CN111705026B

CN111705026B - 一种牛支原体Mbov_0280基因突变株及其应用

Info

Publication number: CN111705026B
Application number: CN202010491009.2A
Authority: CN
Inventors: 郭爱珍; 赵刚; 朱习芳; 陈颖钰; 胡长敏; 陈曦; 陈建国
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-06-02
Filing date: 2020-06-02
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2040-06-02
Also published as: CN111705026A

Abstract

本发明公开了一种牛支原体Mbov_0280基因突变株，属于动物传染病防治技术领域，所述突变株命名为牛支原体(Mycoplasma bovis)T9.297，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020085，所述Mbov_0280基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。该菌株相比野生菌株HB0801诱导宿主巨噬细胞凋亡的能力减弱，鉴于牛巨噬细胞作为宿主抵抗病原感染的重要免疫细胞，该突变株具有更低的毒力，同时有助于机体抵抗牛支原体感染，从而可望在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

Description

一种牛支原体Mbov_0280基因突变株及其应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到一种牛支原体Mbov_0280基因突变株，该突变株诱导巨噬细胞凋亡的能力降低。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)属于古柔膜体纲(Mollicutes)，支原体目(Mycoplasmatles)，支原体科，支原体属，是一种危害养牛业发展的重要病原，在世界范围内广泛存在，可以感染任何年龄段的牛，其发病多与运输应激相关，多数情况下表现为慢性肺炎和关节炎等。泌乳奶牛主要表现为牛支原体乳腺炎，犊牛经乳汁感染患牛支原体肺炎和关节炎。随着临床上抗生素耐药性增加，牛支原体病的防治已经是规模化养牛场面临的迫切难题，而这一问题的解决依赖于新药和新疫苗的开发。但是牛支原体致病机制不清楚严重阻碍新药和新疫苗的开发，进而阻碍牛支原体病的有效防控和治疗。

申请人利用含有mini-Tn4001转座子的pMT85载体，构建了牛支原体Mbov_0280基因突变株，并通过与牛巨噬细胞互作研究证实，该突变株诱导巨噬细胞凋亡能力降低，提示具有更低的毒力，同时有助于机体抵抗牛支原体感染，有望运用于牛支原体免疫防治领域，同时还有助于揭示牛支原体毒力机制和免疫制剂的研发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛支原体Mbov_0280基因突变株，该菌株诱导巨噬细胞凋亡的能力减弱，鉴于牛巨噬细胞作为宿主抵抗病原感染的重要免疫细胞，因此该突变株可望在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

基本思路是，申请人以牛支原体HB0801株(GenBank上的登录号为CP002058)为亲本菌株，利用PEG介导的转化方法，将含有转座子的pMT85质粒转化到牛支原体中，利用庆大霉素做抗性筛选标记，成功构建了牛支原体突变体库。通过对突变菌株进行大量筛选，最终从突变体库中成功鉴定出一株Mbov_0280基因突变株，该突变株的突变基因为Mbov_0280，其核苷酸序列是SEQ ID NO:1中的1-1020位碱基所示的序列，长度为1020bp，该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，共编码339个氨基酸。转座子插入位点位于基因组323270位点后，位于Mbov_0280基因的888位点后。并通过Western blot验证了突变株MbovP0280的表达缺陷。

申请人将该突变株命名为牛支原体T9.297(Mycoplasma bovis T9.297)，于2020年4月27日保藏在湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2020085。最后，将该突变菌株T9.297与野生株HB0801分别接种于PPLO培养基中，进行生长曲线检测，结果显示二者生长速度无差异，利用Annexin-FITC/PI流式分析T9.297突变株和野生株HB0801株引起牛巨噬细胞凋亡的能力，结果发现，相比HB0801株，T9.297突变株引起BoMac细胞凋亡的能力下降。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：Mbov_0280基因序列中转座子插入突变位点。图中：方框所示序列为转座子与HB0801基因组连接处测序序列，所示方向为转座子相对基因组的插入方向。

图2：Western blot鉴定T9.297突变株缺失表达MbovP280。

图3：T9.297突变株在PPLO培养基中生长曲线。

图4：牛支原体野生株HB0801和T9.297突变株诱导巨噬细胞凋亡比较。附图标记说明：Early：巨噬细胞早期凋亡占比；Late：巨噬细胞中晚期凋亡占比；Total：巨噬细胞总凋亡占比。

具体实施方式

实施例1：牛支原体插入突变体库的构建

申请人于2008年6月从病牛的病变肺组织中分离得到一株牛支原体HB0801，命名为牛支原体HB0801(Mycoplasma bovis HB0801)，该毒株已在CN 102220263A的专利文献中公开。pMT85质粒由法国法国农业科学院Eric Baranowski博士惠赠，含有mini型Tn4001转座子(mini-Tn4001)，该转座子中已导入了由aacA-aphD基因编码的庆大霉素抗性标记，它位于转座片段两端的两个反向重复序列(IR)之间，而转座酶基因(tnpA)位于重复序列外侧，可以防止再次发生转座(Baranowski et al 2010)。

以M.bovis HB0801为亲本菌株构建突变体库，基本程序是：收集培养至对数后期的M.bovis，用冷DPBS缓冲液洗涤两次，重悬于0.1M CaCl₂溶液中，冰上孵育30min；将制成的牛支原体感受态细胞与3μg pMT85质粒，10μg酵母tRNA和1mL 50％PEG8000混合。孵育1min后，将混合物稀释至5mL PPLO培养基中，并于37℃孵育3h。然后，洗涤牛支原体，将其重悬于1mL PPLO培养基中，并涂布到含庆大霉素的PPLO固体培养基上。在37℃下温育3～7d，挑选单个菌落于1mL含庆大霉素的PPLO肉汤中培养至对数期，-80℃保存菌株，建立牛支原体HB0801突变体库。

实施例2.牛支原体突变体库突变株基因组测序与鉴定

2.1基因组测序获得牛支原体Mbov_0280突变株

利用细菌基因组提取试剂盒(购自宝生物工程大连有限公司)，提取牛支原体T9.297突变体库中的牛支原体总DNA，对Tn4001转座子与牛支原体基因组连接处进行测序，将测序结果与牛支原体HB0801全基因组序列进行比对，结果显示，突变株T9.297所涉及的基因Mbov_0280中涵盖转座子插入序列，大小为3438bp，T9.297突变基因为Mbov_0280，转座子插入位点位于基因组323270位点后，位于以及Mbov_0280基因888位点后(图1)。

2.2 Western blot验证突变株MbovP0280的表达缺陷

取牛支原体HB0801和T9.297以1:1000的比例接种于PPLO液体培养基各20mL，于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养至对数末期。取10mL培养基12000rpm离心5min，弃掉上清，使用500μL PBS重悬，使用超声法制备全菌蛋白(200W，5min)。取等量的全菌蛋白，加入5×loading buffer并在沸水中煮5min。然后使用SDS-PAGE分离全菌蛋白，转印到硝酸纤维素膜上，使用5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后将膜裁剪并孵育相应的抗体(鼠抗MbovP579单克隆抗体(1:1000)和鼠抗MbovP280多克隆抗体(1:500)，在室温孵育1h后，TBST洗涤3次。然后孵育HRP标记的羊抗鼠IgG(1:5000)，在室温作用1h后，使用ECL显色液检测蛋白的表达情况。实验结果显示MbovP280蛋白在突变株T9.297中不表达，而对照蛋白MbovP579蛋白在两株菌种均表达(图2)。

2.3牛支原体突变体的生长曲线测定

将计数好的牛支原体用PPLO培养基稀释成10⁵CFU/mL，按1:10比例接种至PPLO培养基中，37℃，静置培养，5％CO2培养箱中连续培养72h，每12h取适当菌液进行菌落计数，将各时间点的菌落数对时间作图获得生长曲线，比较突变株和野生株的生长曲线，显示突变菌株和野生株生长速度无差异，都在培养24h后到达平台生长期(图3)。

实施例3：牛支原体突变株诱导巨噬细胞凋亡的能力降低

将T9.297突变株与HB0801株在体外分别进行扩大培养。

将BoMac细胞以每孔5×10⁵个细胞接种于6孔板中，置于37℃，5％CO2孵育过夜。取出细胞板，向各组中加入5×10⁸CFU HB0801或者T9.297，并在37℃孵育24h。收集上清和经过胰酶消化后的贴壁细胞，300g离心5min；去上清，使用预冷的PBS洗涤细胞，300g离心5min，重复上述洗涤步骤一次，然后使用100μl banding buffer(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)重悬细胞沉淀，加入Annexin-FITC/PI染料(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)染色细胞，避光作用10min，然后各孔补加400μl banding buffer(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)。使用流式细胞仪检测。实验结果显示突变株T9.297相比HB0801株，诱导BoMac细胞凋亡的能力降低(p<0.05)(图4)。由于巨噬细胞是一种免疫细胞，该结果提示突变株具有更低的毒力，同时有助于机体抵抗牛支原体感染，因此可望在牛支原体疫苗开发和免疫防治中具有应用前景。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种牛支原体Mbov_0280基因突变株及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1020

<212> DNA

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 1

atgaaaatga ataggaaaat actatttagt atatctgcaa tatcatctgt agcaactgtt 60

ccattattag ctgctaaatg cggcaacact caaggtttgg ataaagtaat caaaacctta 120

aatttaggtg aaattaatgt atatgaagac ttaaagctag acacccctgg tgaaaaacac 180

atattaaatg ctttagccaa agctaatgat acaaaggaag taaaaattga cttatctcaa 240

ttagaagcta aagacattaa atcaactgga gctgttatag aggctaaaaa agattctaaa 300

ctttatagtg gaagaattca agtcactttt acatctaaaa aggtaaaaag agttgatatt 360

tctacagtta agaaggaaaa tcttagtggc attagtaact acactggtgt aaaagaaatg 420

gctactatct taagaaaaga gcttagttta cctaacttaa gtgaaaaaga tataactatt 480

accctagatt ctgcagcaac aaatgataag gaaggaaaat taatagttat ttcaaacccc 540

gattctgaaa atatttttgg caagcttgaa atagttttac caaaactagc accgctaggc 600

aacaatgtta aattagtaag cgaatatata accaaattta aggcacaagc taaaaagatg 660

gaagataatt taagaaacat tactaaatga gaagccagtg aagaaagcaa aaaacaagaa 720

tttgaaaatc tagcaacaaa aattaaagaa gttgctacta aactaaaaga taaatatact 780

aaaactgttg aaaaattaga acaagcaatc aaaggcaaaa atgacattga taatgatgag 840

tttaataagt taaatgttga catatcatta gtatcagttg catatgactc agcagttaaa 900

cctaaagtaa atggtaaagt tacaacagac tatacaaaga taatgaaaga ccttaaaaag 960

gttgctaaac caaaagatgg atctaaagaa gcagaaatat caattgattt tagtaactaa 1020

<210> 2

<211> 339

<212> PRT

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 2

Met Lys Met Asn Arg Lys Ile Leu Phe Ser Ile Ser Ala Ile Ser Ser

1 5 10 15

Val Ala Thr Val Pro Leu Leu Ala Ala Lys Cys Gly Asn Thr Gln Gly

20 25 30

Leu Asp Lys Val Ile Lys Thr Leu Asn Leu Gly Glu Ile Asn Val Tyr

35 40 45

Glu Asp Leu Lys Leu Asp Thr Pro Gly Glu Lys His Ile Leu Asn Ala

50 55 60

Leu Ala Lys Ala Asn Asp Thr Lys Glu Val Lys Ile Asp Leu Ser Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ala Lys Asp Ile Lys Ser Thr Gly Ala Val Ile Glu Ala Lys

85 90 95

Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Ser Gly Arg Ile Gln Val Thr Phe Thr Ser

100 105 110

Lys Lys Val Lys Arg Val Asp Ile Ser Thr Val Lys Lys Glu Asn Leu

115 120 125

Ser Gly Ile Ser Asn Tyr Thr Gly Val Lys Glu Met Ala Thr Ile Leu

130 135 140

Arg Lys Glu Leu Ser Leu Pro Asn Leu Ser Glu Lys Asp Ile Thr Ile

145 150 155 160

Thr Leu Asp Ser Ala Ala Thr Asn Asp Lys Glu Gly Lys Leu Ile Val

165 170 175

Ile Ser Asn Pro Asp Ser Glu Asn Ile Phe Gly Lys Leu Glu Ile Val

180 185 190

Leu Pro Lys Leu Ala Pro Leu Gly Asn Asn Val Lys Leu Val Ser Glu

195 200 205

Tyr Ile Thr Lys Phe Lys Ala Gln Ala Lys Lys Met Glu Asp Asn Leu

210 215 220

Arg Asn Ile Thr Lys Trp Glu Ala Ser Glu Glu Ser Lys Lys Gln Glu

225 230 235 240

Phe Glu Asn Leu Ala Thr Lys Ile Lys Glu Val Ala Thr Lys Leu Lys

245 250 255

Asp Lys Tyr Thr Lys Thr Val Glu Lys Leu Glu Gln Ala Ile Lys Gly

260 265 270

Lys Asn Asp Ile Asp Asn Asp Glu Phe Asn Lys Leu Asn Val Asp Ile

275 280 285

Ser Leu Val Ser Val Ala Tyr Asp Ser Ala Val Lys Pro Lys Val Asn

290 295 300

Gly Lys Val Thr Thr Asp Tyr Thr Lys Ile Met Lys Asp Leu Lys Lys

305 310 315 320

Val Ala Lys Pro Lys Asp Gly Ser Lys Glu Ala Glu Ile Ser Ile Asp

325 330 335

Phe Ser Asn

Claims

1.一种牛支原体（Mycoplasma bovis）Mbov_0280基因突变株，命名为牛支原体T9.297，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2020085，所述Mbov_0280基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的牛支原体Mbov_0280基因突变株在制备牛支原体疫苗中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述牛支原体Mbov_0280基因突变株诱导宿主巨噬细胞凋亡的能力减弱。