CN111676181B - 牛支原体Mbov_0145基因突变株及其应用 - Google Patents

牛支原体Mbov_0145基因突变株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111676181B
CN111676181B CN202010386437.9A CN202010386437A CN111676181B CN 111676181 B CN111676181 B CN 111676181B CN 202010386437 A CN202010386437 A CN 202010386437A CN 111676181 B CN111676181 B CN 111676181B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mycoplasma bovis
strain
mycoplasma
bovis
mutant strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010386437.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111676181A (zh
Inventor
郭爱珍
张慧
胡古月
路豆昆
赵刚
张怡秋
陈颖钰
胡长敏
陈曦
陈建国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN202010386437.9A priority Critical patent/CN111676181B/zh
Publication of CN111676181A publication Critical patent/CN111676181A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111676181B publication Critical patent/CN111676181B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于动物传染病防治技术领域，涉及到一种牛支原体基因突变株，尤其是一种编码分泌性假想脂蛋白的牛支原体Mbov_0145基因突变株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020081，所述Mbov_0145基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。本发明的突变株对宿主细胞的黏附能力减弱，诱导细胞因子IL‑8的能力降低，有作为毒力致弱菌株在制备牛支原体疫苗中发挥价值的潜力。

Description

牛支原体Mbov_0145基因突变株及其应用
技术领域
本发明属于动物传染病防治技术领域，涉及到一种牛支原体基因突变株，尤其是一种编码分泌性假想脂蛋白的牛支原体Mbov_0145基因突变株，本发明还涉及该突变株作为毒力致弱菌株在制备牛支原体疫苗中的应用。
背景技术
牛支原体是致牛呼吸道疾病综合征的重要病原，常在运输应激后爆发，引起牛肺炎、乳腺炎、关节炎、中耳炎等病症(Arcangioli et al 2008)。目前，牛支原体病在世界范围内广泛流行，是危害国内外养牛业的重要传染病。在欧洲，由牛支原体引起的呼吸道疾病约占牛呼吸道疾病总量的25％～35％，引起的经济损失高达5.76亿欧元(Nicholas andAyling 2003)。我国于1983年首次在牛乳房炎病例中分离到牛支原体，2008年由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原室首次在牛肺炎病例中分离到该病原(石磊，等2008)。报道显示，牛支原体病常常与跨省和地区的动物贸易有关，初生犊牛主要通过吸吮患牛支原体乳腺炎母牛的母乳而被感染，临床症状主要以坏死性肺炎为特征，并继发其它细菌和病毒疾病而造成混合感染(郭爱珍2011)。由于缺乏特效抗生素和特异性疫苗，再加上病原表面可变蛋白的高频率变异性引起的牛支原体免疫逃避(Nussbaum et al2002)，导致牛支原体病的预防和治疗变得更加困难。
病原分泌蛋白是一种优先或全面接触宿主细胞的重要蛋白，是诱导致病和免疫反应的重要组分，通常被认为是病原重要毒力因子，调控病原微生物的致病过程。近来研究发现，在支原体中也存在可释放至胞外环境的分泌蛋白，如人型支原体的膜表面蛋白P80通过切割信号肽分泌至胞外，是一种重要的分泌性抗原(Hopfe et al 2004)。另外，在猪肺炎支原体的分泌蛋白组中也发现了15个与毒力相关的重要分泌蛋白(Paes et al2017)，提示支原体的分泌蛋白可能是与致病相关的潜在毒力因子。
课题组前期结合生物信息预测以及Label-free蛋白组学技术在牛支原体强、弱菌株比较分泌蛋白组学中共鉴定到69个差异表达蛋白，其中一种假想脂蛋白MbovP0145为强毒株显著上调表达，经证实该蛋白具有分泌能力和免疫原性。基于牛支原体转座子测序，申请人从牛支原体突变体库中鉴定到了MbovP0145缺陷突变体，利用细胞黏附和细胞因子表达等支原体毒力表型测定方法，发现MbovP0145缺陷突变体表现为黏附减弱，诱导细胞因子IL-8的水平显著降低，证明该突变株毒力致弱，具有作为牛支原体候选疫苗的潜力。
发明内容
本发明的目的在于提供一株重要的牛支原体Mbov_0145基因突变菌株以及该菌株在制备牛支原体疫苗中的用途。其缺失的MbovP0145蛋白为分泌蛋白，相对于野生型牛支原体，该菌株呈现出黏附能力降低，诱导细胞因子IL-8水平显著减弱，可望作为减毒株在牛支原体免疫防控领域中发挥作用。
为了实现上述目的，申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原学分室从牛支原体突变体库中筛选得到一株MbovP0145突变株，此突变株表达MbovP0145蛋白缺陷，该蛋白为牛支原体强、弱菌株差异表达，推测与毒力相关。经验证，在牛支原体与宿主细胞互作过程中，该突变菌株黏附能力和诱导细胞因子IL-8的能力显著降低。在PPLO培养基中，该突变株与野生株生长曲线无显著差别。黏附和诱导细胞因子分泌是牛支原体实现感染的重要指标，也是与毒力相关的生物学特性。因此，牛支原体MbovP0145突变株可作为牛支原体毒力减弱菌株，对开发牛支原体安全有效的疫苗具有重要的应用价值。
更加具体的技术方案如下：
申请人于2008年6月从病牛的病变肺组织中分离得到一株牛支原体HB0801，命名为牛支原体HB0801，Mycoplasma bovis HB0801，该毒株已在CN 102220263A的专利文献中公开。
进一步利用pMT85转座子载体构建了牛支原体HB0801的随机突变体文库。经转座子测序技术，随机突变体库中筛选得到Mbov_0145基因突变株并对该突变体进行蛋白水平验证。
申请人将该毒株命名为牛支原体(Mycoplasma bovis)T6.93，于2020年4月27日送交中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO：M 2020081。
本发明利用细胞黏附模型和细胞因子mRNA检测，发现与野生株相比，T6.93突变株表现为黏附牛肺上皮细胞(EBL)和牛巨噬细胞(BoMac)的能力显著降低，诱导BoMac细胞IL-8能力降低，基于黏附、诱导细胞因子分泌等是支原体感染和致病的毒力相关表型，该突变株可望作为减毒株在牛支原体免疫防控领域中发挥重要作用。将本发明的突变株T6.93与野生株分别接种于PPLO培养基中，进行生长曲线检测，结果显示突变株与野生株生长速度无明显差异。
本发明构建的突变株，目前尚未检索到相关文献报道。
本发明具有以下优点：
本发明的菌株是发明人从牛支原体基因突变体库中筛选获得的Mbov_0145基因突变菌株，也是发明人首次获得。其黏附宿主细胞能力显著降低，诱导IL-8能力降低，因此，可望作为疫苗侯选株而在新型牛支原体疫苗研发以及分泌蛋白的其他相关应用中发挥作用。
更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。
附图说明
图1：是牛支原体突变株T6.93转座子插入的核苷酸序列与牛支原体HB0801全基因组序列的比对结果。图中，方框所示序列为转座子与HB0801基因组连接处测序序列，所示方向为转座子相对基因组的插入方向。
图2：是牛支原体突变株T6.93与野生株MbovP0145蛋白的表达测定。泳道M：分子量参考蛋白质；泳道1为突变株T6.93，泳道2为野生株，泳道3为PPLO空白培养基。
图3：是牛支原体突变株T6.93与野生株感染宿主BoMac细胞后黏附能力定量检测分析。附图标记说明：“*”表示P﹤0.05，“***”或“****”表示P﹤0.001。
图4：是牛支原体突变株T6.93与野生株感染宿主EBL细胞后黏附能力定量检测分析。附图标记说明：“****”表示P﹤0.001。
图5：是牛支原体突变株T6.93与野生株感染牛上皮细胞EBL后IL-8mRNA表达水平检测分析。附图标记说明：“***”表示P﹤0.001。
图6：是牛支原体突变株T6.93与野生株在PPLO培养基中生长曲线分析图。
具体实施方式
牛支原体突变体库由申请人课题组前期构建，保存于-80℃，经转座子测序技术，发现一株转座子插入Mbov_0145基因的突变株T6.93。该菌株表现为对宿主细胞的黏附和诱导IL-8产生的能力均显著降低，具体实施如下：
实施例1：牛支原体插入突变体库构建
pMT85质粒由法国法国农业科学院Eric Baranowski博士惠赠，它含有mini型Tn4001转座子(mini-Tn4001)，该转座子中已导入了由aacA-aphD基因编码的庆大霉素抗性标记，它位于转座片段两端的两个反向重复序列(IR)之间，而转座酶基因(tnpA)位于重复序列外侧，可以防止再次发生转座(Baranowski et al 2010)。
以M.bovis HB0801为亲本菌株构建突变体库，收集培养至对数后期的M.bovis，用冷DPBS缓冲液洗涤两次，重悬于0.1M CaCl2溶液中，冰上孵育30min；将制成的牛支原体感受态细胞与3μg pMT85质粒，10μg酵母tRNA和1mL 50％PEG8000混合。孵育1min后，将混合物稀释至5mL PPLO培养基中，并于37℃孵育3h。然后，洗涤牛支原体，将其重悬于1mL PPLO培养基中，并涂布到含庆大霉素的PPLO固体培养基上。在37℃下温育3～7d，挑选单个菌落于1mL含庆大霉素的PPLO肉汤中培养至对数期，-80℃保存菌株，建立牛支原体HB0801突变体库。
实施例2.牛支原体突变体库突变株基因组测序
2.1 基因组测序获得牛支原体MbovP0145突变株
利用常规的CTAB法提取牛支原体HB0801突变体库中的牛支原体总DNA，对转座子与牛支原体基因组连接处进行测序，将测序结果与牛支原体全基因组序列进行比对，结果显示，突变株T6.93所涉及的基因Mbov_0145中涵盖转座子插入序列，大小为119bp，位于基因组163882位点后，以及位于Mbov_0145基因506位点后(图1)。
牛支原体HB0801全基因组序列的GenBank登录号为CP002058，其中Mbov_0145基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.2 Western blot验证突变株MbovP0145的缺陷表达
将培养至对数末期的牛支原体HB0801和T6.93菌株各100mL，12000rpm，4℃离心30min，收集菌体沉淀，加入蛋白SDS-loading buffer裂解液(250mM Tris-HCl,10％(w/v)SDS，0.5％(w/v)溴酚蓝，50％(v/v)甘油，5％(w/v)β-巯基乙醇)，经95℃水浴煮沸获得各菌株的全菌蛋白。利用BCA试剂盒测定蛋白浓度，调整浓度一致，加入5×loading buffer，100℃煮沸10min，取上清作为蛋白样品进行Western blot检测。检测结果如图2所示，仅在2泳道出现大小为55kDa的蛋白条带，这与MbovP0145蛋白大小一致，而1和3泳道无条带，其中1为T6.93菌株蛋白，2为HB0801菌株蛋白，3为PPLO空白培养基，说明突变株T6.93中Mbov_0145蛋白表达缺陷。
实施例3.突变株T6.93对EBL、BoMac细胞黏附能力的测定
3.1 牛支原体培养和计数
取牛支原体HB0801和T6.93分别以1:1000的比例接种于PPLO液体培养基，于37℃，5％CO2培养箱中静置培养36h到达对数末期后，进行CFU计数。
3.2 BoMac和EBL细胞的培养
将BoMac和EBL细胞分别培养于RIMI-1640完全培养基(即含10％热灭活胎牛血清的RIMI-1640培养基，Hyclone)和DMEM完全培养基(即含10％热灭活胎牛血清的DMEM培养基，Hyclone)中，于37℃，5％CO2条件下培养，待细胞长至80％的单细胞层时，用含0.25％EDTA的胰酶37℃消化处理3min后。立即加入完全培养基终止消化。经100rpm离心5min，弃上清，用适当体积的完全培养基吹打细胞沉淀，制成细胞悬液，并进行细胞计数。将计数好的细胞分别以1×105细胞/孔加入24孔细胞培养板，培养过夜至贴壁。
3.3 牛支原体对BoMac和EBL细胞的黏附
取适量计数好的牛支原体用PBS洗涤3次，并用细胞完全培养基进行重悬，按照感染比MOI为1000的比例分别加入两种细胞中，同时设置牛支原体野毒株HB0801株为阳性对照，各自在37℃，5％CO2条件下反应30min，60min，120min，用无菌PBS洗涤未黏附的菌3次，加入一定量的细胞完全培养基，经-80℃/37℃反复冻融一次，以充分裂解细胞，然后CFU计数，计数结果显示如图3和图4。在两种细胞中，T6.93的黏附能力较野生菌株有降低趋势，在2h时差异极显著，在BoMac细胞中黏附能力降低倍数约为5倍，在EBL细胞中黏附能力降低倍数约为2倍。
实施例4.突变株T6.93诱导EBL细胞产生IL-8的mRNA表达测定
4.1 牛支原体培养和计数：参照3.1。
4.2 EBL细胞的培养：参照3.2。
4.3 牛支原体感染EBL细胞的具体实施步骤：取适量计数好的牛支原体用PBS洗涤3次，并用细胞完全培养基进行重悬，按照感染比MOI为1000的比例分别加入EBL细胞中，同时设置牛支原体野毒株HB0801株为阳性对照，培养基孔为空白对照，分别在37℃，5％CO2条件下反应6h，12h，24h，用无菌PBS洗涤1-2次，加入1mL Trizol裂解2min，收集至无RNA酶的EP管，-80℃保存。
4.4 RNA提取
将所有样品从-80℃拿出来放到室温融化，每孔加入0.2mL氯仿，振荡15s，室温静置2-5min，在4℃，12000rpm离心15min，取上层液体(500μL)至另一无RNA酶的EP管中，加入预冷的异丙醇(500μL)，混匀后室温静置10min,然后在4℃,12000rpm离心10min，弃掉上清用75％的乙醇清洗沉淀；最后在超净台里晾干15-20min，加入适量DEPC水在58℃水浴锅中溶解10min,吸出2μL进行RNA浓度测定。
4.5 荧光定量检测IL-8mRNA表达量
取1μg RNA，利用诺唯赞反转录试剂盒进行反转录，将产物进行10倍稀释，按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行反应体系配制，根据qPCR引物，具体序列如下(表1)：
表1 PCR扩增引物
基因名称 引物序列5’→3’ 退火温度
β-actin-F AGATCAAGATCATCGCGCCC 60℃
β-actin-R TAACGCAGCTAACAGTCCGC 60℃
IL-8-F GAAGAGAGCTGAGAAGCAAGATCC 60℃
IL-8-R ACCCACACAGAACATGAGGC 60℃
结果显示，不同菌株感染EBL细胞后，突变株T6.93较野毒株P1产生IL-8mRNA表达量均有显著降低(如图5)。
实施例5:牛支原体生长曲线测定
取牛支原体野生株HB0801和突变株T6.93以1:10的比例接种PPLO液体培养基，静置于37℃、5％CO2培养箱中连续培养60h，每隔12h取适当菌液进行CFU检测，结果显示，突变株与野生株的生长速度无显著差别(图6)。
综上所述，与野生株比较，突变株T6.93表现出对宿主细胞黏附降低，诱导细胞因子IL-8的能力显著降低。这些特征表明突变株T6.93可能因为缺失MbovP0145蛋白而表现为毒力致弱菌株，有望在牛支原体新型疫苗研发中获得应用，在牛支原体致病和防控中具有重要的潜在应用前景。
相关术语
牛支原体，英文名：Mycoplasma bovis,缩写：M.bovis；
牛支原体湖北分离株HB0801，英文名：Mycoplasma bovis HB0801，缩写：M.bovisHB0801；
牛支原体0145蛋白表述为：MbovP0145；
牛支原体0145蛋白的编码基因表述为Mbov_0145。
主要参考文献：
[1].Arcangioli M A,Duet A,Meyer G,Dernburg A,Bezille P,Poumarat F,LeGrand D.The role of Mycoplasma bovis in bovine respiratory disease outbreaksin veal calf feedlots.Vet J,2008,177:89-93.
[2].Baranowski E,Guiral S,Sagne E,Skapski A,Citti C.Critical role ofdispensable genes in Mycoplasma agalactiae interaction with mammaliancells.Infect Immun,2010,78:1542-1551.
[3].Hopfe M,Hoffmann R,Henrich B.P80,the HinT interacting membraneprotein,is a secreted antigen of Mycoplasma hominis.BMC Microbiol,2004,4:46.
[4].Nicholas R A,Ayling R D.Mycoplasma bovis:disease,diagnosis,andcontrol.Res Vet Sci,2003,74:105-112.
[5].Nussbaum S,Lysnyansky I,Sachse K,Levisohn S,Yogev D.Extendedrepertoire of genes encoding variable surface lipoproteins in Mycoplasmabovis strains.Infect Immun,2002,70:2220-2225.
[6].Paes J A,Lorenzatto K R,De Moraes S N,Moura H,Barr J R,Ferreira HB.Secretomes of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma flocculare revealdifferences associated to pathogenesis.J Proteomics,2017,154:69-77.
[7].郭爱珍.牛呼吸疾病综合征及其防治.中国奶牛,2011,24:7-11.
[8].石磊，等.肉牛传染性牛支原体肺炎流行的诊断.华中农业大学学报,2008,27:629-633.
<110> 华中农业大学
<120> 牛支原体Mbov_0145基因突变株及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1446
<212> DNA
<213> 牛支原体（Mycoplasma bovis）
<400> 1
ttgctttttg ctagttcact tcctttaatt gctgcttcat gtaaaaataa tgaaactaag 60
gagcctaaaa aggaacctga aatggatgct ccaatcgctc cacctaccga tcctgaaaaa 120
gataatccag gtaagacaga gcctatgcac agtgataaac ctaaagtttt caaaactgat 180
atttctggtt taaagcttaa atttagtcca acaaataata caaacaaaaa tgatgtctta 240
gaactattaa aaaaacaacc taaattagag aatttgactg aaggcgattt tgacttcaaa 300
ctagagagaa aatcactttt gaatagagaa gggctgatag ttatcgccgc aaatcctgaa 360
tctcaattag tttcaggaat gcttaatatt actataaaca agctcgataa gttaattcca 420
agagaacata aatacaacaa tgataaaaca aaagttcttg aaattggata tgatgaaaaa 480
ggaagaatca aaaaatttgt cgagaatgta aaagaagttc cagcaaatct tcctgaggaa 540
attattagtc ttgactgagc atttgctaga aatttaaatg aaaaaattgt caatttagaa 600
aagtgagaca cctcaaatat tgagagcatg agtaaaactt ttttgcaagc caaaaaattt 660
aatactgata tttctagttg gaaaacaaac agagtcaaag atatgtcaaa tatgtttacg 720
tcagctgaag catttagtca aaatttagat aagtgagaca catctaatgt tacaactatg 780
tatagaatgt ttgaagaagc taaaacgttc aatggtaaca tttcaagctg aaaaacagaa 840
aatgtcacaa atatggaaca tatgtttgaa aaagctgctg ctttcaatca agacttatca 900
tcatgaaatg ttgagaatgt ttcgaaaatg aaaaatatgt ttagtggtgc caaggaattt 960
aataaaccat tatttaagtt aattaatcct aaagtaagtg atatgtcgta tatgtttttt 1020
ggcgctgaaa aatttaatga ttcgtctgtt tcacagtgaa atacgacaag cgttactaag 1080
atgaatgcaa tgttctgaga cgctaaagca tttaatcaag acttaagcaa ctgaaaaact 1140
gacaatgtaa cattaatgca taatatgttt tatggggcaa tcattttcaa cagtgatata 1200
agcagatgaa aaacatctaa agttacaaat atgagccaaa tgttctgggg tgctaaagca 1260
tttaatcaaa atatatcgga ctgagatgta aaaaacgtaa ccgatgtttc aagtatgttt 1320
gcatatgctt cctctttcaa gcaggattta gataaatgaa catttaacaa aattgtcaac 1380
agtagccatt tccgaaatgg tgctcctatt ttcaaactac ctaattttag gcaagtatct 1440
aaataa 1446

Claims (3)

1.一种牛支原体（ Mycoplasma bovis ） Mbov_0145基因突变株，命名为牛支原体（Mycoplasma bovis）T6.93，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2020081，所述Mbov_0145基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的牛支原体Mbov_0145基因突变株在制备牛支原体疫苗中的应用，所述牛支原体Mbov_0145基因突变株对宿主细胞的黏附性降低，同时诱导细胞因子IL-8的能力降低，是一种毒力致弱菌株。
3.一种毒力致弱牛支原体疫苗，其特征在于含有权利要求1所述的牛支原体Mbov_0145基因突变株。
CN202010386437.9A 2020-05-09 2020-05-09 牛支原体Mbov_0145基因突变株及其应用 Active CN111676181B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010386437.9A CN111676181B (zh) 2020-05-09 2020-05-09 牛支原体Mbov_0145基因突变株及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010386437.9A CN111676181B (zh) 2020-05-09 2020-05-09 牛支原体Mbov_0145基因突变株及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111676181A CN111676181A (zh) 2020-09-18
CN111676181B true CN111676181B (zh) 2021-11-16

Family

ID=72451819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010386437.9A Active CN111676181B (zh) 2020-05-09 2020-05-09 牛支原体Mbov_0145基因突变株及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111676181B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111621506B (zh) * 2020-05-09 2021-07-30 华中农业大学 牛支原体分泌蛋白MbovP0145及其应用
CN111748507B (zh) * 2020-06-02 2021-12-03 华中农业大学 一种牛支原体Mbov_0475基因突变株及其应用
CN111705026B (zh) * 2020-06-02 2021-11-26 华中农业大学 一种牛支原体Mbov_0280基因突变株及其应用
CN111778177B (zh) * 2020-06-02 2021-09-21 华中农业大学 一种牛支原体Mbov_0274基因突变株及其应用
CN111705013B (zh) * 2020-06-02 2021-12-07 华中农业大学 一种牛支原体Mbov_0570基因突变株及其应用
CN114774340B (zh) * 2022-04-20 2023-07-25 华中农业大学 一株牛支原体Mbov_0703基因突变株及其应用
CN115404194A (zh) * 2022-04-20 2022-11-29 华中农业大学 一株毒力致弱的牛支原体基因突变株及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111621506A (zh) * 2020-05-09 2020-09-04 华中农业大学 牛支原体分泌蛋白MbovP0145及其应用
CN111705013A (zh) * 2020-06-02 2020-09-25 华中农业大学 一种牛支原体Mbov_0570基因突变株及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111621506A (zh) * 2020-05-09 2020-09-04 华中农业大学 牛支原体分泌蛋白MbovP0145及其应用
CN111705013A (zh) * 2020-06-02 2020-09-25 华中农业大学 一种牛支原体Mbov_0570基因突变株及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Comparative Secretome Analyses of Mycoplasma bovis Virulent and Attenuated Strains Revealed MbovP0145 as a Promising Diagnostic Biomarker;Hui Zhang 等;《Frontiers in Veterinary Science》;20210618;第1-19页 *
Mycoplasma bovis HB0801 putative lipoprotein;Qi J. 等;《EMBL Database》;20140515;ID AFM51518 *
TLRs介导M.bovis感染牛乳腺上皮细胞调控机制研究;刘玉辉;《万方》;20161111;全文 *
牛支原体强弱菌株分泌蛋白的分离和初步鉴定研究;胡古月;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑》;20190115;A006-1680 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111676181A (zh) 2020-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111676181B (zh) 牛支原体Mbov_0145基因突变株及其应用
CN111705026B (zh) 一种牛支原体Mbov_0280基因突变株及其应用
CN110527669B (zh) 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株及其构建方法和应用
CN103555754B (zh) 一种干酪乳杆菌菌影及其制备方法和应用
WO2021208913A1 (zh) 一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用
CN104059889B (zh) 伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株及其构建方法和应用
CN111778177B (zh) 一种牛支原体Mbov_0274基因突变株及其应用
CN111518740A (zh) 一种表达SARS-CoV-2 S基因的重组植物乳酸菌及其制备方法
CN107988340A (zh) 一种快速检测绵羊肺炎支原体的pcr扩增引物及其应用
CN110747175B (zh) 一株猪δ冠状病毒及其应用
CN107338208B (zh) 一种猪萎缩性鼻炎d型产毒多杀巴斯德氏菌疫苗株及其应用
CN108956985B (zh) 一种检测新型鹅星状病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用
CN111690554A (zh) 用于制备羊支原体肺炎疫苗的组合菌株、羊支原体肺炎三价灭活疫苗及其制备方法
CN114214338B (zh) 猪源piv5全长感染性克隆及其制备方法和应用
CN108842000A (zh) 用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物组
KR20100121288A (ko) 유전자재조합 돼지열병 백신바이러스 Ｆｌｃ―ＬＯＭ―ＢＥｒｎｓ ｖｉｒｕｓ 및 이의 제조방법
CN105749267A (zh) 一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗及其血清学鉴别方法
CN102321638A (zh) 一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒orf5修饰基因及其应用
CN105385666A (zh) 伪狂犬病病毒双荧光标记5基因缺失株的构建
CN110974951A (zh) 一种二联灭活疫苗及其制备方法
CN114774340B (zh) 一株牛支原体Mbov_0703基因突变株及其应用
CN109781973A (zh) 羊传染性胸膜肺炎间接elisa检测诊断试剂制备方法
CN116926022B (zh) 一种鸽源基因Ⅵ型新城疫病毒mGZ08、用途、制备方法、培养方法、疫苗
CN102776155A (zh) 牛肠道病毒中国分离株及其感染性cDNA克隆的构建和应用
CN113462659B (zh) 一种重组病毒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant