1.848χ-0.100 99.9973 半乳糖 0.85 Υ=2.138χ-0.170 99.9765 葡萄糖 1.00 Υ=2.297χ-0.164 99.9630 木糖 1.20 Υ=2.629χ-0.176 99.9620 甘露糖 1.30 Υ=1.911χ-0.147 99.9826 供试品溶液制备：将实施例 1制备的多糖蛋白 ΤΡ-2完全酸水解产物复溶于 50ml去离子水， 超声 10分钟使溶解， 取溶液适量， 过孔径 0.22μιη水系滤膜及 DIONEX RP II固相萃取小柱。
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 ΙΟμΙ^, 注入离子色谱仪， 即得。 3、 甲基化分析
多糖蛋白完全甲基化：称取适量实施例 1制备的多糖蛋白 ΤΡ-2于反应瓶中， 放入真空干燥箱中干燥 5h ( 50°C )， 加入经过分子筛处理过的 DMSO 2ml， 超声 振荡 5分钟， 待样品完全溶解后， 加入研磨成粉状 NaOH 20mg， 同时用氮气赶 尽瓶中空气， 室温下超声 10分钟， 静置 90分钟， 待反应瓶中的 DMSO完全冰 冻后， 逐滴加入 0.1ml碘甲垸 （此过程大约需要 15〜20分钟）， 同时反应物会慢 慢解冻， 并逐渐澄清， 直至成为亮黄色。 然后超声 10分钟， 静置 30分钟。 室 温减压蒸馏， 去尽过量的碘甲垸， 用水透析一天， 减压蒸至 2ml左右。 冷冻干 燥后再于干燥器中干燥 5小时， 重复上述操作 2次后， 取少量样品进行红外检 测， 如果红外光谱中原 SSOOcm 处强而宽的羟基峰消失， 而 S^Ocm—1处甲基峰 显著增强， 表明样品的全甲基化反应已经完成。
部分甲基化阿尔迪醇乙酰酯制备： 将已经完全甲基化的样品溶于 3mL 90% (体积） 的甲酸溶液中， 封管， 100°C下解聚 6h， 向反应瓶中加入 2〜3mL 甲醇， 40°C下减压浓缩蒸干， 重复以上操作三次以除尽过量甲酸， 然后向解聚后的样 品中加入 2 Mol/LTFA溶液 4mL， 密封后于 110°C下水解 2h， 反应瓶中的溶液于 40°C下减压蒸干， 再加入 2〜3mL甲醇， 蒸干， 重复以上操作多次以除尽过量的 TFA。 水解后的样品用 3〜4mL蒸馏水溶解后， 加入约 20mg NaB 于室温下还 原 3h， 然后用冰醋酸调 pH 值到 5左右， 加入 l〜2mL甲醇及一滴冰醋酸后， 再 减压蒸干， 重复上述操作多次以除尽过量的乙酸。 经上述处理的样品置于 P2O5 真空干燥器中减压干燥一天， 再于 110°C干燥 10〜15min 后， 加入 3mL醋酐， 110°C反应 lh， 向反应液中加入 2mL甲苯， 振荡后 40°C下减压蒸去未反应的醋 酐， 如此重复多次以除尽醋酐。 然后将乙酰化后的样品溶于氯仿中， 再加入等 体积的蒸馏水洗涤氯仿层 3 次， 除尽水层， 氯仿层加入无水硫酸钠干燥 10min， 过滤，将氯仿溶液室温减压浓缩至 O. lmL 左右后，进行气质联用分析（GC-MS)。 气质的条件为： 起始温度 50°C， 升温程序为 40°C/min， 至 215°C， 保持 40min， 检测器温度 250°C， DB-5 毛细管 GC-MS色谱柱检测。
4、 氨基酸分析：
称取适量实施例 1制备的多糖蛋白 TP-2放入试管中， 加入 4ml的 6 Mol/L HCl在 100°C下水解 6小时， 蒸去 HC1， 离心， 过滤， 滤液用氨基酸分析仪进行 分析。
5、 IR光谱分析：
称取 lmg实施例 1制备的多糖蛋白 TP-2, 真空干燥过夜， 次日用溴化钾压 片法进行 IR检测。 二、 槐耳多糖蛋白 （TP-2) 化学结构研究结果
根据第一部分的研究方法对实施例 1制备的槐耳多糖蛋白 （TP-2) 的化学 结构进行了研究， 研究结果如下：
1、 纯度及分子量
TP-2为深褐色粉末状物质， 易溶于水、 DMSO, 不溶于高浓度的甲醇、 乙 醇等有机溶剂， 该多糖蛋白的 UPLC-GPC-ESLD图谱呈现一个对称的窄的色谱 峰， 提示其为一个纯的多糖蛋白物质 与分子量标准品对比， 该多糖蛋白的分子 量为 1.86x l06 Da (图 5 ) ，Lowry反应呈阳性， 紫外扫描 280nm处有弱的吸收， 表明该物质含有蛋白。
2、 单糖组成分析
TP-2完全酸水解之后， 水解产物一部分直接进行了离子色谱分析， 与标准 单糖对照， 分析结果表明该多糖由阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄糖、 木糖及甘露糖 组成，在检测过程中没有发现与糖醛酸及氮乙酰氨基糖相关的色谱峰显示出来， 提示其为一中性多糖 （表 2， 图 6)。
表 2 槐耳多糖蛋白 TP-2单糖组成及质量比例离子色谱分析结果 样品名 阿拉伯糖 半乳糖 葡萄糖 木糖 甘露糖
TP-2 7.4 4.5 2.7 9.4 1.9 通过单糖组成分析可以看出， 槐耳多糖蛋白 TP-2含有 5种单糖， 其中以阿 拉伯糖、 木糖的含量最高， 其次为葡萄糖、 半乳糖， 甘露糖含量较少。
3、 甲基化分析
为了确认 TP-2中的糖残基连接方式，采用 Needs法对 TP-2进行了甲基化， 在三次甲基化之后，将其用 90%的甲酸解聚，以 2 Mol/L TFA完全酸水解， NaBH4 还原和醋酐乙酰化制备成阿尔迪醇乙酸酯衍生物， 进行 GC-MS分析， 结果见表 3。
表 3 TP-2甲基化分析结果
连接方式 峰面积百分比 非还原末端连接阿拉伯糖 7%
非还原末端连接木糖 4%
1，5位连接阿拉伯糖 5%
1，3位连接木糖 6%
非还原末端连接甘露糖 12%
非还原末端连接葡萄糖 13%
非还原末端连接半乳糖 11%
1,3位连接葡萄糖 9%
1，3位连接半乳糖 1%
1，4位连接葡萄糖 5%
1，6位连接甘露糖 4% 1，6位连接葡萄糖 10%
1，3，6位连接甘露糖 8%
1，3，6位连接半乳糖 3% 甲基化分析表明， 槐耳多糖蛋白 -2的结构非常复杂。含有 14种不同连接的 糖残基， 分别为： 其中阿拉伯糖以 1位， 1，5位羟基与其它糖残基形成糖苷键形 成连接， 木糖以 1位， 1，3位羟基与其它糖残基形成糖苷键形成连接， 甘露糖以 1位， 1，6-位和 1，3，6位羟基与其它糖残基形成糖苷键形成连接， 葡萄糖以 1位， 1，3位， 1，4位和 1，6位羟基与其它糖残基形成糖苷键形成连接， 半乳糖以 1位， 1,3 位， 1，3，6 位羟基与其它糖残基形成糖苷键形成连接。 注： 上述结果中五碳 糖与六碳糖残基所占比例与单糖组成分析存在差别， 这与反应过程中不同糖残 基损失程度不同有关 （表 3 )。
为了进一步确认 TP-2链结构， 对其进行了部分酸水解 （0.3 Mol/L TFA， 8 小时）， 将水解产物进行了透析， 冷冻干燥之后， 获得了 TP-2 的降解产物， 命 名为 TP-2-in， 同 TP-2—样， 对 TP-2-in进行了单糖组成分析及甲基化分析， 结 果如表 4。
表 4 TP-2-in甲基化分析结果
连接方式 峰面积百分比
非还原末端连接甘露糖 21%
非还原末端连接葡萄糖 21%
1，4位连接葡萄糖 30%
1，6位连接甘露糖 20%
1，3，6位连接半乳糖 9% 单糖组成分析发现， TP-2-in由甘露糖： 葡萄糖： 半乳糖按照 4.1 : 4.3： 1.6 的比例组成， 说明 TP-2中所含的木糖、 阿拉伯糖均分布于支链之中， TP-2的主 链由三种六碳糖构成， 甲基化分析发现， TP-2-in 主要由五种糖残基构成， 分别 为非还原末端连接甘露糖、 非还原末端连接葡萄糖、 1，4位连接葡萄糖、 1，6位 连接甘露糖、 1，3，6位连接半乳糖， 对比原型多糖 TP-2，TP-2-in 中 1，3，6 连接的 甘露糖残基消失， 1，6连接的甘露糖残基比例上升， 说明 TP-2的主链通过 1，3，6 连接的甘露糖残基的 O-3位置形成分支， 而非 O-6位置， 另外 TP-2中原有的 1，3连接半乳糖残基消失， 未有新的 1，3半乳糖残基产生， 说明 TP-2 中的 1，3，6 连接的半乳糖残基可能通过 O-3位置形成分支， 而非 O-6位置形成分支， 另外 1，3，6连接的半乳糖残基比例的上升说明该位点位于不易被水解的位置。 综合分析 TP-2 及 TP-2-in的甲基化分析结果可以发现，槐耳多糖蛋白 ΤΡ-2 的主链由 1，4 连接葡萄糖残基、 1，6 连接甘露糖残基、 1，3，6连接甘露糖残基， 1 ,3,6连接半乳糖残基组成， 并且通过 1，3，6连接甘露糖残基以及 1，3，6连接半乳 糖残基的 Ο-3位置形成分支， 支链则由多种五碳糖和六碳糖残基共同构成。
由于甲基化反应重复四次， 反应过程不同糖残基损失程度不同， 造成糖残 基比例与离子色谱检测所得单糖组成比例存在一定差异。
4、 氨基酸分析：
为了分析槐耳多糖蛋白 ΤΡ-2中的氨基酸组成及比例，采用盐酸水解结合日 立自动氨基酸分析仪， 对其进行了氨基酸组成及比例分析结果见表 5。
表 5 槐耳多糖蛋白 ΤΡ-2氨基酸组成分析结果
氨基酸名称 含量 g/mg
天冬氨酸 2.58
苏氨酸 2.14
丝氨酸 1.22
谷氨酸 3.95
甘氨酸 2.14
丙氨酸 1.65
缬氨酸 2.00
蛋氨酸 0.65
异亮氨酸 0.56
亮氨酸 2.47
酪氨酸 0.72
苯丙氨酸 0.67
赖氨酸 1.09
组氨酸 0.00
精氨酸 0.89
脯氨酸 1.84
5、 IR光谱分析：
TP-2的红外光谱在 SScm 处无吸收， 提示 TP-2不含糖醛酸。 实施例 3 槐耳清膏及所含化学成分体内免疫活性研究
1、 样品来源 槐耳清膏 由启东盖天力药业有限公司提供。 粗多糖 TCP, 均一多糖 TP-1、 ΤΡ-2、 ΤΡ-3、 ΤΡ-4, 低分子量组分 ΤΟ-1、 ΤΟ-2、 ΤΟ-3、 ΤΟ-4由实施例 1制备。
2、 促进小鼠脾细胞增殖
1 ) 检测槐耳多糖是否能剌激小鼠脾细胞增殖
方法： 槐耳清膏各组分（粗多糖 TCP; 槐耳多糖 TP-1、 ΤΡ-2、 ΤΡ-3、 ΤΡ-4; 低分子量组分 ΤΟ-1、 ΤΟ-2、 ΤΟ-3、 ΤΟ-4; 槐耳粗总游离蛋白部分 TFP) 及阴 性对照药品葡聚糖（Dextran)与小鼠脾细胞共培养， 42h后， 惨入 1H-TdR， 48h 后采用细胞收集器 Filtermate harvester检测其增殖指数。 结果如图 7。
结论：从 3H-TdR结果看， 由槐耳清膏中提取的多糖成分（包括粗多糖 TCP, 多糖组分 TP-1， ΤΡ-2, ΤΡ-3 , ΤΡ-4) 均能剌激小鼠脾细胞增殖； 低分子量组分 除 ΤΟ-3外均不能剌激脾细胞增殖。
2) 槐耳多糖能剌激小鼠 Β细胞增殖， 而非 Τ细胞
方法： 粗多糖 TCP、 槐耳多糖 TP-1、 ΤΡ-2、 ΤΡ-3、 ΤΡ-4与阴性对照品葡聚 糖（Dextran) (浓度梯度为 10(^g/ml， 3(^g/ml， l(^g/ml)、阳性对照脂多糖（LPS) 与纯化的 T、 Β 淋巴细胞共培养， 42h 惨入 1H-TdR， 48h 后采用细胞收集器 Filtermate harvester检测其增殖指数。 结果见图 8。
结论：磁珠分选获得高纯度的 T、 Β细胞，与槐耳多糖共孵育 48h后， 3H-TdR 结果显示， 槐耳多糖组分 TP-1、 TP-2、 TP-3、 TP-4、 TCP剌激的是 Β细胞， 而 非 Τ细胞。 且这种剌激作用呈剂量相关性。
3 ) 槐耳多糖剌激小鼠脾细胞及人外周血单个核细胞 （PBMC ) 后， Τ、 Β 细胞比例变化
方法： 粗多糖 TCP、槐耳多糖 TP-1、 ΤΡ-2、 ΤΡ-3、 ΤΡ-4与葡聚糖 (Dextran) (浓度为 50μ§/ιη1)、 脂多糖 （LPS) 与小鼠脾细胞及人外周血 PBMC共培养， 24小时后， 流式检测 1\ B细胞比例。 结果见图 9。
结论：槐耳多糖 TP-1、 ΤΡ-2、 ΤΡ-3、 ΤΡ-4剌激小鼠脾细胞或人外周血 PBMC 后， 与对照药物葡聚糖 （Dextran) 相比， B细胞比例明显上调， 而 T细胞比例 无明显变化。
4) 槐耳多糖剌激小鼠脾细胞后， T， Β细胞上 CD69的表达
方法： 粗多糖 TCP、 槐耳多糖 TP-1、 ΤΡ-2、 ΤΡ-3、 ΤΡ-4与对照多糖葡聚糖 (Dextran) (浓度为 50μ§/ιη1)、 脂多糖（LPS) 与小鼠脾细胞共培养， 6小时后， 流式检测 1\ B细胞表面 CD69的表达。 结果见图 10。
结论： 槐耳多糖剌激小鼠脾细胞 6h后， B细胞开始高表达 CD69, 而 T细 胞无明显变化。
3、 促进巨噬细胞释放 NO 方法：小鼠腹腔巨噬细胞体外培养，加入粗多糖 TCP、槐耳多糖 ΤΡ-1、ΤΡ-2、 ΤΡ-3、 ΤΡ-4、 低分子量组分 ΤΟ-1、 ΤΟ-2、 ΤΟ-3、 ΤΟ-4、 槐耳粗总游离蛋白部 分 TFP与对照多糖葡聚糖 （Dextran)、 脂多糖 （LPS ) 共培养， 48小时后， 用 格里斯试剂盒 （Griess Reagent kit) 检测细胞培养上清中 NO的含量， 结果见图 11。
结论： NO检测结果显示， 槐耳多糖能够剌激小鼠巨噬细胞分泌 NO， 且分 泌量与多糖浓度呈剂量相关性。 低分子量组分剌激后 NO 的分泌则没有显著变 化。 实施例 4 槐耳多糖蛋白对肿瘤血管形成内皮细胞增值的抑制作用 一、 实验方法与步骤：
1、 实验材料
细胞： 人类肿瘤来源的血管内皮细胞
试剂: M199培养基，双抗，胎牛血清 (FBS)，碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)， 明胶 （ gelatin )。
待测样品： TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2
2、 实验步骤：
( 1 ) 用排枪将 0.2%明胶加入 96孔板内， 每孔 40微升， 摇匀。 放入培养箱 孵育 30分钟以上。
(2) 取出 96孔板， 用排枪吸出明胶， 用 PBS洗一遍， 放于超净台备用。
(3 ) 配制 20%FBS， 加双抗的 M199培养液。
(4) 取复苏的人类肿瘤来源的血管内皮细胞， 吸出培养液， 用 PBS洗一次， 离心后用 10%血清的 M199重悬计数， 调整细胞浓度为 40000-50000/ml。
( 5 ) 用排枪将细胞加入 96孔板， 每孔 100微升， 边缘孔加等量 PBS。 放入 培养箱。
(6. ) 12小时后， 配制含 1%-5% FBS， 10-100ng/ml bFGF的 M199培养基。 (7. ) 取出 96孔板， 用排枪吸出培养基， 加入含 1%-5%FBS 以及 bFGF 的 M199与药物，每孔 100微升，设对照组与调零组。并加入待测样品，分别为 TCP、 TP- 1、 TP-2、 TP-3与 ΤΡ-4。每一样品设 4个浓度，分别为 l(^g/L、 10(^g/L、50(^g/L、 与 100(^g/L。 然后在 37°C， 5%的 CO2下连续孵育。
( 8 ) 72小时后， 吸去培养基， 加 MTT (浓度 0.5 mg/ml， 过滤除菌)， 孵育 4-6 小时。
(9) 吸去 MTT， 力 P 100微升 DMSO, 570 nm测 OD.
二、 实验结论： 槐耳多糖蛋白 -2 (TP-2) 对肿瘤血管内皮细胞的增殖具有显著的抑制作用。 结果见图 12。 图中数值显示为均数 ±标准差。各给药组与对照组相比较后， 并经方 差分析及事后 T检验。 *P<0.05， 表示两组比较有显著性差异。 **P<0.01， 表示 两组比较有很显著差异。 ***P<0.001， 表示两组比较有极显著差异。

Claims

权 利 要 求
1、 一种槐耳多糖蛋白， 该多糖蛋白的单糖组成为阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄 糖、 木糖及甘露糖， 其质量比为 7.4:4.5:2.7:9.4: 1.9。
2、 根据权利要求 1所述的多糖蛋白， 其特征在于， 所述多糖蛋白的重均分 子量为 7.0xl05-2.0xl06Da， 优选为 1.86xl06Da。
3、 根据权利要求 1或 2所述的多糖蛋白， 其特征在于， 该多糖蛋白的制备方 法包括如下步骤：
(1) 将浓度为 2%-20% (质量 /体积）， 优选为 8% (质量 /体积） 的槐耳菌 质提取物水溶液采用 Sevage法去除游离蛋白， 收集糖类部分；
(2) 将步骤 （1) 得到的糖类部分加入无水乙醇中， 使其形成醇浓度为 30%-80% (体积）， 优选 30%-50% (体积）， 最优选为 40% (体积） 的糖溶液， 离心， 得到沉淀物；
(3) 将步骤 （2) 得到的沉淀物加水溶解， 过滤， 浓缩、 透析收集袋内部 分； 以及
(4) 使用离子交换柱色谱对步骤 （3) 收集到的袋内部分进行分离， 其中 使用的洗脱液为水、 0.4 Mol/L -0.8 Mol/L的 NaCl水溶液， 优选为 0.5 Mol/L的 NaCl水溶液。
4、 根据权利要求 3所述的多糖蛋白， 其特征在于， 所述多糖蛋白的制备方 法还包括对 NaCl溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。
5、 根据权利要求 4所述的多糖蛋白， 其特征在于， 所述多糖蛋白的制备方 法还包括采用 Sepharose CL-6B 琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯 化的步骤。
6、 一种权利要求 1至 5中任一项所述的多糖蛋白的制备方法， 该制备方法 包括如下步骤：
(1) 将浓度为 2%-20% (质量 /体积）， 优选为 8% (质量 /体积） 的槐耳菌 质提取物水溶液采用 Sevage法去除游离蛋白， 收集糖类部分；
(2) 将步骤 （1) 得到的糖类部分加入无水乙醇中， 使其形成醇浓度为 30%-80% (体积）， 优选 30%-50% (体积）， 最优选为 40% (体积） 的溶液， 离 心， 得到沉淀物；
(3) 将步骤 （2) 得到的沉淀物加水溶解， 过滤， 浓缩、 透析收集袋内部 分； 以及
(4) 使用离子交换柱色谱对步骤 （3) 收集到的袋内部分进行分离， 其中 使用的洗脱液为水、 0.4 Mol/L -0.8 Mol/L的 NaCl水溶液， 优选为 0.5 Mol/L的 NaCl水溶液， 即得。
7、 根据权利要求 6所述的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法还包括对 NaCl溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。
8、 根据权利要求 7所述的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法还包括采 用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。
9、 根据权利要求 6至 8中任一项所述的制备方法， 其特征在于， 所述制备 方法包括如下步骤：
( 1 )准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏 300g， 加入适量蒸馏水将其稀释为 浓度约为 8% (质量 /体积） 的稀溶液， 之后采用 Sevage 法去游离蛋白， 重复操 作 5次， 收集糖类部分；
(2) 向步骤 （1 ) 得到的槐耳菌质糖类部分中缓缓加入无水乙醇使其成为 醇浓度为 40% (体积） 的糖溶液， 4°C静置 24小时后， 以 3000转 /分钟的速度 离心 10分钟， 沉淀， 得到沉淀物；
( 3 ) 称取适量步骤 （2) 得到的沉淀物， 将其溶解于 150ml蒸馏水中， 过 滤， 减压浓缩至体积 50ml; 透析收集袋内部分， 以及
(4) 使用 DEAE-52离子交换柱色谱对步骤 （3 ) 收集到的袋内部分进行分 离， 采用 0.5 Mol/L的 NaCl水溶液进行洗脱， 洗脱部分在浓缩后进行透析除盐， 透析过程为对流水透析三天， 蒸馏水透析两天； 以及
( 5 )采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对步骤（4)得到的产品进行分离 纯化， 直至高效液相色谱法检测为纯品为止。
10、 权利要求 1至 5中任一项所述的多糖蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的 用途。
11、 一种药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物包含槐耳多糖蛋白和 药学上可接受的载体， 其中， 所述组合物中含有重量比为 0.01%-99.95%的槐耳 多糖蛋白作为活性成分， 并且以槐耳多糖蛋白的总重量计， 所述槐耳多糖蛋白 中含有 90wt%-100wt%的权利要求 1至 5中任一项所述的槐耳多糖蛋白。
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