KR100455906B1 - 펠리누스 린테우스의 균사체를 추출 정제하여 얻은다당류를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

펠리누스 린테우스의 균사체를 추출 정제하여 얻은다당류를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) KCTC 0173BP 와 KCTC 0399BP의 균사체를 추출 정제하여 얻은 분자량 153,000 달톤의 항암면역활성 다당류인 α(1,6)-헤테로글리칸(heteroglycan)과 갈락토만노글루칸 (galactomannoglucan)을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

펠리누스 린테우스의 균사체를 추출 정제하여 얻은 다당류를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical agent containing polysaccharide obtained from mycelium of Phellinus linteus against lung cancer}
본 발명은 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) KCTC 0173BP와 KCTC 0399BP 의 균사체를 추출 정제하여 얻은 분자량 153,000 달톤의 항암면역활성 다당류인 α(1,6)-헤테로글리칸(heteroglycan)과 갈락토만노글루칸 (galactomannoglucan)을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
폐암(lung cancer)은 현재 국내에서 많이 발생하는 암 가운데에서 3번째로 흔히 발생하는 암이며, 최근에 위암이나 간암에 의한 사망률이 줄고 있는 반면에 폐암에 의한 사망률은 급격히 증가하고 있다(한국 중앙암등록사업 연례보고서,1998). 미국의 경우 매년 140,000명 이상 이 폐암으로 사망하는 것으로 보고되어 있으며(American Cancer Society,Cancer statistics,1989, 39, 3-20), 폐암의 5년 생존율은 단지 13%로서 췌장, 간, 그리고 식도에 발생한 암을 제외한 다른 어떤 부위의 암보다 예후가 나쁘다고 알려져 있다(American Cancer Society,Cancer statistics,1989, 39, 3-20).
폐암의 중요한 위험인자(risk factor)는 흡연과 기타 발암성물질(carcinogen)에 대한 직업적 노출인데, 특히 기관(trachea) 및 기관지(bronchus)에 생긴 암은 90%이상이 흡연으로부터 초래되는 것으로 보고되어 있다(Department of Health and Human Services,1989, Publication no.,DHHS(PHS), 89-8411).
폐암은 암세포의 현미경학적 세포형태에 따라 크게 비소세포 폐암(non-small cell carcinoma)과 소세포 폐암(small cell carcinoma)으로 구분하는데 비소세포 폐암은 전체 폐암의 약 80%를 차지하며 다음과 같은 3가지 아형이 있다.
1) 편평상피세포암(squamous cell carcinoma): 폐암 중 가장 흔한 형태로 폐중심부에서 주로 발생하며, 남자 폐암 환자에서 가장 많은 형태이다. 또한 흡연과 가장 관계가 깊다.
2) 선암(adenocarcinoma): 폐의 주변부에서 주로 발견되며, 여성에서나 담배를 피우지 않는 사람에게서 주로 발병한다.
3) 대세포암(large-cell carcinoma): 가장 드문 아형으로서 전체 폐암의 4∼10%를 차지하며, 일반적으로 선암과 유사한 예후를 보인다.
소세포 폐암은 전체 폐암의 약 20%를 차지하며 주로 기도(기관지나 세기관지)에서 처음 발병한다. 암종은 대개 기관의 표면이나 선을 따라 생성되어, 대부분(4/5) 폐중앙부에 생기고, 나머지(1/5)는 말초에 생긴다. 전반적으로 악성도가 강해서 성장속도가 빠르고 림프계통이나 혈액순환을 통해 조기에 멀리 전이되는 경향이 있다.
이러한 폐암의 치료방법으로는 수술, 방사선 요법 및 항암화학요법이 사용되고 있으나, 비소세포 폐암의 경우 완전한 수술적 절제가 가능하였던 환자들의 경우에도 다수의 환자가 수술후 재발하기 때문에 결국 1기에선 60∼70%, 2기에선30∼50%, 3기에서는 10∼30%의 환자에서만 장기 생존이 가능하다. 전체적으로 보면 5년 생존율은 30% 밖에 안되며 10년 생존율은 15%에 불과하다. 이와 같이 불량한 치료 성적을 향상시키고자 많은 노력이 이루어지고 있는데, 수술을 전후하여 항암화학요법이나 방사선요법의 병용 등으로 일부에서 효과가 입증되었으나 여러 가지 부작용을 유발하며, 치료율도 여전히 불만족스러은 실정이다. 소세포 폐암은 치료후 재발이 매우 흔하며 일단 재발이 된 경우 다음 치료시에는 항암제에 내성이 생겨 치료율이 떨어진다. 최근 새로운 여러 항암제들이 개발되어 기대를 모으고 있으나 아직도 치료후 2년 이상 살 수 있는 가능성은 30∼40%에 불과하며 5년 이상 살 가능성은 10% 미만이다.
한편, 담자균류의 일종인 펠리누스 린테우스는 한방에서는 상황(桑黃)으로 불리우며, 각종 질병, 특히 종양에 대한 치료 효과가 커서 민간에서는 매우 귀중한 약재로 이용되어 왔다. 그러나 펠리누스 린테우스는 자연계에 널리 분포하지 않는 희귀종이기 때문에 자실체의 입수가 어려울 뿐만 아니라 균사체의 분리 및 배양도 용이하지 않아 적극적으로 활용되지 못하는 실정이었다.
본 발명자들은 펠리누스 린테우스로부터 항암 면역활성 물질을 분리하기 위해 노력한 결과, 국내에서 수집 분리한 상황버섯중 항암면역 효과가 우수할 뿐만 아니라 미생물학적 특성이 기존의 균주와는 전혀 다른 새로운 펠리누스 린테우스 KCTC 0173BP 균주로부터 항암 면역활성 물질을 분리하고 그의 특성이 153,000 달톤의 분자량을 갖는 α(1,6)-헤테로글리칸(heteroglycan)이라는 것을 밝힌 바 있다(대한민국 특허공개 97-15743; 대한민국 특허공고 97-9150). 또한, 펠리누스 린테우스 KCTC 0399BP 균주로부터 신규 면역증강활성 다당류를 분리하여 그 성분이 갈락토만노글루칸(galactomannoglucan)이라는 것을 밝힌 바 있다(대한민국 특허공개 98-15617).
본 발명자들은 상기의 펠리누스 린테우스 KCTC 0173BP의 균사체를 추출, 정제하여 얻은 다당류 α(1,6)-헤테로글리칸을 "메시마(MESIMA)"로, 펠리누스 린테우스 KCTC 0399BP의 균사체를 추출, 정제하여 얻은 다당류 갈락토만노글루칸(galactomannoglucan)을 "메시마(MESIMA) PL-2"라 각각 명명하였으며, 본 발명의 메시마 및 메시마 PL-2가 폐암세포에 대하여 탁월한 항암효과를 보이는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) KCTC 0173BP 와 KCTC 0399BP의 균사체를 추출 정제하여 얻은 분자량 153,000 달톤의 항암면역활성 다당류인 α(1,6)-헤테로글리칸(heteroglycan)과 갈락토만노글루칸 (galactomannoglucan)을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 PMN(peripheral mononuclear cell)과 대식세포(macrophage)의 인간 폐암세포주인 A549 세포에 대한 탐식효과에 미치는 본 발명의 메시마(MESIMA)의 영향을 나타내는 그래프이고,
도 2는 PMN 증식물질인 박토펩톤(bactopeptone)과 대식세포 증식물질인 NIH 티오글리코레이트(thioglycolate)가 면역세포의 A549 폐암세포에 대한 탐식효과에 미치는 영향을 나타내는 그래프이고,
도 3은 호중구(neutrophil)의 A549 폐암세포에 대한 탐식효과에 본 발명의 메시마가 미치는 영향을 나타내는 그래프이고,
◆: 면역세포:암세포(1:1)에 메시마 첨가,
◇: 면역세포:암세포(10:1)에 메시마 첨가,
●: 면역세포:암세포(1:1)에 메시마 PL-2 첨가,
○: 면역세포:암세포(10:1)에 메시마 PL-2 첨가
도 4는 대식세포의 A549 폐암세포에 대한 탐식효과에 본 발명의 메시마가 미치는 영향을 나타내는 그래프이고,
◆: 면역세포:암세포(1:1)에 메시마 첨가,
□: 면역세포:암세포(10:1)에 메시마 첨가,
●: 면역세포:암세포(1:1)에 메시마 PL-2 첨가,
○: 면역세포:암세포(10:1)에 메시마 PL-2 첨가
도 5는 메시마 1으로 유도한 면역세포의 A549 폐암세포에 대한 탐식효과에 본 발명의 메시마가 미치는 효과를 나타내는 그래프이고,
◆: 면역세포:암세포(1:1)에 메시마 첨가,
◇: 면역세포:암세포(10:1)에 메시마 첨가,
●: 면역세포:암세포(1:1)에 메시마 PL-2 첨가,
○: 면역세포:암세포(10:1)에 메시마 PL-2 첨가
도 6은 메시마 2로 유도한 면역세포의 A549 폐암세포에 대한 탐식효과에 본 발명의 메시마가 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
◆: 면역세포:암세포(1:1)에 메시마 첨가,
◇: 면역세포:암세포(10:1)에 메시마 첨가,
●: 면역세포:암세포(1:1)에 메시마 PL-2 첨가,
○: 면역세포:암세포(10:1)에 메시마 PL-2 첨가
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) KCTC 0173BP와 KCTC 0399BP의 균사체를 추출 정제하여 얻은 분자량 153,000 달톤의 항암면역활성 다당류인 α(1,6)-헤테로글리칸(heteroglycan)과 갈락토만노글루칸(galactomannoglucan)을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) KCTC 0173BP와 KCTC 0399BP의 균사체를 추출 정제하여 얻은 분자량 153,000 달톤의 항암면역활성 다당류인 α(1,6)-헤테로글리칸(heteroglycan)과 갈락토만노글루칸 (galactomannoglucan)을 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 본 발명의 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) KCTC 0173BP와 KCTC 0399BP의 균사체를 추출 정제하여 얻은 분자량 153,000 달톤의 항암면역활성 다당류인 α(1,6)-헤테로글리칸(heteroglycan) 일명 "메시마(mesima)" 및 갈락토만노글루칸(galactomannoglucan) 일명 "메시마 PL-2"를 한국신약(주)으로부터 제공받아 하기의 실험에 사용하였다.
본 발명자들은 인간 폐암 세포주(human lung cancer cell line)인 A-549, 생쥐 백혈병 세포주(mouse lymphocytic leukemia cell line)인 L-1210 및 마카우스 원숭이의 신장세포(maccacus monkey kidney cell line)인 MA-104 세포들에 대한 본 발명의 메시마 및 메시마 PL-2의 세포독성 정도를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 메시마 및 메시마 PL-2은 일반적인 항암제에 의해 쉽게 세포독성을 나타내는 L-1210에 대해 세포독성을 나타내지 않았으며, 정상세포인 MA104 세포에도 세포독성을 나타내지 않았으나, 폐암세포주인 A549에 대해서는 메시마 PL-2가 특이적으로 세포독성을 나타낸다는 것을 확인하였다(표 1참조).
또한, 본 발명자들은 박토펩톤, NIH-티오글리코레이트, 메시마 및 메시마 PL-2로 유도한 PEC(peritoneal exudate cell) 면역세포의 A549 폐암세포주에 대한 세포독성을 분석하였다. 복강내 면역세포중 PMN(polymorphonuclear neutrophil)의 유도를 위해서는 일반적으로 박토펩톤(Bactopeptone)을 복강내투여하며, 복강내 면역세포중 대식세포(macrophage)의 유도를 위해서는 일반적으로 NIH-티오글리코레이트(thioglycolate)를 복강내 투여한다.
그 결과, 박토펩톤에 의해 유도된 PE 세포는 A-549 세포와 같은 수 또는 10배 많은 수를 첨가하였을 경우 폐암세포에 대한 세포독성이 거의 없는 것으로 나타났으며, NIH-티오글리코레이트에 의해 유도된 PE 세포는 A-549 세포와 같은수을 첨가한 경우에는 세포독성이 나타나지 않았으나, 10배 많은 수를 첨가하였을 경우에는 폐암세포에 대한 약한 세포독성이 나타났다(도 1참조). 메시마 및 메시마 PL-2에 의해 유도된 PE 세포는 A-549 세포와 같은 수를 배양한 경우에는 모두 세포독성을 나타내지 않았으나, 10배 많은 수를 첨가하였을 경우에는 메시마 PL-2에서 폐암세포주에 대한 세포독성을 나타내는 것을 확인하였다(도 2참조).
또한, 본 발명자들은 박토펩톤, 티오글리코레이트, 메시마 및 메시마 PL-2로 유도한 면역세포의 폐암세포에 대한 세포독성에 미치는 메시마 및 메시마 PL-2의 영향을 분석하였다.
그 결과, 박토펩톤으로 유도한 PE 세포의 폐암세포에 대한 세포독성에 메시마 및 메시마 PL-2는 모두 영향을 주지 못했으며(도 3참조), NIH-티오글리코레이트로 유도한 PE 세포의 A-549 폐암세포주에 대한 세포독성에도 메시마 및 메시마 PL-2 모두 영향을 주지 못한다는 것을 확인하였다(도 4참조). 그러나, 메시마로 유도한 PE 세포의 A549 폐암세포주에 대한 세포독성은 메시마 및 메시마 PL-2에 의해 증가되는 것을 확인하였으며, 특히 메시마 PL-2에 의해 강하게 증가되는 것을 확인하였다(도 5참조). 또한, 메시마 PL-2로 유도한 PE 세포의 A549 폐암세포주에 대한 세포독성에 메시마는 거의 효과가 없었으나, 메시마 PL-2에 의해 강하게 증가되는 것을 확인하였다(도 6참조). 이와 같은 결과는 메시마 또는 메시마 PL-2를 복강내 투여할 경우 면역세포가 활성화되고, A-549 폐암세포에 대한 탐식을 활성화시킬 수 있으며, 이러한 탐식작용은 메시마 및 메시마 PL-2 모두에 의해 활성화되나 특히 메시마 PL-2에 의해 강하게 활성화됨을 알 수 있었다. 즉, 메시마를 계속 섭취하게 되면 메시마에 의해 면역 탐식세포가 활성화 되고 이 메시마에 의해 활성화된 면역 탐식세포는 메시마에 의해 다시 활성화되므로 효과적으로 항암효과를 나타내는 것이다. 더욱이 메시마 PL-2는 다른 암세포에는 거의 직접적인 세포독성을 나타내지 않으나 폐암세포(A-549)에는 세포독성을 나타내고있어 폐암세포에 대해서는 더욱 특이적으로 작용할 것으로 사료된다.
본 발명의 메시마 및 메시마 PL-2는 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 메시마 및 메시마 PL-는은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 메시마 및 메시마 PL-2에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.
본 발명의 메시마 및 메시마 PL-2의 유효용량은 10-25 mg/kg 이고, 바람직하기로는 16-20 mg/kg 이며, 하루 1-3회 투여될 수 있다.
본 발명자들은 또한, 실험동물을 이용하여 본 발명의 메시마 및 메시마 PL-2의in vivo독성실험을 수행하였다. 메시마 및 메시마 PL-2를 체중이 25 g 정도의 ddY 생쥐의 복강에 200 ㎎/㎏ 용량으로 주사한 결과, 투여 30분 후 활동 량이 조금 줄어들었으나, 투여 2시간 후 이런 증상이 나타나지 않았고, 투여 7일 후까지 사망하지 않았으므로, 이 물질에 대한 급성독성은 200 ㎎/㎏ 용량까지는 없는 것으로 판단되었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 메시마의 수득
본 발명자들은 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) KCTC 0173BP와 KCTC 0399BP의 균사체를 추출 정제하여 얻은 분자량 153,000 달톤의 항암면역활성 다당류인 α(1,6)-헤테로글리칸(heteroglycan) 일명 메시마(mesima) 및 갈락토만노글루칸(galactomannoglucan) 일명 메시마 PL-2를 한국신약(주)으로부터 제공받아 하기의 실험에 사용하였다.
<실험예 1> 폐암세포주에 미치는 메시마의 효과
<1-1> 세포주의 배양
본 발명자들은 A549(human lung cancer cell line, 한국세포주은행, 서울대학교 의과대학) L-1210(mouse lymphocytic leukemia cell line, 한국세포주은행, 서울대학교 의과대학) 및 MA-104(Maccacus monkey kidney cell line, 도야마 위생시험소, Japan) 세포주를 10%의 FBS(fetal bovine serum, Biofluids Inc., USA), 1%의 항생물질(antibiotics-antimycotics, Gibco Co., USA), 2.2 g/L의 소디움 바이카보네이트(sodium bicarbonate, 화광순약공업, Japan)가 첨가된 RPMI-1640(Sigma Co., USA) 배지에서 배양하였다.
<1-2> 메시마의 세포독성 측정
본 발명자들은<1-1>의 세포들에 대한 메시마의 세포독성 정도를 측정하였다. 구체적으로, A-549와 MA-104는 0.25% 트립신(trypsin)으로 처리하여 세포들을 플라스크에서 떼어내고 세포수를 3x104세포/웰로 맞추어 96-웰 플레이트에 180 ㎕를 깔아 24시간 동안 37℃, 5% CO2가 포화된 CO2배양기(incubator)에서 부착시켰고,L-1210은 4x104세포/웰이 되게 세포수를 맞추어 180 ㎕를 깔아 2시간 동안 5% CO2가 포화된 CO2배양기에서 안정화시켰다. 그 후 메시마 또는 메시마 PL-2를 10, 1, 0.1, 0.01 및 0.001 ㎎/㎖가 되게 농도를 맞추어 고압증기멸균한 후 웰당 20 ㎕를 가하여 시료의 최종농도가 1 ㎎/㎖이 되게 한 후 48시간 동안 37℃의 5% CO2가 포화된 CO2배양기에서 배양하였다. 48시간 후 2 ㎎/㎖의 MTT시약(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue, Sigma, USA)을 웰당 50 ㎕씩 가하여 4시간동안 CO2배양기에서 반응시킨 후 배지를 걷어내고 침전에 DMSO(Dimethyl Sulfoxide, Duksan pure Chem. Co., LTD) 100 ㎕를 가하여 540 nm에서 ELISA 측정기(Emax, Molecular Devices, USA)로 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 하기 계산식에 따른 저해율을 구하여 분석하였다.
약물처리하지않은 웰의 흡광도 - 약물처리한 웰의 흡광도
저해율(%)=----------------------------------------------------- x100
약물처리하지않은 well의 흡광도
그 결과, 본 발명의 메시마 및 메시마 PL-2는 일반적인 항암제에 의해 쉽게 세포독성을 나타내는 L-1210에 대해 세포독성을 나타내지 않았으며, 정상세포인 MA104 세포에도 세포독성을 나타내지 않았으나, 폐암세포주인 A549에 대해서는 메시마 PL-2가 특이적으로 세포독성(IC50= 140 ㎍/㎖)을 나타낸다는 것을 확인하였다(표 1).
구분 세포독성(IC50,㎍/㎖)
A549 L1210 Ma104
메시마 >200 >200 >200
메시마 PL-2 140 >200 >200
<실험예 2> 메시마의 면역세포 유도능 및 활성화 측정
<2-1> PMN과 단핵구의 분리
PMN(polymorphonuclear neutrophill), 대식세포(macrophage) 및 임파구(lymphocyte) 등을 얻기 위하여 3% 박토펩톤(bactopeptone) 2.5 ㎖를 15시간 및 3시간 전에 생쥐에 복강주사하고, 3% NIH-티오글리코레이트(thioglycolate) 3 ㎖를 5일 전에, 메시마와 메시마 PL-2 1 ㎎을 16시간 전에 생쥐에 복강주사하였다. 각각의 생쥐에 10 ㎖의 헤파리나제 살린(heparinase saline, 5000 IU/㎖)을 복강에 주입하여 복부를 마사지(massage)해주고 복강액을 잘 빨아내어 얼음상에 놓아둔 플라스틱 시험관에 넣었다. 얻어진 액을 4℃, 1200 rpm에서 7분간 원심분리하고 침전물에 5 ㎖의 Tris-NH4Cl(pH 7.2)을 가하여 현탁시킨후 얼음중에서 30분간 방치하고 4℃, 1200 rpm에서 7분간 원심분리하였다. 침전물을 5 ㎖의 HBSS(Hank's balanced salt solutin)에 현탁시키고 4℃, 1200 rpm에서 7분간 원심분리한 후 이조작을 2회 반복하여 PMN, 대식세포 및 임파구를 수득하였다. 상기 세포들을 라이트-김사 염색(Wright-Giemsa staining)하여 확인하였다(표 2).
구분 총세포수(x107) 면역세포의 종류(%)
PMN 대식세포 기타
생리식염수 1.2±0.57 9.2±5.44 21.8±6.29 69.0±0.85
박토펩톤 5.5±0.85 68.3±0.14 8.5±0.85 23.2±0.71
NIH-티오글리코레이트 1.92±0.61 6.5 45.7 47.8
메시마 2.7±0.35 37.6±0.21 30.4±10.54 32.0±10.75
메시마 PL-2 4.4±0.36 52.0±11.24 34.9±9.91 13.1±2.33
<2-2> 박토펩톤, 티오글리코레이트, 메시마 및 메시마 PL-2으로 유도한 면역세포의 폐암세포에 대한 세포독성 분석
복강내 면역세포중 PMN(polymorphonuclear neutrophil)의 유도를 위해서는 일반적으로 박토펩톤(Bactopeptone)을 복강내투여하며, 복강내 면역세포중 대식세포(macrophage)의 유도를 위해서는 일반적으로 NIH-티오글리코레이트 (thioglycolate)를 복강내 투여한다. 본 발명자들은 박토펩톤, NIH-티오글리코레이트, 메시마 및 메시마 PL-2로 유도한 PEC(peritoneal exudate cell) 면역세포의 A549 폐암세포주에 대한 세포독성을 분석하였다. 구체적으로, 박토펩톤을 사용하여 유도한 PE 세포(peritoneal exudate cells, PMN-rich)를 A549 세포주와 0:1, 1:1 또는 10:1의 비율로 혼합하여 CO2배양기에서 배양하면서 PE 세포의 A549 폐암세포주에 대한 세포독성을 측정하였다. 다음은 NIH-티오글리코레이트를 사용하여유도한 PE 세포(macrophage-rich)를 A549 세포주와 0:1, 1:1 또는 10:1의 비율로 혼합하여 CO2배양기에서 배양하면서 PE 세포의 A549 폐암세포주에 대한 세포독성을 측정하였다. 마지막으로, 메시마와 메시마 PL-2를 복강내 투여하여 면역세포를 유도한 PE 세포를 A549 세포주와 0:1, 1:1 또는 10:1의 비율로 혼합하여 CO2배양기에서 배양하면서 PE 세포의 A549 폐암세포주에 대한 세포독성을 측정하였다.
그 결과,도 1에서 보는 것과 같이 박토펩톤에 의해 유도된 PE 세포는 A-549 세포와 같은 수 또는 10배 많은 수를 첨가하였을 경우 폐암세포에 대한 세포독성이 거의 없는 것으로 나타났다. NIH-티오글리코레이트에 의해 유도된 PE 세포는 A-549 세포와 같은수을 첨가한 경우에는 세포독성이 나타나지 않았으나, 10배 많은 수를 첨가하였을 경우에는 폐암세포에 대한 약한 세포독성이 나타났다(도 1). 메시마 및 메시마 PL-2에 의해 유도된 PE 세포는 A-549 세포와 같은 수를 배양한 경우에는 모두 세포독성을 나타내지 않았으나, 10배 많은 수를 첨가하였을 경우에는 메시마 PL-10에서 폐암세포주에 대한 세포독성을 나타내는 것을 확인하였다(도 2).
<2-3> 박토펩톤, 티오글리코레이트, 메시마 및 메시마 PL-2로 유도한 면역세포의 폐암세포에 대한 세포독성에 미치는 메시마 및 메시마 PL-2의 영향 분석
본 발명자들은 박토펩톤, 티오글리코레이트, 메시마 및 메시마 PL-2로 유도한 면역세포의 폐암세포에 대한 세포독성에 미치는 메시마 및 메시마 PL-2의 영향을 분석하였다. 구체적으로, 박토펩톤으로 유도한 PE 세포(P-PEC)와 A-549(T)세포주를 0:1, 1:1 또는 10:1의 비율로 혼합하고 배양하면서 메시마(또는 메시마 PL-2)를 0, 20, 50, 100 ㎍ 첨가하여 5-7일 동안 배양하였다. 또한, NIH-티오글리코레이트로 유도한 PE 세포(TG-PEC)와 A-549(T) 세포주를 0:1, 1:1 또는 10:1의 비율로 넣고 배양하면서 메시마(또는 메시마 PL-2)를 0, 20, 50, 100 ㎍ 첨가하여 5-7일 동안 배양하였다. 마지막으로, 메시마(또는 메시마 PL-2)로 유도한 PE 세포(M-PEC 또는 M10-PEC)와 A-549 세포주를 0:1, 1:1 또는 10:1의 비율로 넣고 배양하면서 메시마(또는 메시마 PL-2)를 0, 20, 50, 100 ㎍ 첨가하여 5-7일 동안 배양하였다. 상기와 같이 배양된 세포를 0.25% 트립신(Trypsin)으로 처리하여 세포들을 플라스크에서 떼어내고 0.4% 트리판 블루(Trypan blue)로 염색하여 살아있는 세포수를 측정하였다.
그 결과, 박토펩톤으로 유도한 PE 세포의 폐암세포에 대한 세포독성에 메시마 및 메시마 PL-2는 모두 영향을 주지 못했으며(도 3), NIH-티오글리코레이트로 유도한 PE 세포의 A-549 폐암세포주에 대한 세포독성에도 메시마 및 메시마 PL-2 모두 영향을 주지 못한다는 것을 확인하였다(도 4). 그러나, 메시마로 유도한 PE 세포의 A549 폐암세포주에 대한 세포독성은 메시마 및 메시마 PL-2에 의해 증가되는 것을 확인하였으며, 특히 메시마 PL-2에 의해 강하게 증가되는 것을 확인하였다(도 5). 또한, 메시마 PL-2로 유도한 PE 세포의 A549 폐암세포주에 대한 세포독성에 메시마는 거의 효과가 없었으나, 메시마 PL-2에 의해 강하게 증가되는 것을 확인하였다(도 6). 이와 같은 결과는 메시마 또는 메시마 PL-2를 복강내 투여할 경우 면역세포가 활성화되고, A-549 폐암세포에 대한 탐식을 활성화시킬 수있으며, 이러한 탐식작용은 메시마 및 메시마 PL-2 모두에 의해 활성화되나 특히 메시마 PL-2에 의해 강하게 활성화됨을 알 수 있었다. 즉, 메시마를 계속 섭취하게 되면 메시마에 의해 면역 탐식세포가 활성화 되고 이 메시마에 의해 활성화된 면역 탐식세포는 메시마에 의해 다시 활성화되므로 효과적으로 항암효과를 나타내는 것이다. 더욱이 메시마 PL-2는 다른 암세포에는 거의 직접적인 세포독성을 나타내지 않으나 폐암세포(A-549)에는 세포독성을 나타내고있어 폐암세포에 대해서는 더욱 특이적으로 작용할 것으로 사료된다.
<실험예 3> 메시마 및 메시마 PL-2의 급성독성 시험
본 발명자들은 실험동물을 이용하여 본 발명의 메시마 및 메시마 PL-2의in vivo독성실험을 수행하였다. 메시마 및 메시마 PL-2를 체중이 25 g 정도의 ddY 마우스의 복강에 200 ㎎/㎏ 용량으로 주사한 결과, 투여 30분 후 활동량이 조금 줄어들었으나, 투여 2시간 후 이런 증상이 나타나지 않았고, 투여 7일 후까지 사망하지 않았으므로, 이 물질에 대한 급성독성은 200 ㎎/㎏ 용량까지는 없는 것으로 판단되었다
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) KCTC 0173BP와 KCTC 0399BP의 균사체를 추출 정제하여 얻은 분자량 153,000 달톤의 항암면역활성 다당류인 α(1,6)-헤테로글리칸(heteroglycan) 일명메시마(mesima)와 갈락토만노글루칸(galactomannoglucan) 일명 메시마(mesima) PL-2는 폐암세포에 대하여 선택적으로 세포독성을 나타내므로 폐암 치료용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.

Claims (2)

  1. 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) KCTC 0173BP와 KCTC 0399BP의 균사체를 추출 정제하여 얻은 분자량 153,000 달톤의 항암면역활성 다당류인 α(1,6)-헤테로글리칸(heteroglycan)과 갈락토만노글루칸(galactomannoglucan)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
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