KR101403591B1

KR101403591B1 - 장수버섯 자실체 유래의 다당체로부터 얻은 올리고당 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101403591B1
Application number: KR1020120061461A
Authority: KR
Inventors: 윤상홍; 이창묵; 강한철; 구본성; 석순자; 김정봉; 박정근
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2012-06-08
Publication date: 2014-06-11
Also published as: KR20130137853A

Abstract

본 발명은 항보체 활성을 갖는 장수버섯 자실체 유래의 다당체로부터 얻은 올리고당 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 장수버섯 자실체에서 분리한 보체활성화 다당체를 글루코시다제로 처리하여 얻은 올리고당 및 이의 제조방법에 의한 것이다.

Description

장수버섯 자실체 유래의 다당체로부터 얻은 올리고당 및 이의 제조방법{Oligosaccharides obtained from polysaccharides-derived from Formitella fracinea and method for preparing the same}

본 발명은 항보체 활성을 갖는 장수버섯 자실체 유래의 다당체로부터 얻은 올리고당 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 장수버섯 자실체에서 분리한 보체활성화 다당체를 글루코시다제로 처리하여 얻은 올리고당 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

면역시스템에서, 보체는 항원-항체 반응의 일차 체액성 매개반응으로써 숙주 저항에 중요한 역할을 담당하는 혈액 내 혈청 효소 일체로 구성되어 있다. 또한, 보체는 특이면역반응의 유도 및 조절, 예를 들어, 대식세포와 림프구의 활성화, 배아중심에서 항원 배치 및 체류, B기억세포의 발생, 항체 생성의 세포성 협조 및 조절에 관여한다. 보체계를 활성화하는 물질(혹은 항보체 활성물질)들이 생체의 면역 부전 상태를 개선하거나 치료하는 면역 요법제로 개발되어 질병의 예방과 치료에 효과적으로 이용될 수 있는 가능성이 제시되고 있으며 항보체 활성물질이 생체내 대식세포 등의 면역세포들을 자극하여 임파구의 증식 및 활성화에 필요한 cytokine의 분비를 유도하여 암 치료에 도움이 될 수 있다는 가능성도 제시되고 있다(한덕용, 1989, 現代生藥學. 學院社 서울), (Andresson J., 1972. Induction of immunoglobulin and antibody synthesis in vitro by lipopolysaccharide. Eur . J. Immunol. 2 : 349), (Mitsuhiko N., S. 1998. Activation of macrophages by crude polysaccharide fractions obtained from shoots of Glycyrrhiza glabra and hairy roots of Glycyrrhiza uralensis in vitro. Bio . Pharm . Bull. 21(109 : 1110～1112).

현재까지 알려진 항보체 활성 물질들은 주로 식물체에서 분리한 당귀(Angelica acutiloba)의 pectic arabinogalactan(Yamada, H.,1987, Structural characterization of an anti-complementary arabinogalactan from the roots of Angelica acutiloba KITAGAWA. Chrbohydr ., Res. 159: 275 ), 시호(Bupleurum falcatum)의 arabinan, arabinogalactan, glucan(Yamada, H., 1988, Chracterization of anti-complementary neutral polysaccharide from the roots of Bupleurum falcatum. Phytochem., 27: 3,163), 대복피(Colocasia antiquorum), 은행잎(Ginkgo biloba), 냉이(Capsella bursapastoris)( Shin, K.S., 1993, Screening of complementsystem activating polysaccharide from edible plants and its action mode. Food Sci . technol., 25: 197) 등의 식품재료에서도 높은 보체계 활성이 보고되고 있다.

한편으로 버섯으로부터 생체 반응 조절제(biological response modifier)로 polysaccharide를 선별하여 이를 의약품 내지는 기능성 식품으로 이용하고자 하는 시도가 계속되고 있다. 이들 중 비교적 상세한 연구가 진행된 부분은 상황버섯(Phelinus linteus), (K. S. Song, 1995. B-lymphocyte-stimulating polysaccharide from mushroom Phellinus linteus. Chem . Pharm. Bull 43(12) : 2105～2108), 양송이버섯(Agaricus bispours) (Yang H. C.,1998. Structural characterization of the anti-complementary and macrophage activating polysaccharides isolated from Agaricus bisporus. Korean J. Food Sci . Technol. 30(3): 709～716), 운지버섯(Coriolus versicolor)의 krestin(Wang H. X., 1996. polysaccharide-peptide complexes from the cultured mycelia of the mushroom Coriolus versicolor and their culture medium activate mouse lymphocytes and macrophages. Int . J. Biochem . Cell Biol. 28(5): 601-607)으로부터 macrophage 활성, 표고버섯(Lentinusedodes)의 lentinan(Song C. H., 1998,Anti-complementary activity of endopolymers produced from submerged mycelial culture of higher fungi with particular reference to Lentinus edodes . Biotechnology Letters, 20(8):741～744)으로부터 항보체 활성 및 항암 활성 물질들이 발견되어 보고되어 있다. 이들은 대부분 옛날부터 식품이나 약용으로 널리 사용되어왔던 재료로서 인체에 대한 안정성이 확보된 물질들이라 할 수 있다.

최근에, 잎새버섯(Grifora umbelata), 복령(Poria cocos), 운지버섯(Coriolus versicolor)과 같은 버섯에서 얻은 다당류와 같은 중합체에서 항보체 활성, 림프구의 분열촉진 활성, 인터페론 유도성 활성 및 항암 활성뿐만 아니라 약리적 활성이 관찰되었다. 또한, 번데기동충하초(Cordyceps militaris), 느타리버섯(Pleurotus ostreatus), 영지버섯(Ganoderma lucidum), 송편버섯(Trametes suaveolens )의 균사체 액체배양의 배양액으로부터 얻은 세포외 다당체가 높은 항보체 활성을 가지고 있음을 보고한 바 있다. 따라서, 면역계의 조절을 입증하기 위한 보다 체계적인 연구가 필요하다.

한편, 장수버섯은(Formitella fracinea)은 민주름 버섯목 구멍장이 버섯과에 속하는 담자균류로서 아카시재목버섯이라고도 명명되며 오래 전부터 민간약재로 사용되어 왔다. 북한에서는 만년버섯, 일명 장수버섯을 이용해 간염주사약을 개발해 치료에 이용하고 있는 것으로 알려졌다. 이것은 특히 북한에서는 백두산 불로초라고도 하는 약용버섯으로 스테로이드 화합물 3.5%, 플라보노이드 1.5%, 배당체 0.2%. 쿠마린 0.8%, 알칼로이드 0.5%가 함유되어 있다. 특히 장수버섯은 만성 B형 간염과 암, 신장염, 관절염을 비롯한 여러 가지 면역성 질병에 특효가 있으며 성욕을 높여주고 항산화 효과가 강한 것으로 밝혀졌다. 또한 장수버섯으로부터 유래된 항생제의 경우 부작용을 덜어주며 핵산합성을 촉진시켜 인체의 원상회복을 돕고 암환자를 치료한 결과 잔존 암세포의 전이를 억제해 성숙된 암조직의 생장도 현저히 억제시키는 것으로 밝혀졌다.

KR 출원번호 제 1993-0028570호

이에 본 발명자들은 의학적으로 가치가 높은 장수버섯 자실체에서 항보체 활성을 갖는 물질을 분리하고, 상기 물질의 항보체 활성을 유지하면서 올리고당으로 제조하는 방법을 개발하기에 이르렀다.

본 발명은 장수버섯 자실체 유래 다당체를 글리코시다제로 처리하여 제조된 올리고당 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 장수버섯 자실체 유래 다당체를 글루코시다제로 처리하여 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10)을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 장수버섯 자실체 유래 다당체를 글루코시다제로 처리하여 얻은 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10)을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10) 또는 상기 다당체를 유효성분으로 포함하는 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 항보체 활성이 뛰어난 장수버섯 자실체 유래의 다당체로부터 얻은 올리고당을 제공하는 효과가 있다. 본 발명의 올리고당은 항보체 활성을 가지며 수용성이고 보체 활성화를 위한 정규경로뿐만 아니라 대체경로에도 참여하여 보체를 활성화시키는 특징이 있다. 따라서 본 발명에 의한 올리고당은 이를 유효성분으로 하는 면역증강용 조성물로 제조할 수 있어 기능성 식품 및 제약산업상 매우 유용할 것이다.

도 1은 DEAE-Sepharose FF 칼럼 크로마토그래피에 의한 항보체 활성 중성, 산성 다당체의 분리에 관한 것이다.
도 2는 Concanavalin A sepharose 칼럼 크로마토그래피에 의한 항보체활성 주 다당체의 정제에 관한 것이다.
도 3은 장수버섯 자실체로부터 정제된 4종 다당체의 농도별 항보체 활성에 관한 것이다.
도 4는 JFMF-AP2α와 JFMF-AP2β 처리에 의한 대식세포의 인터루킨 생산능에 관한 것이다.
도 5는 pEGD7의 대장균 내 발현에 의한 DDGD7-β-1,4- 글루코시다제 분리에 관한 것이다.
도 6은 JFMF-AP2β의 효소처리(pEG7-glucosidase)에 의한 올리고당의 분자량 측정 liquid chromatogram에 관한 것이다(Column: Superdex^TM Peptide 10/300, Detector: refractive index detector).
도 7은 Fraxinean-oligosaccharide10 올리고당의 항보체 활성에 관한 것이다(청색 바는 10ug/ml, 적색 바는 5ug/ml 농도임).

본 발명은 장수버섯 자실체 유래 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10)을 제조하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로,

(a) 장수버섯 자실체로부터 보체활성화 다당체를 분리하는 단계; 및

(b) 상기 분리된 다당체에 글루코시다제를 처리하는 단계;

를 포함하는 장수버섯 자실체 유래 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10)을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서는 국내 자생버섯인 장수버섯의 자실체로부터 인체 혈장 내 보체단백질 경로를 강력히 활성화 시키는 수용성 다당체를 정제할 수 있다. 보다 구체적으로 장수버섯 자실체로부터 수용성 조다당체를 추출하여, 이를 이온교환 수지(DEAE 계열) 및 친화성 크로마토그래피(Concanavalin A 계열)에 의해 JFMF-AP2α, JFMF-AP2β, JFMF-NPα 및 JFMF-NPβ의 4 종의 항보체 활성이 우수한 다당체를 정제할 수 있다.

상기 JFMF-AP2α, JFMF-AP2β 다당체는 분자량이 5000이며, 인터루킨 6 생산능이 있다.

Macrophage는 세균이나 이물질을 탐식, 제거하는 과정에서 여러 가지 cytokine을 분비하여 면역현상을 조절하며, 항원에 대한 면역작용의 중추적인 역할을 하는 세포로서, 항원제시와 림프구의 비특이적 면역작용에 관계하며, 종양세포에 대해서는 직접적인 상해활성을 나타낸다. 또한 TLR(tool-like receptor)에 반응하는 물질(LPS 혹은 천연물)은 macrophage를 활성화하여 T세포와 B 세포의 증식, 식균 작용을 위한 대식세포의 활성, 미생물 감염에 대한 방어 등의 2차 면역반응을 조절할 수 있는 IL-1, IL-6, IL-10, IL-12 및 TNF-α와 같은 cytokine을 생산한다. IL-1, IL-6 및 TNF-α는 macrophage에 의해 유도되는 대표적인 cytokine 으로 세균감염에 따른 염증반응에 있어서 중추적인 역할을 하며 염증병소에서 그 양이 증가된다. IL-6는 IL-1과 협동적으로 작용하여 T 세포와 B 세포의 분화에 관여하고 항암효과가 있다고 보고되었으며, TNF-α은 특정암세포에 대한 세포독성과 항 바이러스성 작용이 있고, 급성 및 만성 염증질환에서 일어나는 여러 가지 생체반응에도 중요한 역할을 한다.

한편, IL-12는 NK cell의 활성화 및 Th1 type의 면역 반응을 유도하는 cytokine으로써 암세포와 같은 세포성 외래물질에 대한 반응성을 높이는 작용을 한다. 또한 IL-10은 macrophage에 의한 TNF, IL-1, chemokine 및 IL-12의 생성을 교차조절(cross-regulation)함으로써 T 림프구 활성화에 있어 대식세포의 부수적 기능(T 림프구 매개성 특이면역염증반응)을 저해한다.

본 발명의 일실시예에서는 주 항보체 활성 다당체 2종(JFMF-AP2α, JFMF-AP2β)을 농도별로 처리하여 IL-6의 생산을 본 결과 전체적으로 농도 의존적 활성을 보였으며 특히 200㎍/㎖에서 유의한 활성을 보여 T 세포와 B 세포의 생산에 관여함을 알 수 있었다. 한편 IL-12분석에서는 전체적으로 농도 의존적이 아니었으나, 오히려 고 농도보다 저 농도에서 유의한 활성을 나타내었고 특히 8㎍/㎖에서 2종의 다당체 모두 최고의 활성을 보였다(도 4).

상기 (b) 단계의 글루코시다제는 DDGD7-β-1,4- 글루코시다제로서 동애등애의 장내 메타게놈은행에서 직접 유전자를 선발하여 대장균에서 다량의 수용성 글루코시다제를 생산함은 물론 세포외로 분비시키므로 경제성 측면에서 매우 가치가 높다. 상기 DDGD7-β-1,4- 글루코시다제를 사용하여 JFMF-AP2-β의 항보체활성을 그대로 유지하면서 분자량은 훨씬 감소된 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10)을 제조할 수 있다.

상기 DDGD7-β-1,4- 글루코시다제를 사용하여 올리고당을 제조함으로써 다당체의 선택적 절단이 가능하므로 올리고당 제작의 재현성을 높일 수 있는 장점이 있다. 분자량이 적은 올리고당은 분자량이 큰 다당체보다 체내 흡수율 증가시킬 수 있으므로 기능성 식품의 효과를 획기적으로 제고시키는 장점을 가진다.

보다 구체적으로상기 다당체, 특히 JFMF-AP2-β에 DDGD7-β-1,4- 글루코시다제를 첨가하고 pH 6-8 및 20℃~55℃에서 2~24시간 처리하여 100℃온도에서 5분간 처리하여 불활성화 시킨 후, 2.5배의 에탄올을 첨가하여 원심분리 하여 회수하는 것을 더 포함할 수 있으며, 이 경우 항보체활성이 탁월한 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10)을 제조할 수 있다.

상기 올리고당은 분자량이 900 내지 1200일 수 있으며, 약 1000일 수 있고, 상기 다당체의 보체활성을 그대로 유지할 수 있다.

상기 다당체는 JFMF-AP2α, JFMF-AP2β, JFMF-NPα 및 JFMF-NPβ의 4 종의 다당체일 수 있으며, 특히, JFMF-AP2β일 수 있으며, 상기 글루코시다제는 DDGD7-β-1,4- 글루코시다제(표 1참조)로서 동애등애의 장내 메타게놈은행에서 직접 유전자를 선발하여 대장균에서 수용성 상태로 발현시킨 효소일 수 있다.

상기 올리고당은 자일로오즈(xylose), 아라비노즈(arabinose), 만노즈(mannose), 글루코오즈(glucose), 갈락토오즈(galactose)로 구성될 수 있다(표 2참조).

또한, 본 발명은 상기 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10) 또는 상기JFMF-AP2α, JFMF-AP2β, JFMF-NPα 및 JFMF-NPβ으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나인 다당체를 유효성분으로 포함하는 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 음료 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 유효성분이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을

의미한다.

또한, 본 발명에 따른 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10) 또는 다당체는 항보체 활성 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10) 또는 다당체를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등이 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10) 또는 다당체의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.2 내지 0.8 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10) 또는 다당체를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10) 또는 다당체 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 약 5 내지 12g일 수 있다.

상기 외에 본 발명의 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10) 또는 다당체은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10) 또는 다당체는 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10) 또는 다당체는 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 따른 항보체 활성 건강기능성 식품 조성물은 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10) 또는 다당체 0.2 내지 0.8중량%, 액상과당 0.5 내지 1.0중량%, 탄산수소 나트륨 0.01 내지 0.05중량%, 구연산 0.1 내지 0.5중량%, 폴리덱스트로즈 1.0 내지 2.0중량%, 자몽종자추출물 0.10 내지 0.15중량% 및 정제수 95 내지 99중량%로 이루어진다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시 예 1: 장수버섯 자실체에서 수용성 다당체의 분리 및 약리적 활성 검정

담자균류 중에서 포미탤라속(Fomitella genus)에 속하는 장수버섯의 풍건된 자실체를 세절하여 증류수를 가하고 95도 내지 100℃에서 2시간 3회 추출, 원심분리한 다음, 상층액을 여과하고 이 액에 2.5배 부피의 에탄올을 가하여 4℃에서 하루밤 방치하여 침전물을 원심분리로 회수하였다. 회수된 침전물을 증류수로 녹여 2일간 투석 후 동결건조한 분말을 수용성 조다당체(JFMF-CP) 시료로 하였다. 장수버섯에서 분리한 조다당 JFMF-CP 500mg을 10mM Tris-HCl (pH 7.0)에 녹인 후 syringe filter(0.45μm)로 여과한 액을 10mM Tris-HCl (pH 7.0)으로 평형화된 DEAE-Sepharose FF (Cl- form, 5.0×50 ㎝) column에 흡착시킨 후, 10mM Tris-HCl (pH 7.0)을 용출하여 비흡착획분을 분리하였으며 이후 0.4 M과 1 M NaCl in 10mM Tris-HCl (pH 7.0)용액으로 단계적으로 용출시켜 흡착 획분을 각각 분리하였다. Anion exchange chromatography column에서 용출된 획분은 fraction collector (Model 2110, Bio-Rad, USA)를 이용하여 분획하고, 각각 총당, 산성당, 단백질 함량을 측정하여 용출 peak를 작성하였다. 총당 함량은 galactose를 표준 물질로 하여 phenol-sulfuric acid 법으로, 산성당 함량은 β-D-galacturonic acid를 표준 물질로 하여 m-hydroxy biphenyl법으로, 단백질 함량은 bovine albumin을 표준 물질로 하여 Bradford법으로 각각 정량 분석하였다(Blumenkrantz N, 1973. New method for quantitative determination of uronic acid. Anal Biochem 54: 484-489), (Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dyebinding. Anal Biochem 72).

본 이온교환 수지를 통해 조다당체로부터 1개의 비 흡착획분 중성다당체(JFMF-NP)와 3개의 흡착획분 산성다당체(JFMF-AP1, JFMF-AP2, JFMF-AP3)을 얻을 수 있었다. 또한, 각 획분들은 투석 및 동결건조를 행하여 이후의 실험에 사용하였다.

Concanavalin A- Sepharose 4B chromatography

이온교환수지를 이용한 정제과정에서 항보체 활성이 우수했던 JFMF-NP와 JFMF-AP2 획분을 Concanavalin A-Sepharose CL4B column (1.5×14 cm)을 이용, affinity chromatography를 수행하였다. JFMF-NP와 JFMF-AP2 획분 100mg을 각각 1차 용출 완충액 (20mM Tris-500mM NaCl, pH 7.4)에 용해하여 syringe filter(0.45μm)로 여과한 액을 동일완충액으로 평형화된 Concanavalin A separose CL4B칼럼에 loading한 다음, 1차 용출 완충액으로 Concanavalin A와 친화성이 없는 β형 다당체가 완전 분리되게끔 충분히 용출한 뒤, 2차 용출 완충액 50mM α-methyl-D-Glucoside, 50mM phosphate (pH 7.0)으로 Concanavalin A와 강한 친화성이 있는 α형 다당체를 분리하였다. 용출액은 5 ml씩 60개의 획분으로 분획하였으며, 각 획분은 phenol-sulfuric acid 법(Dubois M et al., 1951, A colorimetric method for the determination of sugars. Nature 168: 167)으로 당을 정량하여 친화력이 상이한 2개의 획분 JFMF-NP-α. β와 JFMF-AP2-α. β를 얻을 수 있었다. 또한, 각 획분들은 투석 및 동결건조를 행하여 이후의 실험에 사용하였다(도 1).

즉, 국내에서 자생하는 장수버섯 자실체로부터 수용성 조다당체를 추출하여 이를 이온교환 수지 및 친화성 크로마토그래피(DEAE sepharose-FF, Concanavaline A-sepharose)에 의해 JFMF-AP2α, JFMF-AP2β, JFMF-NPα, JFMF-NPβ등 4종의 항보체 활성이 우수한 다당체를 정제하였다. 상기에서 정제된 다당체에 대한 항보체 활성을 검정한 결과, JFMF-AP2β가 2㎍/㎖ 농도에서도 ITCH(Inhibition of Total Complement Hemolysis) 값이 80%이상 됨으로써 일반적 유효 항보체 다당체 (1㎎/㎖에서 ITCH값 70)의 500배 이상의 가장 탁월한 활성을 보였다. 이외에도 JFMF-AP2α, JFMF-NPβ는 100배, JFMF-NPα는 10배 정도의 활성을 나타내었다. 이들 다당체는 보체경로의 고전경로(Ca, Mg이온이 관여)를 주로 활성화시키지만 대체경로(Mg이온이 관여) 활성화에도 관여함을 알 수 있었다.

실시예 2: DDGD7 -β-1,4- 글루코시다제의 분리 및 정제

상기에서 분리, 정제한 항보체 활성 다당체로부터 올리고당을 제조하기 위한 β-1,4-글루코시다제를 동에등애의 메타게놈은행에서 선발하였고(DDGD7-글루코시다제, 하기 표 1참조) 이를 대장균에서 수용성 상태의 효소로 대량발현시키는데 성공하였다. 도 5는 단백질발현 형질전환 대장균(특허균주기탁번호KACC95118P)에서 이 효소가 용해된 상태로 대량 발현된 것을 전기영동으로 확인한 결과이다.

동애등에 유래 글루코시다제의 아미노산배열(적색 밑줄친 부분은 시그널펩타이드임. DDGD7글루코시다제는 시그널 펩타이드가 배제된 나머지부분을 포함함)

실시예 3: DDGD7 글루코시다제 처리에 의한 올리고당 제조 확인

고유의 당분해 효소에 의해 항보체 활성이 우수한 올리고당 제조를 위해 기질 다당체로 항보체 활성이 가장 우수하며 분자량이 5,000정도인 JFMF-AP2β을 선택하여 다음과 같이 실험하였다. 정제된 pEGD7 유래 glucosidase(DDGD7-glucosidase, 총 specific activity 200unit 이상)를 기질 다당체인 JFMF-AP2β 30mg 용액에 첨가하고 pH 7과 55℃에서 2시간 처리하여 100 ℃에서 2분간 불활성화 시킨 후, 2.5 vol.의 에탄올을 첨가하여 원심 분리시켜 최종멸균수로 용해한 뒤 일부를 채취하여 10㎍/㎖과 2㎍/㎖의 농도에서 항보체 활성을 처리 전과 후로 분석하였으며 나머지는 동결 건조하여 재 농축시킨 뒤 분자량 측정을 위해 칼럼(Superdex^TM Peptide 10/300; GE Healthcare사)을 장착한 액체 크로마토그래피(356-LC, Varian, USA)에 의해 RI detector로 분석하였다. 올리고당 분자량의 표준품으로는 Supelco사의 올리고당 분자량 측정 표준품 키트를 사용하였다.

도 6에서 보는 바와 같이 효소로 처리하지 않은 JFMF-AP2β의 분자량은 약 5,000이었으나 glucosidase를 처리했을 시 분자량이 1,000정도로 급격히 감소되었음을 알 수 있었다. 이 결과로 얻어진 올리고당은 급격한 분자량 감소에도 불구하고 항보체 활성의 변화가 거의 없었으며 이는 이 효소가 항보체 활성과 관련된 핵심 당 구조에 변화를 주지 못한다는 것을 암시해 준다(도 7). 일반적으로 인체의 장내 미생물은 사람에 따라 종의 분포도가 다르며 이는 다당체나 배당체의 분해능이 다르기 때문에 흡수율이 상이할 수 있다. 그리고 분자량이 큰 복합다당체는 장내미생물이 이를 잘 분해하지 못하므로 점막세포에 흡수율이 매우 낮을 수 있다.

분자량 1,000 정도의 올리고당으로 줄여서 복용한다면 흡수율이 대폭 증진되고 또한 이것이 약리성을 그대로 보유한다면 약효가 우수한 기능성식품으로 높은 기술적, 경제적 가치를 제고할 것이다. 따라서 본 발명의 항보체활성이 우수한 올리고당은 이점에서 분자량이 큰 다당체에 비해 시장에서 높은 경쟁력을 기대할 수 있다.

실시예 4: 장수버섯에서 유래한 항보체활성 다당체 및 올리고당( Fraxinean - oligosaccharide 10)의 구성당 분석

장수버섯 자실체에서 실시예 1및 3에 의해 분리된 4종의 다당체 및 이에 대한 구성 당의 변화를 가스 크로마토그래피로 분석한 결과는 표2와 같다. 한편 가장 강력한 항보체활성을 가진 JFMF-AP2 β를 DDGD7-글루코시다제로 처리하면 본래 주 구성당인 glucose의 상대적 molar ratio가 현격히 줄어들었고 상대적으로 xylosose의 구성비가 급격히 늘어났으며 최종적으로 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10)의 구성당은 자일로오즈, 아라비노즈, 만노즈, 글루코오즈, 갈락토오즈 순으로 함량을 보였다(표 2). 분자량 1,000으로 추정된 본 올리고당은 일반적으로 구성당의 분자량을 대략 160-180으로 볼 때 약 5-7개의 당으로 구성되어 있음을 알 수 있었다.

하기 표 2는 JFMF AP2-β와 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10)의 구성당 분석에 관한 것이다. 이 결과는 이 올리고당의 탁월한 항보체 활성을 떠나서도 매우 의미 있는 최초의 보고인 것으로 생각된다. 추후 연구에서 만일 다른 약리성 효과의 의미 있는 결과와 더불어 핵심 올리고당의 구조분석과 동정이 완료되면 대량으로 합성제조가 가능하므로 경제적인 파급효과가 지대할 것으로 기대된다.

실시예 5: 항보체 활성 건강기능성 음료의 제조

상기 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10)을 이용하여 올리고당(Fraxinean-oligosaccharide 10) 0.2 내지 0.8중량%, 액상과당 0.5 내지 1.0중량%, 탄산수소 나트륨 0.01 내지 0.05중량%, 구연산 0.1 내지 0.5중량%, 폴리덱스트로즈 1.0 내지 2.0중량%, 자몽종자추출물 0.10 내지 0.15중량% 및 정제수 95 내지 99중량%를 기준으로 하기 표 3과 같이 3가지 음료를 제조하였다.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Oligosaccharides obtained from polysaccharides-derived from Formitella fracinea and method for preparing the same <130> P120282 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1203 <212> DNA <213> DDMD5 <400> 1 tctttcgtaa agcagaagga aggcaagctt acgataaacg acaagcctta ctactttatc 60 ggcactaact tttggttcgg ggctatattg ggttccgaag ggcaaggcgg taaccgtgaa 120 cgattactta aagagcttga ttttatgaaa gaaaacggca tcaataatct tcgggttctt 180 gtaggtgccg acggcccaag cggacaaaag gtaaaagtta tgccgactct tcaaatagag 240 ccgggagtgt ataacgatac tattttcgac ggattagatt tcctcatggc ggaactgggt 300 aaacgggata tgtatgcggt actttatctt aacaacagtt gggaatggag tggcggatac 360 ggacagtatc tcaattgggc aggacgtggt gatgtacccg aagcaggagt tcaggactgg 420 cctgtatttg taaagcatgt tgcccaatat gccgattgcg acagttgcca taccttgttt 480 ctgaatcatg taaagcacgt tattaccaga accaaccgat atacgggaaa gaaatatatt 540 gacgatacgg caatcatgtc atggcaggta gggaacgagc ctcgctcatt cagcgatgag 600 ggtaaacctg cattcgtaaa atggttgaaa gaaactacag ctcttatccg ctctcttgat 660 cctaatcacc tcatctcatt gggtaatgag ggtactaagg gatgtgaaga agatatgaat 720 cttttcgaac aaatcaattc agaccccaat gtcgattatc tgaccattca tatctggcct 780 aaaaactgga gctggattga tcccacccaa gtagtagcat ccgtagatac agcaatcacc 840 gaaactgata aatacattga taatcatctg gctattgcca aaaagctaaa caagcctatg 900 gttatcgaag agtttggata tccgcgcgat aatcacaaat atacactgga ggatactaca 960 gttgcacgtg atacatatta ctccaatatc ttctcgaaaa taataagttc gaaagaaaac 1020 aatggtctga ttgcaggatg caacttctgg acatggggag gattcggaag acctgctcac 1080 acattctggg aaccgtggga cgattatgta ggtgatccat cgcaagaaga acaaggttta 1140 aactctgttt tcgatacaga tacgaccatc aaagtcatca aaagctatac tcaaaaacta 1200 taa 1203

Claims

a) 장수버섯 자실체로부터 열탕 추출한 조다당체를 DEAE-세파로스(DEAE-sepharose) 음이온 교환수지 칼럼 크로마토그래피와 콘카나발린 A 세파로스(Concanavalin A sepharose) 친화성 칼럼 크로마토그래피로 연속적으로 분리하여 구성당의 함량이 글루코스, 갈락토스, 만노즈, 자일로스, 푸코스, 아라비노스 및 잠노스 순으로 구성된 다당체인 JFMF-AP2β와 구성당의 함량이 글루코스, 만노즈, 푸코스, 자일로스, 갈락토스, 잠노스 및 아라비노스 순으로 구성된 다당체인 JFMF-AP2α를 얻는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 분리된 다당체인 JFMF-AP2β 및 JFMF-AP2α에 서열번호 1의 DDGD7-β-1,4-글루코시다제를 처리하는 단계; 를 포함하는 항보체 활성을 가진 장수버섯 자실체 유래 올리고당(oligosaccharides)을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 올리고당은 분자량이 900 내지 1200인 것을 특징으로 하는 항보체 활성을 가진 장수버섯 자실체 유래 올리고당을 제조하는 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 다당체에 서열번호 1의 DDGD7-β-1,4-글루코시다제를 첨가하고 pH 6 내지 8 및 20℃내지 55℃에서 2 내지 24시간 처리하여 90℃ 내지 100℃에서 3분 내지 5분간 효소를 불활성화시킨 후, 에탄올을 첨가하여 원심분리 하여 침전물을 회수하는 것을 특징으로 하는 장수버섯 자실체 유래 올리고당을 제조하는 방법.
제 1항의 제조방법에 따라 제조된 항보체 활성을 가진 장수버섯 자실체 유래의 분자량이 900 내지 1200인 올리고당(oligosaccharides).
상기 제 5항의 올리고당을 유효성분으로 포함하는 건강기능성 식품 조성물.
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