CN112481154B - 一种绵羊肺炎支原体疫苗株、由该疫苗株制备得到的疫苗组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绵羊肺炎支原体菌株、由该菌株制备得到的疫苗及其应用。所述的绵羊肺炎支原体菌株是在发病绵羊上分离得到的，命名为WM01株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.19979。将本发明分离得到的绵羊肺炎支原体WM01F6株制成灭活疫苗，或与羊副流感病毒3型制成二联灭活疫苗，安全性试验表明，单苗和二联苗的所有试验绵羊在接种疫苗后均无局部和全身不良反应。效力试验结果表明，疫苗免疫试验动物后，对强毒攻击可产生较好的保护作用，保护率至少为80％。因此，本发明的提出为预防羊呼吸道疾病提供了有效的技术手段。

Description

一种绵羊肺炎支原体疫苗株、由该疫苗株制备得到的疫苗组 合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种从绵羊上分离的绵羊肺炎支原体，以及用该菌株制备的用于预防羊呼吸道疾病的疫苗组合物及其应用。本发明属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

我国是养羊大国，养羊数量居世界首位。其中绵羊存栏约1.6亿只，山羊存栏1.4亿只，并且绵羊的数量逐渐增加。其中内蒙古地区绵羊存栏量大约4500万只，山羊存栏1700万只，均居全国第一位。当前，我国养羊业仍存在小散的局面，随着羊集约化规模化养殖业的不断发展，疾病问题将严重影响羊的健康养殖。

绵羊支原体肺炎又称为绵羊传染性胸膜肺炎，是由绵羊肺炎支原体(Mycoplasmovipneumoniae,MO)引起的绵羊和山羊肺炎临床表现。该病是绵羊和山羊养殖过程中最为严重的一种支原体疾病，MO是引起绵羊和山羊的重要病原，支原体感染所致的羊肺炎的病死率达到35％～50％，给我国羊养殖业带来巨大的危害(王军2019,穆国冬,张忠湛等.2020，吴锦艳,尚佑军等.2017,韩林梅,吴翠兰等.2018,杜鹏2019,杜奕州,郗宇等.2019)。目前，我国已经分离到引起羊肺炎的支原体主要有三种：丝状支原体山羊亚种(MMC)、山羊支原体肺炎亚种(MCCP)和绵羊肺炎支原体(MO)。MMC和MCCP是引起山羊传染性胸膜肺炎的主要病原。MO既能感染绵羊，也可感染山羊。过去一段时间以来，人们一直认为，MO感染羊后不会出现典型的临床症状，因此，MO在过去一段时间一直不受重视。近些年来，许多研究证实，羊感染MO后，发病羊出现以高热、咳嗽、渐进性消瘦和间质性肺炎等临床症状，危害巨大。临床研究发现，支原体作为羊肺炎最重要的病原之一，常常与其他病原混合感染，已经从发生肺炎的绵羊体内分离到副流感3型病毒、巴氏杆菌等，严重绵羊影响养殖业的发展。

由于临床发病羊肺炎支原体分离难度较大，鉴别诊断有一定的难度，给羊肺炎的治疗和预防带来一定的困难。

目前，我国已经有相关的山羊支原体肺炎灭活疫苗，但在实际临床免疫中发现，山羊支原体肺炎疫苗对绵羊的保护力有限。公开号为CN111690554A，发明名称为“用于制备羊支原体肺炎疫苗的组合菌株、羊支原体肺炎三价灭活疫苗及其制备方法”的专利申请和公开号为CN111514285A，发明名称为“一种羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗”的专利申请，上述两个专利均含有绵羊肺炎支原体菌株，但并不包括有绵羊副流感。研究表明，副流感3型病毒是造成羊呼吸道疾病的重要病原，且与绵羊肺炎支原体往往存在混合感染。因此，本发明针对临床上羊呼吸道疾病绵羊肺炎支原体、副流感3型病毒混合感染的特点，开发出一种以绵羊肺炎支原体为基础的，包含羊副流感病毒的二联疫苗，能够更全面的用于羊呼吸道疾病的防治，达到“一针多效”的目的。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种在发病绵羊上分离得到的一株绵羊肺炎支原体；

本发明的目的之二在于提供上述绵羊肺炎支原体在制备疫苗中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种用于由羊肺炎支原体、副流感3型组成的二联疫苗及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种绵羊肺炎支原体(Mycoplasm ovipneumoniae,MO)菌株，是在发病绵羊上分离得到，所述的绵羊肺炎支原体菌株命名为WM01 F6株，分类命名为绵羊肺炎支原体(Mycoplasm ovipneumoniae)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.19979。

一种疫苗组合物，其含有本发明所述的绵羊肺炎支原体疫苗株。

其中，优选的，所述的疫苗组合物中含有所述的绵羊肺炎支原体疫苗株的含量不低于5×10⁸CCU/ml。

其中，优选的，所述疫苗组合物进一步含有疫苗佐剂。

其中，优选的，所述的疫苗组合物中还含有小反刍兽疫病毒、羊痘病毒、羊口疮病毒、羊副流感病毒、巴氏杆菌以及曼氏杆菌中的一种或多种抗原，所述抗原为全病毒或全菌，或是经修饰后的上述病毒或菌株的抗原；所述的抗原为死的或经减毒后的抗原，死的抗原包括经灭活或本领域常见表达系统表达的蛋白，减毒的方法包括人工自然传代致弱或基因工程手段构建。

进一步的，本发明还提出了所述的疫苗组合物在制备由绵羊肺炎支原体、小反刍兽疫病毒、羊痘病毒、羊口疮病毒、羊副流感病毒、巴氏杆菌以及曼氏杆菌中的一种或多种抗原引起的疫病，尤其是呼吸道疾病疫苗中的应用。

其中，优选的，所述的疫苗为灭活疫苗或亚单位疫苗。

更进一步的，本发明还提出了一种绵羊肺炎支原体-羊副流感病毒3型二联灭活疫苗，所述的疫苗中含有灭活后的所述的绵羊肺炎支原体疫苗株以及羊副流感病毒3型疫苗株。

其中，优选的，所述的羊副流感病毒3型疫苗株为绵羊源的羊副流感病毒3型疫苗株，命名为CRV3-TX01株，分类命名为山羊副流感病毒(Caprine parainfluenza virus)。保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.19970，保藏时间为2020年8月21日。根据国际病毒分类委员会2019年最新分类报告，该病毒为副黏病毒科(Paramyxoviridae)，呼吸道病毒属(Respirovirus)，山羊呼吸道病毒3型(Caprinerespirovirus 3)种。该病毒原也称为羊副流感病毒3型病毒(Caprine parainfluenzavirus 3，CPIV3)。因此，本发明中所提到的CRV3和CPIV3为同一病毒。

再进一步的，本发明还提出了一种制备所述的绵羊肺炎支原体-羊副流感病毒3型二联灭活疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)绵羊肺炎支原体的培养

取所述的绵羊肺炎支原体疫苗株的培养物按培养基总量5％v/v接种改良Thiaucourt氏肉汤培养基，在37℃培养4～5天，pH下降至6.8～7.0左右时收获；

(2)羊副流感病毒3型的培养

将羊副流感病毒3型疫苗株按MOI为0.04～0.06接种生长良好的适宜细胞，加入含1％～4％v/v血清的DMEM培养液继续培养，当80％以上细胞出现CPE时收获，然后在15℃下冻融1～2次，-15℃以下保存，不超过6个月；

(3)灭活

将0.2mol/L BEA和0.4mol/L NaOH以体积比2：1比例混合，37±2℃环化1h，生成BEI，调节pH至7.2～7.6；将检验合格的绵羊肺炎支原体的培养液与羊副流感病毒3型的培养液，置于容器内，加入BEI灭活剂终浓度为3-4mM，灭活36-40小时，充分摇匀，再加入终浓度为0.03M的硫代硫酸钠进行中和；

(4)乳化

将灭活后的绵羊肺炎支原体的培养液与羊副流感病毒3型的培养液按体积比1：1的比例混合后，缓缓注入佐剂，抗原与佐剂按一定的比例进行混合乳化制成绵羊肺炎支原体-羊副流感3型二联灭活疫苗；

其中，优选的，所述的绵羊肺炎支原体-羊副流感3型二联灭活疫苗中含有的绵羊肺炎支原体疫苗株的含量不低于5×10⁸CCU/ml，含有的羊副流感病毒3型疫苗株的含量不低于1×10^7.5CCU/ml；

其中，优选的，按抗原为54/100体积份数，佐剂为46/100体积份数进行混合乳化制成绵羊肺炎支原体-羊副流感3型二联灭活疫苗。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1)本发明在发病绵羊上分离得到了一株绵羊肺炎支原体WM01 F6株，弥补了目前仅有山羊支原体肺炎灭活疫苗，而山羊支原体肺炎疫苗对绵羊的保护力有限的缺陷；

2)将本发明分离得到的绵羊肺炎支原体WM01 F6株和羊副流感病毒3型制成二联灭活疫苗，安全性试验表明，所有试验绵羊在接种疫苗后均无局部和全身不良反应，试验样均安全，免疫效力试验结果表明，该灭活疫苗免疫试验动物后，

对强毒攻击可产生较好的保护作用，保护率能到80％以上；

3)本发明的提出为预防和治疗绵羊肺炎支原体及/或羊副流感病毒3型引起的羊呼吸道疾病提供了有效的技术手段。

附图说明

图1为绵羊支原体WM01株的生化培养鉴定；

图2为绵羊肺炎支原体WM01株PCR鉴定；

图3为绵羊肺炎支原体WM01株基因型及亚型分析。

图4为羊副流感病毒3型细胞培养物的细胞病变结果；

其中：A.病毒接种细胞；B.正常细胞

图5为羊副流感病毒3型MDBK细胞分离株PCR扩增结果；

其中：1、阴性对照；2、MDBK细胞分离毒；M、Marker DL2000

图6为基于羊副流感病毒3型CRV3-TX01株全基因组和M基因的系统进化树；

其中：(a)全基因组序列的进化分析表明，TX01与CPIV3有显著的聚集性，但形成了一个分支；(b)基于M基因序列的进化分析；圆表示新分离到的羊副流感病毒序列；

图7为羊副流感病毒3型CRV3-TX01株病毒攻毒后的肺脏病理变化；

其中：A正常组B、C、D攻毒组；攻毒组表现为肺泡沫细胞增多、肺泡壁增厚、肺泡上皮增生、淋巴细胞及浆细胞浸润、支气管上皮细胞乳头状增生、代偿性肺气肿；

图8为羊副流感病毒3型CRV3-TX01株攻毒后的大体解剖；

其中：A、E为正常组，其他为攻毒组，攻毒组表现为纤维素肺炎，全部病变(左右肺，小叶，隔叶)大叶性肺炎，肺粘连严重。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明的头份是指每只羊注射的疫苗量。

本发明用的CCU(Colour charge unit)是指颜色改变单位，是支原体菌体数目的单位。

本实施例所用的支原体培养基为改良Thiaucourt氏肉汤培养基。

本实施例所用的绵羊支原体WM01株，保藏号为CGMCC No.19979。

本实施例所用的羊副流感病毒3型CRV3-TX01株，保藏号为CGMCC No.19970。

实施例1.绵羊支原体WM01 F6株的分离与保存

1.1病料的采集

采集发生呼吸道疾病的羊组织病料。采集部位为感染绵羊胸腔肺脏，胸腔积液，以及鼻拭子，肺脏和胸腔积液在打开胸腔后迅速用准备好的灭菌剪刀剪下感染部分肺脏放到灭菌平皿里，用无菌注射器抽取胸腔积液放置于灭菌试管里。用拭子沾取鼻液置于灭菌管里。将上述病料放置在保温桶里置冰箱冷藏。将病料在12小时运回实验室，保存于4℃冰箱保存。病羊的血液收集于2ml EP管中，置2-8℃带回实验室。

1.2病料处理

将组织样品或鼻拭子样品经处理后，加入3.0ml灭菌的0.01mph7.2pbs，用振荡器充分振荡1min，用灭菌镊子将棉签挤压干净，弃去棉签，用灭菌的0.01mph7.2pbs补足3.5ml。取上述样品处理液经滤膜孔径为0.45μm的无菌滤器过滤除菌，样品中含有的支原体可透过滤器。取1.0ml滤过液，加入终浓度为20万单位青霉素200μl，置4℃作用15小时，为接种液。将样品放入超净工作台，紫外照半小时后进行操作，用烙铁将病变部位烙去表面，除去杂菌，然后用灭菌剪刀剪开肺脏取未被污染的肺部组织，放入含有培养基的试管，然后轻轻摇晃使组织浸入培养基，将培养基放置二氧化碳培养箱里，37℃恒温培养，CO₂浓度为5％，定时观察。在培养24小时、48小时72小时进行观察，若发现试管变色，即可传代培养。

1.3支原体纯化

培养传代稳定之后将菌液在0.45um的滤膜过滤，然后将液体接种于支原体固体培养平皿，涂抹均匀，置二氧化碳培养箱里，37℃恒温培养，CO₂浓度为5％，定时观察。在24-48小时间，拿到显微镜下观察10倍镜头，可观察到煎蛋样菌落。

1.4支原体鉴定

1.4.1生化培养鉴定

葡萄糖发酵试验：配制终浓度为含10％葡萄糖的MTB培养基，调节pH值至7.8，每管2ml。接种0.2ml待检培养物，做三组平行，同时以未接种的培养基做阴性对照1管，置37℃生化培养箱中培养。水解葡萄糖产酸时，培养基颜色变黄。

精氨酸水解试验：配制终浓度为含10％精氨酸的MTB培养基，调节pH值至7.3，每管2ml。接种0.2ml待检培养物，做三组平行，同时以未接种的培养基做阴性对照1管，以接种绵羊肺炎支原体Y-98标准株的做阳性对照1管，置37℃生化培养箱中培养。水解精氨酸时，培养基颜色由橙黄色变成紫红色。

氯化四氮唑还原试验：在MTB培养基中不加酚红和葡萄糖,另加0.2g/L氯化三苯基四氮唑,PH值调至7.8,接种后在1周左右培养液从无色透明变为红色或砖红色,而对照管不变色为阳性。

胆固醇需要性试验：在MTB液体培养基中不加马血清成分,PH值调至7.8,同时设原培养液为对照,按10％接种量接种，37℃培养,当培养基PH值发生变化时,再次接种于该培养基中传2～3代后,试验组培养液颜色不再变化,而对照组仍有变化时为阳性。

图1为绵羊支原体WM01 F6株的生化培养鉴定结果。从该结果可以看出WM01F6株能分解葡萄糖，不水解精氨酸，能够还原氯化四氮唑及培养中需要胆固醇。

1.4.2PCR鉴定

将培养纯化好的菌液，进行16s RNA PCR鉴定，将20ml菌液高速12000r/min4℃离心20min，将沉淀按照提取DNA试剂盒提取DNA，然后运用绵羊肺炎支原体16s RNA特异性引物扩增，产物进行核酸电泳，产生一条361bp大小片段。PCR鉴定结果如图2所示。对PCR产物进行测序，本发明分离得到的绵羊支原体WM01 F6株的16s RNA序列如SEQ ID NO.1所示。

1.4.3血清学鉴定

将采回的绵羊血清用间接血凝试剂盒进行检测，测定其抗体达到1:8以上，即可判定为阳性。将采回的绵羊全血，置37℃培养箱中静置30min，然后取出置4℃冰箱放置2h，在离心机3500r/min，离心20min，抽取上清液，即为血清，用绵羊肺炎支原体间接血凝试剂盒检测抗体，抗体滴度达到1:8以上，可判为阳性。

1.4.4基因型以及亚型分析

用绵羊肺炎支原体16s rRNA引物对WM01株进行基因扩增、测序，序列用经BLAST比较，结果显示WM01F6株与绵羊肺炎支原体标准株Y-98同源性最近。使用MEGA 7.0中NJ法对绵羊肺炎支原体不同分离株及常见反刍动物支原体和人肺炎支原体、猪肺炎支原体的16srRNA序列进行系统发育树的构建。

图3为绵羊肺炎支原体WM01株基因型及亚型分析，从该结果可以看出WM01F6株为绵羊肺炎支原体。

1.5支原体保存

将分离纯化到的绵羊肺炎支原体菌液50ml 12000r/min 4℃离心20min，灭菌甘油和灭菌水以1:1的比例进行混匀，将沉淀菌液用上述保存液稀释至5ml，置EP管保存至-70℃以下冰箱。

将分离得到的绵羊支原体WM01 F6株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.19979，保藏时间为2020年8月21日。

实施例2绵羊肺炎支原体WM01 F6株的致病性试验

试验选用3-4月龄左右的健康易感羊(羊支原体ELISA抗体阴性、布病抗体阴性)6只，其中4只，用WM01株F4代攻击，每只羊气管接种WM01培养物4ml(原液≥10^9.0CCU/ml)，另外2只作为对照，按相同方式气管注射不含菌种的培养物，连续观察35日。

攻毒前2日及攻毒后每日上、下午测量试验动物直肠温度，观察临床症状(每次至少观察1h)，包括精神、食欲及呼吸系统(如咳嗽、流鼻涕等)症状。攻毒0日称量羊体重，每天采集鼻拭子，如果有腹泻症状，则连同采集粪拭子，-20℃保存后集中处理；每7天采血一次检测ELISA抗体，并称重。试验中如果有死亡记录死亡时间并进行剖检。21日大量采血后剖检1只，28日剖解1只，比较两次剖解病理损伤情况，重点观察肺脏组织，并取组织进行病理切片和免疫组化试验。取病变肺脏、气管、肾脏、脾脏和胸腔积液做qPCR检测，检测组织脏器带毒量。试验结束后统计试验羊的发病及死亡情况，结果如表1所示。

表1致病性试验

结果显示，攻毒组均发病，对照组正常。

实施例3绵羊肺炎支原体WM01 F6株灭活疫苗的制备

取绵羊肺炎支原体WM01 F6株的培养物按培养基总量5％v/v接种改良Thiaucourt氏肉汤培养基，在37℃培养4～5天，pH下降至6.8～7.0左右时收获。按照《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌、支原体检验，毒种应纯净，且毒价不低于5×10⁸TCID₅₀。

将0.2mol/L BEA和0.4mol/L NaOH以体积比2：1比例在适当容器内混合。37±2℃环化1h，生成BEI，调节pH至7.2～7.6。将检验合格的培养液，置于容器内，加入BEI灭活剂终浓度为3mM，灭活36-40小时，充分摇匀，再加入终浓度为0.03M的硫代硫酸钠进行中和。将灭活的抗原缓缓注入206佐剂内，保持30℃，按抗原为54/100体积份数，佐剂为46/100体积份数进行混合乳化。迅速降温至15℃，4℃放置24小时勿摇动，分装即得成品。

实施例4疫苗的安全性试验

用2-3月龄健康易感绵羊5只，每只绵羊颈部皮下注射实施例3制备得到的灭活疫苗6ml，连续观察14日，应无局部和全身不良反应。

结果表明，所有试验绵羊在接种疫苗后均无局部和全身不良反应，试验羊均无局部和全身不良反应。

实施例5免疫原性试验

用2-3月龄健康易感绵羊5只，各颈部皮下注射实施例3制备得到的灭活疫苗3ml，另以相同条件与免疫羊相同的绵羊5只作为对照，接种后21日，各器官注射WM01 F6株培养物6ml(10^9.0CCU/ml)，连续观察30日。对照绵羊应至少4只发病，免疫绵羊应至少保护4只。

结果表明，该灭活疫苗免疫试验动物后，对强毒攻击可产生较好的保护作用，保护率为100％。

实施例6羊副流感病毒3型CRV3-TX01株的分离鉴定

(1)病毒分离

发明人采集患有呼吸道疾病绵羊的鼻拭子和血清样本，4℃，6 000r/min离心10min，取上清液经0.45μm的滤器过滤除菌后，接种于长满80％单层的MDBK细胞上，置于37℃5％CO2培养箱培养。显微镜下观察，该病毒在MDBK细胞上可产生典型病变(CPE)，表现为细胞脱落，聚集皱缩形成网孔。如图4所示。

(2)RT-PCR鉴定

根据CPIV3 M基因序列设计合成CPIV3的特异性引物，用于检测CPIV3病毒的特异性引物。

上游引物：5’-CATTGAATTCATACTCAGCAC-3’；

下游引物：5’-AGATTGTCGCATTT(AG)CCTC3-3’，

结果如图5所示，该结果表明MDBK细胞第6代细胞培养物经PCR扩增可得到约400bp的特异性目的片段，阴性对照无条带。

(3)病毒含量(TCID50)的测定

将分离株F6代病毒液用维持培养液10倍倍比稀释至10^-8，每个稀释度做8孔重复，接种长成单层的96孔细胞培养板中的MDBK细胞，并设正常细胞对照，100μL/孔，37℃、5％CO₂培养，每天观察细胞病变，共培养4d，记录CPE孔数，根据Reed-Muench法计算病毒的TCID50。病毒滴度为10^7.8TCID50/mL。

(4)全基因测序

采用Illumina测序技术完成毒株的基因组扫描测序，其中CRV3-TX01毒株M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。测序结果表明病毒全长15738bp，编码6种结构蛋白，分别为：血凝素-神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase protein,HN)、融合蛋白(Fusionprotein,F)、基质蛋白(Matrx protein，M)、大蛋白(Large protein，L)，核蛋白(Nucleoprotein，N)，磷蛋白(phosphoprotein，P)。

利用DNAStar软件将该病毒株基因序列与GenBank上公开发表的有代表性的毒株序列进行核苷酸与氨基酸同源性分析，分析结果参见表2。

将该毒株与GenBank中山羊副流感(CPIV3)，牛副流感3型(BPIV3)和人副流感3型(HPIV3)全基因进行同源性分析，分析结果表明，该毒株与CPIV3毒株同源性较高为97.5％-97.7.0％，与BPIV3同源性为74.2％-75.4.％，与人副流感3型同源性为72.6.％-73.0％。利用MEGA 7软件绘制全基因系统和M基因进化树，如图6所示。亲缘关系均较远，且在系统进化树上处于独立的分支。全基因序列分析PIV3毒株来源见表3，M基因序列分析所用PIV3毒株来源见表4。

表2 CRV3-TX01毒株核苷酸与氨基酸同源性分析

注：1：核苷酸；2：氨基酸。

表3 PIV3毒株全基因来源记录表

表4 PIV3毒株M基因来源记录表

(5)毒力鉴定

用3-4月龄健康易感羊5只，各气管注射CRV3-TX01株培养物4ml(10^7.5TCID₅₀/ml)作为实验组，另以相同条件下培养的正常绵羊5只作为正常对照，接种后21日，取肺脏进行病理以及解剖学检测。

图7为病毒攻毒后的肺脏病理变化，其中：A正常组B、C、D实验组；实验组可见肺泡沫细胞增多、肺泡壁增厚、肺泡上皮增生、淋巴细胞及浆细胞浸润、支气管上皮细胞乳头状增生、代偿性肺气肿。图8为病毒攻毒后的大体解剖，其中：A、E为正常组，其他为实验组，实验组表现为纤维素肺炎，全部病变(左右肺，小叶，隔叶)大叶性肺炎，肺粘连严重。

以上实验结果表明，该分离毒株为羊副流感病毒3型，命名为CRV3-TX01株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.19970，保藏时间为2020年8月21日。

实施例7绵羊肺炎支原体-羊副流感病毒3型二联灭活疫苗的制备

1抗原制备

1.1绵羊肺炎支原体扩繁

取绵羊肺炎支原体WM01 F6株的培养物按培养基总量5％v/v接种改良Thiaucourt氏肉汤培养基，在37℃培养4～5天，pH下降至6.8～7.0左右时收获。按照《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌、支原体检验，毒种应纯净，且毒价不低于5×10⁸TCID₅₀。

1.2羊副流感病毒3型的培养

取羊副流感病毒3型CRV3-TX01株的培养物按病毒MOI为0.04～0.06接种生长良好的适宜细胞(包括MDBK细胞系、BT细胞系及其他牛羊传代细胞系或原代细胞系)，加入含1％～4％血清的DMEM培养液继续培养，当80％以上细胞出现CPE时收获。-15℃下冻融1～2次后收获，-15℃以下保存，不超过6个月。按照《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌、支原体检验，毒种应纯净，且毒价不低于10^7.5TCID₅₀。

1.3灭活

将0.2mol/L BEA和0.4mol/L NaOH以体积比2：1比例在适当容器内混合。37±2℃环化1h，生成BEI，调节pH至7.2～7.6。将检验合格的培养液，置于容器内，加入BEI灭活剂终浓度为3-4mM，灭活36-40小时，充分摇匀，再加入终浓度为0.03M的硫代硫酸钠进行中和。

1.4乳化

将绵羊肺炎支原体抗原以及羊副流感病毒3型抗原按体积比1：1的比例混合后，在灭活的抗原缓缓注入适宜佐剂，保持30℃，按抗原为54/100体积份数，佐剂为46/100体积份数进行混合乳化。迅速降温至15℃，4℃放置24小时勿摇动，分装即得成品。

实施例8绵羊肺炎支原体-羊副流感病毒3型二联灭活疫苗的安全性试验

试验共使用2-3月龄健康易感绵羊15只，分为3组，每组5只，各组绵羊每只颈部皮下注射实施例7制备得到的绵羊肺炎支原体-羊副流感病毒3型二联灭活疫苗6ml，连续观察14日，应全部无局部或全身不良反应。

结果如表5所示，结果表明，所有试验绵羊在接种疫苗后均无局部和全身不良反应。

表5安全性试验

实施例9绵羊肺炎支原体-羊副流感病毒3型二联灭活疫苗的效力试验

用2-3月龄健康易感绵羊40只，平均分为四组，一至三组每只绵羊颈部皮下注射实施例7制备得到的3批绵羊肺炎支原体-羊副流感病毒3型二联灭活疫苗，每只3ml，其余为对照。注射疫苗后21日，按相同剂量再加强免疫1次，21日后，进行效力攻毒。

1绵羊肺炎支原体攻毒

各组分别取5只免疫羊和5只对照，气管注射WM01 F6株培养物6ml(10^9.0CCU/ml)，连续观察30日。对照绵羊应至少4只发病，免疫绵羊应至少保护4只，结果如表6所示。

2羊副流感病毒3型攻毒

各组分别取5只免疫羊和5只对照，各气管注射羊副流感病毒3型CRV3-TX01株培养物4ml(10^7.5TCID₅₀/ml)，连续观察14日。对照绵羊应至少4只发病，免疫绵羊应至少保护4只，结果如表7所示。

该结果表明，绵羊肺炎支原体-羊副流感病毒3型二联疫苗免疫试验动物后，对绵羊肺炎支原体以及羊副流感病毒3型的攻击可产生较好的保护作用，保护率为100％。

表6绵羊肺炎支原体攻毒

表7羊副流感病毒3型攻毒

序列表

<110> 内蒙古大学

<120> 一种绵羊肺炎支原体疫苗株、由该疫苗株制备得到的疫苗组合物及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1340

<212> DNA

<213> Mycoplasm ovipneumoniae

<400> 1

gtgagtaaca cgtacctaac ctaccttttg gaccgggata accattggaa acagcggcta 60

ataccggata taataaagaa acgcatgttt ttttattaaa aggagcctta aagcttcacc 120

aaaaaatggg ggtgcgcaac attagttagt tggtagggta aaggcctacc aagacgatga 180

tgtttagcgg ggccaagagg ctgtaccgcc acactgggat tgagatacgg cccagactcc 240

tacgggaggc agcagtaagg aatattccac aatgagcgaa agcttgatgg agcgacacag 300

agtgcaggat gaagtcttta gggatgtaaa ctgctgttgt aagggaagaa aaaactagat 360

aggaaatgat ttagtcttga cggtacctta ttagaaagtg acggcaaact atgtgccagc 420

agccgcggta atacataggt cgcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgtccgc 480

aggttttttg ttaagtttaa ggttaaatgc taaagctcaa ctttagttcg ctttagatac 540

tgacaaaata gaattatgaa gaggttagcg gaattcctag tggagcggtg gaatgcgtag 600

atattaggaa gaacaccaat aggcgaaggc agctaactgg tcatatattg acactaatgg 660

acgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga 720

tcattagttg gtggcaaaag tcactagcac agctaacgcg ttaaatgatc cgcctgagta 780

gtatgctcgc aagagtgaaa cttaaaggaa ttgacgggaa cccgcacaag cggtggagca 840

tgtggtttaa tttgaagata cgcgtagaac cttacccact cttgacatcc tcgcaaaact 900

atagagatat agcggaggct aacgagatga cagatggtgc atggttgtcg tcagctcgtg 960

tcgtgagatg ttaggttaag tcctgcaacg agcgcaaccc ttttctttag ttgctaacat 1020

taagttgaga accctagaga tactgccggt gcaaaccgga ggaaggcggg gatgacgtca 1080

aatcatcatg cctcttacga gtggggcaac acacgtgcta caatggctac tacaaagagc 1140

agcgaaacag tgatgtcaag ctaatctcaa aaaagtagtc tcagttcgga ttgaagtctg 1200

caactcgact tcatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcag gtcagctata ctgcggtgaa 1260

tacgttctcg ggttttgtac acaccacccg tcacaccatg ggagttggta atgcccaaag 1320

tcggtgagtt aacctcggag 1340

<210> 2

<211> 1059

<212> DNA

<213> Parainfluenza virus type 3

<400> 2

atggagaata taacaagccc agcaatatac acttttccta agtcatcatt cactgagaat 60

ggtgatttgg aaccactacc acttaaagtc aatgaaaata agaaagctat tcctcatata 120

agagttgtca aggtaggcaa tccaccaaag catggggtaa gataccttga tgttttctta 180

cttggcttct ttgaaatgga aaggactaaa gataagtatg gaagtattag tgatctagat 240

gaggacctag gatacaagat ctgtggatca ggttctttac caatcgggct agccaagtat 300

ggtgggagcg acaaggaact tctacaggct gcaaccaaac tagacataga agtaaggagg 360

acagttaagg ctacagaaat gattgtatat actgtacaaa acataaaacc tgagttatat 420

ccatgggcca gtagattgag aaaagggatg atctttgatg ctcaaaaagt agcacttgct 480

cctcaatgtc ttccgttgga cagaggaata aaattcagag tcatattcgt taattgtacg 540

gctattggct cagtaacact atttaagatc ccaaaatcaa tggcgatgtt gtcattacca 600

aatacaatat caataaatct acaagttcac attaaaacag gggtacagac agattcaaag 660

ggggttgttc agatactaga tgaaaagggc gaaaaatcac ttaatttcat gattcatctt 720

ggcttgatca agcgaaaaat tgggaagatg tattcaattg aatactgcaa gcaaaaaatt 780

gaaaagatga gattgatatt ctcattagga ttgattggag gaatcagctt ccatatcaat 840

gcaactggat caatatccaa aaccttagca agccagttaa cattcaaacg agagatttgc 900

tatcctctta tggatcttaa tccacattta aacattgtta tatgggcatc ctcggttgag 960

attacaagag tagatgcaat tttccaaccc tcattacctg gcgaattcag atactaccca 1020

aatataatag caaagggggt cggcaagatt aaacaataa 1059

Claims (13)

1.一种绵羊肺炎支原体(Mycoplasm ovipneumoniae,MO)疫苗株，其特征在于，所述的绵羊肺炎支原体疫苗株命名为WM01 F6株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.19979。

2.一种疫苗组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的绵羊肺炎支原体疫苗株。

3.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，其中含有权利要求1所述的绵羊肺炎支原体疫苗株的含量不低于5×10⁸CCU/ml。

4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物进一步含有疫苗佐剂。

5.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，还含有小反刍兽疫病毒、羊痘病毒、羊口疮病毒、羊副流感病毒、巴氏杆菌以及曼氏杆菌中的一种或多种抗原，所述抗原为全病毒或全菌，或是经修饰后的上述病毒或菌株的抗原；所述的抗原为死的或经减毒后的抗原，死的抗原包括经灭活或本领域常见表达系统表达的蛋白，减毒的方法包括人工自然传代致弱或基因工程手段构建。

6.权利要求2-5任一项所述的疫苗组合物在制备预防由绵羊肺炎支原体、小反刍兽疫病毒、羊痘病毒、羊口疮病毒、羊副流感病毒、巴氏杆菌以及曼氏杆菌中的一种或多种抗原引起的疫病疫苗中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的疫病为呼吸道疾病。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗或亚单位疫苗。

9.一种绵羊肺炎支原体-羊副流感病毒3型二联灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗中含有灭活后的权利要求1所述的绵羊肺炎支原体疫苗株以及羊副流感病毒3型疫苗株。

10.如权利要求9所述的绵羊肺炎支原体-羊副流感病毒3型二联灭活疫苗，其特征在于，所述的羊副流感病毒3型疫苗株为绵羊源的羊副流感病毒3型疫苗株，命名为CRV3-TX01株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.19970。

11.一种制备权利要求9或10所述的绵羊肺炎支原体-羊副流感病毒3型二联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)绵羊肺炎支原体的培养

取权利要求1所述的绵羊肺炎支原体疫苗株的培养物按培养基总量5％v/v接种改良Thiaucourt氏肉汤培养基，在37℃培养4～5天，pH下降至6.8～7.0左右时收获；

(2)羊副流感病毒3型的培养

将羊副流感病毒3型疫苗株按MOI为0.04～0.06接种生长良好的适宜细胞，加入含1％～4％v/v血清的DMEM培养液继续培养，当80％以上细胞出现CPE时收获，然后在15℃下冻融1～2次，-15℃以下保存，不超过6个月；

(3)灭活

将0.2mol/L BEA和0.4mol/L NaOH以体积比2：1比例混合，37±2℃环化1h，生成BEI，调节pH至7.2～7.6；将检验合格的绵羊肺炎支原体的培养液与羊副流感病毒3型的培养液，置于容器内，加入BEI灭活剂终浓度为3-4mM，灭活36-40小时，充分摇匀，再加入终浓度为0.03M的硫代硫酸钠进行中和；

(4)乳化

将灭活后的绵羊肺炎支原体的培养液与羊副流感病毒3型的培养液按体积比1：1的比例混合后，缓缓注入佐剂，抗原与佐剂按一定的比例进行混合乳化制成绵羊肺炎支原体-羊副流感3型二联灭活疫苗。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的绵羊肺炎支原体-羊副流感3型二联灭活疫苗中含有的绵羊肺炎支原体疫苗株的含量不低于5×10⁸CCU/ml，含有的羊副流感病毒3型疫苗株的含量不低于1×10^7.5CCU/ml。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，按抗原为54/100体积份数，佐剂为46/100体积份数进行混合乳化制成绵羊肺炎支原体-羊副流感3型二联灭活疫苗。

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