CN111748507B

CN111748507B - 一种牛支原体Mbov_0475基因突变株及其应用

Info

Publication number: CN111748507B
Application number: CN202010490088.5A
Authority: CN
Inventors: 郭爱珍; 赵刚; 朱习芳; 陈颖钰; 胡长敏; 陈曦; 陈建国
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-06-02
Filing date: 2020-06-02
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2040-06-02
Also published as: CN111748507A

Abstract

本发明公开了一种牛支原体Mbov_0475基因突变株，属于动物传染病防治技术领域，所述突变株命名为牛支原体(Mycoplasma bovis)T9.55，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020082，所述Mbov_0475基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。该菌株具有诱导巨噬细胞增殖和提高巨噬细胞活力的作用，鉴于牛巨噬细胞是宿主抵抗病原感染的重要免疫细胞，该突变株可望在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

Description

一种牛支原体Mbov_0475基因突变株及其应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到一种牛支原体Mbov_0475基因突变株。该突变株能诱导巨噬细胞增殖和提高巨噬细胞活力。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)属于古柔膜体纲(Mollicutes)，支原体目(Mycoplasmatles)，支原体科，支原体属，是一种危害养牛业发展的重要病原，在世界范围内广泛存在，可以感染任何年龄段的牛，其发病多与运输应激相关，多数情况下表现为慢性肺炎和关节炎等。泌乳奶牛主要表现为牛支原体乳腺炎，犊牛经乳汁感染患牛支原体肺炎和关节炎。随着临床上抗生素耐药性增加，牛支原体病的防治已经是规模化养牛场面临的迫切难题，而这一问题的解决依赖于新药和新疫苗的开发。但是牛支原体致病机制不清楚严重阻碍新药和新疫苗的开发，进而阻碍牛支原体病的有效防控和治疗。

申请人利用含有mini-Tn4001转座子的pMT85载体构建了牛支原体Mbov_0475基因突变株，并通过其与牛巨噬细胞互作研究证实该突变体能诱导牛巨噬细胞增殖并提高巨噬细胞活力，从而可望运用于牛支原体免疫防治领域，同时还有助于揭示牛支原体毒力机制和免疫制剂的研发。

发明内容

本发明的目的在于提供一株牛支原体Mbov_0475基因突变株，该菌株能诱导宿主巨噬细胞增殖并提高巨噬细胞活力，从而可望在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

为了实现本发明的目的，申请人从牛支原体突变体库中筛选得到Mbov_0475基因突变体T9.55菌株，通过实验验证该突变株相比野生株和回补株诱导牛巨噬细胞增殖的能力变强，且感染巨噬细胞的活力增加，而牛巨噬细胞作为宿主抵抗病原感染的重要免疫细胞，因此推测T9.55可望成为牛支原体新型疫苗候选菌株，在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

申请人以牛支原体HB0801为亲本菌株，利用PEG介导的转化方法，将含有转座子的pMT85质粒转化到牛支原体中，利用庆大霉素做抗性筛选标记，成功构建了牛支原体突变体库。通过对突变菌株进行大量筛选，最终从突变体库中成功鉴定出一株Mbov_0475基因突变株，该突变株的突变基因为Mbov_0475，其核苷酸序列是SEQ ID NO:1中的1-1107位碱基所示的序列，长度为1107bp，该基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，共编码368个氨基酸。转座子插入位点位于基因组555965位点后，位于Mbov_0475基因的555位点后。并通过Western blot验证了突变株MbovP0475的缺陷表达。

申请人将该突变菌株命名为牛支原体T9.55，Mycoplasma bovis T9.55，于2020年4月27日保藏于中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2020082。

接着，申请人通过检测MbovP475缺失/回补菌株及野生株HB0801感染牛巨噬细胞后的细胞周期、细胞增殖、细胞活力，具体方法如下：

1)牛支原体MbovP475回补株的构建：

首先克隆Mbov_0475基因，并将该基因连接至pOH/P质粒，获得回补质粒后，转化重组质粒至MbovP475缺失菌株中，并通过抗生素筛选获得回补菌株CT9.55，通过Westernblot方法验证MbovP475蛋白在回补菌株CT9.55中表达后，检测缺失株和回补株与HB0801株生长曲线，发现无统计学差异。

2)利用牛支原体MbovP475缺失/回补株及野生菌株HB0801感染BoMac细胞，在感染12h、24h、36h后通过向每孔中加入CCK-8试剂，37℃孵育1小时后在450nm处读取数值并计算处理组细胞的相对细胞活力，结果显示缺失株感染BoMac后的细胞活力高于野生株和回补株。

3)利用EdU试剂盒检测了MbovP475缺失/回补株及野生株感染BoMac细胞24h后的细胞增殖，结果显示MbovP475缺失株相比野生株和补菌株，感染BoMac细胞后细胞增殖能力增强。

4)利用流式细胞术检测了MbovP475缺失/回补株及野生株感染BoMac细胞12h后的细胞周期，结果显示MbovP475缺失株感染后细胞位于G1期占比低于野生株和回补株，且G2/M期细胞占比高于野生株和回补株，说明MbovP475蛋白通过抑制细胞由S期向G2/M期进程，从而发挥抑制细胞增殖作用。

以上结果表明，牛支原体突变株T9.55具有诱导巨噬细胞增殖和提高巨噬细胞活力的作用，鉴于牛巨噬细胞是宿主抵抗病原感染的重要免疫细胞，该突变株可望在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

附图说明

图1：Mbov_0475基因序列中转座子插入突变位点。图中：方框所示序列为转座子与HB0801基因组连接处测序序列，所示方向为转座子相对基因组的插入方向。

图2：Western blot鉴定T9.55突变株中MbovP475蛋白的表达。图中：αMbovP475为鼠抗MbovP475多克隆抗体。

图3：野生株及缺失/回补株的生长曲线。

图4：是突变株T9.55增加巨噬细胞活力的检测结果。图中，*p<0.05，**p<0.01，“ns”表示无显著差异。

图5：是突变株T9.55诱导巨噬细胞增殖的检测结果。

图6：是突变株T9.55调控巨噬细胞周期的检测结果。图中，NC为空白对照组。

具体实施方式

实施例1：牛支原体插入突变体库的构建

申请人于2008年6月从病牛的病变肺组织中分离得到一株牛支原体HB0801，命名为牛支原体HB0801，Mycoplasma bovis HB0801，该毒株已在CN 102220263A的专利文献中公开。

pMT85质粒由法国法国农业科学院Eric Baranowski博士惠赠，它含有mini型Tn4001转座子(mini-Tn4001)，该转座子中已导入了由aacA-aphD基因编码的庆大霉素抗性标记，它位于转座片段两端的两个反向重复序列(IR)之间，而转座酶基因(tnpA)位于重复序列外侧，可以防止再次发生转座(Baranowski et al 2010)。

以M.bovis HB0801为亲本菌株构建突变体库，收集培养至对数后期的M.bovis，用冷DPBS缓冲液洗涤两次，重悬于0.1M CaCl₂溶液中，冰上孵育30min；将制成的牛支原体感受态细胞与3μg pMT85质粒，10μg酵母tRNA和1mL 50％PEG8000混合。孵育1min后，将混合物稀释至5mL PPLO培养基中，并于37℃孵育3h。然后，洗涤牛支原体，将其重悬于1mL PPLO培养基中，并涂布到含庆大霉素的PPLO固体培养基上。在37℃下温育3～7d，挑选单个菌落于1mL含庆大霉素的PPLO肉汤中培养至对数期，-80℃保存菌株，建立牛支原体HB0801突变体库。

实施例2.牛支原体突变体库突变株基因组测序与鉴定

2.1基因组测序获得牛支原体MbovP0475突变株

利用细菌基因组提取试剂盒(购自宝生物工程大连有限公司)，提取牛支原体T9.55突变体库中的牛支原体总DNA，对Tn4001转座子与牛支原体基因组连接处进行测序，将测序结果与牛支原体HB0801全基因组序列进行比对，结果显示，突变株T9.55所涉及的基因Mbov_0475中涵盖转座子插入序列，大小为3438bp，T9.55突变基因为Mbov_0475，转座子插入位点位于基因组555965位点后，位于以及Mbov_0475基因555位点后(图1)。

2.2Western blot验证突变株MbovP0475的表达缺陷

回补突变体的构建如下：以牛支原体基因组为模板，扩增Mbov_0475基因，将目的片段克隆至pOH/P质粒，获得回补质粒；利用PEG8000(购自SIGMA)介导的转化方法，将构建好的重组质粒转化至Mbov_0475基因缺失菌株中，在固体培养基中培养3-7天，利用抗性挑选阳性克隆。将阳性克隆扩大培养后，提取菌体的总核酸和菌体总蛋白样本，利用PCR方法扩增目的基因来确定重组质粒在菌体内存在且能自我复制；利用Western blot方法验证重组质粒中Mbov_0475基因的表达。最后体外检测突变菌株/回补菌株的生长曲线并与野生株比较，确定突变菌株/回补菌株的生长未受到影响。实验结果显示MbovP475蛋白在缺失株T9.55中不表达，在回补菌株CT9.55中表达(图2)，且缺失株T9.55和回补菌株CT9.55与野生株HB0801生长曲线无差异(图3)。

实施例3：突变株对BoMac细胞增殖和活力的影响

3.1牛支原体感染BoMac后细胞活力检测

使用CCK-8方法检测牛支原体Mbov_0475基因缺失/回补株及野生株HB0801感染细胞12h、24h、36h后的细胞活力。以每孔5000个BoMac细胞接种于96孔板中，37℃，5％CO2培养至贴壁，设置空白孔(无细胞)和对照孔(只有细胞)，每组设定4个重复孔；置于37℃，5％CO2孵育过夜，倒置显微镜下观察。取出细胞板，每孔加入2.5×10⁴CFU牛支原体野生株HB0801或者Mbov_0475基因缺失株或者Mbov_0475基因回补株，37℃，5％CO2静置共培养12h、24h、36h，每孔加入10μL CCK-8(购自日本同仁),37℃，5％CO2孵育1h,测定450nm各孔的吸光值，按照以下公式计算各孔的细胞活力，即细胞活力％＝(OD_{加蛋白细胞}-OD_空白)/(OD_{无蛋白对照}-OD_空白)×100％。实验结果显示缺失株感染BoMac 12h后的细胞活力高于野生株和回补株(p>0.05)；缺失株感染BoMac 24h和36h后的细胞活力显著高于野生株和回补株感染后的细胞活力(p<0.05)(图4)。以上结果揭示了MbovP475与可以抑制BoMac细胞的细胞活力。

3.2牛支原体感染BoMac后细胞增殖检测

使用EdU细胞增殖检测试剂盒(购自碧云天生物科技有限公司)检测牛支原体Mbov_0475基因缺失/回补株及野生株HB0801感染细胞24h后的细胞增殖。以每孔5×10⁴个BoMac细胞接种于12孔板中，37℃，5％CO2培养至贴壁。取出细胞板，每孔加入2.5×10⁵CFU牛支原体野生株HB0801或者Mbov_0475基因缺失株或者Mbov_0475基因回补株，37℃，5％CO2静置共培养24h。然后按如下步骤执行：

1.配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是与培养液等体积加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推荐的EdU终浓度为10μM(1X)，用细胞培养液1:500稀释EdU(10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。

2.将37℃预热的2X的EdU工作液(20μM)，等体积加入12孔板中，使12孔板中的EdU终浓度变为1X。继续孵育2h。

3.去除培养基，并加入4％多聚甲醛1ml，室温固定15min。

4.去除固定液，使用洗涤液(含3％BSA的PBS)洗涤细胞3次，每次5min。

5.加入含0.3％Triton X-100的PBS，室温孵育15min。

6.去除通透液，使用洗涤液(含3％BSA的PBS)洗涤细胞3次，每次5min。

7.每孔中加入200μl Click反应液(按说明书配制)，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品。室温避光孵育30分钟。

8.吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次5min。

9.吸除洗涤液后，每孔加入1×Hoechst 33342溶液500μl，室温避光孵育10min。

10.吸除1×Hoechst 33342溶液，用洗涤液洗涤3次，每次5min。

11.随后即可进行荧光检测，每个实验组随机取5个视野，计算细胞增殖比例。

实验结果显示MbovP475缺失株T9.55相比野生株感染BoMac细胞后，细胞增殖能力增高(p＝0.107)；相比于MbovP475回补菌株CT9.55感染后的BoMac细胞，感染缺失株T9.55的BoMac细胞增殖能力显著增强(p＝0.003)(图5)。以上结果显示出MbovP475可以抑制BoMac细胞的增殖。

3.3牛支原体感染BoMac后细胞周期检测

将BoMac细胞接种于6孔板中，每孔细胞为5×10⁵，37℃，5％CO₂孵育过夜，至细胞完全贴壁。每孔加入2.5×10⁶CFU牛支原体野生株HB0801或者Mbov_0475基因缺失株或者Mbov_0475基因回补株，37℃，5％CO₂静置共培养24h。使用细胞周期检测试剂盒(购自碧云天生物科技有限公司)按如下步骤进行实验：

1.使用胰酶消化细胞，收集细胞(离心2000rpm，5min)。

2.用PBS洗涤细胞一次(离心2000rpm，5min)，去除上清，在细胞中加入体积分数为70％冷乙醇500μl固定，放置于4℃，2h。

3.离心1000rpm，3min，然后吸除上清，用PBS洗涤细胞一次。

4.每管加入500μl PI/RNase A染色工作液，室温避光孵育1h。

5.上流式细胞仪检测，记录激发波长488nm处红色荧光。

实验结果显示Mbov_475缺失株感染后细胞位于G1期占比为(33.09％)与空白组相近(32.29％)，而且低于野生株(36.31％)和回补株(35.35％)。进一步分析表明缺失株感染后的细胞位于G2/M期细胞占比为5.51％，空白组为9.40％，而野生株和回补株感染后G2/M期细胞占比为1.52％和2.18％(图6)，综合以上结果可以看出，Mbov_475突变株抑制细胞由S期向G2/M期进程，进而认为其具有抑制细胞增殖的能力。

<110> 华中农业大学

<120> 一种牛支原体Mbov_0475基因突变株及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1107

<212> DNA

<213> 牛支原体（Mycoplasma bovis）

<400> 1

atgaaaagga aattttcttt attagggggg attttaattt cgcttcctgt tattgcagtt 60

tcatgcaata acactcaaaa ccagacgaat aataatggaa aaaataaatc aaacgagatt 120

gctgttttaa aagtttgaaa tgaaaatttc aaagataaat taaatagtgc tcaaagttat 180

gaaataatct taaataaact aatcaaatta cttaatggta acaaagattt gaaaatatca 240

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<210> 2

<211> 368

<212> PRT

<213> 牛支原体（Mycoplasma bovis）

<400> 2

Met Lys Arg Lys Phe Ser Leu Leu Gly Gly Ile Leu Ile Ser Leu Pro

1 5 10 15

Val Ile Ala Val Ser Cys Asn Asn Thr Gln Asn Gln Thr Asn Asn Asn

20 25 30

Gly Lys Asn Lys Ser Asn Glu Ile Ala Val Leu Lys Val Trp Asn Glu

35 40 45

Asn Phe Lys Asp Lys Leu Asn Ser Ala Gln Ser Tyr Glu Ile Ile Leu

50 55 60

Asn Lys Leu Ile Lys Leu Leu Asn Gly Asn Lys Asp Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Leu Ala Asn Gln Asn Asp Leu Lys Lys Arg Phe Ser Lys Asp Ile Glu

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Ala Lys Leu Thr Gln Lys Leu Ala Leu Lys Val Asn Asn Asn Asp Leu

100 105 110

Leu Leu Glu Ala Gly Lys Val Ala Tyr Gly Gln Gln Ala Thr Lys Tyr

115 120 125

Lys Asp Pro Lys Thr Gly Glu Ile Lys Glu Thr Leu Glu Lys Asp Leu

130 135 140

Ser Lys Leu Lys Glu Phe Gln Asn Val Lys Glu Ile Thr Gln Ile Gly

145 150 155 160

Phe Tyr Asp Asp Glu Trp Asn Asn Tyr Leu Thr Lys His Gly Val Lys

165 170 175

Tyr Asn Tyr Ile Gln Met Val Lys Leu Pro Lys Ser Val Asn Lys Val

180 185 190

Pro Ser Val Leu Pro Glu Glu Ile Thr Ala Leu Ile Glu Val Phe Arg

195 200 205

Gly Asn Thr Asn Ala Lys Ile Glu Gly Ile Glu Ala Trp Asn Thr Lys

210 215 220

Asn Ile Met Asn Thr Lys Gly Leu Phe Ser Tyr Thr Gln Leu Phe Asp

225 230 235 240

Gly Asn Ile Ser Lys Trp Asp Val Ser Ser Val Thr Asn Met His Asp

245 250 255

Met Phe Asn Gly Ala Lys Ser Phe Asn Gln Asp Ile Ser Lys Trp Gln

260 265 270

Thr Lys Ser Leu Lys Tyr Leu Tyr Arg Thr Phe Ser Arg Ala Glu Lys

275 280 285

Phe Asn Gln Asp Ile Ser Asn Trp Asp Val Ser Asn Val Ala Arg Phe

290 295 300

Ser Arg Val Leu Tyr Gly Ala Lys Ser Phe Asn Gln Asp Leu Ser Lys

305 310 315 320

Trp Asp Ile Asn Ile Thr Arg Leu Ala Lys Phe Pro Gly Asp Lys Thr

325 330 335

Gly Tyr Asp Asp Trp Asn Lys Lys Thr Leu Ile Glu Asn Glu Lys Ser

340 345 350

Lys Trp Pro Leu Asn Leu Gln Asn Val Lys Val Ser Ile Gly Asn Lys

355 360 365

Claims

1.一种牛支原体（Mycoplasma bovis）Mbov_0475基因突变株，命名为牛支原体T9.55，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2020082，所述Mbov_0475基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的牛支原体Mbov_0475基因突变株在制备牛支原体疫苗中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述牛支原体Mbov_0475基因突变株能诱导宿主巨噬细胞增殖和提高巨噬细胞活力。