KR100197446B1

KR100197446B1 - 펠리누스 린테우스로부터 분리된 항암 면역활성 다당류 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR100197446B1
Application number: KR1019980029082A
Authority: KR
Inventors: 유익동; 송경식; 이재훈; 조수묵; 김환묵; 고경수; 한만우
Original assignee: 이영호; 주식회사한국신약; 박원훈; 한국과학기술연구원
Priority date: 1995-09-06
Filing date: 1998-07-20
Publication date: 1999-06-15
Also published as: KR0174433B1; KR970015743A

Abstract

본 발명은 펠리누스 린테우스 KCTC 0173BP의 균사체로부터 분리된 분자량 9,000 내지 16,000 또는 153,000 달톤의 항암 면역활성 다당류, 상기 균주의 균사체로부터 열수 추출, 에탄올 추출 및 음이온 교환 크로마토그라피 등에 의해 분리 정제하는 것을 포함하는 상기 다당류의 제조 방법 및 상기 다당류를 활성성분으로서 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

펠리누스 린테우스로부터 분리된 항암 면역활성 다당류 및 이의 제조 방법

본 발명은 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 균주의 균사체로부터 분리 정제된 항암활성 다당류, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이며, 더욱 상세하게는, 펠리누스 린테우스 KCTC 0173BP의 균사체로부터 분리된 분자량 9,000 내지 16,000 또는 153,000 달톤의 함암 면역활성 다당류, 상기 균주의 균사체로부터 열수 추출, 에탄올 추출 및 음이온 교환 크로마토그라피 등에 의해 상기 다당류를 분리 정제하는 것을 포함하는 상기 다당류의 제조 방법 및 상기 다당류를 활성성분으로서 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

담자균류의 일종인 펠리누스 린테우스는 한방에서는 상황(桑黃)으로 불리우며, 각종 질병, 특히 종양에 대한 치료 효과가 커서 민간에서는 매우 귀중한 약재로 이용되어 왔다. 그러나 펠리누스 린테우스는 자연계에 널리 분포하지 않는 희귀종이기 때문에 자실체의 입수가 어려울 뿐만 아니라 균사체의 분리 및 배양도 용이하지 않아 적극적으로 활용되지 못하는 실정이었다.

펠리누스 린테우스 균쥬가 생산하는 다당류와 관련된 기존의 발명으로는, 유일하게 대한민국 특허공고 제 92-2658 호(한만우, 발명의 명칭: 다당류 및 그 제조방법)가 있으나, 상기 특허에서 개시된 다당류는 분자량이 1.5x10⁴내지 68x10⁴달톤, 구성당의 주성분이 D-글루코즈로서 본 특허에서 발명된 다당류와는 분자량, 구성당의 종류 및 구성비율 등이 완전히 다르다.

본 발명자들은 펠리누스 린테우스로부터 항암 면역활성 물질을 분리하기 위해 노력한 결과, 국내에서 수집 분리한 상황버섯중 항암면역 효과가 우수할 뿐만 아니라 미생물학적 특성이 기존의 균주와는 전혀 다른 새로운 펠리누스 린테우스 균주로부터 항암 면역활성 물질을 분리하고 그의 특성을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항암 면역활성을 갖는 다당류를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 펠리누스 린테우스 균주로부터 상기 다당류를 분리 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 활성 성분으로서 상기 다당류를 포함하는 항암제 조성물을 제공하는 것이다.

제1도는 펠리누스 린테우스 균주로부터 항암 면역활성 다당류를 정제하는 과정을 도식화한 것이고,

제2도는, 조추출물 (4)의 DEAE-셀룰로즈 크로마토그라피 결과를 나타낸 것이고,

제3도은 활성물질 4-Ⅲ의 겔 투과 크로마토그라피 결과를 나타낸 것이고,

제4도는 활성물질 4-Ⅲ의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이고,

제5도는 활성물질 4-Ⅲ의 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 펠리누스 린테우스 KCTC 0173BP 균주로부터 분리정제된 항암 면역활성 다당류가 제공된다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 펠리누스 린테우스 KCTC 0173BP 균주의 균사체를 열수 추출하고, 열수 추출물을 에탄올(최종농도 80%)로 처리한 후 원심분리하여 침전물을 얻고, 침전물을 투석하고 에탄올(최종농도 60%)로 처리한 후 원심분리하여 상층액을 얻고, 상층액을 음이온 교환 크로마토그라피로 정제하는 것을 포함하는, 상기 항암 면역활성 다당류의 제조 방법이 제공된다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 활성성분으로서 상기 항암 면역활성 다당류를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 사용한 펠리누스 린테우스 균주는 본 발명자들에 의해 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자원센터에 1995년 6월 12일자로 기탁번호 KCTC 0173BP로서 기탁된 균주이다.

상기 균주로부터 분리정제된 본 발명의 항암 면역활성 다당류는 분자량이 9,000 내지 16,000 달톤, 바람직하게는 14,500 내지 15,500 달톤이거나 153,000 달톤이고, 5∼55 몰%의 글루코즈, 5∼30 몰%의 갈락토즈, 10∼50 몰%의 만노즈, 1∼25 몰%의 자이로즈 및 5∼25 몰%의 아라비노즈로 이루어진 당성분을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 다당류는 9∼25 몰%의 글루코즈, 10∼25 몰%의 갈락토즈, 30∼45 몰%의 만노즈, 3∼19 몰%의 자이로즈 및 6∼23 몰%의 아라비노즈로 이루어진 당성분을 포함한다.

본 발명의 다당류는 펠리누스 린테우스 KCTC 0173BP를 배양한 후 배양 균사체의 추출액으로부터 분리정제함으로써 얻을 수 있으며, 배양 및 분리는 예를 들어 다음과 같이 수행한다.

우선, 펠리누스 린테우스 KCTC 0173BP를 pH 6 내지 7, 바람직하게는 pH 6.8의 통상적인 배양배지, 예를 들어, 포도당, 효모 추출물, 펩톤 및 인산 제 2 칼륨이 함유된 배지에서 배양하여 균사체를 대량 생산한다.

상기에서 얻은 균사체를 실온 내지 100℃, 바람직하게는 95℃에서 3 내지 24시간, 바람직하게는 5 시간 동안 열수로 추출한 후, 열수 추출액에 최종농도 80%가 되도록 에탄올을 가하고 3℃내지 20℃, 바람직하게는 4℃에서 12 내지 48 시간, 바람직하게는 24 시간 동안 방치한다. 이를 원심분리하여 침전물을 얻고, 이 침전물을 투석 및 동결건조한 후, 여기에 최종농도 60% 가 되도록 에탄올을 가하여 3℃ 내지 20℃, 바람직하게는 4℃에서 12 내지 48 시간, 바람직하게는 24 시간 동안 처리한다.

상기 추출액을 원심분리하여 80% 에탄올에는 불용성이며, 60℃ 에탄올에는 가용성인 상충액을 얻은 후, 상충액을 음이온 교환 크로마토그라피, 예를 들어, DEAE-셀룰로즈 크로마토그라피하여 순수한 항암 면역활성 다당류를 얻는다.

상기 방법에 의해 분리된 다당류들을 GC, IR, NMR 등의 분석 방법으로 분석하여 구성당의 종류 및 비율, 및 다당류의 구조를 확인한 결과, 본 발명의 다당류들은 담자균류에서 분리된 기존의 항암 면역활성 물질인 베타-글루칸과는 달리, 알파 타입과 베타 타입의 두가지 글리코시드 결합이 모두 존재하고, (1→3), (1→4) 및 (1→6) 등 다양한 타입의 단당류 결합이 존재하는 특이적인 구조를 갖는 신규의 산성 복합 다당류임이 밝혀졌다.

본 발명의 다당류의 항암 면역활성은 한국과학기술연구원 생명공학연구소 유전자원센터 실험동물연구실에서 분양받은 B6C3F1 마우스에서 적출한 비장세포(splenocyte)에 상기 다당류를 처리하여 2일간 면역화시킨 후 특정 항체를 생상하는 항체생성 림프구를 항체생성 세포 계산법(antibody forming cell method, 참고문헌: Barington, T. and Heimann. C., J. Immuno. Methods, 146, 129-137(1992))으로 측정함으로써 확인할 수 있으며, 본 발명의 다당류는 탁월한 항암 면역활성을 나타낸다.

따라서, 본 발명에서는 상기 항암 면역활성 다당류를 활성 성분으로서 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

이러한 약학적 조성물은 상기 다당류와 함께 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제 등을 포함할 수 있으며, 쉽게 입수할 수 있는 성분들을 이용하여 공지의 방법에 따라 제제화할 수 있다. 제제의 제조시에는, 활성 성분을 담체와 혼합하거나, 담체로 희석하거나, 캡슐, 사셰, 종이 또는 다른 용기의 형태인 담체 내에 담을 수 있다. 담체가 희석제의 역할을 할 경우에는, 활성 성분을 위한 비히클, 부형제 또는 매질로 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 따라서, 제제는 정제, 환제, 분산제, 과립제, 엘릭서, 현탁제, 유화제, 용액, 시럽제, 에어로졸제, 연질 및 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사 용액, 멸균 포장된 분말제 및 연고 등의 형태일 수 있다.

적당한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 텍스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸 셀룰로즈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등이 있다. 조성물은 상기 성분들 외에도 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 환자에게 투여된 후 활성 성분을 급속하게, 지속적으로 또는 지연시켜 방출하도록 당분야의 공지 기술들을 이용하여 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있고, 활성 화합물은 광범위한 투여 범위에 대해 유효하다. 예를 들어, 활성 화합물의 1일 투여량은 통상적으로 체중 1 kg당 약 1 내지 20mg 범위이다. 그러나, 실제적으로 투여되는 화합물의 양은 치료하려는 질환의 상태, 선택된 투여 경로, 개별적인 환자의 연령, 체중 및 반응, 및 병의 중증도를 비롯한 관련 상황에 비추어 의사가 결정할 것이므로 상기 투여 범위는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

펠리누스 린테우스 균주의 대량 배양

펠리누스 린테우스 KCTC 0173BP 균주를 1,000ℓ의 발효조에 들어 있는 700ℓ의 멸균된 액체 배양배지(1ℓ당 가용성 전분 10g, 포도당 50g, 효모 추출물 5g, 펩톤 6g, 콘스팁리커 10g, 인산 제 2 칼륨 0.5g, 황산마그네슘 0.3g 및 FeSO₄, ZnSO₄등의 미량 원소, pH 6.8)에 접종하고, 온도 28℃, 통기량 1vvm, 및 교반 속도 100∼200 rpm으로 3일 동안 연속배양하였다. 배양이 완료된 후 배양액을 원심분리함으로써 균사체를 대량으로 얻었고, 이때의 균사체 수율은 ℓ당 32g이었다.

[실시예 2]

펠리누스 린테우스 균사체로부터 항암 면역활성 물질의 추출

상기 실시예 1에서 얻은 균사체 1kg을 95℃의 증류수 10ℓ에 넣고 3시간씩 3회 반복 열수 추출한 후, 균사체 케익을 제거하고 추출액만을 회수하였다. 상기 열수 추출액을 진공농축하여 154g의 열수 추출물을 얻었다.(조추출물 (1)). 조추출물(1)에 에탄올 농도가 80%가 되게 에탄올을 가하여 4℃에서 24 시간 동안 방치 한 후, 혼합물을 원심분리하여 80% 에탄올을 가용성인 상충액을 얻고 이를 조추출물(2)로 명명하였다. 한편, 침전물은 물에 녹인 후 투석막(cellulose tubing, 일본 삼광순약 제품)에 넣고 증류수에서 4℃로 72 시간 동안 투석하였다. 이때, 투석액은 12 시간 간격으로 교환하였다. 투석이 완료된 후, 투석막 속의 조추출물을 동결건조하여 조추출물(3)으로 명명하였다.

조추출물(3)에서 다시 에탄올 농도가 60%가 되게 에탄올을 가하여 4℃에서 24 시간 동안 처리 한 후 원심분리하여, 80% 에탄올에 불용성이고 60% 에탄올에 가용성인 상충액을 조추출물 (4)로, 그리고 80% 에탄올과 60% 에탄올에 모두 불용성인 침전물을 조추출물(5)로 각각 명명하였다. 이상의 정제과정을 제1도에 나타내었다.

한편, 조추출물(1), (2), (3), (4), (5) 및 양성대조군으로 LPS(lipopolysaccharide)를 한국과학기술연구원 생명공학연구소 유전자원센터 실험동물연구실에서 분양받은 B6C3F1 마우스 비장세포에 각각 0.1 mg/㎖씩 처리하여 2일간 면역화시킨 후, TNP 결합 면양적혈구에 대한 항체를 생산하는 세포수를 플라크 형성법으로 조사하여 각 시료의 T 세포 비의존성 면역반응에 대한 항암 면역활성을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었으며, 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 조추출물 (4)가 가장 강한 항암 면역활성을 나타내었고, 그 밖에 조추출물(1), (2), (3) 및 (5)도 항암 면역활성을 나타내었다.

[실시예 3]

음이온 교환 크로마토그라피에 의한 활성분획의 순수 분리

실시예 2에서 항암 면역활성이 강한 것으로 확인된 조추출물 (4)를 DEAE-셀룰로즈 크로마토그라피로 분리하여 각기 이온성이 다른 활성분획들을 얻었다. 먼저 조추출물 (4)를 5mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.2)에 용해시킨 후 DEAE-셀룰로즈 칼럼(Merck 사, 독일)에 넣고 용출액으로서 5mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.2)을 사용하여 분당 5㎖의 유속으로 용출시켜 각 시험관에 15 ㎖씩 분취하였다. 각 분획의 당 함유 및 단백질 함량을 페놀-황산정량법(Dubois, M. et al., Anal. Chem., 28, 350-356(1956)) 및 로우리 방법(Lowry, O. H., et al., J. Biol. Chem., 193, 265-275(1951))에 의해 각각 측정하였다. 그 결과, 활성분획들은 제2도에 나타낸 바와 같이 이온성 및 단백질의 함량이 각각 다른 5개의 분획, 즉, 4-Ⅰ, 4-Ⅱ, 4-Ⅲ, 4-Ⅳ 및 4-Ⅴ로 나눌 수 있었다.

이 과정을 3회 반복하여 2g의 조추출물 (4)로부터 4-Ⅰ 900mg, 4-Ⅱ 98mg, 4-Ⅲ 860mg, 4-Ⅳ 950mg, 및 4-Ⅴ 240mg의 순수한 항암 면역활성 다당류를 얻었다.

[실시예 4]

각 항암 면역활성 다당류의 구성당 및 구성 비율

실시예 3에서 얻은 각 활성 분획 다당류들의 구성 단당류 성분을 분석하기 위하여 가스 크로마토그라피를 실시하였다.

실시예 3에서 얻은 활성 분획 다당류 2mg씩을 각각 2N TFA로 가수분해하고 소디움 보라이드(NaBH₄)로 환원시킨 다음, 무수초산으로 아세틸화시켜 애디톨 아세테이트(aditol acetate)로 만든 시료를 퓨즈드 실리카 캐필러리 컬럼 SP-2330(fused ailica capillary column SP-2330, 0.32mmID x 30M, 필름 두께 0.2㎛, 입수처: Supelco사, 미국)이 장착된 GC(Varian 3400)에 의해 분석하였다. 이 때, 컬럼 온도는 초기에 200℃로 2분간 유지한 후 1분 간격으로 4℃씩 온도를 증가시켜 최종 온도 250℃로 10분간 유지되게 하였고, 검출기(detector)의 온도는 250℃, 주입부(injector)의 온도는 250℃로 유지하였다. 가스 크로마토그라피에 의해 분석된 각 시료의 구성당 및 구성비율을 하기 표 2에 나타내었다.

[실시예 5]

각 활성 분획 다당류의 분자량 측정

실시예 3에서 얻은 각 활성 분획 다당류의 분자량을 확인하기 위해 각 분획을 고압 액체 크로마토그라피하여 용출시간을 측정하고, 이를 다당류의 분자량 표준물질인 풀루란(pullulan p-82, Showa Denco. K.K.)을 사용하여 얻은 표준곡선과 비교하여 분자량을 결정하였다. 컬럼으로서 TSK-gel GMPW 컬럼(7.8mmID x 30cm, Tosoh Co., 일본)을 사용하였고, 0.1M NaCl을 이동상 용매로 하여 분당 1㎖의 유속으로 용출시키면서 12kg/㎤의 분압하에서 RI-8010 검출기를 사용하여 측정하였다. 분자량 측정 결과는 하기 표 3과 같다.

[실시예 6]

항암 면역활성 물질의 구조적 특징

활성 분획 다당류 4-Ⅲ을 HW65F 겔 컬럼(Tosoh사, 일본)로 로딩하고 0.1M NaCl을 용출액으로 하여 겔 투과 크로마토그라피한 결과, 제3도에서 볼 수 있는 바와 같이 단일 대칭 피크가 나타났으므로 분획 4-Ⅲ의 순도가 확인되었다. 다른 활성분획들도 동일한 컬럼에서 비슷한 용출양상을 보였다.

또한, 활성 분획 다당류 4-Ⅲ에 대한 적외선 흡수 스펙트럼 분석 결과(제4도), 다당류에 고유한 피크들이 관찰되었으며, 탄소 핵자기공명 스펙트럼 분석 결과(제5도), 알파 타입과 베타 타입의 두가지 글리코시드 결합이 모두 존재하고, (1→3), (1→4) 및 (1→6) 등 다양한 타입의 단당류 결합이 존재함을 확인하였다. 또한, 단당류 분석에서 확인된 우론산 유래 피크와 아미노당 유래 피크가 관찰되었다.

상기 결과는 표 2의 구성 단당류 분석결과와 일치하며, 상기 결과로부터 활성 분획 다당류 4-Ⅲ이 지금까지 담자균류에서 항암 면역활성물질로 알려진 베타-글루칸과는 상이한 구조를 갖는 글루쿠론산을 가진 신규의 산성 복합 다당류임이 확인되었다.

[실시예 7]

활성 분획 다당류의 항암 면역활성

다당류의 항암활성은 암세포에 대한 직접적인 세포치사에 기인하는 것이 아니라, 면역활성에 의해 매개된다는 것이 알려져 있다(Chihara, G., Rev. Immunol. Immunopharmacol., 4, 85-96(1984)), 암 억제에 관여하는 면역반응으로는 암세포에 대한 항체 생성으로 유발되는 항체면역 반응과 자연 살해 세포, 대식세포, 세포 독성 T-세포 등이 관여하는 세포면역 반응으로 구분될 수 있다.

본 실시예에서는 상기 실시예에서 얻은 활성 물질의 항암면역 활성을 조사하기 위하여 실시예 2에서와 같이 상황 추출물의 활성 분획을 면역세포와 함께 배양한 후 항체 생성 세포 계산법에 의해 항체생성 세포 수의 증가를 관찰하였다. 하기 표 4에 나타난 결과로부터 알 수 있듯이, 활성분획은 양성대조군인 리포폴리사카라이드(LPS)와 유사하게 B 세포를 자극하여 항체생성 반응을 증가시키는 효과가 있으며, 특히 활성 분획 다당류 4-Ⅲ 이 가장 강한 항체면역 증강활성을 나타냈다. 이하의 실험에서는 가장 강항 항암 활성을 나타낸 활성 분획 4-Ⅲ 을 시료로 사용하였다.

[실시예 8]

활성 분획의 항암 항체면역 활성

B 세포의 항체 생성능력을 향상시키는 리포폴리사카라이드(LPS) 및 그 유도체(TNP-LPS)와 활성분획 4-Ⅲ 간의 상관관계를 규명하고자 실시예 2의 방법에 따라 하기 표 5의 각 실험군의 항암 항체면역 활성을 측정하였다.

활성분획은 그 자체로서는 항체 생성반응을 증가시키는 효과가 있으나, 리포폴리사카라이드의 면역 증강 효과에 대해서는 상승작용을 나타내지 않았고, 리포폴리사카라이드 유도체의 작용에는 병용처리에 의해 명확한 상승효과를 나타내었다. 따라서, 세포배양에서 활성분획은 명확한 항암 항체면역 활성이 있음이 증명되었다.

[실시예 9]

생체 내에서의 항체 생성반응에 대한 4-Ⅲ 활성분획의 효과

동물 체내에서의 항체 생성반응에 대한 4-Ⅲ 활성분획의 효과를 조사하기 위해 B6C3F1 마우스에서 항체 생성 세포수를 측정하였다. B6C3F1 마우스의 복강에 면양 적혈구를 주사하여 T 세포 의존성 항체 생성 반응을 유도하였으며, 면역화 시점에 활성 분획을 100mg/kg의 농도로 복강 주사하였다. 양성 대조군으로서는 면양 적혈구만을 주사한 B6C3F1 마우스를 사용하였다. 면역반응을 유도한지 5일 후, 마우수의 비장을 적출하고 비장 유래 면역세포 중에서 면양 적혈구에 용혈 반응을 유발하는 항체 생성 세포수를 플라크 생성 세포 측정법(Holsapple, M. P., et al., J. Pharmacol. Exp. Therapeutics, 229, 493-500(1984))으로 측정하였다.

하기 표 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 4-Ⅲ 활성분획은 동물의 체내에서도 면역세포의 면역화 과정을 활성화시켜 항체 생성반응을 증가시켰다. 따라서 활성분획이 동물의 체내에서 항암 항체면역 활성을 나타냄이 확인되었다.

[실시예 10]

자연살해세포의 기능에 대한 활성분획의 효과

항체를 생성하는 체액성 면역반응과 달리 세포매개성 면역반응에서는 면역세포가 직접 반응한다. 이들 면역세포 중 자연살해세포는 생체내에 자연적으로 존재하여 면역반응을 나타내는 세포로서 암세포의 일차적인 제거에 관여한다. 자연살해세포는 암세포에 대하여 비특이적인 세포독성을 나타내며 항암작용에 중요한 기능을 하는 세포로 여겨지고 있다.

본 실시예에서는 자연살해세포의 기능에 대한 4-Ⅲ 활성분획의 효과를 검증하기 위해 세포독성 측정법을 사용하였다. 활성분획이 동물의 체내에서 자연살해세포의 활성을 증가시키는지를 확인하기 위해 생체 실험을 하였으며, 자연살해세포 자체의 활서을 증가시키는지를 확인하기 위해 면역세포를 분리하여 배양기 내에서 배양하는 세포배양 실험을 하였다.

생체 실험을 위해 B6C3F1 마우스의 복강에 활성분획을 100mg/kg의 농도로 복강 주사하고, 3일 후에 비장세포를 분리하여 세포독성 실험에 사용하였다. 한편, 세포배양 실험을 위해 정상 동물의 비장세포를 분리하여 활성분획을 0.1 mg/㎖의 농도로 처리하고, CO₂배양기에서 3일간 배양한 후 세포독성 실험에 사용하였다.

상기에서 생체실험 및 세포배양 실험을 위해 준비된 면역세포들을 YAC-1 암세포와 4시간 동안 배양한 후, 죽은 암세포 수를 유동 혈구계(flow cytometry)로 측정하여 전체 암세포에 대한 죽은 암세포의 비율인 암세포 치사율을 구함으로써 세포독성 실험을 실시하였다. 활성분획을 처리하지 않은 실험군의 암세포 치사율을 대조군으로서 비교하였다.

그 결과, 하기 표 7에 나타난 바와 같이 활성분획은 자연살해세포의 기능을 생체 실험에서는 65%, 세포배양 실험에서는 60% 증가시켰다.

[실시예 11]

대식세포의 기능에 대한 활성분획의 효과

생체내에서 자연살해세포와 비슷한 기능을 하는 세포로 대식세포가 존재한다. 대식세포는 암세포에 대하여 직접적인 식세포작용을 나타내며 암세포의 제거에 일차적인 중요한 기능을 한다.

본 실시예에서는 대식세포에 대한 활성 분획의 영향을 확인하기 위해 실시예 10에서 사용한 방법과 동일한 세포독성 측정 방법을 사용하였다. 즉, 활성분획으로 처리된 B6C3F1 마우스의 비장세포를 플라스틱 페트리 디쉬에서 1 시간 동안 배양한 후 바닥에 붙은 세포를 대식세포로 사용하여 실시예 10에서와 같이 암세포 치사율을 조사하였으며, 활성분획으로 처리하지 않은 실험군을 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 하기 표 8에 나타낸 바와 같이 활성분획은 대식세포의 기능을 생체 실험에서는 53%, 세포배양 실험에서는 29% 증가시켰다.

[실시예 12]

세포독성 T 세포의 기능에 대한 활성분획의 효과

비특이적으로 암세포 제거 작용을 하는 자연살해세포 또는 대식세포와는 달리 특정 암세포에 대해서 세포독성을 나타내는 세포독성 T 세포가 있다.

활성분획의 세포독성 T 세포의 기능에 대한 영향을 확인하기 위해 상기 실시예 10 및 11에서 사용한 세포독성 측정 방법을 사용하였는데, 암세포로서 BDF1과 조직접합성이 동일한 P388 암세포를 사용하였다. BDF1과 B6_C3_F1 마우스의 비장세포를 각각 분리한 후, 이들을 5일간 혼합배양하여 세포독성 T 세포의 활성 증가를 유도하였으며, 활성분획을 0.1mg/㎖의 농도로 배양고 동시에 처리하여 활성 증가에 대한 효과를 조사하였다.

그 결과, 하기 표 9에 나타낸 바와 같이 활성분획은 세포독성 T 세포의 기능을 144% 증가시켰다.

[실시예 13]

T 세포의 증식에 대한 활성분획의 효과

암세포 제거작용에 중요한 기능을 하는 T 세포의 증식에 대한 활성분획의 효과를 혼합 면역세포 반응을 이용하여 측정하였다. 혼합 면역세포 반응을 위하여 조직적합성 항원의 종류가 다른 BDF1과 B6C3F1 마우스의 비장세포를 각각 분리한 후 혼합배양하였는데, 이 때 비장세포중의 T 세포는 상대세포의 조직적합성 항원을 인식하여 반응하게 되고 T 세포의 증식을 유발한다.

각각의 동물에서 분리한 면역세포를 1 x 10⁶세포/㎖ 의 농도로 조절한 후, 96 웰 배양용기의 각 웰에 100㎕씩 가하여 3일 동안 5% C0₂배양기에서 배양하였다. 배양이 끝나기 18 시간 전에 [³H]-티미딘을 1μCi/웰의 농도로 가하여, 증식하는 면역세포의 DNA 내로 티미딘을 유입시켰다. 배양인 끝난 후, 세포회수기(이노텍, 스위스)를 이용하여 면역세포 내의 DNA를 회수하였으며 DNA 내로 유입된 [³H]-티미딘의 양은 방사선 계수기를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 하기 표 10에 나타낸 바와 같이 활성분획은 0.1mg/㎖의 농도에서 T 세포의 기능을 413% 증가시켰다.

[실시예 14]

활성물질의 고순도 정제

실시예 1 내지 7에서 분리된 항암면역 활성물질을 더욱 순수하게 분리하기 위하여 4-Ⅲ 활성분획을 겔 투과 크로마토그라피에 의해 정제하였다. 즉, 도요펄 HW 65F 컬럼(2.5 X 51cm)을 물로 평형화시킨 후 4-Ⅲ 활성분획 150 mg을 로딩하고 2 ㎖/분의 유속으로 물로 용출시켜 시험관당 4 ㎖씩 분획하였다. 그 결과 4-Ⅲ 활성분획을 다시 4-Ⅲ-1, 4-Ⅲ-2, 4-Ⅲ-3, 4-Ⅲ-4의 4 분획으로 나누었으며, 실시예 7에서와 같은 방법으로 각 분획의 항암 면역활성을 조사한 결과, 하기 표 11과 같이 4-Ⅲ-1 분획에서 항암 면역 활성이 급격히 증가하였다.

[실시예 15]

고순도 활성분획 추출물과 구성당 및 구성비율

실시예 14에서 얻은 각 활성분획 다당류 중 항암활성이 가장 높은 4-Ⅲ-1 활성분획의 구성 다당류 성분을 분석하기 위하여 실시예 4와 동일한 방법으로 가스 크로마토그라피를 실시하였다. 그 결과, 4-Ⅲ-1 활성분획의 구성당 및 구성 비율은 하기 표 12와 같았다.

[실시예 16]

고순도 활성분획 다당류의 분자량 측정

실시예 5와 동일한 방법으로 4-Ⅲ-1 활성분획 다당류의 분자량을 조사한 결과, 4-Ⅲ-1 활성분획 다당류의 분자량은 153,000 달톤이었다.

상기 실시예들에서 볼 수 있는 바와 같이, 펠리누스 린테우스 KCTC 0173BP의 균사체로부터 열수 추출, 에탄올 추출 및 음이온 교환 크로마토그라피 등에 의해 분리 정제된 항암 면역활성 물질들은 지금까지 보고된 바 없는 신규 구조의 물질로서 우수한 항암 면역활성을 나타낸다.

Claims

펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) KCTC 0173BP 균주의 균사체로부터 분리정제되고, 고압 액체 크로마토그라피로 측정된 분자량 9,200 달톤이며, 당성분이 15.9 몰%의 글루코즈, 10.4 몰%의 갈락토즈, 34.3 몰%의 만노즈, 16.1 몰%의 자이로즈 및 15.8 몰%의 아라비노즈로 이루어진 항암 면역활성 다당류.
펠리누스 린테우스 KCTC 0173BP 균주의 균사체를 열수 추출하고, 열수 추출물을 최종 에탄올 농도가 80% 가 되도록 에탄올로 처리한 후 원심분리하여 침전물을 얻고, 침전물을 투석하고 투석물을 최종 에탄올 농도가 60% 가 되도록 에탄올로 처리한 후 원심분리하여 상층액을 얻고, 상층액을 음이온 교환 크로마토그라피로 정제하는 것을 포함하는, 제1항의 항암 면역활성 다당류의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 열수 추출시 균사체를 실온 내지 100℃의 증류수 중에서 3 내지 24 시간 동안 추출하는 방법.
제1항의 항암 면역활성 다당류를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.