CN113181172B - 芝麻素在制备治疗和/或预防淋巴瘤产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种芝麻素在制备治疗和/或预防淋巴瘤产品中的应用，属于淋巴瘤治疗技术领域。本发明通过体外和体内实验发现芝麻素具有淋巴瘤的抗肿瘤作用，其药理作用包括抑制淋巴瘤生长和抑制淋巴瘤细胞增殖。进一步的，本发明发现芝麻素通过促进淋巴瘤细胞的凋亡、焦亡和自噬的PCD过程，进而抑制淋巴瘤细胞增殖，而且，芝麻素通过诱导淋巴瘤细胞自噬，进而进一步促进淋巴瘤细胞凋亡和焦亡。本发明拓展了芝麻素对T细胞淋巴瘤的药理作用，为芝麻素治疗T细胞淋巴瘤中的应用提供理论依据。

Description

芝麻素在制备治疗和/或预防淋巴瘤产品中的应用
技术领域
本发明属于淋巴瘤治疗技术领域，尤其涉及芝麻素在制备治疗和/或预防淋巴瘤产品中的应用。
背景技术
淋巴瘤是一类异质性的淋巴系统恶性肿瘤，可由环境、感染和遗传因素诱发。淋巴瘤可以侵犯人体各种器官，预后取决于组织学类型、临床因素和分子特征。淋巴瘤可分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin Lymphoma,NHL)，NHL约占淋巴瘤的90％。NHL可分为B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和NK细胞淋巴瘤。大约10-15％的NHL病例为T细胞淋巴瘤和NK细胞淋巴瘤。成熟T细胞来源的肿瘤称为外周T 细胞淋巴瘤(PTCLs)，并且PTCLs的大多数亚型的预后较差。环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松(CHOP)或CHOP样化疗仍是大多数PTCLs的标准治疗方案，但许多类型的PTCLs仍没有一致性的有效的治疗方法。因此，新的治疗策略对于开发更有效的T细胞淋巴瘤治疗方法至关重要。
程序性细胞死亡(PCD)是指依赖于特定基因编码信号活动的细胞死亡，包括凋亡、自噬、坏死、焦亡和铁死亡等。自噬是细胞自我消化的过程，在降解错误折叠的蛋白质和功能失调的细胞器中起作用。自噬对于维持体内平衡是必不可少的，已被证实可调节癌症治疗的耐药性。凋亡是多细胞生物中一种重要的自我稳定机制，是维持细胞能量代谢的基础，负责调节细胞器的周转。研究表明，肿瘤细胞的自发凋亡可能对肿瘤本身有治疗作用，这一作用可能与自噬有关。焦亡是一种不同于凋亡和坏死的新型程序性炎症细胞死亡方式。焦亡与恶性肿瘤也有着密切的关系。焦亡在肿瘤的癌变过程中可能扮演双重角色。一方面，焦亡相关的多种信号通路和炎症介质与肿瘤的发生和化疗耐药密切相关。另一方面，焦亡也可以抑制肿瘤生长。细胞凋亡、焦亡和自噬均可诱导肿瘤细胞死亡。
已有的研究表明植物衍生化合物具有潜在的抗肿瘤药理作用。目前常用的抗肿瘤药物大多为植物性化合物，如长春碱、拓扑替康、依托泊苷、紫杉醇等。芝麻素是一种木酚类化合物，存在于大约30种不同的植物属中，包括芝麻、病毒、胡椒、茶花和木兰。芝麻素具有抗增殖、抗转移、抗炎和促凋亡作用，可用于癌症治疗。然而，芝麻素对淋巴瘤的作用目前研究甚少。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供芝麻素在制备治疗和/或预防淋巴瘤产品中的应用，芝麻素通过抑制淋巴瘤生长和抑制淋巴瘤细胞增殖的方式治疗或预防淋巴瘤。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了芝麻素在制备治疗和/或预防淋巴瘤产品中的应用。
优选的，所述产品包括食品和药品。
优选的，所述芝麻素抑制淋巴瘤生长。
优选的，所述芝麻素抑制淋巴瘤细胞增殖。
优选的，所述芝麻素通过促进淋巴瘤细胞的PCD过程，抑制淋巴瘤细胞增殖。
优选的，所述PCD包括凋亡、焦亡和自噬。
优选的，所述芝麻素通过诱导淋巴瘤细胞自噬，促进淋巴瘤细胞凋亡和焦亡。
优选的，所述淋巴瘤包括T细胞淋巴瘤。
本发明还提供了一种治疗和/或预防淋巴瘤的药物，所述药物中包含有效量的芝麻素。
优选的，所述药物中芝麻素的百分含量为1％-99％。
本发明的有益效果：
本发明通过体外和体内实验发现芝麻素对淋巴瘤具有抗肿瘤作用，其药理作用包括抑制淋巴瘤生长和抑制淋巴瘤细胞增殖。本发明发现芝麻素通过促进淋巴瘤细胞的凋亡、焦亡和自噬的PCD过程，进而抑制淋巴瘤细胞增殖，而且，芝麻素通过诱导淋巴瘤细胞自噬，进而进一步促进淋巴瘤细胞凋亡和焦亡。本发明拓展了芝麻素对T细胞淋巴瘤的药理作用，为芝麻素治疗 T细胞淋巴瘤中的应用提供理论依据。
附图说明
图1芝麻素显著抑制EL4荷瘤小鼠肿瘤生长，其中A为小鼠肿瘤体积， B为小鼠肿瘤重量；
图2芝麻素显著抑制EL4细胞增殖，其中A为CCK-8法测定细胞活力结果，B和C为westernblot检测各组Cyclin D1蛋白相对表达结果；
图3芝麻素诱导EL4细胞凋亡，其中A和B为westernblot检测各组凋亡标志物蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3表达水平，C为流式细胞仪检测芝麻素处理后的EL4细胞的凋亡结果，D和E为westernblot检测芝麻素处理前采用抑制剂抑制EL4细胞后各组凋亡标志物蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3表达水平；
图4芝麻素诱导EL4细胞焦亡，其中A和B为westernblot检测各组焦亡相关标志物蛋白Caspase1,NLRP3和IL-1βp17表达水平，C为ELISA法检测小鼠血清IL-1β水平，D为ELISA法检测细胞培养上清IL-1β水平，E 为不同剂量芝麻素处理组的LDH活性，F和G为westernblot检测芝麻素处理前采用抑制剂抑制EL4细胞后各组焦亡相关标志物蛋白Caspase1,NLRP3 和IL-1βp17表达水平，H为芝麻素处理前采用抑制剂抑制EL4细胞后各组细胞培养上清中LDH活性；
图5芝麻素诱导EL4细胞自噬，其中A和B为westernblot检测各组自噬相关标志物蛋白Atg5、LC3和SQSTM1/P62表达水平，C和D为western blot检测芝麻素处理前采用自噬抑制剂抑制EL4细胞后各组自噬相关标志物蛋白Atg5、LC3和SQSTM1/P62表达水平；
图6芝麻素诱导EL4细胞自噬发生早于凋亡和焦亡，其中A和B为 westernblot检测各组自噬相关标志物蛋白Atg5、LC3和SQSTM1/P62表达水平，C和D为western blot检测各组凋亡相关标志物蛋白Bax、Bcl-2和 Caspase-3表达水平，E和F为western blot检测各组焦亡相关标志物蛋白 Cleaved-Caspase1,NLRP3和IL-1βp17表达水平变化；
图7阻断自噬抑制芝麻素处理后的EL4细胞凋亡和焦亡作用，其中A 和B为阻断自噬抑制芝麻素处理后westernblot检测各组凋亡相关标志物蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3表达水平，C和D为阻断自噬抑制芝麻素处理后 westernblot检测各组焦亡相关标志物蛋白Cleaved-Caspase1,NLRP3和IL-1βp17表达水平，E为ELISA法检测不同组别细胞培养上清IL-1β水平，F为不同组别LDH活性。
具体实施方式
本发明提供了芝麻素在制备治疗和/或预防淋巴瘤产品中的应用。
本发明对于芝麻素的来源没有特殊限定，可以通过从自然界生物体中分离、化学合成，也可通过市售获得。在本发明具体实施例中，芝麻素的分子式为C20H18O6，分子量为354.36，分子结构为
Figure BDA0003105405470000041
在本发明中，所述产品优选的包括食品和药品，所述淋巴瘤优选的包括T细胞淋巴瘤。
本发明构建小鼠T细胞淋巴瘤模型，用芝麻素处理该模型发现芝麻素能够显著抑制EL4荷瘤小鼠肿瘤生长。本发明进一步研究芝麻素对T细胞淋巴瘤的抗肿瘤作用机制，发现芝麻素在体外对小鼠T细胞淋巴瘤细胞系EL4 细胞的增殖具有显著抑制作用。凋亡信号的激活是细胞毒性药物杀死肿瘤细胞的关键机制。本发明研究芝麻素抑制EL4细胞增殖的机制，发现芝麻素可以诱导EL4细胞凋亡。
焦亡是一种新型的程序性细胞死亡方式，特征是释放促炎分子，包括 NLRP3、IL-1β和IL-18等。焦亡除了参与经典炎症性疾病和糖尿病外，还参与癌症的发病过程。本发明发现，与对照组相比，不同剂量的芝麻素处理组焦亡标志物Cleaved-Caspase1,NLRP3和IL-1βp17的蛋白表达水平显著升高，同时，芝麻素处理组小鼠血清IL-1β水平较对照组明显升高，MCC-950 可抑制焦亡标志物蛋白表达水平，而芝麻素可显著提高焦亡标志物蛋白表达水平，说明芝麻素可诱导EL4细胞焦亡。
自噬参与多种肿瘤相关的病理过程，包括肿瘤的发生、癌变和转移，一些化疗药物也可诱导肿瘤细胞发生自噬。本发明进一步研究芝麻素抑制EL4 细胞增殖的原因，发现芝麻素能显著促进EL4细胞的自噬。
本发明发现芝麻素可以诱导EL4细胞凋亡、凋亡和自噬以共同起到抵抗小鼠T细胞淋巴瘤的作用，进一步研究这三种PCD发生的顺序，结果表明芝麻素处理后的EL4细胞发生自噬早于凋亡和焦亡。本发明进一步研究自噬对凋亡和焦亡是否有调节作用，发现芝麻素通过诱导EL4细胞自噬进而进一步促进EL4细胞凋亡和焦亡。
综上可知，在本发明中，所述芝麻素优选的通过抑制淋巴瘤生长、抑制淋巴瘤细胞增殖的方式治疗或预防淋巴瘤，更优选的通过促进淋巴瘤细胞的 PCD过程，抑制淋巴瘤细胞增殖，所述PCD优选的包括凋亡、焦亡和自噬，更优选的，所述芝麻素通过诱导淋巴瘤细胞自噬，促进淋巴瘤细胞凋亡和焦亡。
本发明还提供了一种治疗和/或预防淋巴瘤的药物，所述药物中包含有效量的芝麻素。
在本发明所述药物中，优选的还包括药学上可接受的辅料。本发明所述药物中，以芝麻素为有效成分，所述芝麻素在所述药物中的百分含量优选为 1％-99％，所述芝麻素的纯度优选为≥99.9％。本发明对所述辅料的来源及种类并没有特殊限定，利用本领域的常规药学辅料即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
5×105个EL4细胞皮下注射到6～8周龄BALB/c雌性小鼠右侧腋窝，建立小鼠T细胞淋巴瘤模型。当平均肿瘤体积约为100mm3时，荷瘤小鼠随机分为两组进行后续治疗。治疗组小鼠每2天腹腔注射10mg/kg芝麻素，由无菌磷酸盐缓冲液(PBS)稀释。对照组(NC)小鼠腹腔注射同等体积的 PBS溶液。所有小鼠均在无特定病原体(SPF)条件下饲养，自由饮水和进食。每两天测量一次肿瘤体积。21天后，处死小鼠，并收集肿瘤组织称重。结果如图1所示。芝麻素治疗组小鼠肿瘤体积约从肿瘤接种11天开始显著小于对照组小鼠肿瘤体积(图1A)；同时芝麻素治疗组小鼠肿瘤重量明显低于对照组小鼠肿瘤重量，与肿瘤体积生长曲线结果一致(图1B)。综上所述，芝麻素可以显著抑制EL4荷瘤小鼠肿瘤生长。
实施例2
用CCK-8法测定细胞活力，具体方法如下：在96孔板中配置100μL 的细胞悬液，每孔2000个EL4细胞。将培养板在培养箱预培养24h(37℃，5％CO2)。24h后，分别用10μM、20μM和40μM芝麻素(将芝麻素溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，依据实验需求用RPMI-1640培养基稀释芝麻素终浓度为10μM，20μM和50μM)刺激小鼠T细胞淋巴瘤细胞系EL4细胞 (购自美国ATCC公司)48、72和96h，EL4细胞在含10％胎牛血清(FBS)、 100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中37℃、5％CO2的湿化培养箱中培养。到达规定时间后，向每孔加入10μL CCK8溶液。将培养板在培养箱内孵育1-4h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，根据吸光度计算细胞活力。若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M 的HCl溶液或者1％w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。 24h内测定，吸光度不会发生变化。
细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100。其中A(加药)：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度；A(空白)：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度；A(0加药)：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。
结果如图2A所示，不同剂量的芝麻素处理组的细胞活力在处理后48、 72和96h均显著低于对照组。
Cyclin D1是细胞周期G1/S期的特异性周期蛋白，对于肿瘤细胞的增殖是必不可少的。用10μM、20μM和40μM芝麻素处理EL4细胞72h后，提取各组总蛋白，利用westernblot方法检测各组Cyclin D1蛋白相对表达水平变化，具体方法如下：用蛋白裂解液RIPA裂解细胞，4℃，10000转/min，离心15min，吸取蛋白上清。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。10-12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，每组上样20μg蛋白提取物， 110V恒压电泳使其分离。然后，将分离的蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF) 膜上，并用5％脱脂牛奶封闭PVDF膜2h，阻断非特异性结合。磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜2次，每次7-8min。将PVDF膜与一抗Cyclin D1(1:1000) 在4℃环境孵育过夜。第二日，PBST洗膜5次，每次7-8min。将膜与二抗室温孵育1h，PBST洗膜5次，每次7-8min。采用增强化学发光试剂盒检测蛋白印迹发光强度。
结果如图2B和图2C所示，与对照组相比，不同剂量的芝麻素处理组细胞Cyclin D1的蛋白表达水平均显著降低。由此可见，芝麻素显著抑制EL4 细胞的增殖。
实施例3
首先，分别用10μM、20μM和40μM芝麻素处理EL4细胞72h，提取各组总蛋白，利用westernblot方法检测各组凋亡相关标志物蛋白表达水平变化，包括Bax、Bcl-2和Caspase-3，内参为β-Tubulin，具体方法同实施例 2，区别仅在于一抗为Caspase-3(1:1000)、Bax(1:1000)、Bcl-2(1:1000)、β -Tubulin(1:3000)，二抗为相应的二抗。
结果如图3A和图3B所示，与对照组相比，不同剂量的芝麻素处理组凋亡标志物(Bax/Bcl-2和cleaved-Caspase3)的蛋白表达水平明显升高。
其次，分别用10μM、20μM和40μM芝麻素处理EL4细胞72h，流式细胞仪检测芝麻素处理后的EL4细胞的凋亡比例(Annexin V+PI-和 AnnexinV+PI+)，具体方法为：每管样品收集1×105个细胞，并用预冷PBS 洗涤。将收集好的细胞至于流式管中，补满PBS，4℃，1400转/min，离心 7min。离心后弃去上清，补适量PBS吹匀管底细胞，体积调整为50μL左右。加入流式荧光抗体AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)(1:100)，吹打混匀， 4℃冰箱或冰上避光染色15min。染色后补满PBS溶液，4℃，1400转/min，离心7min，PBS缓冲液重悬细胞，流式细胞术检测荧光强度。
结果如图3C所示，芝麻素处理诱导EL4细胞细胞凋亡比例较对照组显著增高，芝麻素可以促进EL4细胞凋亡。
为进一步验证上述结果，在芝麻素处理前，用10μM Caspase-3抑制剂 Z-DEVE-FMK刺激EL4细胞，以抑制细胞凋亡作用，6h后加入20μM芝麻素，刺激72h后，提取各组总蛋白，利用western blot方法检测各组凋亡相关标志物蛋白表达水平变化，包括Bax、Bcl-2和Caspase-3，具体方法如前所述。结果如图3D和3E所示，Z-DEVE-FMK可抑制抑制EL4细胞凋亡标志物蛋白表达水平，而接受芝麻素处理后显著提高凋亡标记物蛋白表达水平。综上所述，芝麻素可以诱导EL4细胞凋亡。
实施例4
芝麻素诱导EL4细胞焦亡
作为一种新型的程序性细胞死亡方式，焦亡的特征是释放促炎分子，包括NLRP3、IL-1β和IL-18等。焦亡除了参与经典炎症性疾病和糖尿病外，还参与癌症的发病过程。首先分别用10μM、20μM和40μM芝麻素处理 EL4细胞72h，提取各组总蛋白，利用westernblot方法检测各组焦亡相关标志物蛋白表达水平变化，包括Caspase1，NLRP3和IL-1βp17，内参为β -Tubulin，具体方法同实施例2，区别仅在于一抗为β-Tubulin(1:3000)、 Caspase-1(1:1000)、NLRP3(1:1000)和IL-1βp17(1:1000)，二抗为相应的二抗。
ELISA法检测细胞培养上清和小鼠血清IL-1β水平，将实施例1造模成功的小鼠T细胞淋巴瘤模型处死时留取血样本，4℃，5000转/分钟，离心8 分钟，提取血清。10μM、20μM和40μM芝麻素或20μM芝麻素联合10 μM自噬抑制剂氯喹(CQ)处理后收集细胞培养上清。采用IL-1βELISA 试剂盒检测血清和细胞培养上清中IL-1β的水平，酶标仪测定450nm处的吸光度。具体采用IL-1βELISA试剂盒检测细胞培养上清中IL-1β的水平，酶标仪测定450nm处的吸光度。
乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH活性，具体方法为：根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中，使待检测时细胞密度不超过80-90％满。每孔4000个EL4细胞置于96孔板内。吸去培养液，用 PBS液洗涤一次。换新鲜培养液(推荐使用含1％血清的低血清培养液或适当的无血清培养液)，将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)，未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔)，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔)，以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔)，并做好标记。按照实验需要，用10μM、20μM和40μM的芝麻素或20μM芝麻素联合10μM CQ刺激EL4细胞，继续按常规培养。到预定的检测时间点前1h，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10％。加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心 5min。分别取各孔的上清液120μL，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。
结果显示如图4所示，与对照组相比，不同剂量的芝麻素处理组焦亡标志物(Cleaved-Caspase1，NLRP3和IL-1βp17)的蛋白表达水平显著升高(图 4A、B)。同时，芝麻素处理组小鼠血清IL-1β水平较对照组明显升高(图4C)。细胞培养上清IL-1β水平与细胞IL-1β蛋白水平变化呈一致性(图4D)。焦亡通常涉及细胞内容物的释放，包括LDH和细胞因子等。不同剂量的芝麻素处理组的LDH释放百分比均显著高于对照组(图4E)。
为了进一步验证上述结果，在芝麻素处理前用10μM NLRP3抑制剂 MCC-950刺激EL4细胞,以抑制细胞焦亡作用，6h后加入20μM芝麻素，刺激72h后，提取各组总蛋白，利用westernblot方法检测各组焦亡相关标志物蛋白表达水平变化，包括Caspase1，NLRP3和IL-1βp17等，具体方法同上；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH释放活性，具体方法如前所述。结果显示，MCC-950可抑制焦亡标志物蛋白表达水平，而芝麻素可显著提高焦亡标志物蛋白表达水平(图4F，G)。细胞培养上清中LDH释放活性与焦亡标志蛋白表达水平一致(图4H)。综上所述，芝麻素可诱导EL4细胞焦亡。
实施例5
芝麻素诱导EL4细胞自噬
为了进一步探究芝麻素抑制EL4细胞增殖的原因，检测芝麻素处理后的 EL4细胞的自噬水平。用10μM、20μM和40μM芝麻素处理EL4细胞72h，提取各组总蛋白，利用westernblot方法检测各组自噬相关标志物蛋白表达水平变化，包括Atg5、LC3和SQSTM1/P62，内参为β-Tubulin，具体方法同实施例2，区别仅在于一抗为β-Tubulin(1:3000)、Atg5(1:1000)、LC3B (1:1000)、P62(1:1000)，二抗为相应的二抗。结果如图5A、5B所示，不同剂量的芝麻素处理均可显著提高EL4细胞自噬相关标志物Atg5和LC3B-II/I 的蛋白表达水平，降低SQSTM1/P62的蛋白表达水平，表明芝麻素有促进自噬的潜在作用。
为进一步验证上述结果，在芝麻素处理前，用10μM自噬抑制剂CQ刺激EL4细胞，以抑制细胞自噬作用，6h后加入20μM芝麻素，刺激72h后，提取各组总蛋白，利用westernblot方法检测各组自噬相关标志物蛋白表达水平变化，包括Atg5、LC3和SQSTM1/P62等，具体方法如前所述。结果如图5C、5D所示，CQ可以明显抑制EL4细胞的自噬水平，而芝麻素可显著增强EL4细胞的自噬水平。这些结果表明芝麻素能显著促进EL4细胞的自噬。
实施例6
芝麻素诱导EL4细胞自噬发生早于凋亡和焦亡
实施例3-5研究结果表明芝麻素可以诱导EL4细胞焦亡、凋亡和自噬以共同起到抵抗小鼠T细胞淋巴瘤的作用。然而，这三种PCD发生的顺序尚未明确。用20μM芝麻素分别处理EL4细胞0、6、12、24、48、72h，提取各组总蛋白，利用westernblot方法检测各组凋亡(Bax、Bcl-2和Caspase-3)、焦亡(Cleaved-Caspase1,NLRP3和IL-1βp17)和自噬(Atg5、LC3和SQSTM1/P62)相关标志物蛋白表达水平变化，具体方法如前所述。结果如图 6A、6B所示，自噬标志物蛋白表达水平在芝麻素处理6h后开始显著变化。与0h组相比，Atg5和LC3B-II/I在不同时间点的表达水平显著升高，而 SQSTM1/P62在不同时间点的表达水平显著降低。凋亡标志物的相对蛋白表达水平在芝麻素处理24h后开始发生显著变化。与0h组相比，24h、48h和 72h组凋亡标志物的蛋白(Bax/Bcl-2和cleaved-Caspase3)表达水平明显升高 (图6C,D)。焦亡标志物(Cleaved-Caspase1,NLRP3和IL-1βp17)的变化趋势与凋亡标志物的变化趋势相似(图6E,F)。结果表明，芝麻素处理后的EL4 细胞发生自噬早于凋亡和焦亡。
实施例7
阻断自噬抑制芝麻素处理后的EL4细胞凋亡和焦亡作用
实施例6结果表明，芝麻素处理后的EL4细胞自噬发生早于凋亡和焦亡。因此，进一步探究自噬对凋亡和焦亡是否有调节作用。芝麻素治疗前，在芝麻素处理前，用10μM自噬抑制剂CQ刺激EL4细胞，以抑制细胞自噬作用， 6h后加入20μM芝麻素，刺激72h后，提取各组总蛋白，利用westernblot 方法检测各组凋亡(Bax、Bcl-2和Caspase-3)和焦亡(Cleaved-Caspase1,NLRP3 和IL-1βp17)相关标志物蛋白表达水平，方法同上；ELISA法检测细胞培养上清IL-1β水平，方法同上；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH释放活性，具体方法如前所述。
结果显示，与对照组相比，芝麻素可以显著促进EL4细胞凋亡水平，而给予CQ处理后，CQ组与CQ联合芝麻素组之间凋亡标志蛋白(Bax/Bcl-2和 cleaved-Caspase3)表达水平无差异，以上结果提示自噬可能处于凋亡的上游发挥作用(图7A,B)。焦亡水平的变化趋势与凋亡水平相似，包括焦亡标志蛋白(Cleaved-Caspase1,NLRP3和IL-1βp17)表达水平、细胞培养上清IL-1β水平和LDH释放活性(图7C-F)。综上所述，CQ阻断自噬可明显抑制芝麻素处理后的EL4细胞的凋亡和焦亡，提示自噬可能处于细胞凋亡和焦亡的上游。芝麻素通过诱导EL4细胞自噬进而进一步促进EL4细胞凋亡和焦亡。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.芝麻素作为唯一活性成分在制备治疗和/或预防T细胞淋巴瘤药品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芝麻素抑制淋巴瘤生长。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芝麻素抑制淋巴瘤细胞增殖。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述芝麻素通过促进淋巴瘤细胞的PCD过程，抑制淋巴瘤细胞增殖。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCD包括凋亡、焦亡和自噬。
6.根据权利要求1或5所述的应用，其特征在于，所述芝麻素通过诱导淋巴瘤细胞自噬，促进淋巴瘤细胞凋亡和焦亡。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009013131A (ja) * 2007-07-06 2009-01-22 Suntory Ltd 細胞増殖抑制剤
WO2021006822A1 (en) * 2019-07-08 2021-01-14 Chiangmai University Pharmaceutical compositions having synergistic effects of natural extracts for cancer treatment undergoing chemotherapy

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108143730A (zh) * 2018-02-12 2018-06-12 哈尔滨医科大学 褪黑素在霍奇金淋巴瘤治疗中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009013131A (ja) * 2007-07-06 2009-01-22 Suntory Ltd 細胞増殖抑制剤
WO2021006822A1 (en) * 2019-07-08 2021-01-14 Chiangmai University Pharmaceutical compositions having synergistic effects of natural extracts for cancer treatment undergoing chemotherapy

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Sesamin suppresses NSCLC cell proliferation and induces apoptosis via Akt/p53 pathway.;Chen, Y. 等;《 Toxicology and Applied Pharmacology 》;20200115;第 387 卷;全文 *
LONP1在常见恶性肿瘤中表达和作用的研究进展;李金晶等;《医学研究杂志》;20190315(第03期);全文 *
中医药调节内质网应激防治疾病的研究进展;刘蓉等;《天津中医药》;20200112(第01期);全文 *
芝麻素对S_(180)荷瘤小鼠免疫功能及对增殖细胞核抗原表达的影响;卞红磊;《中国现代医学杂志》;20081215(第23期);全文 *

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