CN112920976B

CN112920976B - 一株绵羊肺炎支原体强毒株及其应用

Info

Publication number: CN112920976B
Application number: CN202110341911.0A
Authority: CN
Inventors: 刘茂军; 毛立; 李文良; 杨蕾蕾; 张纹纹; 孙敏; 杜改梅
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2041-03-30
Also published as: CN112920976A

Abstract

本发明公开了一株绵羊肺炎支原体强毒株及其应用，所述绵羊肺炎支原体的分类命名为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)NJ01株，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2020907，保藏日期为2020年12月14日。所述的应用为上述绵羊肺炎支原体在感染发病和制备治疗羊支原体肺炎药物中的应用。本发明的绵羊肺炎支原体强毒株培育采用的支原体培养基，其制备简便、成本低、培养支原体变色快且滴度高。

Description

一株绵羊肺炎支原体强毒株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株绵羊肺炎支原体强毒株及其在建立绵羊肺炎支原体感染发病模型中的应用。

技术背景

羊支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae of sheep and goat,MPSG)是由绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)引起的一种绵羊和山羊慢性呼吸道传染病。该病主要以气喘为临床特征，在世界范围内广泛流行，山羊和绵羊都较易感，几乎普遍存在，给养羊业造成了重大损失。建立绵羊肺炎支原体感染发病模型是研究该病的重要前提。由于支原体难于培养，且绵羊肺炎支原体毒力较弱，难以发病，给感染发病模型的建立带来了困难，严重制约了该病的研究。

文献“白永平，绵羊肺炎支原体的分离鉴定与敏感药物试验的研究，四川农业大学，2011”中的23页报道，随着传代的次数增加，绵羊肺炎支原体分离株的生长速度增快，由最初的10天左右缩短到3-5天。由上述报道可见，由于绵羊肺炎支原体对营养要求苛刻，培养较为困难，且生长变色速度慢，需3-10天。

疫苗研究文献报道用绵羊肺炎支原体感染羊的发病肺组织、胸水等制备灭活疫苗，对于防控具有一定效果；后来在组织中加入经处理的支原体培养物，制成灭活疫苗，结果表明对羊支原体肺炎具有有效保护。但组织灭活苗由于其需用羊病肺组织，易被细菌污染，且质量难以控制。后续疫苗研究相关文献报道支原体增殖后，测定生长滴度并进行超滤浓缩，使绵羊肺炎支原体菌液浓度达到6.0×10⁸-10.0×10⁸CCU/mL，然后再进行配苗，具有较好免疫保护效果。但疫苗制备中抗原需要浓缩，导致了疫苗制备周期长，成本高，杂蛋白浓度上升，影响了该疫苗的生产和应用。因此，急需可用纯培养物且不需要浓缩即可制备疫苗的菌株和工艺，来制备具有良好保护效力的疫苗，满足市场需求。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种绵羊肺炎支原体强毒株。

本发明还要解决的技术问题是提供上述绵羊肺炎支原体强毒株在建立绵羊肺炎支原体感染发病模型中的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述绵羊肺炎支原体强毒株在制备治疗绵羊肺炎支原体感染引起疾病药物中的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株绵羊肺炎支原体强毒株，所述绵羊肺炎支原体的分类命名为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)NJ01株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCCNO：M 2020907。该菌株是发明人于2018年于南京某羊场自行采集病料，经分离、纯化和鉴定，获得一株绵羊肺炎支原体。

在一些实施方式中，所述绵羊肺炎支原体的热应激蛋白70与其他绵羊肺炎支原体的相似性为95.76％-98.51％。

在一些典型实施方式中，所述绵羊肺炎支原体的热应激蛋白70的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了一种绵羊肺炎支原体强毒株在建立绵羊肺炎支原体感染发病模型中的应用。

在一些实施方式中，所述绵羊肺炎支原体强毒株为绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae)NJ01株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2020907。该菌株是发明人于2018年于南京某羊场自行采集病料，经分离、纯化和鉴定，获得一株绵羊肺炎支原体。

在一些实施方式中，所述的应用为将所述绵羊肺炎支原体感染发病模型用于研究绵羊肺炎支原体的致病机制。

在一些实施方式中，所述的应用为将所述绵羊肺炎支原体感染发病模型用于评估绵羊肺炎支原体疫苗的效力。

在一些实施方式中，所述的应用为将所述绵羊肺炎支原体感染发病模型用于抗绵羊肺炎支原体感染药物的评价。

在一些实施方式中，所述绵羊肺炎支原体感染发病模型的建立方法为采用所述绵羊肺炎支原体强毒株的攻毒制剂进行攻毒感染。

在一些实施方式中，绵羊肺炎支原体强毒株的攻毒制剂为绵羊肺炎支原体强毒株培养物和/或绵羊肺炎支原体强毒株制备的其他攻毒制剂。

在一些实施方式中，所述感染的途径为气管内注射。

在一些更典型实施方式中，每只羊气管内注射绵羊肺炎支原体培养物3-6mL，观察临床症状，剖检观察肺病变，可见典型的肺病变。

在一些实施方式中，所述绵羊肺炎支原体强毒株攻毒制剂的活性成分为上述绵羊肺炎支原体强毒株。

在一些实施方式中，所述绵羊肺炎支原体强毒株攻毒制剂中，绵羊肺炎支原体强毒株的浓度为10⁵CCU/mL以上。

在一些实施方式中，所述绵羊肺炎支原体强毒株培养物采用支原体液体培养基进行培养制备。

在一些实施方式中，所述绵羊肺炎支原体强毒株培养物的培养方法包括如下步骤：

(1)将绵羊肺炎支原体NJ01株按照1:3-1:10的体积比接种支原体液体培养基，在36-38℃下培养24-72h传代，待培养物变成橙黄到黄色时，得到第一代培养物；

(2)将第一代培养物以1:5以上的体积比接种支原体液体培养基中，在36-38℃下培养24-72h传代，待培养物变成橙黄到黄色时，得到第二代培养物；

(3)重复第(2)步继续传代，待培养物变成橙黄到黄色时，收获即得。

在一些实施方式中，步骤(1)和步骤(2)所述培养为静置培养。

在一些实施方式中，步骤(2)中，将第一代培养物以1:5-1:10以上的体积比接种支原体液体培养基中。

在一些实施方式中，步骤(2)中，重复第(2)步，继续传1-5代。

在一些实施方式中，所述支原体液体培养基中各组分含量及制备方法为：Eagles液40％-50％v/v，水解乳蛋白0.005-0.02g/mL，pH 7.4的磷酸盐缓冲液30％-40％v/v，0.04g/mL酚红0.15％-0.2％v/v；用NaOH调pH值为7.4-7.6，高压灭菌后，加入无菌血清10％-20％v/v，鲜酵母浸出汁1％-2％v/v(鲜酵母浸出汁参考张瑞婷等.酵母浸出液提取方法的改进.中国兽药杂志.1998年02期的方法制备)。

为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了一种绵羊肺炎支原体强毒株在制备治疗羊支原体肺炎药物中的应用。

在一些实施方式中，所述绵羊肺炎支原体强毒株的分类命名为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)NJ01株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2020907。

在一些实施方式中，所述药物为疫苗或抗血清。

在一些实施方式中，所述疫苗由所述绵羊肺炎支原体强毒株的培养物配置而成，每头份包含如下组分：绵羊肺炎支原体强毒株NJ01株不低于2.86×10⁸CCU，免疫佐剂5％-75％g/g。

在一些实施方式中，所述的免疫佐剂为注射用白油、MONTANIDE ISA206VG、ISA201VG、Gel 01ST、ISA 11R或ISA 760VG等。

在一些实施方式中，步骤(1)和步骤(2)所述培养为静置培养。

在一些实施方式中，步骤(2)中，将第一代培养物以1:5-1:10的体积比接种支原体液体培养基中。

在一些实施方式中，步骤(2)中，重复第(2)步，继续传1-5代。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1)本发明所提供的菌株绵羊肺炎支原体NJ01株毒力强，通过气管内注射培养物或制剂即可引起发病。

2)本发明的绵羊肺炎支原体强毒株培育采用的支原体培养基，其制备简便、成本低、培养支原体变色快且滴度高。

3)本发明所提供的菌株绵羊肺炎支原体NJ01株可通过1:3-1:10接种支原体液体培养基复苏，然后在36-38℃下培养变橙色时迅速以1:5以上的体积比接种传代，连续传代后，培养12-72h即可变色，含量达到10¹⁰CCU/mL，这为绵羊肺炎支原体攻毒制剂的制备节约了成本和时间，提高了效率。

4)本发明的绵羊肺炎支原体强毒株及其在感染发病试验中的应用及其方法，能较好的满足目前绵羊肺炎支原体致病机制的研究，疫苗效力评价，药物制剂筛选的迫切需要，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

5)用本发明的绵羊肺炎支原体强毒株制备的治疗羊支原体肺炎药物，如疫苗具有良好的安全性和保护力，能满足目前市场上对高效疫苗的迫切需要，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会和生态效益。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为基于绵羊肺炎支原体热应激蛋白70的进化树；其中，阴影部分为绵羊肺炎支原体NJ01株。

图2为绵羊肺炎支原体强毒株NJ01感染发病羊肺病变。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明作进一步的说明，而非对本发明进行限制。

下述实施例为在一些实施方式中的所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：绵羊肺炎支原体NJ01株的获得及培养鉴定

1.菌株分离及培养

从南京某羊场有疑似羊支原体肺炎特征的羊中进行筛选，采集羊支原体肺炎特征典型的病羊，无菌采集其肺脏，用支原体液体培养基直接打入细支气管，再从中吸取，获得支气管灌洗液。灌洗液可直接用孔径为0.45μm的滤器进行过滤后，按1：1和1：10稀释接种支原体液体培养基，37℃静置培养，待培养物颜色由红变橙黄色或黄色时，进行传代，如此连续传5代，生长稳定后接种支原体固体培养基进行纯化，克隆纯化后，接种支原体液体培养基，变黄后收获培养物进行特性鉴定。

2.菌株鉴定

培养物瑞氏染色镜检，其形态为环状、球状等多形态微生物，无细胞壁，革兰氏染色阴性。培养物在含0.5％葡萄糖的培养基中培养时，颜色可由红色变成黄色，表明其发酵葡萄糖培养基产酸。培养物在支原体液体培养基上生长良好，37℃培养1-5天，培养物pH下降至6.6-6.8，轻度浑浊。培养物经变色单位测定其浓度可达10⁹CCU/mL。培养物接种支原体固体培养基，37℃培养3-7日后，可见乳头状菌落。

3.测序分析

参考Bin Zhang,etal.Molecular characterization of the heat shockprotein 70gene in Mycoplasma ovipneumoniae,The Veterinary Journal 198(2013)299–301报道的绵羊肺炎支原体全热休克蛋白70(heat shock protein 70，Hsp70)基因的引物进行PCR，并进行测序，序列结果见序列SEQID NO：1所示。与已报道序列进行Blast比对，与已报道序列进行Blast比对，相似性达95.76％-98.51％，结果见表1。进化树分析结果见图1基于绵羊肺炎支原体的热应激蛋白70的核苷酸序列的进化树。

表1 Blast比对结果

4.菌株保藏

菌株送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏信息如下：分类命名：绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)NJ01株；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2020年12月14日；保藏编号为CCTCC NO：M 2020907。

实施例2：绵羊肺炎支原体培养试验

1.材料

绵羊肺炎支原体NJ01株；保藏编号为CCTCC NO：M 2020907。绵羊肺炎支原体IK3-3株，保藏编号为CVCC 380。

支原体培养基配方及制备方法为：Eagles液50％(v/v)，水解乳蛋白0.02g/mL，磷酸盐缓冲液(pH 7.4)28.8％(v/v)，0.04g/mL酚红0.2％(v/v)；用NaOH调pH值为7.4-7.6，高压灭菌后，加入无菌马血清20％(v/v)，鲜酵母浸出汁1％(v/v)。其中，所述的鲜酵母浸出汁参考“张瑞婷等.酵母浸出液提取方法的改进.中国兽药杂志.1998”。

2.培养试验

(1)把冻存于-20℃的菌株(绵羊肺炎支原体NJ01株和IK3-3株)分别取出，解冻后以1:3的体积比接种于支原体液体培养基，37℃静置培养至培养物颜色变橙黄时，得到第一代培养物；

(2)立即再按1:5的体积比，将第一代培养物接种于支原体液体培养基中，在37℃下静置培养至培养物颜色变橙黄时，得到第二代培养物；

(3)按照步骤(2)的方法再传5代(与步骤(2)的区别在于，接种体积比更改为1:10)，培养物变橙黄-黄色时收获，-20℃以下保存，分别得到绵羊肺炎支原体NJ01株、IK3-3株的培养物，同时测定培养物的含量(颜色变化单位，CCU)。

(4)取已传5代或7代的培养物，按体积比1:10各接种6支，其中3支37℃静置培养，另3支放置于37℃、160r/min的恒温空气浴摇床中培养，培养物颜色变黄时，测定培养物的含量(颜色变化单位，CCU)。

3.结果

表2 NJ01株复苏传代变色时间及含量

1代

2代

3代

4代

5代

6代

7代

接种比例(V/V)

1:3

1:5

1:10

变色时间(h)

18

12

18

12

10

CCU含量(CCU/mL)

109

1010

表3 IK3-3株复苏传代变色时间及含量

1代

2代

3代

4代

5代

6代

7代

接种比例(V/V)

1:3

1:5

1:10

变色时间(h)

96

72

CCU含量(CCU/mL)

未测

107

108

表4 NJ01株静置和振荡培养变色时间及含量

由上表结果可见，NJ01株复苏传代3-5代后可在12-18h变色，含量可到10¹⁰CCU/mL，在生长速度和含量上高于IK3-3株。由表4可见，NJ01株静置培养与振荡培养变色时间和含量无差异。

实施例3：绵羊肺炎支原体强毒株感染发病试验

1.材料

绵羊肺炎支原体NJ01株，保藏编号为CCTCC NO：M 2020907。绵羊肺炎支原体IK3-3株，保藏编号为CVCC 380。

按照实施例2所述的方法，采用支原体液体培养基分别培养绵羊肺炎支原体NJ01株和IK3-3株，得到两个支原体的培养物。用支原体液体培养基将各毒株培养物调整浓度至10⁷-10⁸CCU/mL，作为攻毒制剂。

2.攻毒试验

将健康试验山羊随机分为3组，每组4头；第一组(NJ01株攻毒组)用NJ01株培养物(10⁷CCU/mL)进行攻毒，第二组(IK3-3株攻毒组)用IK3-3株培养物(10⁸CCU/mL)进行攻毒，攻毒方式均为气管内注射方式，攻毒剂量均为每头山羊气管内注射4mL。第三组(健康对照组)气管内注射4mL支原体培养基。

NJ01株感染组羊在感染后5-7d出现咳嗽等症状，第14d出现打喷嚏、咳嗽等较为严重的呼吸道症状，并持续到第28d。IK3-3感染组羊在感染后7d后，出现轻微咳嗽，21d后最为严重的呼吸道症状，后减轻。对照组无症状。

攻毒28日后，剖检所有试验山羊，观察肺病变，按羊支原体肺炎肺病变指数记分标准判定。羊支原体肺炎肺病变指数记分标准为：试验山羊剖检后，分别观察肺组织左尖叶、左心叶、左膈叶、右尖叶、右心叶、右膈叶和副叶的背面和腹面发生胰样肉变的实变的平均肺面积占该肺叶面积的百分比；将面积比在1％到25％之间的记为1分，在26％到50％之间的记为2分，在51％到75％之间的记为3分，在76％到100％之间的记为4分；各肺叶评定的记分相加即为该羊的肺病变指数记分，最高为28分。结果如表5和图2，NJ01株培养物接种山羊肺部出现典型的羊支原体肺炎病变，且肺病变指数与对照组相比差异显著(P<0.05)，其发病程度显著高于IK3-3株培养物攻毒，说明NJ01株具有较强的毒力、且毒力高于IK3-3株，NJ01株培养物可用于羊支原体肺炎感染发病模型的建立，该模型可用于绵羊肺炎支原体的致病机制研究，也可在绵羊肺炎支原体疫苗效力评价和药物治疗效果评价的动物感染试验中用于攻毒。

另外，统计各组试验山羊攻毒后病变肺数量，结果如表6所示。从表6可以看出，本发明NJ01株攻毒后，4头山羊中有4个肺均发生病变，且肺病变指数显著高于IK3-3株攻毒组，说明NJ01株具有较强的毒力、且毒力高于IK3-3株。

表5不同毒株培养物攻毒后山羊支原体肺炎肺部病变指数

攻毒毒株	攻毒剂量	肺病变指数
			NJ01株	4×10<sup>7</sup>CCU/只	12±4.1<sup>a</sup>
IK3-3株	4×10<sup>8</sup>CCU/只	5±3.6<sup>b</sup>
			健康对照组	0CCU/只	0±0<sup>c</sup>

注：表5中肺病变指数表示为平均值±标准差；a、b、c表示每组之间两两比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著(p＜0.05)。

3.攻毒山羊病变肺中绵羊肺炎支原体的再分离

应用实施例1中菌株分离及培养方法从攻毒山羊病变肺中进行绵羊肺炎支原体的再分离和鉴定。经过支原体培养基盲传培养，观察培养物颜色变化、涂片镜检并参考BinZhang,etal.Molecular characterization of the heat shock protein 70gene inMycoplasma ovipneumoniae,The Veterinary Journal 198(2013)299–301报道的绵羊肺炎支原体扩增热休克蛋白70基因的方法进行PCR鉴定，考察各毒株是否能够再次分离。

结果如表6所示，NJ01株攻毒的4头山羊病变肺均再次分离到绵羊肺炎支原体NJ01株，而IK3-3株攻毒的4头山羊中3头分离到绵羊肺炎支原体。试验结果表明，绵羊肺炎支原体NJ01株的毒力强、致病性高，因而肺部病变明显，再次分离率也较高。

表6攻毒后山羊肺炎支原体再分离结果

攻毒组	病变肺个数	PCR鉴定为阳性的肺个数	羊肺炎支原体分离率
				NJ01株	4	4	4/4
IK3-3株	3	3	3/4

实施例4攻毒制剂组织毒的制备

1.攻毒发病

按照实施例3绵羊肺炎支原体强毒株感染发病试验中的感染方法将绵羊肺炎支原体强毒株NJ01株感染健康山羊，在攻毒后28日，扑杀试验羊，采集肺部有明显羊支原体肺炎特征病变的肺脏组织样品，参考Bin Zhang,etal.Molecular characterization of theheat shock protein 70gene in Mycoplasma ovipneumoniae,The Veterinary Journal198(2013)299–301报道的绵羊肺炎支原体全热休克蛋白70(heat shock protein 70，Hsp70)基因的引物进行PCR，并进行测序鉴定。测序符合NJ01株特征的阳性肺组织样品用于制备羊支原体肺炎疫苗效力检验中用于攻毒的攻毒制剂。

2.攻毒制剂组织毒制备

将符合组织强毒制备要求的肺脏组织用无菌PBS冲洗肺脏表面，沥干后，用灭菌剪刀将肺脏组织剪碎成小块，按质量比1：4将肺脏组织与Hank’s液混合，放入消毒好的匀浆机中匀浆，过滤收集滤液。将滤液与冻干保护剂(如：含有1.5％(w/v)明胶和12.5％(w/v)蔗糖的水溶液)按体积比1.5：1进行充分混匀，加入终浓度均为1000单位/mL的青霉素及链霉素，充分混匀，获得NJ01株的攻毒用组织强毒。将攻毒用组织强毒悬液无菌加入到灭菌瓶中，冷冻干燥，获得各毒株组织强毒冻干物，检验冻干物理性状合格，做好标记，-20℃保存备用。

实施例5：绵羊肺炎支原体灭活疫苗制备

1.材料

绵羊肺炎支原体NJ01株，保藏编号为CCTCC NO：M 2020907。埃索Marcol 52白油。

2.制苗

2.1抗原制备及灭活

按照实施例2所述的方法，采用支原体液体培养基培养绵羊肺炎支原体NJ01株，得到支原体的第5代培养物。按照中国兽药典的规定进行纯粹检验和含量测定。

将检验合格的制苗用菌液加入终浓度为0.005％的硫柳汞，37℃进行灭活。灭活检验合格后用于配苗。

2.2配苗

每头份1mL含灭活前绵羊肺炎支原体2.86×10⁸CCU，配苗比例由所用佐剂决定(免疫佐剂在疫苗中的重量百分含量为5％-75％)，抗原不足部分用PBS补足。

2.2.1注射用白油的配苗及混合

取注射用白油94份(重量比)，司本-80 6份，加入油相罐中，搅拌均匀，经121℃灭菌30分钟，冷却至室温备用。取灭活检验合格的菌液96份，吐温-80 4份，加入水相罐中，搅拌混匀备用。将油相2-3份加入乳化罐中，先低速搅拌30分钟，再缓慢加入1份水相，继续搅拌均匀，用高速剪切机进行乳化，制成油包水型乳液。

2.2.2ISA 206VG(SEPPIC)、ISA 201VG(SEPPIC)、Gel 01ST(SEPPIC)、ISA 11R VG(SEPPIC)的配苗及混合

按照说明书进行配苗和混合。如ISA 201VG，按抗原和佐剂重量比50：50配苗，将佐剂预热至31℃，用低剪切力搅拌，维持在30℃，加抗原(水相)到佐剂中，搅拌均一即可。如ISA 11R VG，按佐剂和抗原重量比15：85的比例配比，在室温或更低温度下将抗原水相加入佐剂中用低剪切力搅拌器搅拌均一即可。如Gel 01ST，佐剂按10％配苗，在室温或更低温度下将抗原水相加入佐剂中用低剪切力搅拌器搅拌均一即可。

3.成品检验

3.1性状

应符合所属剂型。用注射用白油制备疫苗为油包水型，用ISA 201VG制备疫苗为水包油再包水型，用ISA 11R VG制备疫苗为水包油型，用Gel 01ST制备疫苗为水剂型。

3.2稳定性

吸取疫苗10mL加入离心管，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相均不超过0.5mL。

3.3黏度

按现行《中国兽药典》附录进行检验，均不超过200cP。

3.4无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。

实施例6：绵羊肺炎支原体灭活疫苗的免疫试验

1.材料

待试疫苗：羊支原体肺炎灭活疫苗(NJ01株)油佐剂(每头份含绵羊肺炎支原体NJ01株2.86×10⁸CCU)，按照实施例5的方法制备。

同类疫苗：国内某公司生产的山羊支原体肺炎灭活疫苗(MoGH3-3株+M87-1株)(每头份含绵羊肺炎支原体MoGH3-3株4×10⁸CCU)。

绵羊肺炎支原体株组织强毒，按照实施例4的方法制备。

3月龄健康易感羊15只。

2.试验设计

疫苗免疫组：待试疫苗免疫羊：用待试疫苗免疫羊5只，每只1mL。

疫苗免疫组：同类疫苗免疫羊：按疫苗说明书，将同类疫苗每只皮下注射3mL疫苗。

同时设立条件相同的羊作攻毒对照组和健康对照组各5只。

疫苗免疫后28日内观察临床反应。在首免后35日，疫苗免疫组和攻毒对照组进行攻毒试验，每只羊气管内注射实施例4制备的绵羊肺炎支原体株组织强毒5mL，攻毒28日后剖检，统计肺部病变记分，计算肺病变指数减少率。

3.临床反应观察

试验羊在注射疫苗后观察28日，结果待试疫苗免疫羊未见不良反应，同类疫苗免疫羊有2只羊在免疫后出现精神不振，但在免疫后三日内均恢复正常。未见其它异常临床反应。

4.效力比较试验

试验羊攻毒28日后内观察，发现攻毒对照组中有5只羊出现不同程度的咳嗽，待试疫苗免疫羊均未见咳嗽等羊支原体肺炎特征性症状，同类疫苗免疫羊有2只出现轻微咳嗽等羊支原体肺炎特征性症状。

攻毒28日后剖检，观察肺病变，结果攻毒对照组5只羊均出现典型病变，说明实施例4制备的攻毒制剂可以发病，可用于绵羊肺炎支原体灭活疫苗的免疫效力等试验；待试疫苗羊支原体肺炎灭活疫苗(NJ01株)的免疫组均未出现典型病变，同类疫苗免疫组中2只出现轻微病变。

实施例7绵羊肺炎支原体抗血清制备及代谢抑制试验

1.材料

绵羊肺炎支原体NJ01株；保藏编号为CCTCC NO：M 2020907。绵羊肺炎支原体Y98株，参考株。

支原体培养基配方及制备方法为：Eagles液50％(v/v)，水解乳蛋白0.02g/mL，磷酸盐缓冲液(pH 7.4)28.8％(v/v)，0.04g/mL酚红0.2％(v/v)；用NaOH调pH值为7.4-7.6，高压灭菌后，加入无菌马血清20％(v/v)，鲜酵母浸出汁1％(v/v)。其中，所述的鲜酵母浸出汁参考“张瑞婷等.酵母浸出液提取方法的改进.中国兽药杂志.1998年02期”的方法制备。

清洁级新西兰大白兔，金陵种兔场。

2.兔抗绵羊肺炎支原体高免血清的制备

2.1免疫原制备

(1)取绵羊肺炎支原体NJ01株接种于支原体液体培养基中，37℃培养，进行复壮和扩大培养，待培养基变黄色(pH值6.6-7.0)收获培养物，测定CCU含量。

(2)将步骤(1)所得培养物高速离心，所得沉淀物为浓缩后的菌体，PBS洗涤，浓缩洗涤后菌体，进行超声破碎，测定蛋白含量，蛋白含量达3mg/mL以上，作为蛋白抗原。

(3)将步骤(2)制备的蛋白与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，按说明书无菌进行乳化，制备绵羊肺炎支原体NJ01株弗氏完全佐剂制剂和绵羊肺炎支原体NJ01株弗氏不完全佐剂制剂。

(4)按照步骤(1)-(3)，制备绵羊肺炎支原体Y98株弗氏完全佐剂制剂和绵羊肺炎支原体Y98株弗氏不完全佐剂制剂。

2.2高免血清制备

首免当日，新西兰大白兔背部皮下多点注射1mL绵羊肺炎支原体NJ01株弗氏完全佐剂制剂；首免后14日，在兔背部皮下多点注射1mL绵羊肺炎支原体NJ01株弗氏不完全佐剂制剂；首免后21、28和35日，分别在兔腿部肌肉注射1mL蛋白抗原。首免后42日采血，分离血清，无菌过滤，检验后，制备成兔抗绵羊肺炎支原体NJ01株高免血清。

按照上述方法制备兔抗绵羊肺炎支原体Y98株高免血清。

3.兔抗绵羊肺炎支原体高免血清检测试验

参考文献(孙亚波等不同动物高免血清对猪肺炎支原体的代谢抑制作用研究.中国兽药杂志，2016，50(12):7-11)的方法进行。

将绵羊肺炎支原体培养物进行10倍比稀释至10^-10(具体稀释浓度如表7所示)；将兔抗绵羊肺炎支原体高免血清用支原体液体培养基稀释到1/10，即兔抗绵羊肺炎支原体高免血清占兔抗绵羊肺炎支原体高免血清与支原体液体培养基总体积的10％。

将稀释后的各个绵羊肺炎支原体培养物加入等体积的稀释后的兔抗绵羊肺炎支原体高免血清混匀，作为试验组，于37℃培养；同时，将绵羊肺炎支原体培养物测定CCU含量；另设支原体液体培养基作培养基对照组，于37℃静置培养；2日内无新增变色时判定结果。空白对照应不变色，根据CCU含量测定结果和试验组变色情况即可判定为抗血清的抗绵羊肺炎支原体代谢抑制价(血清变色稀释度/CCU变色稀释度)。

4.结果

兔抗绵羊肺炎支原体高免血清检测试验，于37℃培养，变色情况见表6。

表7兔抗绵羊肺炎支原体高免血清抗绵羊肺炎支原体代谢抑制价测定结果

由结果可见，培养基对照组不变色，NJ01株的含量为10⁹CCU/mL，NJ01株测定抗血清组种10^-1-10^-6稀释度变色，10^-7-10^-9稀释度未变色，兔抗绵羊肺炎支原体高免血清的代谢抑制价为10³。Y98株的含量为10⁸CCU/mL，试验成立；Y98株测定抗血清10^-1-10^-5稀释度变色，10^-6-10^-8稀释度未变色，兔抗绵羊肺炎支原体高免血清的代谢抑制价为10³。由此可见，绵羊肺炎支原体NJ01株和Y98株测定兔抗绵羊肺炎支原体高免血清的代谢抑制价结果相同，而NJ01株含量高于Y98株，且培养停止变色的时间也较早于Y98株。因此，NJ01株用于评价血清等制剂对绵羊肺炎支原体等抑制作用中准确且省时。

本发明提供了一株绵羊肺炎支原体强毒株及其在感染发病和制备治疗羊支原体肺炎药物中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的实施方式之一，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一株绵羊肺炎支原体强毒株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1815

<212> DNA

<213> 热应激蛋白70 (HSP70)

<400> 1

atgaaaggaa aacataatat ggcaaaagaa ataattttag gtattgactt aggaacaaca 60

aactcagttg ttgcaattat tgaaaatcaa aaacctgttg ttcttgaaaa tcctaacgga 120

aaaagaacaa ctccttctgt tgttgccttt aaaaatggtg aggaaattgt tggtgatgcg 180

gcaaaacgtc aactagaaac taacccagaa gcaatcgcat ctgttaaaag attaatgggt 240

agcgataaaa ctgttcgtgc taaccaaaga gactataaac ccgaagaaat ttcagcaaaa 300

attcttgctt atttaaaaga atatgctgaa aaaaagattg gtcacaaagt ttcaaaagct 360

gttatcacag ttcctgctta ttttgataat gctcaacgtg aagcgacaaa aaatgccgga 420

aaaatcgcag gattagaagt tgaaagaata attaacgaac caacagctgc cgcacttgca 480

tttggtcttg acaaaaccga aaaagaaatg aaagtgcttg tttatgactt aggtggtgga 540

acttttgacg tttcagttct tgaattatct aacggaactt ttgaagtttt atcaacaagt 600

ggtgataacc atttaggtgg tgatgactgg gataatcaaa ttgttgactg aatggttaaa 660

agaattaaag aagagtacga ttttgatgca aaaagtgaca aaatggcact tactcgtcta 720

aaagaagaag ctgaaaaaac caaaattaac ctatcaaatc aaagtgtttc aacaatttcc 780

ttaccatttt taggtctagg aaaaaatggt ccaattaacg ttgaacttga actaaaaaga 840

tcagactttg aaaaaatgac agctcaccta attgaccgaa caagaaaacc aatcgttgat 900

gccttaaaac aagcaaaaat tgaagcaagt gagcttgacg aggttcttct tgttggtgga 960

tcaacacgta tgccagctgt tcagacaatg attgaacaca ctttaaataa aaagccaaat 1020

cgttcaataa atcctgatga agttgtggca attggagctg caattcaagg tggagttctt 1080

gctggagaaa ttagtgatgt tttattactt gacgttactc ctttaacttt aggaattgaa 1140

accttaggtg gagtttcaac cccgttaatt ccaagaaata caacaattcc ggtaacaaaa 1200

tcacaaattt tctcaacagc tgaagacaat caaaccgaag ttacaatttc tgtagtccaa 1260

ggtgaaagac aacttgctgc tgataacaaa atgttaggtc gctttaatct ttcaggaatc 1320

gagcctgctc ctcgtggtct tccacaaatt gaagttagtt tttcaattga cgtcaacggt 1380

attacaactg tttcagcaaa agataaaaaa actggaaaag aacaaacaat cacaattaaa 1440

aatacttcaa ctttatctga agaagaaatt aacagaatga ttcaagaagc cgaagaaaat 1500

cgtgaagctg atgcaatcaa aaaagataaa attgaaacaa cagttcgtgc cgaaggtctt 1560

attaatcaac ttgaaaaatc aataactgat caaggtgaaa aaattgatcc taaacaaaaa 1620

gaacttcttg aaaaacaaat tcaagaactc aaagatcttt taaaagaaga aaaaattgac 1680

gaactaaaaa caaaattaga ccaaattgag caagcagccc aagcttttgc ccaagcaagc 1740

gctcaacaag ctaacagtgc aagtgaaact gattcagatt caaacacaat tgatgctgaa 1800

atcaaacaaa attaa 1815

Claims

1.一株绵羊肺炎支原体强毒株，其特征在于，所述绵羊肺炎支原体的分类命名为绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae）NJ01株，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2020907，保藏日期为2020年12月14日。

2.一株绵羊肺炎支原体强毒株在建立绵羊肺炎支原体感染发病模型中的应用，其特征在于，所述绵羊肺炎支原体强毒株为权利要求1所述绵羊肺炎支原体强毒株。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述绵羊肺炎支原体感染发病模型用于研究绵羊肺炎支原体的致病机制，或用于评估绵羊肺炎支原体疫苗的效力。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述绵羊肺炎支原体感染发病模型用于非治疗目的的抗绵羊肺炎支原体感染药物的评价。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述绵羊肺炎支原体感染发病模型的建立方法为采用所述绵羊肺炎支原体强毒株的攻毒制剂进行攻毒感染；其中，所述绵羊肺炎支原体强毒株的攻毒制剂为绵羊肺炎支原体强毒株培养物和/或绵羊肺炎支原体强毒株制备的其他攻毒制剂；其中，所述感染的途径为气管内注射。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述攻毒制剂中，所述绵羊肺炎支原体强毒株的浓度为10⁵CCU/mL以上。

7.一株绵羊肺炎支原体强毒株在制备治疗羊支原体肺炎药物中的应用，其特征在于，所述绵羊肺炎支原体强毒株为权利要求1所述绵羊肺炎支原体强毒株。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗或抗血清。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疫苗由所述绵羊肺炎支原体强毒株的培养物配置而成，每头份包含如下组分：绵羊肺炎支原体强毒株NJ01株不低于2.86×10⁸CCU，免疫佐剂5%-75% g/g。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述绵羊肺炎支原体强毒株培养物的培养方法包括如下步骤：

（1）将绵羊肺炎支原体NJ01株按照1:3-1:10的体积比接种支原体液体培养基，在36-38℃下培养24-72 h传代，待培养物变成橙黄-黄色时，得到第一代培养物；

（2）将第一代培养物以1:5以上的体积比接种支原体液体培养基中，在36-38℃下培养24-72 h传代，待培养物变成橙黄-黄色时，得到第二代培养物；

（3）重复第（2）步继续传代，待培养物变成橙黄-黄色时，收获即得。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述支原体液体培养基中各组分含量及制备方法为：Eagles液40%-50% v/v，水解乳蛋白0.005-0.02 g/mL，pH 7.4的磷酸盐缓冲液30%-40% v/v，0.04 g/mL酚红0.15%-0.2% v/v；用NaOH调pH值为7.4-7.6，高压灭菌后，加入无菌血清10%-20% v/v，鲜酵母浸出汁1%-2% v/v。