CN110923211A - 塞内卡病毒分离株、塞内卡病毒病灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了塞内卡病毒分离株、塞内卡病毒病灭活疫苗及其制备方法。本发明从黑龙江省疑似感染塞内卡病毒的发病的猪场分离得到一株猪塞内卡病毒CH‑HLJ株，其全基因序列为SEQ ID No.1所示，其微生物保藏编号是CGMCC NO.18851。本发明进一步提供了一种制备塞内卡病毒病灭活疫苗的方法，包括：(1)病毒增殖后灭活；(2)将疫苗佐剂加热得到油相；(3)病毒液加热得到水相；(5)将油相与水相混合乳化成双相油乳剂。猪免疫实验结果表明，本发明制备的猪塞内卡病毒灭活疫苗能够刺激机体产生高水平的抗体。灭活疫苗的免疫保护效力评估结果表明本发明制备的灭活疫苗对猪塞内卡病毒的攻击能够提供良好的保护。
Description
技术领域
本发明涉及塞内卡病毒分离株，本发明进一步涉及由塞内卡病毒分离株制备得到的预防塞内卡病毒病的灭活疫苗及其应用，属于塞内卡病毒灭活疫苗领域。
背景技术
2002年，在美国马里兰州盖瑟斯堡偶然分离塞内卡谷病毒即SVV-001株。研究发现其具有溶瘤病毒特性，被广泛应用于癌症治疗，发现其与心病毒属相关病毒具有相似的特征。2015年，SVV更名为“A型塞内卡病毒”(SVA)，其所在属命名为塞内卡病毒属。SVA可以引起猪发生以腹泻、跛行、厌食、嗜睡、皮肤、鼻腔、口腔和冠状动脉条带上的囊泡和糜烂为特征的水疱性疾病，其临床症状与口蹄疫病毒，水疱性口炎病毒，猪传染性水疱病毒、猪传染性水疱皮疹病毒难以区分。各年龄段的猪均可以感染该病毒，对养猪业造成巨大的困扰。
目前，对于塞内卡病毒的防控没有特别有效的手段，目前市场上还未见商品化的疫苗，因此迫切需要一种可用于防治猪塞内卡病毒病的疫苗。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株猪塞内卡病毒分离株；
本发明的目的之二是提供一种预防塞内卡病毒病的灭活疫苗；
本发明的目的之三是提供一种制备预防塞内卡病毒病的灭活疫苗的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先从黑龙江省疑似感染塞内卡病毒的发病的猪场分离得到一株猪塞内卡病毒CH-HLJ株，其全基因序列为SEQ ID No.1所示。
本发明将分离的兵毒株的全基因组核苷酸与其它其他SVV基因组序列核苷酸进行了比对分析，结果发现，本发明所分离的SVV-CH-HLJ株的全基因组序列与其他SVV基因组序列核苷酸同源性为95-98％。全基因组序列进化分析表明SVA-CH-HLJ株和AH01-CH-2016在同一进化分支。
本发明将该毒株命名为猪塞内卡病毒CH-HLJ株。该毒株已于2019年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18851；分类命名是：塞内卡病毒。
为确定本发明分离的塞内卡病毒CH-HLJ分离株的致病性，使用了收获的第3代病毒液进行动物回归试验。动物回归结果发现，未攻毒对照组猪在14d观察期均未出现异常。攻毒组猪在攻毒后3d-8d有4头猪表现出典型的临床症状，其中1头猪的鼻吻部开始出现白色肿胀区域，随后发展为水疱，3头猪蹄部均可见水疱，并导致溃烂，引起跛行。
本发明进一步提供了一种应用所分离的塞内卡病毒CH-HLJ分离株制备预防塞内卡病毒病灭活疫苗的方法，包括：
(1)将所述的猪塞内卡病毒CH-HLJ株进行病毒增殖；(2)将增殖后的病毒灭活；(3)将疫苗佐剂加热后得到油相；(4)将灭活后的病毒液加热得到水相；(5)将油相与水相充分混合，乳化成双相油乳剂，即得。
作为本发明一种优选的实施方式，步骤(3)中将疫苗佐剂加热加热至30℃得到油相，所述的疫苗佐剂优选是MontanideTM ISA 206VG佐剂；
作为本发明一种优选的实施方式，步骤(4)中将灭活后的病毒液加热至30℃得到水相。
作为本发明一种优选的实施方式，步骤(5)中将油相与水相按照体积比为1:1的比例进行混合，在搅拌条件下，将水相真空或正压进料到乳化罐中，循环搅拌至油相与水相充分混合，乳化成双相油乳剂。
本发明用血清学方法进行灭活疫苗的效力检验，首免后28天采血、分离血清测定中和抗体效价为1:256～1:1024之间。阴性对照组的猪的猪塞内卡病毒抗体水平呈阴性；猪免疫实验结果表明，本发明制备的猪塞内卡病毒灭活疫苗能够刺激机体产生高水平的抗体。
本发明用免疫攻毒法进行灭活疫苗的免疫保护效力评估，试验结果表明本发明制备的灭活疫苗对猪塞内卡病毒的攻击能够提供良好的保护。
附图说明
图1病料SVV PCR检测结果。
图2SVV-CH-HLJ株全基因组序列核苷酸同源性分析结果。
图3VV-CH-HLJ全基因序列构建的进化树。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1塞内卡病毒CH-HLJ株的分离和鉴定
1试验材料
病料来源于黑龙江省疑似感染塞内卡病毒的发病的猪场；BHK-21细胞为哈药集团生物疫苗有限公司保存。
2试验方法
2.1病料的采集与处理
从疑似感染SVA的病猪中采集水疱液，反复冻融后，加入1％的青霉素-链霉素后分装于1.5mL的无菌EP管中，用0.22μm的细菌滤器过滤，于-80℃保存备用。
2.2病毒的检测
用商品化的DNA/RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录获得cDNA模板，利用SVA基因的一对特异性引物进行PCR扩增，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
表1鉴定SVA基因的引物
2.3病毒的分离与培养
将PCR鉴定为阳性的样品无菌过滤，接种长满单层的BHK-21细胞，于37℃5％CO2培养箱中培养，吸附1h后，补加含2％FBS的DMEM培养基，继续在37℃5％CO2培养箱中培养，同时设置正常的细胞对照组，每日观察细胞病变情况。细胞发生病变且有80％以上的细胞病变后，反复冻融细胞两次。
2.4病毒的全基因组测序及序列分析
从Gebank下载公布的SVV全基因序列，设计7对相互重叠片段的引物(表2)，对分离到的病毒进行全基因的PCR扩增，检测扩增片段后回收纯化并连接到pMD18-T载体，送吉林库美生物科技有限公司测序。
根据测序利用DNA STAR软件对全基因组的核苷酸其他毒株进行比较，并与相关的塞内卡谷病毒毒株一起绘制进化树分析图。
表2扩增SVA全基因的引物
表3所用毒株的登录号
3试验结果
3.1病毒的检测
PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳检测结果见图1，由结果可见，扩增出一条约400bp的条带，与预期扩增片段大小相符。
3.2病毒的全基因组测序及序列分析
用DNAstar软件将7段重叠片段的测序结果进行拼接，得到猪塞内卡病毒SVA-CH-HLJ株全基因序列，结果表明，SVA-CH-HLJ分离株的全基因序列为7200bp。
将全基因组核苷酸比对的结果进行分析。SVV-CH-HLJ株的全基因组序列与其他SVV基因组序列核苷酸同源性为95-98％(图2)。全基因组序列进化分析表明SVA-CH-HLJ株和AH01-CH-2016在同一进化分支(图3)。
本发明将该毒株命名为猪塞内卡病毒CH-HLJ株。该毒株已于2019年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.18851。
实施例2塞内卡病毒CH-HLJ株灭活疫苗的制备
1病毒增殖
按培养基总量的5‰将毒种接种长满单层的BHK-21细胞，置37℃5％CO2培养箱中培养，吸附1小时后，补加血清含量为2％的DMEM细胞培养液，继续在37℃5％CO2培养箱中培养。接毒后细胞培养40-48小时，当细胞病变达到80％以上时，收获细胞及细胞培养物。
2半成品检验
2.1无菌检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验，制苗用病毒液病毒含量为9.5TCID50/ml，无菌检验合格。
2.2病毒含量测定
将处于对数生长期的BHK-21细胞，传至96孔细胞培养板，每孔加入BHK-21细胞悬液100μl(细胞含量7.0×104个/ml)，置37℃含5％CO2培养箱中培养24h。将毒种用DMEM培养基作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9 4个稀释度，各加入培养24小时的96孔细胞培养板，每个稀释度接种96孔细胞培养板6孔，每孔100μl，同时设立正常细胞6孔为阴性对照。置37℃含5％CO2培养箱中培养4日，每日观察和记录各孔中病毒感染情况，按Reed-Muench法，计算病毒的致半数细胞感染滴度(TCID50)。检测结果为，每毫升病毒含量≥108.0TCID50。
3病毒灭活及检验
3.1病毒灭活
将检验合格的病毒液缓慢加入2％的二乙烯亚胺(BEI)溶液，充分混匀，使其最终浓度为0.02％。30℃灭活72小时。将50％硫代硫酸钠溶液加入灭活病毒液中，使其终浓度为2％，中止灭活。灭活后的病毒液置2～8℃保存。
3.2病毒灭活检验
取1.0ml灭活的猪塞内卡CH-HLJ株病毒液，接种到长满单层的BHK-21细胞，置37℃下培养72小时。接种细胞盲传2代，均应不产生细胞病变，判断为灭活完全；
制苗用病毒液接种细胞盲传三代均无细胞病变，灭活检验合格，
4灭活疫苗的配制
4.1油相制备取法国赛比克公司MontanideTM ISA 206VG佐剂加热至30℃。
4.2水相制备将病毒液作为水相加热至30℃。
4.3乳化油相与水相体积比为1:1，在搅拌条件下，将水相真空或正压进料到乳化罐中，循环搅拌至油相与水相充分混合，乳化成双相油乳剂。
试验例1塞内卡病毒CH-HLJ分离株的动物回归试验
为确定塞内卡病毒CH-HLJ分离株的致病性，使用了收获的第3代病毒液进行动物回归试验。用12周龄的试验猪10头，随机分2组，每组5头。其中一组经滴鼻接种毒种3ml(每毫升病毒含量≥108TCTD50)，左右鼻孔各1.5ml，另外一组猪作空白对照，滴鼻相同剂量的生理盐水。攻毒后逐日观察试验猪的临床症状，以口鼻部和蹄部出现典型的水疱或溃烂作为判定发病的标准。
动物回归结果发现，未攻毒对照组猪在14d观察期均未出现异常。攻毒组猪在攻毒后3d-8d有4头猪表现出典型的临床症状，其中1头猪的鼻吻部开始出现白色肿胀区域，随后发展为水疱，3头猪蹄部均可见水疱，并导致溃烂，引起跛行。
试验例2灭活疫苗的安全检验试验
4周龄健康易感猪5头，各经颈部肌肉接种实施例2制备的灭活疫苗4.0ml，观察有无不良反应，连续观察7日。结果5头试验猪注射4ml疫苗后全部健活，无局部和全身不良反应。
试验例3灭活疫苗的效力检验试验
1试验方法
1.1血清学方法
用8周龄的试验猪5头，各经颈部肌肉接种灭活疫苗(实施例2制备)2.0ml，接种后21日，以相同剂量加强免疫1次。另设对照猪5头。二免后7日对所有猪采血，分离血清，经处理后测定猪塞内卡病毒中和抗体效价。
1.2免疫攻毒法
用8周龄的健康易感猪5头，各经颈部肌肉接种灭活疫苗(实施例2制备)2.0ml，接种后21日，以相同剂量加强免疫1次。另设对照猪5头。首免后28日，其中一组经滴鼻接种毒种3ml(每毫升病毒含量≥108TCTD50)，左右鼻孔各1.5ml，另外一组猪作空白对照，滴鼻相同剂量的生理盐水。攻毒后逐日观察试验猪的临床症状，
2试验结果
2.1血清学方法
用血清学方法进行疫苗效力检验的试验猪，首免后28天采血、分离血清测定中和抗体效价为1:256～1:1024之间(表4)。阴性对照组的猪的猪塞内卡病毒抗体水平呈阴性。猪免疫实验结果表明，本发明制备的猪塞内卡病毒灭活疫苗能够刺激机体产生高水平的抗体。
表4效力检验中和抗体效价测定结果
2.2免疫攻毒法
用免疫攻毒法进行灭活疫苗(实施例2制备)的免疫保护效力评估。
试验猪首免后28日进行猪塞内卡病毒攻毒试验，结果表明免疫猪5头均未发病，对照组5头全部发病(表5)。表明本发明制备的灭活疫苗对猪塞内卡病毒的攻击能够提供良好的保护。
表5效力检验攻毒结果
| 组别 | 数量/头 | 免疫途径 | 免疫剂量/ml | 攻毒途径 | 攻毒剂量/ml | 发病率 |
| 免疫组 | 5 | 颈部肌肉 | 3.0 | 滴鼻 | 3 | 0/5 |
| 对照组 | 5 | 颈部肌肉 | 3.0 | 滴鼻 | 3 | 5/5 |
SEQUENCE LISTING
<110> 哈药集团生物疫苗有限公司
<120> 塞内卡病毒分离株、塞内卡病毒病灭活疫苗及其制备方法
<130> HLJ-3002-191019A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7200
<212> DNA
<213> Senecavirus
<400> 1
tttttgaatg gggggctggg cactcatgcc cagtccttcc tttccccttc cggggggtaa 60
accggctgtg tttgctagag gcacagagga gcaacatcca acctgctttt gtggggaacg 120
gtgcagctcc aattcctgcg acgccaaagg tgttagcgca cccaaacggc gcatctacca 180
atgccattgg tgtggtctgc gagttatagc ctactcgttt ttcccctact cactcattca 240
cgcacaaaaa gcgtgttgta actacaagat ttagacctcg cacgggatgt gcggtaaccg 300
caagattgac tcaagcgcgg aaagcgctgt aaccacatgc tgttagtccc tttatggctg 360
cgagatggct atccacctcg gatcactgaa ctggagttcg accctcctta gtaagggaac 420
cgagaggcct tcttgcaaca agctccgaca cagagtccac gtgattgcta ccaccatgag 480
tacatggttc tcccctctcg acccaggact tcttttagaa tatccacggc tcgatccaga 540
gggtggggca tgatccccct agcatagcga gctacagcgg gaactgtagc taggccttag 600
cgtgccttgg atactgcctg atagggcgac ggcctagtcg tgtcggttct ataggtagca 660
catacaaata tgcagaactc tcatttttct ttcgataaag cctctggcac ctttgaagac 720
gtaaccggaa caaaagtcaa gatcgttgaa taacccagat cggtgaacaa tggtgtttac 780
gattcgtcca ctcatttaga gatactgaac ctacagggtg aaattgaaat tttaaagtct 840
ttcaacgaat accaaattcg cgccgccaaa caacaacttg gactggacat cgtatacgaa 900
ctgcagggta atgttcagac aacctcaaag aatgactttg attcccgcgg caataatggt 960
aacatgacct tcaattacta cgcaaacact taccagaatt cagtagactt ctcgacctcc 1020
tcgtcggcgt caggcgccgg acccgggaac tcccggggcg gactagcggg tctcctcaca 1080
aatttcagtg gaatcttgaa ccctcttggc tacctcaaag atcacaatac cgaagaaatg 1140
gaaaactctg ctgatcgagt catacgcaaa cggcgggcaa cactgccata aacacgcaat 1200
catcactggg tgtgttgtgt gcctacgttg aagacccgac caaatctgac cctccgtcca 1260
gcagcacaga tcaacccacc accactttta ctgccatcga caggtggaat actggacgcc 1320
tcaactcttg gacaaaagct gtaaaaacct tctcttttca ggccgtcccg ctacctggag 1380
ccttcctgtc tagacaggga ggcctcaacg gaggggcctt cacggctacc ctacatagac 1440
acttcttaat gaagtgcggg tggaaggtgc aggtccaatg caatttgacg caattccacc 1500
aaggtgctct tcttgttgcc atggtccctg agaccaccct tgatgtcaaa cctgacggca 1560
aggcaaagag cttacaggag ctgaatgaag aacagtgggt agaaatgtct gacgattacc 1620
agaccgggaa aaacatgcct tttcagtctc ttggcacata ctatcggccc cctaactgga 1680
cttggggtcc caattttatc aacccctatc aagtaacagt tttcccacac caaattctga 1740
atgcgagaac ttctacctcg gtagacataa gtgtcccata catcggggag actcctacac 1800
agtcctcaga gacacagaac tcctggaccc tcctcgttat ggtgcttgtc cccttcgact 1860
acaaggaggg agccacaact gacccagaaa ttacattctc tgtaaagcct acaagtcctt 1920
acttcaatgg gcttcgtaac cgtttcacga ccgggacgga cgaggaacag gggcccattc 1980
ccacagcacc cagagaaaac tagcttatgt ttctctcaac catccccgac gacactgtcc 2040
ctgcttacgg gaatgtgcgt acccctcccg tcaattacct ccccggtgaa ataaccgacc 2100
tcttacaact ggcccgtata cccactctta tggcgtttgg gcgggtgtct gaacccgagc 2160
ctgcctcaga cgcttacgtg ccctacgttg ctgttcctgc tcagttcgac gacaagcctc 2220
tcatctcctt cccgatcacc ctttcagatc ctgtctacca gaacaccctg gtaggcgcca 2280
tcagttcgaa cttcgctaac taccgggggt gtatccaaat cactctgaca ttttgtggac 2340
ccatgatggc aagagggaaa ttcctgctct cgtattctcc cccaaatgga gcacaaccac 2400
agaccctttc tgaagctatg cagtgcacat actctatttg ggacataggc ttgaactcta 2460
gttggacctt tgtcatcccc tacatctcgc ccagtgatta ccgagaaact cgggctatta 2520
ccaactcagt ttattctgct gatggttggt ttagcttaca aaagctgacc aaaatcactc 2580
taccacctga ctgcccacag aatacctgta ttctcttttt cgcctctgct ggtgaggatt 2640
acaccctccg tctccctgtt gattgtaatc cttactacgt gttccactcc accgacaacg 2700
ccgagactgg tgttattgag gcaggcaaca ctgacaccga attctctggt gaactggcgg 2760
ctcctggctc taaccatact aatgtcaaat ttctttttga tcgatctcga ctactgaatg 2820
taattaaggt actggagaag gacgctgtct tcccccgtcc tttccccaca gcaacaggcg 2880
cacagcagga cgatggttac ttttgtcttc tgacaccccg cccaacggtc gcttcccgac 2940
ccgccacccg tttcggcctg tacgtcaacc cgtctgacag tggcgttctc gctaacactt 3000
cactggattt caatttttac agtttggcct gtttcactta ctttagatca gaccttgaag 3060
tcacggtagt ctcactggag ccaaatctgg aattcgccgt ggggtggttc ccctctggca 3120
gtgagtacca ggcttctagc tttgtatacg accaactgca tgtaccctac cactttactg 3180
ggcgcactcc ccgcgctttc aacagcaagg gcggaaaggt atctttcgtg ctcccttgga 3240
actctgtctc ttccgtgctt cccgtgcgct gggggggcgc ttccaagctt tcttctgcca 3300
cgcggggtct gccggctcat gctgactggg ggaccattta cgccttcatc ccccgtccta 3360
acgagaagaa aagcaccgct gtaaagcacg tggcggtgta cgttcggtac aagaacgcgc 3420
gtgcttggtg ccccagcatg cttacctttc gcagttacaa gcaaaagatg ctgatgcaat 3480
caggcgacat cgagaccaac cctggccctg cttctgacaa cccaatcttg gagtttcttg 3540
aagcggaaaa cgatctagtc actctggcct ctctctggaa aatggtacac tctgttcaac 3600
agacctggag gaagtatgtg aagaacgata atttttggcc aaacttgctc agtgagctag 3660
tgggggaagg ctccatcgct ttggccgcca cgctatctaa ccaagcttca gtgaaagctc 3720
tcttgggcct gcattttctc tctcgagggc tcaattacac agatttttac tctttactga 3780
tagagaaatg ctctagtttc ttaactgtag aaccgcctcc tccaccagct gaaaatctga 3840
tgaccaagcc ctccgtgaag tcgaaattcc gaaagctgtt caagatgcaa ggacccatgg 3900
atacagtcaa agactggaac caaatagccg ccggcttgaa gaatttccaa tttgttcgtg 3960
acctagtcaa agaggtggtc gataggctcc aggcctggat caataaagag aaagccagcc 4020
ctgtcctcca gtaccagctg gagatgaaga agctcgggcc cgtggctttg gctcatgatg 4080
ccttcatggc cggttctggg cccccccttg gtgacgacca gattgaatac ctccagaacc 4140
tcaaatctct tgccctgaca ctgggaaaga ctaatttggc ccaaagtctc accactatga 4200
tcaatgccaa gaagagctcc gcccaacgag tcgaacccgt tatggtggtc ctcagaggca 4260
agccaggatg cggcaaaagc ctggcctcca cgttgattgc ccaggctgtg tctaagcgtc 4320
tctatggctc acaaagtgtg tattctcttc ctccggatcc agacttcttc gacggataca 4380
aaggacagtt tgtaaccttg atggacgacc agggacaaaa cccggatggg caagatttct 4440
ccaccttttg tcagatggta tcgaccgccc aatttcttcc caacatggcg gaccttgcag 4500
agaaggggcg tcccttcacc tccaatctta tcattgcaac taaaaacctc cctcacttta 4560
gccctgtcac cattgctgat ccttctgcag tctctcggcg tattaactac gacctgactc 4620
tggaagtatc tgaggcctac aagaagcaca cacggctgaa ttttgacctg gctttcagac 4680
gcactgacgc cccccccatt tacccttttg ctgcccatgt gcccttcgtg gacgtggctg 4740
tgcgcttcaa aaatggtcat caaagcttca atctcctaga gttggtcgac tctatttgta 4800
cagacattcg ggccaagcaa caaggagctc gaaatatgca gactctggtt ctacagagcc 4860
ctaacgagaa cgacgacacc cccgtcgacg aagcgttggg tagagttctc acccccgctg 4920
cggtcgacga agcgcttgct gaccttgctc cagatgccga cccggttggc cgcttggcta 4980
ttctcgccaa gctaggtctt gccctagctg cggtcacccc tggtttgata atcttggcag 5040
tgggactcta caagcacttc tctggctctg atacagacca agaagagaca gaaagtgagg 5100
agcctgctaa agcgcctagg agcgagaatg cttatgacgg tccgaagaaa aactctaagc 5160
cccctggagc gctctctctt atgaaaatgc aacagcccaa cgtggacatg ggctttgagg 5220
ctgcggtcgc taagaaagtg gtcgtcccca ttaccttcat ggttcccaac agaccttctg 5280
gacttacaca gtccgctctt cttgtggccg gccggacctt cctaatcaat gagcatacat 5340
ggtccaaccc ctcctggacc agcttcacaa tccgtggtga ggtgaacact cgtgatgagc 5400
ctttccaaac ggttcatttt acccaccatg gtcttcccac agatctgatg atggtacgtc 5460
tcagaccggg caactctttc cctaacaatc tagacaagtt tggacttgac cagatgccgg 5520
cacgtaactc ccgtgtggtt ggcgtttcgg ctagttacgg taacttcttt ttctctggga 5580
acttcctcgg atttgttgac tccatcacct ctgaccaagg aacctatgcg agacttttca 5640
ggtacagggt gacgacttac aagggatggt gcggttcggc cctggtctgt gaggccggtg 5700
gtgtccggcg catcattggc atgcattctg ctggtgccgc tggtatcggc gccgggactt 5760
acatctcaaa attaggactg atcaaagccc ttaaacacct cggtgagcct ctggctacaa 5820
tgcaaggact aatgactgag ctagagcctg gagtcaccgt acatgtgccc cgaaaatcta 5880
aattgagaaa gacgaccgca cacgaggtgt acaaaccgga gtttgaacct gctgtgttgt 5940
caaaatttga tcccagactg aacaaggatg ttgacctaga tgaggaaatt tggtctaagc 6000
acaccgccaa tgtcccttac caacctcctt tgttctacac atacatgtca gagtacgctc 6060
atcgggtttt ctcctttttg ggaaaagaca atggcattct gaccgtcaaa gaagcaatcc 6120
tgggcatccc tggactagac cctatggatc cccacacagc tccgggtttg ccttacgccg 6180
ttagcggcct tcgacgtact gatctcgtcg attttgcgaa cggcacggta gacccggcac 6240
tggccatgca gatccagaaa ttcttagacg gtgactactc tgatcatgtc ttccaaactt 6300
ttctgaaaga tgaaatcaga ccctcagaga aggtccgggc gggaaaaacc cgcattgttg 6360
acgtgccctc cctggcgcac agcattgtgg gcagaatgtt gcttgggcgc tttgccgcca 6420
agtttcaatc ccatcctggc tttctccttg gctccgctat cgggtctgac cccgatgtct 6480
tctggaccgt cataggggcc cagctcgagg gaagaaagaa aacgtacgac gtggactaca 6540
gtgcctttga ctcttcacac ggcactggct acttcgaggc tctcatctct cactttttca 6600
ccgtggacaa tggtttcagc cctgcgctgg gaccgtatct cagatccctg gctgtctcgg 6660
tgcacgctta cggcgagcgt cgcatcaaga ttaccggagg cctcccctct ggttgtgccg 6720
cgaccagcct gctgaacaca gtgctcaaca atgtgatcat caggactgct ctggcattga 6780
cctacaagga atttgaatat gacatggttg atatcatcgc ctacggtgac gatcttctgg 6840
ttggtacgga ttacgatcag gacttcaatg aggtggcgcg gcgcgctgct aaactggggt 6900
ataagatgac tcctgcaaac aagggttctg tcttccctcc gacttcctct ctctctggtg 6960
ctgtttttct aaaacgcaaa ttcgtccaaa acaatgatgg cttatataga ccagttatgg 7020
atgtaaagaa tttggaagcc atgctctcct acttcaaacc aggaacacta ctcgagaagc 7080
tgcaatctgt ttctatgttg gctcaacatt ctagaaaaga agaatatgat agattgatgc 7140
accccttcgc tgactacggt gccgtaccga gtcacgagta cctgcaggca agatggaggg 7200
Claims (10)
1.一株猪塞内卡病毒CH-HLJ株，其特征在于，其全基因序列为SEQ ID No.1所示。
2.按照权利要求1所述的猪塞内卡病毒CH-HLJ株，其特征在于，其微生物保藏编号是CGMCC NO.18851。
3.权利要求1或2所述的猪塞内卡病毒CH-HLJ株制备预防塞内卡病毒病疫苗中的用途。
4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。
5.一种预防塞内卡病毒病的疫苗组合物，其特征在于，含有预防上有效量的权利要求1或2所述的猪塞内卡病毒CH-HLJ株。
6.一种制备预防塞内卡病毒病的灭活疫苗的方法，其特征在于，包括：
(1)将权利要求1或2所述的猪塞内卡病毒CH-HLJ株进行病毒增殖；(2)将增殖后的病毒灭活；(3)将疫苗佐剂加热后得到油相；(4)将灭活后的病毒液加热得到水相；(5)将油相与水相充分混合，乳化成双相油乳剂，即得。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的疫苗佐剂是MontanideTMISA 206 VG佐剂。
8.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中将疫苗佐剂加热加热至30℃得到油相。
9.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(4)中将灭活后的病毒液加热至30℃得到水相。
10.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(5)中将油相与水相按照体积比为1:1的比例进行混合，在搅拌条件下，将水相真空或正压进料到乳化罐中，循环搅拌至油相与水相充分混合，乳化成双相油乳剂。
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