KR100955973B1 - 세포 사멸을 조절하는 세포독성인자 - Google Patents
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Abstract
세포 사멸을 조절하는 사용되는 세포독성인자 및 괴사나 아폽토시스-관련된 질환을 치료하는 방법에서 이들의 용도를 개시한다. 본원 발명은 또한, 세포 사멸과 관련된 질환을 치료하는데 효과적인 활성물질을 동정하는 방법에 관한다. 본 발명자들은 개별 병원균이 항암 활성을 갖는 별개의 세포독성인자를 생산한다는 사실을 발견하였다. 실질적으로 순수한 세포독성인자는 감염성 질환이나 암을 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
Description
본 출원은 미국 분할 출원 60/269,133(2001. 2. 15)에 우선권을 주장한다.
본원의 요부는 국립보건원(NIH), Bethesda, Maryland, U.S.A.,로부터 연구 승인(승인 번호 AI 16790-21, ES 04050-16, AI 45541, CA 09432, NOI-CM97567)을 받았다. 미국 정부는 본원에 일정한 권리를 갖는다.
본원 발명은 병원성 미생물에 의해 분비되는 세포독성인자, 이런 세포독성인자의 저해물질, 괴사와 아폽토시스에 의한 세포 사멸의 조절에서 이들의 용도에 관한다. 본원 발명은 또한, 아폽토시스를 조절하는데 유용한 세포독성인자를 생산, 분리, 동정하는 방법 및 세포 사멸을 조절하는데 효과적인 실질적으로 순수한 세포독성인자를 함유하는 조성물에 관한다. 본원 발명은 또한, 아폽토시스-관련된 질환을 치료하는 방법에 관한다. 좀더 구체적으로, 본원 발명은 암 세포에 아폽토시스를 유도하는 방법에서 실질적으로 순수한 세포독성인자의 용도 및 감염이나 다른 병원균-유도된 질환을 치료하는 방법에서 세포독성인자 저해물질의 용도에 관한다.
감염 질환은 다양한 환경 인자의 산물일 수 있다. 감염성 질환의 기초적 원 인은 감염성 병원체이다. 전형적으로, 감염성 병원체는 병원성 미생물, 예를 들면 병원성 박테리아이다. 방어 기전을 극복하고 병을 유발하는 병원성 미생물의 능력 정도는 독력(virulence)과 연관한다. 병원성 미생물은 세포독성인자를 발현하는 것으로 알려져 있는데, 이들 세포독성인자는 병원균이 숙주 면역계로부터 자신을 보호하고 식세포(예, 대식세포와 비만세포)가 체내에서 병원균을 제거하지 못하도록 한다. 살아남은 병원성 미생물은 숙주 조직에 침투하고 증식하여 심각한 병적 증상을 유발할 수 있다. 병원성 박테리아는 예로써 결핵, 콜레라, 백일해, 플라크 등을 비롯한 다양한 쇠약성 또는 치명적 질환의 근본 원인으로 확인되고 있다. 이런 중증도 감염을 치료하기 위하여, 감염성 병원체를 죽이거나 세포독성인자를 무해하게 하는 약물, 예를 들면 항생제를 투여하여 감염성 병원체가 숙주면역계로부터 자신을 방어하지 못하도록 한다. 하지만, 병원성 박테리아는 항생제에 대한 저항성을 개발하기 때문에 이런 미생물로 인한 감염의 확산을 막기 위해서는 개선된 약물이 필요하다.
암은 잠재적으로 무한히 성장하는 악성 종양이다. 근본적으로, 이는 체내에서 발견되는 다양한 세포 종류의 병원성 복제(정상적인 조절의 상실)이다. 암의 초기 치료는 주로 수술, 방사선 치료 또는 이들의 조합이지만, 전이성 질환이 국소적으로 빈번하게 재발한다. 일부 암에서 화학치료요법이 가능하긴 하지만, 이들 요법은 장기적인 완화를 유도하지 못한다.
따라서, 이들 요법은 치료력이 없다. 일반적으로, 종양과 이들의 전이는 다중약물 저항성의 발생으로 화학요법에 반응하지 않게 된다. 많은 경우에, 종양은 일부 계통의 화학요법제에 선천적으로 저항한다. 이에 더하여, 이런 치료는 비-암세포를 위협하고 인체에 스트레스를 유발하며 많은 부작용을 초래한다. 따라서, 암세포의 확산을 예방하기 위하여 개선된 약물이 필요하다. 환자가 병원성 박테리아에 감염되면 많은 암들이 퇴행되는 것으로 알려져 있다. 하지만, 박테리아 감염이 인체 암의 퇴행을 유도하는 기전과 관련하여 밝혀진 내용은 거의 없다.
본원 발명은 괴사 또는 아폽토시스로 세포 사멸을 촉진하는 세포독성인자에 관한다. 한 측면에서, 실질적으로 순수한 세포독성인자가 특성화 및 분리되었다. 실질적으로 순수한 세포독성인자는 병원성 미생물에 노출된 성장 배지의 칼럼 크로마토그래피 분별로 얻는다. 적절하게는, 이런 세포독성인자의 생산과 분비는 포유동물 단백질의 존재하에 병원성 미생물의 성장동안 촉진된다.
본원 발명의 다른 측면에서, 독성과 무독성 미생물을 구분하는 수단으로 포유동물 단백질에 대한 수용체의 동정은 질환 치료의 향상된 특이성을 결과할 수 있다.
본원 발명의 또 다른 측면은 세포 사멸에 대한 저항성 또는 감수성과 관련된 질환을 치료하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 선택적으로 제약학적 담체에 통합된 세포독성인자, 세포독성인자의 저해물질, 또는 이의 변이체나 유도체를 투여하는 단계로 구성된다.
세포독성인자, 또는 이의 변이체나 유도체는 비정상적 세포 증식과 관련된 질환의 예방과 치료에 사용되는 제약학적 조성물에 통합될 수 있다. 가령, 세포독성인자는 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
세포독성인자의 저해물질, 또는 이의 변이체와 유도체는 식세포 사멸을 예방하여 숙주 면역계가 침입 병원균에 저항할 수 있도록 함으로써 박테리아 감염을 치료하는데 사용될 수 있다.
본원 발명의 다른 구체예에서, 세포독성인자 및 이들의 분비계의 구성요소는 감염성 병원체에 대한 백신 후보로 사용될 수 있다.
본원 발명은 또한, 세포 사멸을 조절하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 세포독성인자의 분비를 조절하는 단계로 구성된다. 적절한 구체예에서, 세포독성인자는 인체 암세포의 숙주에 대한 항-암 물질로 사용될 수 있다. 이에 더하여, 세포독성인자는 저해물질의 스크리닝이나 합리적 설계를 통한 약물 개발의 표적으로 사용될 수 있다.
본원 발명의 이런 측면, 이점, 특징은 다음의 도면 및 적절한 구체예의 상세한 설명으로부터 자명하다.
본원에서 "세포독성인자"는 병원성 미생물에 의해 분비되고 괴사나 아폽토시스로 세포 사멸을 촉진하는 인자를 의미한다. "세포독성인자"를 수식(modification)하는데 이용되는"ATP-의존성"은 아데노신 5'-삼인산염(ATP)의 존재하에 세포 사멸을 유도하는 세포독성인자를 의미한다. "세포독성인자"를 수식하는데 이용되는"ATP-독립성"은 ATP의 부재하에 세포 사멸을 유도하는 세포독성인자를 의미한다.
본원에서 "치료"에는 치료하려는 질환이나 증상의 진행 또는 심각도를 예방, 저하, 중단 또는 역전시키는 작업이 포함된다. 따라서, "치료"에는 적절한 의학적, 치료적 및/또는 예방적 투여가 포함된다.
본원에서 "세포 사멸에 대한 저항성과 관련된 질환"은 합리적이고 숙련된 의사 또는 임상의에 의해 건강한 세포와 비교하여 연장된 세포 생존의 경향으로 적어도 특성화되는 질환, 상태 또는 병을 의미한다. 본원에서 "세포 사멸에 대한 감수성과 관련된 질환"은 합리적이고 숙련된 의사 또는 임상의에 의해 건강한 세포와 비교하여 조기 세포 사멸의 경향으로 적어도 특성화되는 질환, 상태 또는 병을 의미한다.
본원에서"세포독성인자"또는"독력 인자"를 수식하는데 이용되는"실질적으로 순수한"은 분비된 성장 배지로부터 활성 저해 화합물이 실질적으로 없거나 섞이지 않은 형태로 분리되는 인자를 의미한다. "실질적으로 순수한"은 분리된 분취물 중량당 대략 75%이상의 인자, 또는 적어도"75% 실질적으로 순수한"인자를 의미한다. 좀더 적절하게는, "실질적으로 순수한"은 분리된 분취물 중량당 적어도 대략 85%이 상의 인자, 또는 적어도"85% 실질적으로 순수한"인자를 의미한다. 실질적으로 순수한 세포독성인자 또는 독력 인자는 실질적으로 순수한 한가지이상의 다른 화합물 또는 분리된 세포독성인자와 병용될 수 있다.
본원에서 "이의 변이체나 유도체"는 화합물이나 물질을 인코드하는 유전자의 화학적 수식 또는 조작으로 수득되는 화합물이나 물질을 의미한다. 세포독성인자의 변이체나 유도체는 세포독성인자의 화학적 수식 또는 이런 세포독성인자를 인코드하는 유전자의 조작, 예를 들면 세포독성인자의 독성이외의 기본적인 조성이나 특성을 변화시켜 수득할 수 있다. 유사하게, 세포독성인자 저해물질의 유도체는 이런 저해물질의 화학적 구조에 화학적 수식 또는 이런 저해물질을 인코드하는 유전자의 조직을 포함한다. 가령, 항생제 페니실린을 화학적으로 수식하여 페니실린 자체보다 좀더 강력하거나 좀더 넓은 스펙트럼을 갖는 유도체를 제공할 수 있다.
"치료요법적 효과량"은 처리된 개체에서 기존 증상의 진행을 예방 또는 완화시키는 효과량이다. 치료요법적 효과량의 결정은 당업자의 능력 범위에 속한다.
개요.
본원 발명은 병원성 미생물에 의해 분비되고 괴사나 아폽토시스에 의한 세포 사멸을 촉진하는 세포독성(또는 독력) 인자를 제시한다. 병원성 미생물이 인체나 동물 조직에 침투할 때, 식세포가 숙주 면역계에서 최초 방어선 역할을 한다. 전형적으로, 식세포는 체내에 침입한 외래 병원균을 찾아 파괴시킨다. 하지만, 미생물 병원균에 의해 분비되는 세포독성인자는 식세포의 세포 사멸을 촉진할 수 있다. 따라서, 식세포는 보호 면역 기능을 수행하지 못하게 된다.
본 발명자들은 많은 병원성 박테리아가 ATP-의존성 세포독성인자, 예를 들면 괴사에 의해 식세포 사멸을 유발하는 ATP-이용 효소를 분비한다는 사실을 이미 보고하였다[Zaborina O. et al., Infect. Immun. 67:5231-5242(1999); Melinikov A. et al., Mol. Microbiol. 36: 1481-1493(2000); Punj et al., Infect. Immun. 68: 4930-4937(2000)]. ATP-이용 효소는 여러 에너지-관련된 뉴클레오티드 유도체, 예를 들면 ATP, 아데노신 5'-이인산염(ADP), 아데노신 5'-일인산염(AMP), 또는 아데노신에 작용하여 이들을 다양한 산물로 전환시키는데, 상기 산물은 퓨린작동성(purinergic) 수용체의 활성화를 통하여 대식세포와 비만세포와 같은 식세포의 사멸을 촉진할 수 있다.
본원 발명의 한 측면은 ATP-독립성 세포독성인자, 예를 들면 산화환원(redox) 단백질 역시 일부 병원성 미생물 종에 의해 분비되고 이런 인자가 괴사에 의한 식세포 사멸을 유발한다는 발견에 관한다[Zaborina O. et al., Microbiology 146: 2521-2530(2000)]. 본원 발명의 다른 측면은 ATP-독립성 세포독성인자가 암세포에서 아폽토시스를 유도한다는 놀라운 발견에 관한다. 통상의 암세포는 아폽토시스 사멸에 감수성이 없다. 포유동물 세포 아폽토시스는 p53 단백질의 존재를 필요로 하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 인체 암의 50%에서 p53 종양 억제 단백질을 인코드하는 유전자에 불활화 돌연변이가 존재한다. p53이 포유동물 세포에서 산화환원 단백질의 발현을 조절하긴 하지만, 포유동물 산화환원 단백질은 암세포 아폽토시스에 직업 관여하지 않는다. 암세포에서 아폽토시스 유도 및 종양 크기의 감소에서 미생물 ATP-독립성 세포독성인자의 역할은 확인되지 않았다. 따라서, 이런 세포독성인자는 세포 사멸에 대한 저항성과 관련된 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 이런 질환에는 예로써 사람 흑색종, 백혈병, 유방암, 난소암, 폐암, 간엽(mesenchymal)암, 결장암, 소화관암(예, 위암, 식도암, 후두암, 구강암)이 포함된다.
본원 발명의 다른 측면은 병원성 미생물에 의해 분비되는 세포독성인자의 동정 및 특성화의 방법에 관한다. 이런 방법은 세포 사멸의 적절한 저해물질이나 촉진물질을 발견하는 수단을 제공할 수 있다. 저해물질과 촉진물질은 제약학적 약물로 개발되어 세포 사멸에 대한 저항성 또는 감수성으로 특성화되는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
본원 발명의 또 다른 측면은 특성화되고 동정된 세포독성인자 및 이런 세포독성인자의 저해물질에 관한다. 세포독성인자는 세포 사멸과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위하여 본원 발명의 방법으로 활성화 또는 불활성화될 수 있다.
세포독성인자의
분비
본원 발명의 한 측면에서, 본원 발명의 세포독성인자는 박테리아와 원생동물을 비롯한 다수의 상이한 병원성 미생물에 의해 분비된다. 세포독성인자를 제공하는데 적합한 병원성 박테리아의 예에는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 비브리오 콜레아(Vibrio cholera), 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이에 더하여, 세포독성인자는 리슈마니아 아마조네시스(Leishmania amazonensis)와 말레이사상충(Brugia malayi)과 같은 병원균에 의해 분비된다.
기회적 병원균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa); 낭포성 섬유증과 만성 육아종성 질환으로 고생하는 환자에 치명적 감염을 유발하는 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia); 콜레라를 유발하는 장내 병원균인 비브리오 콜레라(Vibrio cholera); 결핵을 유발하는 마이코박테리아 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 또는 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis)와 같은 느리게 성장하는 마이코박테리아 독성군은 ATP-이용 효소를 분비하는 것으로 밝혀졌다.
ATP-이용 효소의 분비이외에, 본 발명자들은 녹농균(P. aeruginosa)이 ATP-독립성 세포독성인자를 분비한다는 것을 밝혀냈다. 이들 인자는 2개의 산화환원 단백질, 아주린(azurin)과 시토크롬 c551로 동정되었다. 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) 역시 산화환원 단백질을 분비하는 것으로 확인되었다. 마이코박테리아 보비스(M. bovis) 역시 식세포에 대하여 ATP-독립성 세포독성을 갖는 세포독성인자를 분비하는 것으로 밝혀졌다.
포유동물 단백질의 존재하에
세포독성인자의
분비 촉진
본원 발명의 다른 측면에서, 세포독성인자의 생산과 분비는 포유동물 단백질의 존재하에 병원성 미생물의 성장동안 촉진된다. 가령, 병원성 미생물, 예를 들면 녹농균(P. aeruginosa), 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia), 마이코박테리아 보비스(M. bovis)에 의한 세포독성인자의 분비는 포유동물 단백질, 예를 들면 카파-카세인, 소 혈청 알부민, 난알부민 또는 α2-마크로글로불린의 존재에 의해 촉진 된다. 병원성 미생물은 특정 포유동물 단백질의 존재를 포유동물 숙주 환경으로 인식하고, 숙주 방어를 파괴하는 세포독성물질의 분비 기전을 개시한다.
버크홀데리아 세파시아(B. cepacia)의 여러 임상적(독성) 분리균은 아데닐레이트 키나아제 또는 5'-뉴클레오티다제와 같은 ATP-이용 효소를 다량 분비하는 반면, 여러 환경적(무독성) 분리균은 이들 효소를 소량 분비한다는 것으로 밝혀졌다. 임상적 분리균, 예를 들면 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) 균주 38에서, 세포독성인자의 분비 수준은 성장 배지에서 α2-마크로글로불린의 존재에서 현저하게 강화된다. 임상적 분리균으로부터 얻은 분비된 산물은 환경적 분리균으로부터 얻은 분비된 산물보다 대식세포와 비만세포에 대하여 좀더 높은 수준의 세포독성을 갖는다. α2-마크로글로불린의 존재하에 세포독성인자의 강화된 분비를 보이는 임상적 분리균은 표면에서 α2-마크로글로불린에 대한 수용체의 존재를 또한 보였다.
본원 발명의 적절한 구체예에서, ATP-독립성 세포독성인자의 생산과 분비는 포유동물 단백질의 존재하에 병원성 미생물의 성장동안 촉진된다.
따라서, 세포독성인자의 증가된 분비는 포유동물 단백질을 함유하는 성장 배지에 병원성 미생물을 성장시켜 달성할 수 있다. 적절한 성장 배지는 예로써 L 액체배지, 영양 액체배지, 트립티카제 소이 액체배지, 트립톤-효모 추출물 액체배지(Difco Laboratories, Maryland, U.S.A.)이다. 전형적으로, 대략 500 ㎖ 내지 1,000 ㎖ 무균 증기가압멸균된 성장 배지는 104 내지 106 세포/㎖를 접종한다. 이 후, 접종된 배지는 미생물의 성장에 적합한 조건, 일반적으로 30℃ 내지 37℃에서 회전 교반기에 배양한다. 성장 배지, 배양 조건 및 박테리아와 다른 미생물의 성공적인 배양을 가능하게 하는 다른 인자의 선택은 당업자에게 자명하다. 본 발명자들은 성장 배지에서 최대 농도가 기하급수적 성장기 후반 및 성장 정지기 초반에 나타난다는 것을 발견하였다.
본원 발명의 다른 구체예에서, 포유동물 단백질의 수용체 동정은 미생물의 독성과 무독성 균주를 구별하는 수단을 제공한다. 가령, 환경적 분리균이 아닌 주로 임상적 분리균에서 α2-마크로글로불린에 대한 수용체의 존재는 숙주 방어에 대항하는 무기로서 세포독성물질을 분비할 뿐만 아니라 임상적 독성 균주와 환경적 무독성 균주를 구별할 수 있는 전자의 능력과 연관한다. 여기에서, 미생물의 독성 균주를 동정하고, 이후 항생제 감수성이나 다른 임상적 목적으로 검사할 수 있다.
ATP
-독립성
세포독성인자의
정제
*본원 발명의 다른 측면에서, 실질적으로 순수한 ATP-독립성 세포독성인자는 분비 미생물의 성장 배지에서 칼럼 크로마토그래피 분별로 수득한다. 적절하게는, 박테리아 세포는 분별에 앞서 성장 배지로부터 제거한다. 이는 성장 배지의 초기 원심분리 및 후속 여과로 달성할 수 있다. 적합한 필터는 전형적으로 대략 0.5 ㎛이하, 바람직하게는 대략 0.2 ㎛ 이하 구멍 크기를 갖는다. 하지만, 병원균 제거의 다른 방법이 당업자에게 공지되어 있다.
분별되지 않은 성장 배지는 높은 ATP-독립성 세포독성 활성을 갖지 않기 때 문에, 칼럼 크로마토그래피 분별은 아폽토시스-유도 활성을 강화시키는데 필요하다. 분별은 ATP-의존성 세포독성인자를 제거한다. 분별은 또한 분별되지 않은 성장 배지에 존재하는 ATP-독립성 세포독성인자의 저해물질을 제거하는 것으로 생각된다.
세포독성인자를 정제하는데 유용한 크로마토그래피 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 여기에는 예로써 이온-교환 크로마토그래피, 하이드록시아파티트 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔-여과 크로마토그래피 등이 있다. 박테리아 성장 배지의 분별에 유용한 크로마토그래피 칼럼에는 예로써 하이드록시아파티트; 슈퍼덱스 75 또는 200; 슈퍼로스 6 또는 12; 세파크릴 S; 세파덱스 G 또는 세파덱스 LH; 모노 Q 또는 모노 S; Q-세파로스; DEAE 세파로스 또는 CM 세파로스; 세파로스 XL; ATP-세파로스; Hi Trap Blue; Blue 세파로스; DNA 셀룰로오스 또는 세파로스 2B, 4B, 6B 등인데, 이들은 Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden이나 Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, U.S.A.로부터 구매가능하다.
적절하게는, ATP-이용 효소는 칼럼 크로마토그래피 분별에 의해 하이드록시아파티트와 ATP-아가로즈 칼럼의 통과(flow-through) 또는 용리된 분취물로 분리된다. 이런 분별동안, ATPase 또는 아데닐레이트 키나아제와 같은 ATP-이용 효소는 칼럼에 흡수되고 추가로 제거 또는 정제될 수 있다(Matkaryan et al., J. Bacteriol., 183, pp 3345-3352, 2001).
본원 발명의 적절한 구체예에서, ATP-독립성 세포독성인자는 Q-세파로스 칼 럼(QSFT)의 통과 분취물로 분리된다. Q-세파로스는 4차 암모늄 강 음이온 교환기이다. 이런 칼럼은 Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden으로부터 구할 수 있다. 상층액(SUP) 또는 하이드록시아파티트 칼럼 통과 분취물(HAFT)이나 ATP-아가로즈 칼럼 통과 분취물(AAFT)과 같은 다른 칼럼 분취물은 일반적으로 높은 ATP-독립성 세포독성을 보이지 않는다.
ATP
-독립성
세포독성인자의
특성화
본원 발명의 다른 측면에서, 분별된 성장 배지는 ATP-독립성 세포독성인자의 존재를 검사한다. 세포 사멸의 정도는 Zaborina et al., Infection and Immunity, 67, 5231-5242(1999)와 Zaborina et al., Microbiology, 146, 2521-2530(2000)에서 밝힌 바와 같이 세포내 효소 락테이트 디하이드로게나제(LDH)의 방출로 측정할 수 있다. 아폽토시스를 유도하는 ATP-독립성 세포독성인자의 능력은 MITOSENSORTM APOLERTTM 미토콘드리아 막 센서 키트(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A)를 이용한 미토센서 ApoAlert 공초점 현미경으로 관찰할 수 있다. 상기 분석에서, 비-아폽토시스 세포는 적색 형광을 발하고, 아폽토시스로 사멸된 세포는 녹색 형광을 발한다. 아폽토시스로 죽어가는 세포는 적색과 녹색의 조합인 황색 형광을 발한다(Zaborina et al., Microbiology, 146, 2521-2530(2000)).
*아폽토시스는 카스파제로 알려진 효소 캐스케이드의 활성화로 매개되는데, 카스파제는 아스파르트 잔기를 절단하는 시스테인 프로테아제이다. 따라서, 아폽토시스는 Zou et al., J. Biol. Chem., 274: 11549-11556(1999)에서 밝힌 방법으로 2가지 중요한 카스파제, 카스파제 9와 카스파제 3의 활성을 측정하여 탐지할 수도 있는데, 이들 카스파제는 세포질 단백질 Apaf-1로 미토콘드리아로부터 방출된 시토크롬의 올리고머화(oligomerization)반응에 의해 아폽토시스동안 활성화되는 것으로 알려져 있다.
*이에 더하여, 아폽토시스는 APOLERT DNA 단편화 키트(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A.)로 아폽토시스-유도된 핵 DNA 단편화를 탐지하여 관찰할 수 있다. 이런 분석은 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제(Tdt)-매개된 dUTP 새김눈-단부 라벨링(TUNEL)에 기초하는데, 여기서 Tdt는 아폽토시스가 진행되는 세포에서 단편화된 DNA의 유리 3'-하이드록실 단부에 플루레신-dUTP의 통합을 촉매한다. 단편화된 핵 DNA에 플루레신-dUTP의 통합은 공초점 현미경에 의해 탐지되는 녹색 형광을 발생시킨다.
본원 발명의 적절한 구체예에서, 분별된 성장 배지는 아폽토시스를 유도하는 이런 분취물의 능력을 검사한다. 이런 방법은 ATP-독립성 세포독성인자의 동정 및 특성화에 유용하다.
ATP
-독립성
세포독성인자의
동정
다른 측면에서, 본원 발명은 ATP-독립성 아폽토시스-촉발 세포독성을 보이는 특성화된 세포독성인자를 제시한다. 본 발명자들은 녹농균(P. aeruginosa)과 버크 홀데리아 세파시아(B. cepacia)의 QSFT 분취물에 2개의 단백질, 아주린(azurin)과 시토크롬 c551이 풍부하게 존재한다는 사실을 발견하였다. 이들 2가지 단백질의 동정은 SDS-PAGE에서 분리 및 N-말단 아미노산 서열의 동정에 기초한다. 대조적으로, 마이코박테리아 보비스(M. bovis) QSFT 분취물의 SDS-PAGE 분석에서 마이코박테리아 보비스(M. bovis)를 성장시키는데 사용되는 7H9 배지의 구성성분인 소 혈청 알부민(BSA)의 65 kDa 밴드 및 45 kDa 분자량의 여러 밴드가 나타나지만, 아주린 또는 시토크롬 c551의 특징적인 밴드는 나타나지 않는다(실시예 9).
아주린이나 시토크롬 c551 및 QSFT 분취물은 식세포에 대하여 아폽토시스-유도 세포독성을 보인다. 정제된 아주린/시토크롬 c551 혼합물, 또는 항-아주린과 항-시토크롬 c551 항체의 혼합물로 처리된 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia)의 QSFT 분취물은 현저하게 감소된 대식세포 세포독성을 보인다. 대조적으로, 항-아주린과 항-시토크롬 c551 항체의 혼합물로 전처리된 마이코박테리아 보비스(M. bovis) QSFT 분취물은 세포독성의 감소를 거의 나타내지 않는데, 이는 마이코박테리아 보비스(M. bovis) QSFT 분취물이 아주린이나 시토크롬 c551이외의 세포독성인자를 함유한다는 것을 입증한다. 따라서, 개별 병원균은 별개의 아폽토시스-유도 세포독성인자를 분비하고, 이들 세포독성인자는 항-감염성 약물 개발의 우수한 표적이 된다.
ATP
-독립성
세포독성인자에
의한 암세포에서
아폽토시스
유도
본원 발명은 ATP-독립성 세포독성인자를 사용하여 암세포에서 아폽토시스 세포 사멸을 유도하는 방법을 제시한다. ATP-독립성 세포독성인자, 예를 들면 아주린과 시토크롬 c551은 세포 사멸의 비정상적 실패와 관련된 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 암세포에서 아폽토시스가 일어나지 않는다는 것은 공지의 사실이다. 본원 발명의 한 측면에 따라, 암세포 아폽토시스를 유도할 수 있을 만큼 충분한 함량으로 세포독성인자 분비를 촉진하는 세포독성인자나 활성제를 투여하는 것은 생체내에서 종양 크기를 감소시키고 종양의 성장을 저해하는데 유익하다. 가령, 아주린과 시토크롬 c551을 공지된 항-흑색종 암 약물[5-(3,3'-N,N'-디메틸 트리아젠-1-일)-이미다졸-4-카복시아마이드](DTIC)과 비교하는 검사에서 아주린과 시토크롬 c551의 혼합물이 누드 생쥐의 생체내에서 종양 퇴행을 촉진하는 강력한 비-독성 조성물을 제공하는 것으로 확인되었다.
감염성 질환의 치료에서
세포독성인자의
용도
본원 발명의 다른 측면에서, 세포독성인자의 특성화는 예로써 감염성 질환에서 세포 사멸을 저해하는 새로운 물질을 동정하는데 유용할 수 있다. 가령, ATP-이용 세포독성인자의 분비나 활성의 저해, 또는 ATP의 생산은 병원균에 의한 세포독성 활성을 제거할 수 있다.
따라서, 세포독성인자의 분비나 활성을 저해하는 화합물의 적절한 투여는 항-감염제 개발에 유용한 도구를 제공한다. 세포 사멸 유도 세포독성인자의 활성을 저해하는데 효과적인 활성물질의 예는 세포독성인자에 대한 항체, ATP-이용 효소의 활성화를 예방하는 ATP 유사체 등이다. 세포독성인자 분비나 발현을 저해 또는 촉진하는 세포독성인자와 활성물질의 예에는 ATP-이용 효소, 산화환원 단백질, ATP-생산의 활성물질, ATP 생산의 저해물질, 산화환원 단백질의 활성물질, 산화환원 단백질의 저해물질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
세포독성인자를
포함하는 제약학적 조성물의 투여
세포독성인자를 포함하는 제약학적 조성물은 통상적인 방법, 예를 들면 통상적인 혼합, 분해, 과립화, 당의정-만들기, 에멀젼화, 캡슐화, 포획, 또는 동결 건조 과정으로 제조할 수 있다. 실질적으로 순수한 세포독성인자 또는 다른 물질은 당분야에 공지된 제약학적으로 수용가능한 담체와 쉽게 혼합할 수 있다. 이런 담체는 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등의 형태로 제조를 가능하게 한다. 적합한 부형제에는 예로써 충진제와 셀룰로오스 제형이 포함될 수 있다. 다른 부형제에는 예로써 향료, 착색제, 증점제, 디태크피어(detackifier), 다른 수용가능한 첨가제, 어쥬번트 또는 결합제가 포함될 수 있다.
본원 발명의 조성물은 세포 사멸과 관련된 질환의 치료 및 이의 예방에 사용될 수 있다. 실질적으로 순수한 세포독성인자는 예로써 백신으로 숙주 면역계와 숙주 생물의 분비계의 자연 반응을 촉진할 수 있을 만큼 충분한 함량으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 숙주 생물은 포유동물, 예를 들면 사람과 동물이다.
조성물은 적절한 루트, 예를 들면 경구, 협측, 흡입, 설하, 직장, 질, 경요도, 비강, 국소, 경피, 다시 말하면 경피와 장관외(정맥내, 근육내, 피하, 관상동 맥내 포함) 투여될 수 있다. 조성물과 이의 제약학적 제제는 의도한 목적을 달성하는 효과량으로 투여될 수 있다. 좀더 구체적으로, 조성물은 치료요법적 효과량으로 투여된다.
정확한 제제, 투여 루트, 용량은 환자의 상태에 비추어 임상의에 의해 결정된다. 용량과 휴지기를 개별적으로 조정하여 치료 효과를 유지하는데 충분한 혈장 수준의 활성 세포독성인자를 제공할 수 있다. 일반적으로, 원하는 세포독성인자는 의도한 투여 루트와 표준 제약학적 관례에 따라 선택된 제약학적 담체와의 혼합물로 투여된다. 본원 발명에 사용되는 제약학적 조성물은 세포독성인자의 가공을 용이하게 하는 부형제와 보조성분, 세포독성인자의 분비를 저해/촉진하는 활성물질, 또는 이들의 혼합물을 함유하는 한가지이상의 생리학적으로 수용가능한 담체를 이용한 통상적인 방식으로 치료에 사용될 수 있는 제형으로 만들 수 있다.
세포독성인자
분비의 촉진과 저해
세포독성인자의 동정과 특성화로 세포독성인자의 분비 촉진 방법을 개발할 수도 있다. 병원성 미생물은 포유동물 단백질의 존재하에 다량의 세포독성인자를 분비하는 것으로 밝혀졌다. 이런 원리를 인체에서 적용하여 원하는 세포독성인자 생산을 촉진하거나 원하지 않는 세포독성인자 생산을 저해하는 새로운 방법을 제공할 수 있다. 이런 방법은 세포 아폽토시스를 저해하거나 촉진하는데 유용하다. 세포독성 효과의 이해 및 이의 특성화와 발생은 세포독성인자의 활성이나 분비를 조절하는데 적합한 활성물질이나 화합물의 약물 개발과 스크리닝을 가능하게 한다. 또한, 세포에서 세포독성인자 분비와 관련된 분비계의 이해는 세포독성인자의 효과 적인 저해물질이나 촉진물질의 설계를 개발하고 확인하는데 새로운 길을 제공한다. 포유동물 단백질에 대한 수용체의 구별과 동정 역시 독성과 무독성 미생물을 구별하는 수단으로 이용될 수 있는데, 이런 수단은 질환을 치료하는데 특이성을 제공할 수 있다. 세포독성인자 자체 및 분비계의 구성요소는 백신으로 사용될 수 있다.
세포독성인자의
변형
세포독성인자를 화학적으로 변형하거나 유전학적으로 조작하여, ATP-이용 효소나 산화환원 활성은 결핍되지만 독성을 유지하는 변이체를 생산할 수 있다. 유전자의 돌연변이 및/또는 절두는 기능적 활성을 보이는 다양한 조성의 세포독성 물질을 산출할 수 있다. 특히, 높은 효능과 낮은 항원성을 갖는 절두된 유도체는 원형 세포독성인자로부터 만들 수 있다. 이런 변형되거나 조작된 세포독성인자 및 세포독성 물질 본원 발명의 범주에 속한다.
본원 발명의 좀더 완전한 이해는 다음의 구체적인 실시예를 참고하여 달성할 수 있다. 실시예는 설명의 목적으로 하며, 본원 발명의 범주를 제한하지 않는다. 본원에 특정한 용어가 이용되었지만, 이들 용어는 설명을 위한 것으로 본원 발명을 제한하지 않는다. 본원 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 본원 발명의 개변은 본원 발명에 속하고, 따라서 본원 발명은 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정된다.
실시예
1. 포유동물 단백질에 의한
세포독성인자의
분비 촉진
버크홀데리아 세파시아(B. cepacia)의 임상적 분리균과 환경적 분리균(각각 5개)은 α2-마크로글로불린(1 ㎎/㎖)이 첨가되거나 첨가되지 않은 프로테오스 펩톤 -효모 추출물(PPY) 액체배지에 성장시킨다. 34℃, 교반기에서 10시간동안 성장이후, 각 배양액에서 성장 배지의 일부는 원심분리하고, 상층액은 0.22 ㎛ 밀리포아(millipore) 필터에 여과하여 전체 세포와 조직파편을 제거한다. 이후, 여과된 상층액은 Melnikov A. et al., Mol. Microbial., 36: 1481-1493(2000)에서 밝힌 바와 같이 아데닐레이트 키나아제 활성을 검사한다. 아데닐레이트 키나아제는 [γ-32P]ATP로부터 AMP로 말단 인산염을 전달하여 ADP를 발생시킨다. 이 반응의 산물은 박막 크로마토그래피로 탐지한다. 아데닐레이트 키나아제의 분비는 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) 세포를 PPY 액체배지에서 성장시키는 경우에 최소이었다. 하지만, 환경적 분리균이 아닌 임상적 분리균으로부터 분비는 α2-마크로글로불린의 존재하에 촉진되었다.
항-α2-마크로글로불린 항체의 면역형광 검경에서 임상적 분리균은 α2-마크로글로불린에 결합하는 수용체를 갖는 반면 환경적 분리균은 이런 수용체가 결핍되는 것으로 밝혀졌다. 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia)의 임상적 분리균과 환경적 분리균은 PPY 액체배지에서 1시간동안 1 ㎎/㎖ α2-마크로글로불린의 존부하에 성장시킨다. 외래 α2-마크로글로불린은 인산염-완충 식염수로 세척하여 제거한다. 세포는 α2-마크로글로불린을 토끼에 주사하여 수득된 플루레신 이소티오시아네이트(FITC)-공액된 α2-마크로글로불린 항체와 함께 2시간동안 배양한다. 인산염-완충 식염수로 세척한 이후, FITC 공액된 항체 처리된 세포는 16% 파라포름알데하이드에 고정시키고 폴리-L-리신 코팅된 슬라이드에 입히고 공초점 검 경(microscopy)으로 검사한다. 임상적 분리균에서만 형광 α2-마크로글로불린(녹색 형광 세포)의 존재하에 강화된 세포독성인자 분비가 확인되었는데, 이는 α2-마크로글로불린에 대한 수용체의 존재를 입증한다.
실시예 2. 버크홀데리아 세파시아 ( B. cepacia ) 성장 배지로부터 유래되는 여과된 상층액 또는 칼럼 크로마토그래피 분취물에 의한 ATP-의존성 대식세포 살해
버크홀데리아 세파시아(B. cepacia)의 임상적 균주(균주 38 - 수집 번호 95828, D.G. Allison, University of Manchester Institute of Science and Technology, manchester, UK)는 34℃, 교반기에서 TB 액체배지(물 1ℓ당 10 g Bacto 트립톤, 3 g Bacto 쇠고기 추출물)에 1.3의 OD550nm로 성장시킨다. 이후, 성장 배지는 원심분리하고, 상층액은 0.22 ㎛ 밀리포아 필터에 여과하여 전체 세포와 조직파편을 제거한다. 대식세포는 Zaborina O. et al., Infect. Immun. 67: 5231-5242(19999)에서 밝힌 바와 같이 J774 세포주로부터 분리하고 RPMI 배지 1640(GIBRO-BRL, Grand Island, N.Y.)에서 성장시킨다. 여과된 성장배지는 하이드록시아파티트, ATP-아가로즈, Q-세파로즈 칼럼에 순서대로 첨가한다. 하이드록시아파티트 칼럼(HHAFT)의 통과 분취물은 ATP-아가로즈 칼럼(AAFT)에서 분별한다. 이후, AAFT 분취물은 Q-세파로즈 칼럼(QSFT)에서 분별한다.
106 대식세포는 96 웰 평판의 웰에 첨가하고 부착을 위하여 CO2 배양기에서 2시간동안 배양한다. 상층액에서 얻은 2 ㎍ 단백질 또는 상기 칼럼 각각에서 얻은 통과 분취물은 웰에 첨가하고, 평판은 1.0 mM ATP의 존부하에 4시간동안 배양한다. 이후, 대식세포 세포 사멸의 정도는 Zaborina O. et al., Infect. Immun., 67: 5231-5242(1999)에서 밝힌 바와 같이 세포내 효소 락테이트 디하이드로게나제의 방출로 측정한다. 1.0 mM ATP의 존부하에 여과된 상층액(SUP) 및 HAFT, AAFT, QSFT 칼럼에 의한 대식세포 살해의 정도는 도 1에 도시한다. 모든 분석은 삼중으로 실시하고 오차 막대를 표시한다.
실시예 3. 버크홀데리아 세파시아 ( B. cepacia ) 성장 배지로부터 유래되는 여과된 상층액 또는 칼럼 크로마토그래피 분취물에 의한 ATP-독립성 대식세포 살해
버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) 성장 배지의 상층액(SUP)과 칼럼 크로마토그래피 분취물(HAFT, AAFT, QSFT)은 실시예 2에서와 동일하다. 대식세포 분리는 실시예 2에서와 동일하다. 대식세포 세포 사멸의 정도는 실시예 2에서처럼 LDH의 방출로 측정하고 도 2에 도시한다. QSFT 분취물만 대식세포에 대하여 높은 ATP-독립성 세포독성을 보인다.
실시예 4. 녹농균( Pseudomonas aeruginosa ) 세포독성인자에 의한 대식세포에서 아폽토시스의 유도
녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 12시간동안 37℃에서 L 액체배지에 1.2의 OD550nm로 성장시킨다. 이후, 성장 배지는 원심분리하고, 상층액은 0.22 ㎛ 필터에 여과한다. 상층액(SUP)과 칼럼 크로마토그래피 분취물(HAFT, AAFT, QSFT)은 실시예 2에서와 동일하게 수집한다. 대식세포 분리는 실시예 2에서와 동일하다. 상층액에서 얻은 2 ㎍ 단백질 또는 통과 분취물중 한가지는 200 ㎕ RPMI 배지에서 1x105 대식세포에 첨가하고, 혼합물은 하룻밤동안 배양한다. 처리되지 않거나 SUP 또는 HAFT, AAFT, QSFT 분취물의 하룻밤동안 배양으로 처리된 대식세포에서 아폽토시스의 유도는 Zaborina O et al., Microbiology 146: 2521-2530(2000)에서 밝힌 바와 같이 AplAlert 미토콘드리아 막 센서 키트(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A)를 이용한 공초점 검경으로 측정한다.
상기 분석에서, 건강한 비-아폽토시스 세포는 적색 형광을 발하고, 아폽토시스로 사멸된 세포는 녹색 형광을 발한다. 아폽토시스로 죽어가는 세포는 적색과 녹색의 조합인 황색 형광을 발한다. 처리되지 않은 대식세포, 또는 SUP, HAFT 혹은 AAFT 분취물로 하룻밤동안 처리된 대식세포는 주로 적색 형광을 발하는데, 이는 아폽토시스 세포 사멸의 부재를 시사한다. QSFT 분취물로 하룻밤동안 처리된 대식세포는 주로 녹색 형광을 발하는데, 이는 상당수 대식세포의 아폽토시스 사멸을 시사한다. 시간 과정 연구에서는 아폽토시스가 대략 6시간 시점에 시작되고(적색과 녹색 형광의 조합에 의한 황색의 발생으로 확인) 12시간 내지 16시간이내에 완결된다는 것을 보였다.
실시예 5. 버크홀데리아 세파시아 ( B. cepacia ) 세포독성인자에 의한 비만세포에서 아폽토시스의 유도
비만세포는 Melnikov A. et al., Mol. Microbiol. 36: 1481-1493(2000)에서 밝힌 방법으로 분리한다. 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) 분별된 성장 배지는 실시예에 2에서와 동일하게 준비한다. 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) 세포독성인자에 의한 비만세포에서 아폽토시스의 유도는 실시예 4에서 밝힌 바와 같이 공 초점 검경으로 측정한다.
처리되지 않은 비만세포 또는 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) 성장 배지의 SUP, HAFT 혹은 AAFT 분취물로 하룻밤동안 처리된 비만세포는 주로 적색을 발하는데, 이는 아폽토시스 세포 사멸의 부재를 시사한다. 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) 성장 배지의 QSFT 분취물로 하룻밤동안 처리된 비만세포는 주로 녹색 형광을 발하는데, 이는 상당수 비만세포의 아폽토시스 사멸을 시사한다.
실시예 6. 버크홀데리아 세파시아( B. cepacia )와 마이코박테리아 보비스( M. bovis)에 의한 대식세포에서 아폽토시스의 유도
대식세포 분리는 실시예 2에서와 동일하다. 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia)와 마이코박테리아 보비스(M. bovis) 세포독성인자에 의한 대식세포에서 아폽토시스의 유도는 실시예 4의 방법으로 측정한다. 대식세포의 아폽토시스 유도는 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia)와 마이코박테리아 보비스(M. bovis) QSFT 분취물로 처리될 때 관찰되었다.
실시예 7. 버크홀데리아 세파시아 ( B. cepacia ) QSFT 분취물로 처리된 대식세포의 세포질 추출물에서 카스파제 활성(카스파제-3과 카스파제-9)의 측정
대식세포 분리는 실시예 2에서와 동일하다. 대식세포는 실시예 2에서 밝힌 방법으로 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) QSFT 분취물로 하룻밤동안 처리한다. 대식세포 세포질 추출물의 준비 및 카스파제 분석은 Zabrino O. et al., Microbiology 146: 2521-2530(2000)에서 밝힌 바와 동일하다.
간단히 말하면, 카스파제-3 활성의 측정은 Ac-DEVD-pNA(N-아세틸-Asp-Glu- Val-Asp-p-NO2-아닐린)을 기질로 하여 실시한다. pNA(p-니트로아닐린)의 방출은 유도되지 않은 대식세포 세포질 추출물; 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) QSFT 분취물(10 ㎍ 단백질)과 함께 하룻밤동안 배양된 대식세포의 세포질 추출물; 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) QSFT 분취물(10 ㎍ 단백질) 및 저해물질(DEVD-CHO)과 함께 하룻밤동안 배양된 대식세포의 세포질 추출물로 37℃에서 15, 30, 45, 60, 75, 90분 배양후 카스파제-3 기질(200 ㎛)로부터 405 nm에서 분광광도법으로 측정한다(도 3A). 10 ㎍ 대식세포 세포질 단백질이 각 경우에 사용된다.
카스파제 9 분석에서, 200 μM 카스파제-9 기질 Ac-LEHD-pNA(N-아세틸-Leu-Glu-His-Asp-p-NO2-아닐린)으로부터 pNA의 방출은 유도되지 않은 대식세포 세포질 추출물; 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) QSFT 분취물(10 ㎍ 단백질)과 함께 하룻밤동안 배양된 대식세포의 세포질 추출물; 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) QSFT 분취물(10 ㎍ 단백질) 및 저해물질(LEHD-CHO)과 함께 하룻밤동안 배양된 대식세포의 세포질 추출물로 15, 30, 45, 60, 75, 90분 배양후 측정한다(도 3B). 10 ㎍ 대식세포 세포질 단백질이 각 경우에 사용된다.
DEVD-CHO와 LEHD-CHO는 각각 카스파제 3과 카스파제 9 활성을 차단하는데, Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, PA, U.S.A.로부터 구입가능하다. 카스파제-9와 카스파제-3의 활성은 대식세포가 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) QSFT 분취물로 하룻밤동안 처리될 때 증가하였다(도 3A와 B). 이들 활성은 처리되지 않은 대식세포에서 또는 저해물질이 존재하는 경우에 매우 낮았는데, 이는 QSFT 분취물에 의한 아폽토시스 유도가 카스파제 활성화를 수반한다는 것을 시사한다.
실시예 8. 마이코박테리아 보비스 ( M. bovis ) 또는 버크홀데리아 세파시아( B. cepacia) QSFT 분취물로 처리된 대식세포에서 핵 DNA 단편화를 측정하는 TUNEL 분석
분별된 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) 성장 배지는 실시예 2에서 밝힌 방법으로 수득한다. 마이코박테리아 보비스(M. bovis) BCG는 2% 글리세롤, 0.02% TWEEN®80과 ADC(알부민/덱스트로스/구연산염)(Difco Laboratories, Maryland, U.S.A.)로 보충된 Middlebrook 7H9 액체배지(Difco Laboratories, Maryland, U.S.A.)에 성장시킨다. 박테리아는 수거에 앞서 32℃, 교반기에서 수일동안 성장시킨다. 분별된 마이코박테리아 보비스(M. bovis) 성장 배지는 실시예 2에서 밝힌 방법으로 수득한다. 대식세포 분리는 실시예 2에서와 동일하다. 처리되지 않거나 SUP 또는 HAFT, AAFT, QSFT 분취물의 하룻밤동안 배양으로 처리된 대식세포에서 아폽토시스의 유도는 AplAlert DNA 단편화 키트(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, U.S.A.)로 아폽토시스-유도된 핵 DNA 단편화를 탐지하여 공초점 검경으로 측정한다. 상기 분석은 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제(Tdt)-매개된 dUTP 새김눈-단부 라벨링(TUNEL)에 기초하는데, 여기서 Tdt는 아폽토시스가 진행되는 세포에서 단편화된 DNA의 유리 3'-하이드록실 단부에 플루레신-dUTP의 통합을 촉매한다. 단편화된 핵 DNA에 플루레신-dUTP의 통합은 공초점 현미경에 의해 탐지되는 녹색 형광을 발생시킨다.
마이코박테리아 보비스(M. bovis) 또는 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) QSFT 분취물로 처리된 대식세포는 적색 세포질 배경에서 황색-녹색 핵을 보이는데, 이는 핵 DNA 단편화를 시사한다. 처리되지 않은 대식세포 또는 다른 칼럼 분취물로 처리된 대식세포에서는 단편화가 거의 관찰되지 않았다.
실시예 9. 녹농균( Pseudomonas aeruginosa ), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis)로부터 유래된 성장 배지의 상층액 및 AAFT, HAFT, QSFT 분취물에서 단백질의 SDS-PAGE 분석
SDS-PAGE 분리는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis)의 상층액 및 AAFT, HAFT, QSFT 분취물에서 단백질의 존재를 보였다. 점액성 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 균주 8821로부터 유래된 QSFT 배지 분취물은 2개의 밴드, N-말단 분석에 의해 아주린에 상응하는 18kDa 밴드와 시토크롬 C551에 상응하는 9kDa 밴드의 존재를 보였다. 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) QSFT 분취물은 주로 75 kDa, 20 kDa, 8 kDa 밴드의 존재를 보였다. 에드먼 분해법(Edman degradation)으로 측정된 20 kDa 밴드의 10개 아미노산의 N-말단 아미노산 서열(AHHSVDIQGN)은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 아주린의 N-말단 10개 아미노산 서열과 80% 서열 상동성을 보이고, 8 kDa 밴드의 10개 아미노산의 N-말단 아미노산 서열(EDPEVLFKNK)은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 시토크롬 C551의 N- 말단 10개 아미노산 서열과 100% 일치하였다. 따라서, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)과 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia)의 높은 세포독성 활성을 갖는 QSFT 분취물에는 아주린과 시토크롬 C551 유형의 산화환원 단백질이 풍부하게 존재한다. 대조적으로, 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) 분취물은 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis)를 성장시키는데 사용되는 7H9 배지의 구성요소인 소 혈청 알부민의 65 kDa 밴드와 45 kDa이상 분자량의 여러 밴드를 보이긴 했지만, 8 kDa 또는 22 kDa의 아주린이나 시토크롬 C551 유형의 단백질을 보이지는 않았다.
실시예
10.
아주린
/
시토크롬
C
551
로 처리된 대식세포에서 세포 사멸
정제된 아주린과 시토크롬 C551(Sigma Chemicals, St. Louis U.S.A.)은 실시예 2에서와 동일하게 준비된 대식세포에 첨가하고, 혼합물은 2시간동안 배양한다. 아주린과 시토크롬 C551 농도는 도 4에서와 동일하다. 숫자는 ㎍ 단백질을 나타낸다. 대식세포 세포 사멸은 실시예 2의 방법을 이용하여 세포내 효소 락테이트 디하이드로게나제(LDH)의 방출로 측정한다. 아주린과 시토크롬 C551 모두 대식세포 세포 사멸을 유도하였다. 아주린과 시토크롬 C551의 혼합물은 좀더 광범위한 대식세포 세포 사멸을 유도하였다. 완충액 대조(완충액)는 오른쪽에 도시한다(도 4).
실시예
11.
아주린
/
시토크롬
C
551
로 처리된 대식세포에서
아폽토시스의
유도
대식세포 분리는 실시예 2에서와 동일하다. 대식세포는 4시간과 6시간동안 아주린/시토크롬 C551(50/25 ㎍)로 처리하고, 이후 실시예 4에서와 동일하게 AplAlert 미토콘드리아 막 센서 키트를 이용한 공초점 검경으로 검사하여 아폽토시스 정도를 측정한다. 대식세포는 아주린/시토크롬 C551 혼합물의 존재하에 배양 기간이 증가하면 아폽토시스 수준이 증가하였다. 처리없는(6시간동안 인산염-완충 식염수로 처리된) 대조 대식세포는 아폽토시스를 보이지 않았다.
실시예 12. 항- 아주린과 항- 시토크롬 C 551 항체로 사전처리이후 대식세포에서 아주린/시토크롬 C551 혼합물 또는 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) 혹은 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis)로부터 유래된 QSFT 분취물의 세포독성.
대식세포 분리는 실시예 2에서와 동일하다. 대식세포는 토끼에서 만들어진 항-아주린과 항-시토크롬 C551 항체의 혼합물의 존부하에 정제된 아주린/시토크롬 C551 혼합물(50/25 ㎍), 또는 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) 혹은 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물로 처리한다. 항체는 1:1의 비율로 혼합하고, 혼합된 항체(1, 2, 3 또는 4 ㎎)는 대식세포의 처리에 사용된다.
대식세포 세포 사멸의 정도는 실시예 2에서와 동일하게 LDH의 방출로 측정한다. 도 5 에서는 항-아주린과 항-시토크롬 C551 항체가 존재할 때 아주린/시토크롬 C551 혼합물(A+C), 또는 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) QSFT 분취물(Bc-QSFT)로 처리된 대식세포에 대한 세포독성의 감소를 보인다. 이런 감소는 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물(Mb-QSFT)에서 관찰되지 않았다.
따라서, 아주린/시토크롬 C551 혼합물 또는 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) QSFT 분취물을 항-아주린과 항-시토크롬 C551 항체의 혼합물로 처리하고 대식세포 세포독성을 측정하면, 세포독성이 현저하게 감소하였다. 대조적으로, SDS-PAGE 젤에서 아주린과 시토크롬 C551 밴드가 결핍되는 것으로 앞서 밝혀졌던(실시예 9) 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물을 항-아주린/항-시토크롬 C551 항체로 처리하고 세포독성을 측정하면, 세포독성의 감소가 전혀 관찰되지 않았다.
실시예 13. 공초점 검경으로 측정에서 버크홀데리아 세파시아 ( B. cepacia ) QSFT 분취물 및 아주린/시토크롬 C551에 의한 종양 세포주에서 아폽토시스의 유도
H460 폐 암종, PA-1 난소암, NCF 유방암, HT-29 결장암, HT-1080 백혈병 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)(Manassas, VA, U.S.A.)에서 구하였다. MDD7과 MN1 유방암 세포주는 Andrei Gudkov, Ph.D., Cleveland Clinic Foundation(Cleveland, OH U.S.A.)으로부터 구하였다. UISO-BCA-9 유방암과 USIO-MEL-1, MEL-2, MEL-6, MEL-29 흑색종 세포주는 Rauth, S et al., In Vitro Cellular and Development Biology, 30a(2):79-84(1994); Rauth, S et al., Anticancer Research, 14(6): 2457-2463(1994)에서 밝힌 바와 같이 발생시키고 유지시켰다. 대략 1x105의 각 세포형은 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia) QSFT 분취물(5 ㎍ 단백질) 또는 아주린/시토크롬 C551 혼합물(50/25 ㎍)의 존재하에 0.15 mm 두께 dTC3 접시(Bioptech, Butler, PA, U.S.A.)에 하룻밤동안 배양한다. 이후, 세포는 실시예 4에서처럼 공초점 검경으로 검사하여 아폽토시스 정도를 측정한다. 버크홀데리아 세파시아(B. cepacia)와 아주린/시토크롬 C551 혼합물은 하룻밤동안 배양후 H460 폐 암종, HT-29 결장암, HT-1080 백혈병, PA-1 난소암, MDD7, NCF, MN1 유방암, USIO-MEL-1, MEL-2, MEL-6, MEL-29 흑색종 세포에서 광범위한 아폽토시스를 유도하였다. 각 경우에, 세포독성인자로 처리되지 않은(인산염-완충 식염수 첨가된) 세포는 광범위한 아폽토시스를 보이지 않았다.
실시예 14. TUNEL 분석으로 측정에서 마이코박테리아 보비스( Mycobacterium bovis) QSFT 분취물에 의한 USIO-Mel-6 흑색종 세포에서 아폽토시스의 유도.
USIO-Mel-6 흑색종 세포는 Rauth, S et al., Anticancer Research, 14(6): 2457-2463(1994)에서 밝힌 바와 같이 준비한다. 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물은 실시예 8에서와 동일하게 준비한다. 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물(5 ㎍ 단백질)로 처리된 흑색종 세포와 처리되지 않은 대조 세포는 12시간동안 배양한다. 아폽토시스의 유도는 TUNEL 분석으로 측정하여 실시예 8에서처럼 아폽토시스-유도된 핵 DNA 단편화를 탐지한다. 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물로 처리된 흑색종 세포는 적색 세포질 배경에서 황색-녹색 핵을 보이는데, 이는 핵 DNA 단편화를 시사한다. 처리되지 않은 대조 세포에서는 단편화가 거의 관찰되지 않았다.
실시예 15. 아주린 / 시토크롬 C 551 로 처리이후 누드 생쥐에서 흑색종 종양 세 포(USIO-Mel-2)의 성장 감소
대략 106 USIO-Mel-2 세포는 누드 생쥐(Frederick Cancer Research and development Center, Frederick, Maryland U.S.A.)에 피하 주사하였다. 대략 3주후에 작은 종양이 발생하였다. 이후, 생쥐는 4주동안 공지된 항-흑색종 약물 DTIC[5-(3,3'-N,N-디메틸 트리아젠-1-일)-이미다졸-4-카복사미드](7.5 ㎍)(Ahlmais et al., cancer 63: 224-7(1989)를 주1회, 또는 고용량(150 ㎍ 아주린/75 ㎍ 시토크롬 c551)이나 저용량(10 ㎍ 아주린/5 ㎍ 시토크롬 c551)의 아주린/시토크롬 c551 혼합물 또는 대조(구연산염 완충액)를 주3회 복강내 주사하였다. 종양 부피는 대조 생쥐, DTIC-처리된 생쥐, 고용량과 저용량 아주린/시토크롬 c551-처리된 생쥐에서 측정한다.
대조 생쥐, DTIC-처리된 생쥐, 아주린/시토크롬 c551-처리된 누드 생쥐에서 종양 크기 증가는 도 6에 도시하고, 이런 생쥐에서 체중 증가/감소 데이터는 도 7에 도시한다. 고용량의 150 ㎍ 아주린/75 ㎍ 시토크롬 c551의 주사는 DTIC와 비교하여 지연된 성장 및 종양 크기의 축소를 유도하였다. 도 7에서는 DTIC 또는 아주린/시토크롬 c551 혼합물의 주사가 생쥐의 체중 증가에 영향을 주지 않는다는 것을 보인다. 모든 생쥐는 실험 기간동안 체중이 증가하였다.
실시예 16. 흑색종 종양 세포( Mel -6)의 주사이후 누드 생쥐에서 종양 크기에 대한 아주린과 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물 주사의 효과.
대략 106 USIO-Mel-6 세포는 3마리의 누드 생쥐(Frederick Cancer Research and development Center, Frederick, Maryland U.S.A.)에 피하 주사하였다. 대략 3주후에 작은 종양이 발생하였다. 한 마리 생쥐는 인산염-완충 식염수를 복강내 주사하고(대조), 다른 한 마리는 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물(5 ㎍ 단백질)을 주사하고, 나머지 한 마리는 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물(5 ㎍ 단백질)과 아주린(50 ㎍)의 혼합물을 주사한다. 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물(5 ㎍ 단백질)은 실시예 8에서와 동일하게 준비한다. 대조 생쥐, 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물 처리된 생쥐, 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물/아주린 처리된 생쥐의 크기(종양 부피)는 30일동안 측정한다. 이들 데이터는 도 8에 도시한다. 처리된 생쥐는 대조 생쥐와 비교하여 감소된 종양 성장을 보였다.
도 1 은 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) 성장 배지로부터 유래되는 여과된 성장 배지 상층액(SUP) 또는 하이드록시아파티트 통과(HAFT), ATP-아가로즈 통과(AAFT), Q-세파로즈 통과(QSFT) 칼럼 크로마토그래피 분취물의 존부하에 대식세포 살해에 대한 1.0 mM ATP의 효과를 보여주는 차트이다. 대식세포 세포 사멸의 정도는 세포내 효소 락테이트 디하이드로게나제(LDH)의 방출로 측정한다. 각 분취물로부터 얻은 2 ㎍ 단백질이 상기 분석에 사용된다. 모든 분석은 삼중으로 실시하고, 오차 막대를 표시한다.
도 2 는 ATP의 부재하에 대식세포 세포 사멸에 대한 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia)의 여과된 성장 배지 상층액(SUP)과 칼럼 크로마토그래피 분취물(HAFT, AAFT, QSFT)의 효과를 보여주는 차트이다. 대식세포 세포 사멸의 정도는 세포내 효소 락테이트 디하이드로게나제(LDH)의 방출로 측정한다. 모든 분석은 삼중으로 실시하고, 오차 막대를 표시한다.
도 3 은 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) GSFT 분취물로 처리된 J774 대식세포의 세포질 추출물에서 카스파제 활성(도 3A - 카스파제-3; 도 3B - 카스파제-9)을 보여주는 그래프이다. 세포질 추출물은 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) GSFT 분취물(10 ㎍ 단백질)과 함께 하룻밤동안 배양된 대식세포 및 처리되지 않은 대식세포로부터 준비한다. 카스파제-3 활성의 측정을 위한 기질은 Ac-DEVD-pNA(N-아세틸-Asp-Glu-Val-Asp-p-NO2-아닐린)이다. 카스파제- 9 활성을 위한 기질은 Ac-LEHD-pNA(N-아세틸-Leu-Glu-His-Asp-p-NO2-아닐린)이다. 추출물은 지정된 시간동안 37℃에서 기질과 함께 배양한다. 10 ㎍ 대식세포 세포질 단백질이 각 경우에 사용된다. pNA(p-니트로아닐린)의 방출은 405 nm에서 분광광도계로 측정한다.
도 4 는 아주린(Az), 시토크롬 c551(Cyt C551), 이들의 혼합물의 존재하에 대식세포에서 락테이트 디하이드로게나제(LDH) 방출 %로 측정된 세포독성을 보여주는 차트이다. 숫자는 ㎍ 단백질을 나타낸다. 완충액 대조(완충액)는 오른쪽에 표시한다.
도 5 는 사전면역 혈청의 존재하에 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia)(A)와 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis)(B) QSFT 분취물의 세포독성에 대한 항-아주린과 항-시토크롬 c551 항체의 효과를 보여주는 차트이다. A, 아주린(50 ㎍); C, 시토크롬 c551(25 ㎍); ab, 항-아주린과 항-시토크롬 c551 항체의 혼합물; P. 사전면역 혈청. 2 ㎍ QSFT 분취물이 각 분석에 사용된다. ab와 P이후의 숫자는 항체 또는 사전면역 단백질의 ㎍을 나타낸다. 표시된 결과는 삼중 실험의 평균±표준 편차이다.
도 6 은 누드 생쥐에서 흑색종 종양 세포(UISO-Mel-2)의 유도이후 종양 크기에 대한 아주린/시토크롬 c551의 주사 효과를 보여주는 그래프이다. 대략 106 UISO-Mel-2 세포는 누드 생쥐에 피하 주사하고, 이후 4주동안 구연산염 완충액(대조), 공지된 항-흑색종 약물 DTIC(7.5 ㎍)을 주1회, 또는 고용량(150 ㎍ 아주린/75 ㎍ 시토크롬 c551)이나 저용량(10 ㎍ 아주린/5 ㎍ 시토크롬 c551)의 아주린/시토크롬 c551 혼합물을 주3회 복강 주사한다. 다양한 시점에서, 대조(완충액 처리된) 생쥐, DITC-처리된 생쥐, 고용량과 저용량 아주린/시토크롬 c551-처리된 생쥐의 크기(종양 부피)를 측정하고 그래프로 표시한다.
도 7 은 도 6에서 밝힌 실험동안 생쥐의 체중 증가나 감소를 보여주는 그래프이다. 상기 실험 과정동안, 생쥐는 칭량하고 중량은 g 단위로 표시한다.
도 8 은 아주린(AZ)의 존부하에 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물로 처리된 누드 생쥐에서 Mel-6 종양의 퇴행을 보여주는 그래프이다. 대략 106 UISO-Mel-6 세포가 누드 생쥐에 피하 주사된다. 대략 1주일후 작은 종양이 발생하였다. 이후, 생쥐는 인산염 완충 식염수(대조), 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물, 또는 마이코박테리아 보비스(Mycobacterium bovis) QSFT 분취물과 아주린의 혼합물을 복강내 주사하였다.
Claims (4)
- 흑색종, 백혈병, 난소암, 폐암, 간엽(mesenchymal)암, 결장암, 소화관암에서 선택되는 암 치료를 목적으로 하고, 아주린(azurin), 절두형 아주린(truncated azurin), 사이토크롬 c551에서 선택된 최소 한가지 세포독성인자를 활성 성분으로 하고, 약학 담체를 포함하는 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 제약학적 담체는 충진제, 셀룰로오스 제형, 향료, 착색제, 증점제, 디태크피어(detackifier), 첨가제, 어쥬번트, 결합제, 이들의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 조성물은 경구, 협측, 흡입, 설하, 직장, 질, 경요도, 비강, 국소 또는 경피 투여되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 삭제
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