CN111690554A - 用于制备羊支原体肺炎疫苗的组合菌株、羊支原体肺炎三价灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于制备羊支原体肺炎疫苗的组合菌株、羊支原体肺炎三价灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域，所述组合菌株包括绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、MO_NM02和MO_NM03；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01的保藏编号为CGMCC No.19698；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02的保藏编号为CGMCC No.19699；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02的保藏编号为CGMCC No.19700。所述组合菌株中的看家基因、结构蛋白和菌株的多抗均存在差异，利用所述组合菌株制备的三价灭活苗可以对不同的毒株起到良好的保护作用，免疫保护率高。

Description

用于制备羊支原体肺炎疫苗的组合菌株、羊支原体肺炎三价 灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，尤其涉及用于制备羊支原体肺炎疫苗的组合菌株、羊支原体肺炎三价灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

绵羊肺炎支原体是从绵羊或山羊支气管、肺脏中分离得到的一种最常见的病原菌，主要引起羊支原体肺炎。羊支原体肺炎是一种高度接触性的呼吸道传染病。绵羊支原体肺炎又称绵羊传染性胸膜肺炎，四季均有流行，尤其夏秋换季时节最易爆发，各年龄段的羊只均可受感染，但特别以1-3月龄的羔羊发病和死亡率最高，个别羊场的羔羊死亡率可达50％以上。患病羊临床特征为高热、咳嗽、喘气、肺和胸膜发生浆液性及纤维素性炎症，呈急性或慢性经过。由于在其导致的慢性感染中，病程可达数月至数年，因此即使是幸免耐过的羊只也会因肺部受损而导致生长速度缓慢、出栏率低，同时料肉比明显升高、毛质毛量下降，造成人力和饲料的双重浪费，严重危害着羊养殖业的发展。

使用疫苗进行免疫接种是预防羊支原体肺炎病发生与流行的核心技术，但是用单一的菌株目前免疫保护效果不理想，这是制约该病疫苗免疫效果的主要因素。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供用于制备绵羊支原体肺炎疫苗的组合菌株、绵羊支原体肺炎三价灭活疫苗及其制备方法；所述组合菌株包括三种分离自不同时间不同地点的菌株，所述组合菌株中的看家基因、结构蛋白和菌株的多抗均存在差异，利用所述组合菌株制备的三价灭活苗可以对不同的毒株起到良好的保护作用，疫苗菌株的多样性提高了疫苗的免疫保护率。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了用于制备羊支原体肺炎疫苗的组合菌株，包括绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01的保藏编号为CGMCC No.19698；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02的保藏编号为CGMCC No.19699；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02的保藏编号为CGMCC No.19700。

本发明提供了一种用于制备羊支原体肺炎疫苗的菌液制剂，包括独立存在的绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液；

所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液的菌浓度分别≥5×10E8CCU/ml。

本发明提供了一种羊支原体肺炎三价灭活疫苗，包括灭活所述的菌液制剂和佐剂。

优选的，所述灭活的菌液制剂和佐剂的质量比为(0.8～1.2):(0.8～1.2)。

优选的，所述佐剂为水包油包水矿物油。

优选的，所述灭活的菌液制剂中绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。

本发明还提供了所述的羊支原体肺炎三价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)分别培养绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03获得绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液；

2)分别将所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液灭活后混合获得灭活的菌液制剂；

3)将灭活的菌液制剂和佐剂混合乳化获得羊支原体肺炎三价灭活疫苗。

优选的，步骤2)中所述的灭活的方法为将所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液分别与β丙内酯混合，3～5℃作用45～55h，然后35～40℃振荡1～3h。

优选的，所述β丙内酯的体积为所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液或绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液体积的0.1％～0.3％；所述振荡的转速为120～180rpm。

优选的，所述混合乳化的温度为30～32℃，所述混合乳化的时间为25～35min，所述混合乳化的转速为250～350rpm

本发明的有益效果：本发明提供的用于制备羊支原体肺炎疫苗的组合菌株，包括绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03；所述菌株MO_NM01、菌株MO_NM02和菌株MO_NM03的看家基因、结构蛋白和菌株的多抗均存在差异，利用所述组合菌株制备的三价灭活苗可以对不同的毒株起到良好的保护作用，免疫保护率高；根据实施例的记载，本发明提供的三价灭活疫苗的保护率高于单价灭活疫苗，三价灭活疫苗免疫中剂量即可达到免疫保护的效果，免疫保护效果远远大于商品化疫苗。

生物保藏信息

绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年5月11日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01的保藏编号为CGMCCNo.19698；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02的保藏编号为CGMCCNo.19699；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02的保藏编号为CGMCCNo.19700。

附图说明

图1为三种绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、MO_NM02和MO_NM03的16SrRNA基因进化树；

图2为三种绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、MO_NM02和MO_NM03的FusA基因遗传进化树；

图3为三种绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、MO_NM02和MO_NM03的gyrB基因遗传进化树；

图4为三种绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、MO_NM02和MO_NM03的LepA基因遗传进化树；

图5为三种绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、MO_NM02和MO_NM03的rpoB基因遗传进化树；

图6为Westernblot检测三种绵羊肺炎支原体MO_NM01，MO-NM02和MO-NM03三株菌株膜蛋白组成的多样性；

图7为不同疫苗免疫家兔血清抗体监测结果；

图8为不同疫苗免疫绵羊攻毒后健康和发病情况；

图9为不同疫苗接种本动物后抗体效价监测结果。

具体实施方式

本发明提供了用于制备羊支原体肺炎疫苗的组合菌株，包括绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01的保藏编号为CGMCC No.19698；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02的保藏编号为CGMCC No.19699；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02的保藏编号为CGMCC No.19700。

在本发明中，所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03是2016～2018年从内蒙古西部、中部、东北部等地羊场、牧场采集绵羊支原体肺炎病料中分离获得的免疫原性和毒力均较好的菌株。所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03经16SrRNA通用引物27F/1492RPCR扩增、测序及序列分析确定3菌株序列同源性99％以上，与GenBank中收录的绵羊肺炎支原体(MO)序列同源性也在99％以上，确认三个菌株为绵羊肺炎支原体菌株。

本发明通过对上述三个菌株中绵羊肺炎支原体的看家基因fusA，gyrB，lepA，rpoB进行序列分析及比对，确认上述三个菌株与欧美流行株亲缘关系较近，三个菌株有一定的遗传距离；三个菌株的外膜蛋白的组成也存在比较明显的差异性，抗血清的覆盖度也不同，本申请将上述三个菌株进行组合用来制备羊支原体肺炎疫苗，免疫保护性更为全面。

本发明还提供了一种用于制备羊支原体肺炎疫苗的菌液制剂，包括独立存在的绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液。在本发明中，所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液的菌浓度分别≥5×10E8CCU/ml。

在本发明中，所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液的制备方法优选的包括一级种子繁殖、二级种子繁殖和发酵培养。在本发明中，所述一级种子繁殖包括将菌株接种于改良KM2培养基中36～38℃培养45～55h后传代至新的改良KM2培养基中36～38℃培养45～55h获得一级种子液。在本发明中，所述培养温度优选的37℃，每一代的培养时间优选为46～50h，更优选为48h；所述传代的接种量优选为8％～12％(V/V)，更优选为10％(V/V)。本发明在获得一级种子液后，进行二级种子繁殖，将所述一级种子液转接至改良KM2培养基中36～38℃培养24～48h，进行纯粹检验合格后，作为二级种子液。在本发明中，所述转接的接种量优选为8％～12％(V/V)，更优选为10％(V/V)；本发明对所述纯粹检验的方法没有特殊要求，参考《中华人民共和国兽药典》附录进行。本发明在获得所述二级种子液后，将所述二级种子液接种于改良KM2培养基中，36～38℃培养48～72h后收获菌液。在本发明中，二级种子液接种的接种量优选为8％～12％(V/V)，更优选为10％(V/V)。在本发明中，所述改良KM2培养基优选的包括以下组分：1640细胞培养液500ml/L，1.7wt％水解乳蛋白Hanks液300ml/L，25wt％酵母液20ml/L，马血清200ml/L，青霉素(20万国际单位)2mL，1％醋酸铊14mL/L，0.4wt％酚红5mL/L，葡萄糖4g/L和丙酮酸钠2g/L。在本发明中，所述改良KM2培养基的pH值优选为7.6～7.8，更优选为7.7；在本发明中，所述改良KM2培养基的制备方法如下：将上述成分混合均匀后，用1mol/LNaOH调整pH，经0.22μm滤器过滤获得；所述改良KM2培养基优选的放置于4℃保存。

本发明还提供了一种羊支原体肺炎三价灭活疫苗，包括灭活所述的菌液制剂和佐剂。

在本发明中，所述灭活的菌液制剂和佐剂的质量比优选为(0.8～1.2):(0.8～1.2)，更优选为1:1；在本发明中，所述佐剂优选为水包油包水矿物油，在本发明中，所述佐剂优选为ISA-201-VG免疫油佐剂，所述ISA-201-VG免疫油佐剂的厂家优选为法国SEPPIC。在本发明中，所述灭活的菌液制剂中绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液的体积比优选为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，更优选为1:1:1。

本发明还提供了所述的羊支原体肺炎三价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)分别培养绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03获得绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液；

2)分别将所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液灭活后混合获得灭活的菌液制剂；

3)将灭活的菌液制剂和佐剂混合乳化获得羊支原体肺炎三价灭活疫苗。

在本发明中，所述培养绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03的具体方法参见上述菌液制剂制备过程中记载的方法，在此不再赘述。

本发明在获得所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、MO_NM02菌液和MO_NM03的菌液后，将所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、MO_NM02菌液和MO_NM03菌液灭活后混合获得灭活的菌液制剂。在本发明中，所述的灭活的方法优选为将所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、MO_NM02菌液和MO_NM03菌液分别与β丙内酯混合，3～5℃作用45～55h，然后35～40℃振荡1～3h。在本发明中，所述β丙内酯的体积优选的分别为所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、MO_NM02菌液或MO_NM03菌液体积的0.1％～0.3％，更优选为0.2％。在本发明中，所述作用的温度优选为4℃，所述作用的时间优选为46～50h，更优选为48h；本发明在所述作用过程中，优选的每6h进行一次混匀，本发明对所述混匀的方法没有特殊限定，采用本领域常规的混匀方法即可。在本发明中，所述振荡的温度优选为37℃，所述振荡的时间优选为2h；所述振荡的转速优选为120～180rpm，更优选为150rpm。在本发明中，所述振荡的作用是使β丙内酯降解。

本发明在获得灭活的菌液制剂后，将所述灭活的菌液制剂和佐剂混合乳化获得羊支原体肺炎三价灭活疫苗。在本发明中，所述混合乳化的温度优选为30～32℃，更优选为31℃；所述混合乳化的时间优选为25～35min，更优选为30min；所述混合乳化的转速优选为250～350rpm，更优选为280～320rpm，最优选为300rpm。镜检观察本发明获得的羊支原体肺炎三价灭活疫苗，疫苗乳滴细小均匀，混合乳化后的羊支原体肺炎三价灭活疫苗滴入水中后扩散均匀。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

疫苗生产用菌株：

菌株来源：

于2016-2018年从内蒙古西部、中部、东北部等地羊场、牧场采集绵羊支原体肺炎病料，用改良KM2培养基从病羊肺脏、气管等部位分离出多株绵羊肺炎支原体菌株，对分离的绵羊肺炎支原体进行了形态观察、培养特性、生化特性、血清学试验、毒力和免疫原性试验，最终筛选到免疫原性、毒力较好的菌株各一株，分别命名为绵羊肺炎支原体MO_NM01株、绵羊肺炎支原体MO_NM02株和绵羊肺炎支原体MO_NM03株。

改良KM2培养基：1640细胞培养液500ml/L，1.7wt％水解乳蛋白Hanks液300ml/L，25wt％酵母液20ml/L，马血清200ml/L，青霉素(20万国际单位)2mL，1％醋酸铊14mL/L，0.4wt％酚红5mL/L，葡萄糖4g/L和丙酮酸钠2g/L。制备方法如下：将上述成分混合均匀后，用1mol/LNaOH调整pH至7.6～7.8，经0.22μm滤器过滤获得；放置于4℃保存。

菌种特性：

1)菌落形态特征：在40倍放大的显微镜下菌落有明显的凸起，可看到很小的透明菌落，菌落表现为圆形突起，无脐，呈桑葚状。

2)生化特性：分离株能发酵葡萄糖，还原美兰，液化血清；不水解尿素和精氨酸；菌落吸附红细胞呈阴性(表1)。

表1生化鉴定结果

检测项目	MO_NM01	MO_NM02	MO_NM03
				水解精氨酸	阴性	阴性	阴性
水解尿素	阴性	阴性	阴性
				美兰还原	阳性	阳性	阳性
发酵葡萄糖	阳性	阳性	阳性
				马血清液化	阳性	阳性	阳性
吸附红细胞	阴性	阴性	阴性

菌株基因鉴定：

1)16SrRNA鉴定：用16SrRNA通用引物27F/1492RPCR扩增获得1420bp的目的条带，经过测序及序列分析表明3菌株序列同源性99％以上，与GenBank中收录的绵羊肺炎支原体(MO)序列列同源性也在99％以上，说明分离到的三个菌株为绵羊肺炎支原体菌株。

2)看家基因(housekeepinggene)分析：

通过对绵羊肺炎支原体四个看家基因fusA，gyrB，lepA，rpoB进行序列分析及比对，发现三株分离株与欧美流行株亲缘关系较近，三个分离株有一定的遗传距离，具体结果如图2～图5所示，三个菌株的看家基因存在差异。

3)外膜蛋白westernnlot鉴定

提取三个绵羊肺炎支原体菌株的外膜蛋白，分别用MO_NM01、MO_NM02和MO_NM03灭活疫苗免疫羊产生的抗血清为一抗，经过Westernblot鉴定，结果如图6所示，三个菌株外膜蛋白的组成也存在比较明显的差异性，抗血清的覆盖度也不同，因而，将三个菌株混合制备三价灭活疫苗具备更为全面的免疫保护性。

毒力测试

分别用三个绵羊肺炎支原体菌株1E9，1E8，1E7，1E6CCU/ml不同浓度的菌液气管注射健康1月龄羔羊各4只，连续观察21天，1E9CCU/ml和1E8CCU/ml攻毒组全部发病，有明显咳嗽、流涕、发热症状，剖检肺部黏连，有明显肺炎症状，1E7CCU/ml攻毒组一半发病，1E6CCU/ml攻毒组无发病，剖检肺部正常。从发病羊肺脏和气管可以分离到绵羊肺炎支原体病原体。

免疫原性

分别用三个绵羊肺炎支原体菌株制备灭活疫苗，免疫家兔进行免疫原性检测，结果如图7所示，在免疫7天可以检测到特异性抗体，14天～21天抗体达到高峰，并且高峰期能够持续6～8周，随后缓慢下降。三价灭活疫苗在免疫三个月后抗体效价虽然有所下降，但相比商品化疫苗仍然保持较高的抗体滴度。

实施例2

绵羊支原体肺炎三价灭活疫苗的生产制备

菌种及菌种繁殖

1)一级种子繁殖

绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、MO_NM02、MO_NM03株菌种分别接种于改良KM2培养基中，37℃培养48h分别以10％(V/V)传代接种改良KM2培养基中，37℃培养48h，纯粹性检测和活力检测合格后，作为一级种子液。

2)二级种子繁殖

将各株一级种子液分别按10％接种于改良KM2培养基中，37℃摇床振荡培养36h，进行纯粹检验合格后，作为二级种子液。

3)抗原菌液培养

将三种菌株的二级种子液按10％分别接种改良KM2培养基中，分别于37℃，摇床振荡培养60h后收获菌液。

活菌计数：用常规的CCU计数方法，进行计数，菌液浓度可达5×10E8CCU/ml。

纯粹检验：从上述培养好的三种菌液中取样，用PPLO固体培养基，添加20％马血清，2g/L丙酮酸钠，4g/L葡萄糖进行培养，参考《中华人民共和国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹。

菌液灭活：

分别向三种绵羊肺炎支原体菌株的培养液中添加体积总量的0.2％β丙内酯，在4℃灭活48h，期间每6h混匀一次，随后37℃，150rpm振荡2h，使β丙内酯降解。

灭活检验：

分别取三种菌株的灭活菌液0.2mL接种改良KM2液体培养基中，置37℃，150rpm培养7d，同时接种PPLO固体培养基，连续培养7d，无绵羊肺炎支原体生长为合格。

疫苗制备：

将灭活检验合格的三种抗原菌液按1:1:1(体积比)的比例混合均匀，再与水包油包水矿物油佐剂按照质量比1:1进行乳化，乳化条件：31℃，300rpm，乳化30min，镜检观察疫苗乳滴细小均匀，乳化后的疫苗滴入水中后扩散均匀。

无菌检验：

取上述疫苗，按照《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。

安全性检验：

取上述疫苗，颈部皮下注射SPFBalb/c小鼠3只，7天内全部健活，方为合格。取体重为1.5-2kg的家兔3只，背部皮下多点注射，每只2ml，观察10日，均应健活。

疫苗的免疫保护试验

方法：疫苗经颈部皮下免疫4周龄健康羔羊，同时设置PBS空白对照组和商品化疫苗对照组，每组实验动物4只，免疫后监测血清抗体效价增长情况，疫苗免疫4周后，气管攻毒，每只羊攻毒剂量为1+1E10CCU。攻毒后鼻拭子采样监测绵羊肺炎支原体病原，监测6个月。

计算整个观察周期实验羔羊的发病率，测定体温，对羔羊剖检，从肺脏和气管进行支原体分离培养。

结果：

不同疫苗免疫绵羊攻毒后健康和发病情况如图8所示：疫苗组与未免疫组有明显的免疫保护差异，攻毒后，未免疫对照组全部发病，而商品化疫苗组也全部发病，三价疫苗组保护率高于单价疫苗组，三价疫苗免疫中剂量即可达到免疫保护效果。商品化疫苗组绵羊免疫疫苗后一个月内抗体效价极低，在攻毒时抗体效价未能够达到免疫保护水平，因此而全部发病。

三价灭活疫苗与三种不同血清型单苗及商品苗免疫攻毒比较：

疫苗A：绵羊肺炎支原体三价灭活疫苗

疫苗B：商品化灭活疫苗

疫苗C：绵羊肺炎支原体MO_NM01株灭活疫苗

疫苗D：绵羊肺炎支原体MO_NM02株灭活疫苗

疫苗E：绵羊肺炎支原体MO_NM03株灭活疫苗

表2三价灭活疫苗与三种不同血清型单苗及商品苗免疫攻毒比较

	免疫数量	免疫剂量	发病数量	保护率
					疫苗A高剂量	4	3ml(1E10)	0	4/4
疫苗A中剂量	4	3ml(1E9)	0	4/4
					疫苗A低剂量	4	3ml(1E8)	1	3/4
疫苗B	4	3ml(1E9)	3	1/4
					疫苗C	4	3ml(1E9)	2	2/4
疫苗D	4	3ml(1E9)	2	2/4
					疫苗E	4	3ml(1E9)	3	1/4
空白对照	4	3ml	4	0/4

本发明所述的羊支原体肺炎三价灭活灭活疫苗免疫绵羊后血液抗体效价在短期内可达到比较高的水平，14天基本即可达到峰值，在28天攻毒时，仍保持较高的抗体水平，因而，本发明所述的疫苗对攻毒能够起到有效的保护作用；整体监测结果见图9。

本发明所用三株绵羊肺炎支原体MO_NM01，MO_NM02和MO_NM03菌株，看家基因存在一定的差异性，结构蛋白和菌株的多抗均存在多样性，虽然单独菌株免疫绵羊后也能产生较高的抗体滴度，但是在攻毒时却不能够对多株菌株起到良好的保护作用，而本发明提供的三价灭活疫苗却可以对不同的毒株起到良好的保护作用，疫苗菌株的多样性提高了疫苗的免疫保护率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.用于制备羊支原体肺炎疫苗的组合菌株，其特征在于，包括绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01的保藏编号为CGMCC No.19698；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02的保藏编号为CGMCC No.19699；所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02的保藏编号为CGMCC No.19700。

2.一种用于制备羊支原体肺炎疫苗的菌液制剂，其特征在于，包括独立存在的绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液；

所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液的菌浓度分别≥5×1E8CCU/ml。

3.一种羊支原体肺炎三价灭活疫苗，其特征在于，包括灭活的权利要求2所述的菌液制剂和佐剂。

4.根据权利要求3所述的羊支原体肺炎三价灭活疫苗，其特征在于，所述灭活的菌液制剂和佐剂的质量比为(0.8～1.2):(0.8～1.2)。

5.根据权利要求3或4所述的羊支原体肺炎三价灭活疫苗，其特征在于，所述佐剂为水包油包水矿物油。

6.根据权利要求3所述的羊支原体肺炎三价灭活疫苗，其特征在于，所述灭活的菌液制剂中绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。

7.权利要求3～6任意一项所述的羊支原体肺炎三价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)分别培养绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03获得绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液；

2)分别将所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液灭活后混合获得灭活的菌液制剂；

3)将灭活的菌液制剂和佐剂混合乳化获得羊支原体肺炎三价灭活疫苗。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述的灭活的方法为将所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液和绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液分别与β丙内酯混合，3～5℃作用45～55h，然后35～40℃振荡1～3h。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述β丙内酯的体积为所述绵羊肺炎支原体菌株MO_NM01菌液、绵羊肺炎支原体菌株MO_NM02菌液或绵羊肺炎支原体菌株MO_NM03菌液体积的0.1％～0.3％；所述振荡的转速为120～180rpm。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述混合乳化的温度为30～32℃，所述混合乳化的时间为25～35min，所述混合乳化的转速为250～350rpm。

Images