CN111748045B

CN111748045B - 亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯制备方法及应用

Info

Publication number: CN111748045B
Application number: CN201910237552.7A
Authority: CN
Inventors: 董彩霞; 李轶; 邓菲
Original assignee: Tianjin Medical University
Current assignee: Tianjin Medical University
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2022-01-07
Anticipated expiration: 2039-03-27
Also published as: CN111748045A

Abstract

本发明提供亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯，由岩藻糖和半乳糖组成，分子量为4.0×10⁵‑6.0×10⁵，亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯由亨氏马尾藻提取获得；通过提取亨氏马尾藻粗多糖，再将粗多糖多次经过离子交换色谱和分子筛色谱柱提纯，从而获得能够用于抗疱疹病毒研究的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯。本方案能够从海洋药用资源亨氏马尾藻中分离具有新颖抗病毒作用模式、低毒高效、安全易被接受的天然多糖，能够为进一步开发作用机制新颖、疗效确切、靶点明确抗病毒药物提供研究基础；亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯能够通过有效的抑制疱疹病毒吸附至宿主细胞表面而起到抗病毒作用，其作用位点是细胞表面，可作用于病毒感染的第一步，不进入细胞，引起毒副作用的可能性相对较小。

Description

亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯制备方法及应用

技术领域

本发明属于抗病毒药物领域，尤其是涉及亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯制备方法及应用。

背景技术

II型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type II，HSV-2)可以引起生殖器疱疹、先天性疱疹脑炎等感染性疾病，同时也是人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiencyvirus，HIV)感染的一个重要影响因素。目前针对HSV-2感染的治疗方法主要有疫苗免疫和抗病毒药物治疗，自1990年以来的六次HSV-2疫苗研制的临床试验均以失败而告终，HSV-2疫苗研究仍有很多问题有待进一步解决，其最终问世可能还需很长时间，因此，药物治疗仍然是目前治疗HSV-2感染的主要手段。

由于抗病毒药物的研制起步较晚，目前临床上能有效治疗病毒性疾病的药物十分匮乏。近些年，虽然药物研究工作者投入巨大的努力研发抗疱疹病毒的新药，但临床效果较好的抗疱疹病毒的药物仍然是类核苷类药物，如Acyclovir，Valaciclovir，Vidarabine等。其中首选药物Acyclovir一直广泛应用在临床治疗免疫功能正常的疱疹病毒感染者，对初发的疱疹有很好的抗病毒作用。但由于该类药物无法阻断病毒感染和传播，对复发性疱疹疗效较差，并且由于长期大量的使用，使临床上95％的患者产生了耐药性，极大限制了该类药物的应用，尤其对免疫功能低下的患者，增加了HSV感染复发的风险。因此，开发具有新型抗病毒作用机制的药物来取代或者辅助类核苷类药物用药势在必行。

马尾藻属海藻隶属于褐藻门墨角藻目马尾藻科，在我国有丰富的资源和悠久的药用历史。其中亨氏马尾藻(Sargassumhenslowianum)是暖温带广东、浙江沿海最常见且大量生长，是我国马尾藻属海藻最大的天然资源之一，具有与药典品种羊栖菜(Sargassumfusiforme(Harv.)Setch.)和海蒿子(Sargassumpadllidum(Turn.)C.Ag.)相似的功效，是民间常用的17种药用马尾藻之一。近年的研究中发现从马尾藻属海藻铜藻(Sargassumhorneri)的热水提取物中分离到的一种岩藻聚糖硫酸酯的组分，有抑制HSV-1、HIV-1、和人细胞巨化病毒作用，其中对HSV-1的抑制选择性指数SI能够达到11000，优于现有药物阳性药物Acyclovir(一般为1000-3000)。并且，现有临床应用的抗II型疱疹病毒的药物仍然为类核苷类药物，这类药物主要通过阻断病毒DNA的复制起到抗病毒的作用，对初次感染II型疱疹病毒的病人效果较好。但长期应用，耐用性病毒株出现，产生耐药性，对于复发的病人效果不明显。

亨氏马尾藻是也是上述活性多糖的一个重要的天然来源，其结构特征各部相同，所具有的效果也差别甚远，前期的研究结果表明亨氏马尾藻粗多糖具有抗疱疹病毒和科萨奇病毒的作用。虽然近些年有学者对亨氏马尾藻的多糖类成分进行了化学方面的研究，但由于多糖类结构的复杂性及分析手段的局限性，对亨氏马尾藻多糖的研究仅限于提取工艺、单糖组成的研究，药理活性也因此限制在粗多糖的研究层面，其药效物质基础和作用机制尚不明确。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯制备方法及应用。

本发明采用的技术方案是：亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯，由岩藻糖和半乳糖组成，分子量为4.0×10⁵-6.0×10⁵；

优选地，岩藻糖在亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯中的占比为74-77％，优选为76.3％或74.9％。

优选地，亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯主链由1,3-链接α-L-Fucp残基组成，在主链糖残基的O-2位和O-4位被硫酸酯化，或者主链残基在O-2位被硫酸酯化，或者O-2、O-3和O-4位被硫酸酯化；主链糖残基的O-2或/和O-4-位有分支；支链由末端链接、1,2-链接、1,6-链接、1,2,6-链接的Galp残基组成，Galp残基的非链接位置均被硫酸酯化，主链糖残基的O-2位有分支，支链由末端链接和1，6-链接的Galp残基组成。

优选地，亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯由亨氏马尾藻提取获得。

制备亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，具体步骤如下：

步骤一取干燥的亨氏马尾藻药材，热水回流，所得溶液浓缩或获得提取液；

步骤二向提取液加入乙醇进行醇沉，收集醇沉物后复溶于水，去离子水透析后对透析内液冻干，获得亨氏马尾藻粗多糖SHCP；

步骤三取亨氏马尾藻粗多糖SHCP制成粗多糖溶液，通过色谱柱多次层析纯化获得亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯SHAP；

其中，步骤三中具体纯化步骤如下：

步骤A制备亨氏马尾藻粗多糖SHCP溶液，经阴离子交换柱，分别用H₂O、0.5mo l/LNaCl、1.0mol/L NaCl洗脱，收集含糖部分，取1.0mol/L NaCl洗脱部分SHA2，冻干保存；

步骤B制备含糖组分SHA2溶液，经阴离子交换柱，以0-1mol/L的NaCl溶液进行梯度混合洗脱，分段收集获得SHA2A、SHA2B、SHA2C、SHA2D四个含糖组分，将SHA2C冻干保存；

步骤C制备含糖组分SHA2C溶液，经凝胶色谱柱，用0.l mo l/L NaCl洗脱，用硫酸苯酚法检测，收集获得含糖组分SHA2C-1和SHA2C-2；分别重复经凝胶色谱柱，用0.l mo l/LNaCl洗脱，得到纯化的含糖组分SHAP-1和SHAP-2，即为亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯SHAP。

优选地，步骤一中，先将干燥的亨氏马尾藻药材脱脂处理，晾干后再进行热水回流提取；

优选地，热水连续回流三次，每次2h。

优选地，步骤二中采用12000Da分子量的透析袋进行透析。

亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯在抗疱疹病毒药物中的应用；

优选地，抗疱疹病毒为I型疱疹病毒HSV-1或II型疱疹病毒HSV-2；

优选地，亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯对I型疱疹病毒的选择性指数SI>50000，对II型疱疹病毒的选择性指数SI>500000；

优选地，亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯通过抑制疱疹病毒吸附至宿主细胞表面而起到抗病毒作用。

本发明具有的优点和积极效果是：

1本方案能够从海洋药用资源马尾藻属海藻--亨氏马尾藻中分离具有新颖抗病毒作用模式、低毒高效、安全易被接受的天然多糖，能够为进一步开发作用机制新颖、疗效确切、靶点明确抗病毒药物提供研究基础；

2本方案分别采用CCK-8法和台盼蓝法及流式细胞技术对亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯进行了细胞毒测试，即使浓度增加至5mg/mL依然没有显示出明显细胞毒作用，确保了亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯作为潜在药物的安全性；

3本案所涉及的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯对I型疱疹病毒的选择性指数SI>50000，对II型疱疹病毒的选择性指数SI>500000，明显优于现行临床药物Acyclovir(一般为1000-3000)的抗病毒效果，也明显高于现有技术中海藻铜藻分离到的岩藻聚糖硫酸酯对HSV-1的抑制选择性指数SI所达到的11000；

4本案所涉及的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯能够通过有效的抑制疱疹病毒吸附至宿主细胞表面而起到抗病毒作用，其作用位点是细胞表面，可作用于病毒感染的第一步，不进入细胞，因此引起毒副作用的可能性相对较小。

附图说明

图1亨氏马尾藻纯化多糖的分离流程；

图2 SHA2在DEAE-650M离子交换色谱柱上的洗脱曲线；

图3亨氏马尾藻纯化多糖的高效液相凝胶渗透色谱图；

图4 SHNP，SHAP-1，和SHAP-2在200-400nm范围内的紫外扫描；

图5 HSAP-1和HSAP-2单糖组成分析色谱图(1，甘露糖；2，鼠李糖；3，葡萄糖醛酸；4，半乳糖醛酸；5，葡萄糖；6，半乳糖；7，阿拉伯糖；8，岩藻糖)；

图6 SHAP-1样品脱硫前后红外光谱对照；

图7 SHAP-2样品脱硫前后红外光谱对照；

图8亨氏马尾藻来源的HSNP，HSAP-1和HSAP-2纯化多糖的细胞毒实验；图9两个亨氏马尾藻纯化多糖的抗病毒筛选结果；

图10样品抗病毒的敏感时相分析实验结果；

图11 SHAP-1和SHAP-2对HSV-2吸附步骤的抑制实验结果；

图12 SHAP-1和SHAP-2对HSV-2侵入步骤的抑制实验结果；

图13 SHAP-1的¹H-NMR谱；

图14 DS-SHAP-1的¹H-NMR谱；

图15 SHAP-1的¹³C-NMR谱；

图16 DS-SHAP-1的¹³C-NMR谱；

图17 SHAP-2的¹H-NMR谱；

图18 DS-SHAP-2的¹H-NMR谱；

图19 DS-SHAP-2的¹³C-NMR谱。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的一个实施例做出说明。实施例中未标注具体条件的实验方案，皆按照常规方案或产品说明书中所建议的反应条件。实施例中的通用设备、材料和试剂等，如无特指，皆可从商业购买。

亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯SHAP，由亨氏马尾藻提取获得，检测其由岩藻糖和半乳糖组成，分子量为4.0×10⁵-6.0×10⁵；具体通过对亨氏马尾藻粗多糖的多次纯化提取，获得两个相关组分，分别为SHAP-1和SHAP-2，其分子量分别为6.0×10⁵，4.2×10⁵，通过对SHAP-1和SHAP-2的单糖组成分析能够看出，二者均由少量的半乳糖和大量的岩藻糖组成，不含蛋白，也不含糖醛酸，SHAP-1中岩藻糖含量为76.3％，SHAP-2中岩藻糖含量为74.9％。

采用颜色反应、红外光谱、高效液相色谱(HPGPC)、化学衍生结合气相色谱-质谱联用技术和核磁共振技术对分离得到的两个多糖进行结构特征研究。对SHAP-1和SHAP-2经过脱硫处理后，脱硫前和脱硫后样品的甲基化衍生的PMAA产物经GC-MS测试得知，亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯主链主链主要由1,3-链接α-L-Fucp残基组成，且在主链糖残基的O-2位和O-4位被硫酸酯化，仅少量的主链残基在O-2位或O-2、O-3和O-4位被硫酸酯化。另外在主链糖残基的O-2或/和O-4-位有少量的分支。支链主要由末端链接、1,2-链接、1,6-链接、1,2,6-链接的Galp残基组成，且Galp糖残基的非链接位置均被硫酸酯化。

其中，步骤三中具体纯化步骤如下：

步骤A制备亨氏马尾藻粗多糖SHCP溶液，经阴离子交换柱，分别用H₂O、0.5mo l/LNaCl、1.0mol/L NaCl洗脱，取1.0mol/L NaCl洗脱部分含糖组分SHA2，冻干保存；

具体可按照下述方式进行。

步骤一取干燥的亨氏马尾藻药材，无水乙醇在室温下脱脂24h，将药渣过滤晾干，在90-100℃热水中连续回流三次，每次2h，所得液体合并浓缩后获得提取液；预脱脂步骤能够降低对多糖提取的影响，提高提取效率；

步骤二向提取液中加入乙醇进行醇沉，收集沉淀后复溶于水，装入12000Da分子量的透析袋，去离子水透析后对透析内液冻干，获得亨氏马尾藻粗多糖SHCP；

步骤三取亨氏马尾藻粗多糖SHCP制成粗多糖溶液，通过色谱柱多次层析纯化获得亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯SHAP；具体如下：

亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯能够应用在抗疱疹病毒中；对提取的含糖组分SHAP-1和SHAP-2，分别采用CCK-8法和台盼蓝法及流式细胞技术对两个纯化多糖进行了细胞毒测试，结果显示在两种方法测试下，即使浓度增加至5mg/mL依然没有显示出明显细胞毒作用，确保了多糖作为潜在药物的安全性。对SHAP-1和SHAP-2抗病毒活性进行筛选，结果显示两个硫酸酯化多糖HSAP-1和HSAP-2分别在10μg/mL显示出了显著的抗I型疱疹病毒(HSV-1)作用，几乎完全抑制病毒对Vero细胞的感染，半数致死量IC50均为1μg/mL；而两个硫酸酯化多糖均在1μg/mL显示出了显著的抗II型疱疹病毒(HSV-2)作用，完全抑制了病毒对Vero细胞的感染，半数致死量IC50均为0.1μg/mL。按照通用的抗病毒评价指标抗病毒选择指性数SI(SI＝CC50/IC50)计算，两个硫酸酯化多糖HSAP-1和HSAP-2对I型疱疹病毒的选择性指数SI>50000，对II型疱疹病毒的选择性指数SI>500000，明显优于现行临床药物Acyclovir(一般为1000-3000)的抗病毒效果。

为阐明其作用靶点，本项目通过抑制病毒敏感时相分析、抑制病毒吸附实验和抑制病毒侵入实验，阐明了SHAP-1和SHAP-2对疱疹病毒感染宿主细胞的作用的靶点步骤。通过多糖样品干扰病毒吸附实验可知SHAP-1和SHAP-2在样品浓度约0.15μg/mL时即可抑制半数病毒吸附至宿主细胞，在100μg/mL时完全抑制了II型疱疹病毒对宿主细胞的吸附，提示SHAP-1和SHAP-2能够通过有效的抑制疱疹病毒吸附至宿主细胞表面而起到抗病毒作用。

HSV-2是被膜DNA病毒，它的感染始于病毒与宿主细胞的接触，进而侵入细胞进行后继的复制。因此，干扰病毒进入细胞是抗病毒治疗优选的方案，已成为开发抗病毒制剂研究的热点。在这一研究领域，天然或合成来源的硫酸酯化多糖(Sulfated polysaccharide)显示出令人鼓舞的抗病毒潜力。与临床用药物Acyclovir抑制病毒DNA复制的机理不同，这类物质的作用位点是细胞表面，其特点是可作用于病毒感染的第一步，不进入细胞，因此引起毒副作用的可能性相对较小。

下面通过具体实施例对本方案所涉及的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯结构特征，提取方法和抗病毒应用做出进一步说明。

实施例1亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的提取、分离和纯化

亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的提取分离流程图如图1所示。取亨氏马尾藻干燥药材，加入3倍量体积的无水乙醇在室温下脱脂24h，药渣过滤去除醇味后，加入30倍质量的水，热水回流提取3次，每次2h，合并三次滤液，减压浓缩。浓缩液加入98％乙醇至终浓度为80％，根据情况也可采用95％乙醇或无水乙醇，放至4℃过夜醇沉。醇沉物复溶于去离子水，以12000Da分子量的透析袋对去离子水透析，收集袋内溶液，减压浓缩、冷冻干燥，得到亨氏马尾藻粗多糖SHCP(48克，6％)。

取2克粗多糖样品SHCP复溶于适量去离子水，离心后取上清液，上样至已装填平衡完全的阴离子交换柱(DEAE-650M，55mm×19cm)，分别用H₂O、0.5mol/L NaCl、1.0mol/LNaCl洗脱，以硫酸苯酚法检测，分段收集含糖部分，其中1.0mol/L NaCl洗脱部分为主要含糖组分SHA2，经透析、冷冻干燥，得率为26.8％。

取1.0克SHA2样品溶于适量去离子水，离心去除不溶物后，上清液上样至已装填平衡完全的阴离子交换柱(DEAE-650M，55mm×19cm)，以0-1mol/L的NaCl溶液进行线性洗脱，以硫酸苯酚法检测，分段收集含糖部分的洗脱液，得到SHA2A、SHA2B、SHA2C、SHA2D四个组分，各个组分洗脱曲线如图2所示，其中主要组分SHA2C经透析、冷冻干燥，得率为47.3％。

取1.0克SHA2C样品溶于适量去离子水，离心去除不溶物后，上清液上样至已装填平衡完全的凝胶色谱柱(Sepharose 6B，40mm×90cm)，用0.l mo l/LNaCl洗脱，按每管15ml收集洗脱液，用硫酸苯酚法检测，得到两个主要组分SHA2C-1和SHA2C-2。两个组分进一步采用凝胶色谱柱(Sepharcyl S-500，22mm×90cm)纯化，用0.l mol/L NaCl洗脱，按每管5mL收集，得到纯化多糖SHAP-1(680毫克，11.2％)和SHAP-2(440毫克，7.24％)。

实施例2亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯SHAP-1和SHAP-2结构特征分析

1.均一性分析及分子量测定

取普鲁兰系列标准品(分子量分别为642、337、194、107、47.1、21.1、9.6、6.1kD)5mg，用l mL超纯水充分溶解后，分别配置成5mg·mL^-1普鲁兰系列标准溶液，过0.22μm滤膜，备用。分别取10μL标准溶液，进样至高效凝胶色谱仪(HPGPC)，用0.02M CH₃COONH₄洗脱，流速为0.6mL·min^-1，柱温40℃。以保留时间A为纵坐标，分子量C为横坐标绘制标准曲线A＝-1.449C+19.868，R²＝0.9968。取亨氏马尾藻多糖单一组分样品5mg，用l mL超纯水充分溶解后，配置成5mg·mL^-1样品溶液，过0.22μm滤膜，进样至高效凝胶色谱仪(HPGPC)，用0.02MCH₃COONH₄洗脱，流速为0.6mL·min^-1，柱温40℃。得出本发明提取方法提取的亨氏马尾藻多糖保留时间。

两个多糖均为无色粉末，具有非常好的水溶性。如图3所示，高效凝胶色谱测定结果显示两个多糖均峰型尖锐、对称，结果表明这两个多糖均为分子量分布均一的纯化多糖。经普鲁兰系列标准曲线计算，两个多糖的相对分子量分别为：6.0×10⁵，4.2×10⁵。

2.化学组成分析

(1)总糖含量测定

总糖含量利用苯酚硫酸法进行测定。以α-D-半乳糖做标准品，配制1mg·mL^-1半乳糖标准品溶液，依次稀释成200μg·mL^-1，100μg·mL^-1，50μg·mL^-1，25μg·mL^-1、12μg·mL^-1系列浓度溶液，分别取0.2ml半乳糖标准品系列浓度，加入0.2mL质量分数5％苯酚溶液，快速加入l.0mL浓硫酸，充分震荡后，静置20min，在490nm处测定吸光度，以浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线A＝0.0077C+0.0473，R²＝0.9996。取干燥的样品，配制成100μg·mL^-1样品溶液，稀释至50μg·mL^-1，按照上述方法显色后测定吸光度，带入标准曲线，计算样品总糖含量。

(2)糖醛酸含量测定

糖醛酸含量利用间羟基联苯法进行测定。以α-D-半乳糖醛酸做标准品，配制1mg·mL^-1半乳糖醛酸标准品溶液，依次稀释成20μg·mL^-1，10μg·mL^-1，5μg·mL^-1，2.5μg·mL^-1，1.25μg·mL^-1系列浓度溶液，分别吸取200μL半乳糖醛酸标准品系列浓度，加入l.2mL0.0125M硫酸-四硼酸钠溶液，冰浴至冷却，l00℃水浴加热5min，冰浴冷却后，加入20μL体积分数为0.15％间羟基联苯溶液，空白组加入20μL质量浓度0.5％的NaOH溶液充分震荡后，静置5min，在520nm出测定吸光度，以浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线A＝0.0709C-0.0847，R2＝0.9855。取干燥的样品，配制成100μg·mL^-1样品溶液，稀释至50μg·mL，按照上述方法显色后测定吸光度，带入标准曲线，计算样品糖醛酸含量。

(3)硫酸根含量测定

硫酸根含量测定采用元素分析仪进行S元素的测定。分别用下列公式计算SHAP-1，SHAP-2的硫酸根含量，硫酸根含量(％)＝S％×3.22。其中S％为样品中硫的百分比，3.22为硫含量与硫酸盐含量的换算系数。

两个多糖的化学组成分析结果如表1所示，从亨氏马尾藻中分离得到的SHAP-1和SHAP-2的总糖含量分别为61.1％和45.8％，间苯三酚方法检测结果显示两个多糖含有痕量糖醛酸，由于颜色反应较大的误差(10％)，可以认为SHAP-1和SHAP-2结构中不含糖醛酸。元素分析结果，SHAP-1和SHAP-2样品中含有硫元素，根据公式计算硫酸根含量，结果发现SHAP-1和SHAP-2的硫酸根含量近相同。由图4可以看出，在260-280nm处无吸收峰，可以提示两个多糖均不含蛋白。

表1亨氏马尾藻多糖样品的化学组成分析

3.单糖组成分析

采用PMP衍生法检测硫酸酯化多糖的单糖组成。

标准品配制及衍生化：准确称取单糖标准品(Fuc，Rha，Ara，Man，Gal，Glc，GlcA，GalA)各10mg，以纯水配制成2mg/mL的混合标准溶液。取标准液500μL加入500μL的4M TFA在120℃水解2h。反应完毕后，冷却，用N₂吹干。水解产物再以0.5mL纯水溶解，摇匀。各取0.1mL加入0.1mL 0.6M NaOH，加入0.2mL 0.5M PMP甲醇液，混匀后在70℃反应30min。取出，冷却至室温，用0.1mL的0.6M HCl调节至中性，加入等体积的三氯甲烷萃取，离心，水层上清液以微孔滤膜(0.22μM)滤过，备高效液相色谱分析用。

样品的制备：取1mg样品，配制2mg/mL的样品水溶液。按照上述步骤制备PMP衍生物。

色谱条件：流动相A(0.1M乙酸铵缓冲液)，流动相B(乙腈)流速1mL/min，检测波长245nm，进样量5μL，柱温30℃。流动相按照表2中梯度进行。

表2流动相的梯度洗脱程序

结果如图5所示，混合单糖标准品的色谱图从左至右依次是：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖。根据SHAP-1、SHAP-2的PMP衍生物的HPLC图谱计算每种单糖占总单糖的百分比。两个硫酸酯化多糖的单糖组分分析结果如表3所示。由表可知，SHAP-1和SHAP-2均由大量岩藻糖Fuc和少量半乳糖Gal组成，两个多糖均不含糖醛酸。

表3亨氏马尾藻多糖样品的单糖组成分析

4.糖苷键的组成分析

(1)硫酸酯化多糖的脱硫处理

硫酸酯化多糖在进行甲基化前需要进行脱硫处理，方法如下：SHAP-1和SHAP-2(100mg)以纯水做流动相通过Dowex 50w×8树脂柱(H⁺，2×13cm)进行脱盐处理，所得脱盐后的多糖样品以吡啶中和形成吡啶盐，所得样品溶液冻干处理。冻干后的吡啶盐多糖以10％甲醇/二甲亚砜(10mL)充分溶解后，在金属浴中反应5h，温度设置为80℃。反应完毕后用1000Da透析袋对反应混合物进行透析，透析袋内容物冻干得到脱硫后的多糖DS-SHAP-1和DS-SHAP-2。

(2)硫酸酯化多糖的脱硫结果验证

以FT-IR光谱对脱硫产物进行验证。方法：KBr压片法。取干燥的多糖样品约2mg，加入约200mg KBr在玛瑙研钵中研磨混合后压片，用红外光谱仪在4000—400cm^-1区域内进行红外扫描。

(3)甲基化分析

对脱硫前后的样品分别进行甲基化，通过比较脱硫前后甲基化后的分析结果，确定糖苷键类型和硫酸根的取代位置。具体方法如下：

分别取干燥的SHAP-1和SHAP-2多糖样品2mg，DS-SHAP-1和DS-SHAP-2样品1mg于2mL反应瓶中，置于干燥器中过夜。加入l mL DMSO，搅拌至样品完全溶解。将50mg NaOH用研钵中研成细粉，加入反应瓶中，搅拌2h。分3次加入450μL碘甲烷，室温下搅拌45min，至溶液澄清透明，以纯水冰浴条件下终止反应，以氮气去除过量碘甲烷后，用等量氯仿萃取甲基化产物，再用纯水洗涤5次，水层弃去。部分甲基化产物以2M TFA在120℃条件下水解2h。水解产物以0.5mL的l mo l/L氨水充分溶解，加入30mg硼氘化钠粉末，室温下进行还原反应。反应过夜后加入10％体积分数的醋酸-甲醇溶液终止反应，用减压浓缩法去除溶解。还原产物加入l mL醋酸酐和0.l mL的1—甲基咪唑在室温条件下进行乙酰化反应，反应15min后加入l mL纯水终止反应，以氯仿萃取部分甲基化的乙酰化产物，以无水硫酸钠干燥后，备GC-MS分析用。

GC-MS进样条件：载气为He₂，分流比100：1，检测器：280℃，柱温初始温度设为120℃，按照每分钟4℃升高至280℃，保持5min。根据分子质谱图和相对保留时间鉴别糖残基。

(4)核磁NMR测定

SHAP-1和DS-SHAP-1；SHAP-2和DS-SHAP-2(12mg)在P₂O₅真空干燥72h后，通过冻干法用D₂O(0.5mL)作溶剂来进行氘交换。以Bruker Avance 400光谱仪对脱硫前后多糖样品的^l H-NMR和¹³C-NMR测定，温度设置在40℃。¹H化学位移引用HDO在δ4.79ppm作为内标，结果如图13-19所示。

硫酸酯化多糖进行甲基化前需将样品进行脱硫，通过对脱硫前后样品甲基化产物的分析获知糖苷键组成及硫酸根的取代位置。首先对两个硫酸酯化多糖经脱硫处理，以红外光谱验证脱硫的效果。脱硫前后样品的红外图谱如图6图7所示。SHAP-1和SHAP-2在3444.8cm^-1附近有非常显著的羟基的伸缩振动峰，观察到1265.25cm^-1附近有显著的振动峰，是由于硫酸酯S＝O＝S的不对称伸缩振动导致的。结果表明，多糖SHAP-1和SHAP-2是硫酸酯化的岩藻聚糖。另外，脱硫后的样品DS-SHAP-1和DS-SHAP-2在1265.25cm^-1的伸缩振动峰均消失，说明样品脱硫完全。

表4亨氏马尾藻多糖样品SHAP-1的单糖组成分析

以SHAP-1为例，经过脱硫处理后，脱硫前SHAP-1和脱硫后样品DS-SHAP-1甲基化分析结果如表4所示。脱硫前样品主要由1,2,3,4-链接Fcup(72.6％)和1,2,3,4,6-链接Galp(18.9％)糖残基组成，二者占总糖残基的91.5％。脱硫后样品中1,2,3,4-链接Fcup糖残基组成降低至2.8％，同时1,3-链接Fucp的组成增加至49.5％，末端链接Fucp和1,3,4-链接Fcup分别增加了8.1％和9.4％，提示SHAP-1主链由1,3-链接Fucp残基组成，且在主链糖残基的O-2位和O-4位被硫酸酯化，少量的主链残基在O-2位或O-2、O-3和O-4位被硫酸酯化。另外在主链糖残基的O-2或/和O-4-位有少量的分支。脱硫后样品中1,2,3,4,6-链接Galp糖残基消失，同时末端链接、1,2-链接、1,6-链接、1,2,6-链接的Galp残基均出现，提示SHAP-1样品中半乳糖残基主要以末端链接、1,2-链接、1,6-链接、1,2,6-链接的Galp残基形式存在，且Galp糖残基的非链接位置均被硫酸酯化。

根据以上分析方法对比SHAP-2脱硫前后的部分甲基化的乙酰衍生物(PMAA)得知，两个多糖的不同之处在于分子量和硫酸酯化度不同。

从SHAP-1的¹H-、¹³C-NMR谱图(图13和图15)中可以看出在α-异头端区域(δH 5.0–5.5,δC 92–101)有一些强烈的信号峰同时在高场区(δH1.2–1.3,δC16.0–16.5)存在一个较宽强烈的信号峰,从以上两点可判断主链中糖残基的构型是α-L-吡喃型岩藻糖(α-L-Fucp)。SHAP-2的谱图与SHAP-1相似。

综上所述，两个多糖的主链主要由1,3-链接α-L-Fucp残基组成，且在主链糖残基的O-2位和O-4位被硫酸酯化，仅少量的主链残基在O-2位或O-2、O-3和O-4位被硫酸酯化。另外在主链糖残基的O-2或/和O-4-位有少量的分支。支链主要由末端链接、1,2-链接、1,6-链接、1,2,6-链接的Galp残基组成，且Galp糖残基的非链接位置均被硫酸酯化。

实施例3亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯SHAP-1和SHAP-2抗病毒活性筛选

1、样品的细胞毒实验

(1)CCK8法

将Vero细胞以5×10³/well的密度铺在96孔板里，37℃，5％CO₂条件下培养过夜。第二天，加入梯度稀释后的药物，共同培养72小时(每个浓度3个重复)。每孔加入10μL的CCK8(5mg/mL，Beyotime)，继续培养2小时后，用酶标仪在450nm的波长处检测样品的吸光值。

(2)台盼蓝染色

将Vero细胞以1×10⁴/well的密度铺在24孔板里，37℃，5％CO2条件下培养过夜。第二天，加入梯度稀释后的药物，共同培养72小时(每个浓度3个重复)。用2.5％的胰酶消化细胞后用台盼蓝进行染色，显微镜下统计活死细胞比例。

(3)流式细胞仪分析

将Vero细胞以5×10⁴/well的密度铺在12孔板里，37℃，5％CO₂条件下培养过夜。第二天，加入梯度稀释后的药物，共同培养72小时。用2.5％的胰酶消化收集细胞后用PBS重悬清洗细胞2次后，加入5μL的碘化丙啶(PropidiumIodide)至100μL的细胞悬液中，避光孵育30分钟后，将细胞经过400目的尼龙网过滤后，用流式细胞仪计数统计样品死亡细胞比例。

结果如图8所示，结果显示三个多糖在两种方法测试下，即使浓度增加至5mg/mL依然没有显示出明显细胞毒作用，确保了多糖作为潜在药物的安全性。该实验进行了重复，均取得一致结果。

2、抗病毒活性筛选

将Vero细胞以2×10⁵/well的密度铺在12孔板里，培养过夜至细胞长满成单层细胞层。将药物用含有2％胎牛血清的DMEM培养基梯度稀释后分别与病毒(HSV-1或HSV-2，100PFU/well)混合均匀后，将药物和病毒混合液加入Vero细胞在37℃，5％CO₂条件下进行共孵育。2小时后，移走孵育液，加入含有1％甲基纤维素的DMEM培养基覆盖单层细胞，放入培养箱培养72小时。待噬斑形成后，固定细胞并用5％结晶紫染色液染色。在低倍显微镜下进行噬斑数统计并计算药物的抗病毒活性。抗病毒活性实验结果以与对照相比的噬斑数比例±SEM来展示。

本实验以样品抗病毒的选择性指数(SI)为指标进行活性筛选，一般SI大于10即可认为该样品具有潜在的抗病毒活性。可由样品的半数细胞毒浓度(CC50)及抑制病毒半数死亡的样品浓度(IC50)之比计算。即：SI＝CC50/IC50。

结果如图9所示，采用噬斑法对两个纯化多糖的抗病毒活性进行筛选，结果显示两个硫酸酯化多糖HSAP-1和HSAP-2分别在10μg/mL显示出了显著的抗I型疱疹病毒(HSV-1)作用，几乎完全抑制病毒对Vero细胞的感染，半数致死量IC50均为1μg/mL；而两个硫酸酯化多糖均在1μg/mL显示出了显著的抗II型疱疹病毒(HSV-2)作用，完全抑制了病毒对Vero细胞的感染，半数致死量IC50均为0.1μg/mL。按照通用的抗病毒评价指标抗病毒选择指性数SI(SI＝CC50/IC50)计算，两个硫酸酯化多糖HSAP-1和HSAP-2对I型疱疹病毒的选择性指数SI>50000，对II型疱疹病毒的选择性指数SI>500000，明显优于现行临床药物Acyclovir(一般为1000-3000)的抗病毒效果，其结果也要远远优于现有同属海藻的效果。

实施例4亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯SHAP-1和SHAP-2抗病毒作用机制研究

作用机制研究首先对对样品抗病毒的敏感时相进行分析，根据结果再具体分析样品作用于病毒感染的靶点步骤，包括样品对病毒的直接杀灭作用，干扰病毒对宿主细胞的吸附及侵入等靶点步骤。

1、样品抗病毒的敏感时相分析

将Vero细胞以2×10⁵/well的密度铺在12孔板里，培养过夜至细胞长满成单层细胞层，HSV-2病毒以100PFU/well的量感染vero细胞。样品SHAP-1或SHAP-2(0.1或1g/mL)分别在以下时间加入：感染前3h(3h b.i.)；感染时加入；感染时加入共孵育(0-10h)；感染1小时后加入共孵育(1-10h),感染3小时后加入共孵育(3-10h)；感染6小时后加入共孵育(6-10h)。病毒滴度通过噬斑法测定。以空白组噬斑形成数为100％，计算样品组噬斑数。实验重复三次，取平均值。

结果如图10所示，样品在病毒感染时加入能够起到显著的抗病毒效果，在感染后1小时和3小时加入显示了一定的抗病毒效果，而在感染前加入样品没有抗病毒效果。这些结果提示，样品可能通过干扰病毒吸附于宿主的机制起到抗病毒作用，对病毒的侵入有一定的效果，但不明显，而无直接的杀病毒作用。

2、多糖抗病毒作用的靶点

(1)抑制病毒吸附实验

将Vero细胞以2×10⁵/well的密度铺在12孔板里，培养过夜至细胞长满成单层细胞层。将药物用含有2％胎牛血清的DMEM培养基梯度稀释后分别与病毒(HSV-2，100PFU/well)混合均匀后，将药物-病毒混合液加入Vero细胞4℃共孵育1小时(病毒能够结合在细胞表面但不能进入细胞)，1小时后移走孵育液，PBS清洗3次以移去未结合的病毒颗粒，加入含有1％甲基纤维素的DMEM培养基覆盖单层细胞，放入培养箱(37℃，5％CO₂)培养待噬斑形成后，固定细胞并用5％结晶紫染色液染色。在低倍显微镜下进行噬斑数统计并计算噬斑减少率。

多糖样品干扰病毒吸附实验结果如图11所示，可知SHAP-1和SHAP-2在样品浓度约0.15μg/mL时即可抑制半数病毒吸附至宿主细胞，在100μg/mL时完全抑制了II型疱疹病毒对宿主细胞的吸附，提示SHAP-1和SHAP-2能够通过有效的抑制疱疹病毒吸附至宿主细胞表面而起到抗病毒作用，这与抗病毒敏感时相的分析结果一致。

(2)抑制病毒侵入实验

将Vero细胞预冷(4℃，15分钟)后，加入HSV2(100pfu/well)4℃孵育让病毒结合在细胞表面，1小时后移走病毒液，PBS清洗3次以移去未结合的病毒颗粒，加入含有梯度稀释药物的培养基37℃，5％CO2培养2小时，移去孵育液加入含有1％甲基纤维素的DMEM培养基覆盖单层细胞，放入培养箱(37℃，5％CO2)培养待噬斑形成后，固定细胞并用5％结晶紫染色液染色。在低倍显微镜下进行噬斑数统计并计算噬斑减少率。

结果图12所示，SHAP-1和SHAP-2即使在浓度达到1mg/mL能够抑制50％的病毒侵入寄主细胞，提示两个多糖对病毒感染后侵入寄主细胞有一定的抑制作用，但不明显，这与抗病毒敏感时相的分析结果一致。

HSV-2是被膜DNA病毒，它的感染始于病毒与宿主细胞的接触，进而侵入细胞进行后继的复制。因此，干扰病毒进入细胞是抗病毒治疗优选的方案，已成为开发抗病毒制剂研究的热点。在这一研究领域，天然或合成来源的硫酸酯化多糖(Sulfated polysaccharide)显示出令人鼓舞的抗病毒潜力。由以上研究结果可以得知，亨氏马尾藻来源的SHAP-1和SHAP-2能够显著抑制II型疱疹病毒吸附至宿主细胞表面，对抵抗病毒的感染起到决定性的作用，与临床用药物Acyclovir抑制病毒DNA复制的机理不同，这类物质的作用位点是细胞表面，可作用于病毒感染的第一步，不进入细胞，因此引起毒副作用的可能性相对较小。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims

1.亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯，其特征在于：由岩藻糖和半乳糖组成，分子量为4.0×10⁵-6.0×10⁵；

亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯主链由1,3-链接α-L-Fucp残基组成，在主链糖残基的O-2位和O-4位被硫酸酯化，或者主链残基在O-2位被硫酸酯化，或者O-2、O-3和O-4位被硫酸酯化；主链糖残基的O-2或/和O-4-位有分支；支链由末端链接、1,2-链接、1,6-链接、1,2,6-链接的Galp残基组成，Galp残基的非链接位置均被硫酸酯化。

2.根据权利要求1所述的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯，其特征在于：岩藻糖在亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯中的占比为74-77%。

3.根据权利要求1所述的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯，其特征在于：岩藻糖在亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯中的占比为76.3%或74.9%。

4.根据权利要求1-3中任一所述的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯，其特征在于：所述亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯由亨氏马尾藻提取获得。

5.制备权利要求1-4中任一所述的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

步骤一，取干燥的亨氏马尾藻药材，热水回流，所得溶液浓缩或获得提取液；

步骤二，向提取液加入乙醇进行醇沉，收集醇沉物后复溶于水，去离子水透析后对透析内液冻干，获得亨氏马尾藻粗多糖SHCP；

步骤三，取亨氏马尾藻粗多糖SHCP制成粗多糖溶液，通过色谱柱多次层析纯化获得亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯SHAP。

6.根据权利要求5所述的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：步骤三中具体纯化步骤如下：

步骤A 制备亨氏马尾藻粗多糖SHCP溶液，经阴离子交换柱，分别用H₂O、0.5mo l / LNaCl、1.0 mol / L NaCl洗脱，收集含糖部分，取1.0 mol / L NaCl洗脱部分SHA2，冻干保存；

步骤B 制备含糖组分SHA2溶液，经阴离子交换柱，以0-1mol / L 的NaCl溶液进行线性洗脱，分段收集获得SHA2A、SHA2B、SHA2C、SHA2D四个含糖组分，将SHA2C冻干保存；

步骤C 制备含糖组分SHA2C溶液，经凝胶色谱柱，用0.l mo l / L NaCl洗脱，用硫酸苯酚法检测，收集获得含糖组分SHA2C-1和SHA2C-2；分别重复经凝胶色谱柱，用0.l mo l / LNaCl洗脱，得到纯化的含糖组分SHAP-1和SHAP-2，即为亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯SHAP。

7.根据权利要求5或6所述的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：步骤一中，先将干燥的亨氏马尾藻药材脱脂处理，晾干后再进行热水回流提取。

8.根据权利要求7所述的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：热水连续回流三次，每次2h。

9.根据权利要求5或6所述的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：步骤二中采用12000Da 分子量的透析袋进行透析。

10.权利要求1-4中任一所述的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯在制备抗疱疹病毒药物中的应用。

11.根据权利要求10所述的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯在制备抗疱疹病毒药物中的应用，其特征在于：所述抗疱疹病毒为I型疱疹病毒HSV-1或II型疱疹病毒HSV-2。

12.根据权利要求11所述的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯在制备抗疱疹病毒药物中的应用，其特征在于：所述亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯对I型疱疹病毒的选择性指数SI>50000，对II型疱疹病毒的选择性指数SI>500000。

13.根据权利要求10所述的亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯在制备抗疱疹病毒药物中的应用，其特征在于：

所述亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯通过抑制疱疹病毒吸附至宿主细胞表面而起到抗病毒作用。