CN109652590A - 一种甲型肝炎病毒的负链rna分子生物学检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法及应用，所述方法以HAV(‑)RNA为模板，运用RT‑PCR法进行(‑)RNA的检测。若检测到(‑)RNA，则说明有HAV在复制，即样品中有活着的HAV，若检测不到(‑)RNA，则说明没有HAV复制，即样品中没有活的HAV；同时，检测到(‑)RNA时，亦可依据(‑)RNA的含量来推断样品中活的HAV的量，进而推算出样品中的HAV滴度。RT‑PCR的高灵敏度性使得可在较短的培养时间内检测出代表HAV复制的(‑)RNA的存在与否及其相对含量，进而在更少的时间内完成病毒灭活效果的验证和病毒滴度的测定，加速甲肝疫苗的研发进度以及减少成品甲肝疫苗的库存期。

Description

一种甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体地说涉及一种甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法及应用。

背景技术

甲型肝炎，简称甲肝，是一种由甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）引起的高发病率的病毒性传染病，可导致暴发流行，是我国重要的卫生问题，接种甲肝疫苗是预防甲肝流行的最佳途径。

目前使用的甲肝疫苗包括甲肝减毒活疫苗和甲肝灭活疫苗两大类。其中，甲肝减毒活疫苗使用弱毒株进行生产，但存在毒力返祖、对免疫缺陷者可能存在诱发严重疾病的安全隐患。甲肝灭活疫苗是病毒培养后经灭活而制成的疫苗，在安全性、有效性及适用范围等方面均优于减毒活疫苗。

在毒种选育和病毒培养阶段，HAV病毒滴度是一个关键指标，病毒灭活是甲肝灭活疫苗安全性的关键指标，而现行版《中华人民共和国药典》（下简称《中国药典》）中的关于HAV的病毒滴定和病毒灭活验证等的方法存在耗时长久、不利于甲肝疫苗的研发和生产的问题，因此开发一种快速的检测方法至关重要。

HAV属于小核糖核酸病毒科小核糖核酸病毒属，是无包膜的ss(+)RNA病毒，在病毒复制过程中，基因组(+)RNA转录成为(-)RNA；以(-)RNA为模板复制出子代基因组(+)RNA，同时基因组(+)RNA作为mRNA指导相关病毒蛋白的合成，最终病毒蛋白和基因组(+)RNA组装成为成熟HAV颗粒。从以上过程可见，(-)RNA仅存在于病毒的复制过程中。此前已有检测HAV的RT-PCR法，但此类方法不能判定产物源自基因组(+)RNA还是(-)RNA，即不能判定病毒是否在进行复制、病毒是否依然存活。

发明内容

为此，本发明正是要解决上述技术问题，从而提出一种甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法及应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

本发明提供一种甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法，其包括如下步骤：

S1、培养人二倍体细胞，并接种HAV，得到带病毒细胞；

S2、从步骤S1得到的带病毒细胞中提取总RNA；

S3、以所述总RNA作为模板，采用第一引物进行逆转录反应，用核糖核酸酶处理逆转录反应体系，降解RNA；

S4、以步骤S3得到的逆转录反应产物为模板，使用第二引物和第三引物进行第一次聚合酶链式反应，得到第一次聚合酶链式反应产物；

S5、以步骤S4得到的产物为模板，使用第四引物和第五引物进行第二次聚合酶链式反应，得到第二次聚合酶链式反应产物；

S6、将所述第一次聚合酶链式反应产物、第二次聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，判断是否存在负链RNA。

作为优选，所述第一引物的基因序列为TCCTACGTAATATCCGTGAT

GTTATCTAAGTA；所述第二引物的基因序列为TCCTACGTAATATCC；所述第三引物的基因序列为GTACCTATAATGCATCCTAATTTAGCAAAGCT

GTACAA；所述第四引物的基因序列为GCCGAATGTATTGGGGTCC；所述第五引物的基因序列为GTACCTATAATGCATCCT。

作为优选，所述步骤S1包括如下步骤：

S11、将人二倍体细胞培养为单层细胞，并接种HAV，在36-38℃下吸附1-2h；

S12、洗除未吸附病毒后加入维持液，在36-38℃下培养；

S13、用细胞消化液收获带病毒细胞。

作为优选，所述步骤S3中所述的逆转录反应在逆转录反应体系中进行，所述逆转录反应体系包括：浓度为25mM的MgCl₂、10 x RNA PCR 缓冲液、RNase Free dH₂O、浓度为10mM的dNTP Mixture、逆转录抑制剂、AMV反转录酶、浓度为10 µmol/L的第一引物、总RNA。

作为优选，所述逆转录反应包括在55℃下反应30min、在95℃下反应5min、在5℃下反应5min的步骤。

作为优选，所述步骤S4所述的第一次聚合酶链式反应在第一次聚合酶链式反应体系中进行，所述第一次聚合酶链式反应体系包括：浓度为25mM的MgCl₂、10×LA PCR缓冲液、浓度为10mM的dNTP Mixture、TaKaRa LA Taq、第二引物、第三引物、逆转录反应产物和灭菌水。

作为优选，所述步骤S5所述的第二次聚合酶链式反应产物在第二次聚合酶链式反应体系中进行，所述第二次聚合酶链式反应体系包括：浓度为25mM的MgCl₂、10×LA PCR缓冲液、浓度为10mM的dNTP Mixture、TaKaRa LA Taq、第四引物、第五引物、第一次聚合酶链式反应产物和灭菌水。

作为优选，所述第一次聚合酶链式反应、第二次聚合酶链式反应均包括：第一循环：在94℃下反应2min；第二循环：在94℃下反应30s、在55℃下反应30s、在72℃下反应1min；第三循环：在72℃下反应2min，其中第一循环的次数为1次，第二循环的次数为35次。

作为优选，所述步骤S6所述的电泳条件为电压100V、反应时间15-30min。

本发明还提供一种所述的方法在甲型肝炎病毒滴度滴定和灭活验证中的应用。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明所述的甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法，包括如下步骤：S1、培养人二倍体细胞，并接种HAV，得到带病毒细胞；S2、从步骤S1得到的带病毒细胞中提取总RNA；S3、以所述总RNA作为模板，采用第一引物进行逆转录反应，用核糖核酸酶处理逆转录反应体系，降解RNA；S4、以步骤S3得到的逆转录反应产物为模板，使用第二引物和第三引物进行第一次聚合酶链式反应，得到第一次聚合酶链式反应产物；S5、以步骤S4得到的产物为模板，使用第四引物和第五引物进行第二次聚合酶链式反应，得到第二次聚合酶链式反应产物；S6、将所述逆转录反应产物、第一次聚合酶链式反应产物、第二次聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，判断是否存在负链RNA。所述方法以HAV (-)RNA为模板，运用RT-PCR法进行(-)RNA的检测。若检测到(-)RNA，则说明有HAV在复制，即样品中有活着的HAV，若检测不到(-)RNA，则说明没有HAV复制，即样品中没有活的HAV；同时，检测到(-)RNA时，亦可依据(-)RNA的含量来推断样品中活的HAV的量，进而推算出样品中的HAV滴度。RT-PCR的高灵敏度性使得可在较短的培养时间内检测出代表HAV复制的(-)RNA的存在与否及其相对含量，进而在更少的时间内完成病毒灭活效果的验证和病毒滴度的测定，加速甲肝疫苗的研发进度以及减少成品甲肝疫苗的库存期。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明实施例的所述的方法中电泳结果图。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供一种甲型肝炎病毒的负链RNA分子（HAV(-)RNA）生物学检测方法，其包括如下步骤：

S1、培养人二倍体细胞，所述人二倍体细胞是人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2，于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201055，保藏地址：中国武汉大学，保藏存活性结果为存活。将Walvax-2培养成薄单层细胞后，接种HAV，所述HAV是云南沃森生物技术股份有限公司自临床粪便样品中分离在Walvax-2细胞上适应后获得的YN5D株，亦可采用其他HAV毒种，目的基因是RNA聚合酶P3D蛋白的基因，该基因是高度保守的。YN5D株ORF基因组(+)RNA序列：5’-atgaacatgtctagacaaggtattttccagactgttgggagtggtcttgaccacatcctgtctttggcagacattgaggaagagcaaatgattcaatcagttgataggactgcagtgactggttcttcttattttacttctgtggatcaatcttcagttcatacagctgaggttggatcacaccaggttgaacctttgagaacctctgttgataaacccggttcaaagaggactcagggagagaaatttttcttgattcattctgcagattggcttactacacatgctcttttccatgaagttgcaaaattggatgtggtgaaattattatacaatgagcagtttgctgttcaagggttgttgagataccatacatatgcaagatttggcattgaaattcaagttcagataaaccctacacctttccaacaggggggattgatttgtgctatggttcctggtgaccagagctatggttctatagcatcattgactgtttatcctcatggtttgttaaattgcaatattaacaatgtggttagaataaaggttccatttatttacacaagaggtgcttaccactttaaagatccacaatacccagtttgggaattgacaattagagtttggtcagaattaaatattgggacaggaacttcagcttatacttcactcaatgttttagctagatttacagatttggagttgcatggattaactcctctttctacacaaatgatgagaaatgaatttagggtcagtactactgagaatgtggtgaatctgtcaaattatgaagatgcaagagcaaagatgtcttttgctttggatcaggaagattggaaatctgatccgtcccagggtggtgggatcaaaattactcattttactacttggacatctattccaactttggctgctcagtttccatttaatgcttcagactcagttggtcaacaaattaaagttattccagttgacccatattttttccaaatgacaaatacaaatcctgaccaaaaatgtataactgctttggcttctatttgtcagatgttttgtttttggagaggagatcttgtctttgattttcaagtttttcccaccaaatatcattcaggtagattactgttttgttttgttcctggcaatgagctaatagatgtttctggaatcacattaaagcaagcaactactgctccttgtgcagtaatggatattacaggagtgcagtcaactttgagatttcgtgttccctggatttctgacactccttacagagtgaacaggtatacaaagtcagcacatcagaaaggtgagtacactgccattgggaagcttattgtgtattgttataacagattgacctctccttctaacgttgcttcccatgtcagagtgaatgtttatctttcagcaattaacttggaatgttttgctcctctttatcatgctatggatgttactacacaagttggagatgattctggaggtttttcaacaacagtttctacagaacagaatgttccagatccccaagttggtgtaacaaccatgaaagatttgaaaggaaaagctaacagagggaaaatggatgtttcaggagtacaagcacctgtgggagctatcacaacaattgaggatccagttttagcaaagaaagtacctgagacatttcctgaattgaaacctggagaatccagacatacatcagatcatatgtccatctacaagtttatgggaaggtctcatttcttgtgcacttttacattcaattcaaataataaagagtacacatttcctataaccttgtcttcaacctctaatcctcctcatggtttgccatcaacactgaggtggtttttcaacttgtttcagttgtatagagggcctttagatctgacaattattattacaggagcaactgatgtagatggcatggcctggttcactccagtaggtcttgccgttgatactccttgggtagagaaggagtcagctttgtctattgactacaaaactgctcttggagctgtcagatttaacacaaggagaacagggaacattcagattagattaccatggtattcttatttatatgctgtgtctggagcactggatggtttgggagacaagacagattctacatttggattggtttctattcagattgcaaattacaatcattctgatgaatacttgtcttttagttgttatttgtctgtcacagaacaatcagagttttattttcccagagctccattgaactcaaatgccatgttatccactgtatcaatgatgagcagaattgcagctggagacttggagtcatcagtggatgatcctagatcagaggaagataaaagatttgagagtcatatagaatgcaggaagccatataaagaactgagattagaagttgggaaacaaagactcaagtatgctcaggaagaattgtcaagtgaagtacttccaccccctaggaaaatgaagggactgttttcacaagccaaaatttctcttttttatactgaggagcatgaaataatgaagttttcctggagaggtgtgactgctgatactagagctttaaggaggtttggattctctttggccgcaggcagaagtgtgtggactcttgaaatggatgctggggttcttactgggagactgattagattgaatgatgagaaatggacagaaatgaaggatgacaaggttgtttcattgattgaaaagtttacaagtaacaaatattggtccaaagtgaatttcccacatgggatgttggatcttgaagaaattgctgccaattctaaggattttcctaacatgtctgaaacggatttgtgtttcttgctgcattggttaaatccaaagaaaattaatttagcagatagaatgcttggattgtctggagttcaggaaattaaagaacaaggtgttggattaatagcagagtgtagaactttcttagattctattgctggaactttaaaatctatgatgtttggatttcatcattctgtgactgttgaaattataaacactgtgctctgttttgttaagagtggaattttgctttatgtaatacaacaattgaatcaggatgaacattctcacataattggtttgttgagagtcatgaattatgtagacattggttgttcagttatttcatgtgccaaagttttttccaaaatgctggaaacagtctttaattggcaaatggactccagaatgatggagttaaggactcagagtttttccaactggttaagagatatttgttctgggatcaccattttcaaaaacttcaaggatgcaatttattggctttatacaaaattaatggacttttatgaagtgaattatggcaagaagaaggacattttaaatattcttaaagataaccaacaaaaaatagagaaagccattgaggaagccgataaattttgcattttgcaaatccaagatgtggaaaaatctgaacagtatcagaaaggggttgacttgatacaaaaattgagaactgttcattcaatggctcaggttgatccaaatttaatggttcatttgtcacctttgagagattgtatagcaagagttcatcagaaacttaaaaaccttggatctataaatcaggcaatggtaacgagatgtgagccagttgtttgttatttatatggcaaaagagggggaggaaagagcttaacatcaattgcattggcaaccaaaatttgtaaacattatggtgttgagcctgaaaagaatatctatactaaacctgtggcttcagattactgggatggatatagtggacaattaatttgcatcattgatgatattggccaaaacacaacagatgaggattggtcagatttttgtcagttagtgtcaggatgtccaatgagattaaacatggcctctcttgaggagaagggtaggcatttttcttctccttttataatagcaacttcaaattggtcaaatccaagtccaaaaacagtttatgttaaggaagcaattgaccgcagactccatttcaaggttgaagttaaacctgcctcatttttcaaaaatcctcacaatgatatgttgaatgttaatttagctaaaacaaatgatgcaatcaaagatatgtcctgtgttgatttgataatggatggacataatgtttcattgatggatttgctcagttctttagtcatgacagttgaaattagaaaacaaaacatgactgaattcatggggttgtggtctcagggaatttcagatgatgataatgatagtgcagtagctgagtttttccagtcttttccatctggtgaaccatcgaactctaaattatctggctttttccaatctgttactaatcacaagtgggttgctgtgggagctgcagttggcattcttggagtgctcgttggaggatggtttgtgtataagcatttctcccgcaaagaggaagaaccaatcccagctgaaggggtatattatggtgtaactaagcccaagcaagtgattaaattagatgcagatccagtagaatctcagtcaactttggaaatagcaggactggttaggaagaacttggttcagtttggagttggagagaagaatggatgtgtgagatgggttatgaatgccttgggagtgaaagatgattggctgcttgtgccttcccatgcttataaatttgagaaagattatgaaatgatggagttttattttaatagaggtggaacttactattcaatttcagctggtaatgttgttattcaatctttggatgtgggattccaggatgttgttctgatgaaggttcctacaattcctaagtttagagatattactcagcattttattaagaaaggggatgtgcctagagctttgaatcgcctggcaacattagtgacaactgtaaatggaacccctatgttaatttctgagggcccactaaagatggaagagaaagctacttatgttcataagaaaaatgatggtacagcagttgatttaactgtggatcaggcatggagaggaaaaggcgaaggtcttcctggaatgtgtggtggggccttggtttcatcgaatcaatctatacagaatgcaatcttgggcatccatgttgctggaggaaattcaattcttgttgcaaaattggttactcaagaaatgttccaaaatattgataagaaaattgaaagtcagagaattatgaaagtggagtttactcagtgttcaatgaatgtggtctccaaaacgctttttagaaagagtcccattcatcatcacattgataaaaccatgattaattttcctgcagctatgcccttttctaaagctgaaattgatccaatggctgtgatgttatctaagtattcattacctattgtagaagaaccagagaattataaagaggcttcaattttttatcaaaataaaatagtgggtaagactcagttagttgatgattttctagatcttgatatggccattacaggggccccaggaattgatgctatcaacatggattcatctcctggatttccttatgtccaggagaagttgaccaaaagagatttaatttggttggatgaaaatggtttattgctgggagttcatccaagattggctcagagaatcttattcaatactgtcatgatggaaaattgttctgatttggatgttgtttttacaacctgtccaaaagatgaattgagaccattagagaaagtgttggaatcaaaaacaagagctattgatgcttgtcctctggattacacaattttgtgccgaatgtattggggtccagctattagttattttcatttgaatccaggtttccatacaggtgttgctattggcatagatcctgatagacagtgggatgaattatttaaaacaatgataagattcggagatgttggtcttgatttagatttctctgcttttgatgctagtcttagtccatttatgattagagaagcaggtagaatcatgagtgaactatctggaactccatcccattttggcacagctcttatcaatactatcatttattccaagcatttgctgtataactgttgttaccatgtctgtggttcaatgccctctgggtctccttgtacagctttgctaaattcaattattaataatgtcaatttgtattatgtgttttccaagatatttggaaagtctccagttttcttttgtcaggctttgaagattctctgttatggagatgatgttttaatagttttctctcgagatgttcagattgataatcttgatctgattggacaaaaaattgtagatgagtttaagaaacttggcatgacagctacttctgctgacaagaatgtacctcagctgaaaccagtttcggaattgacttttctcaaaagatctttcaatttggtagaggatagaattagacctgcaatttcggaaaaaacaatttggtctttaatagcatggcagagaagtaacgctgagtttgagcagaatttagaaattgctcagtggtttgcttttatgcatggctatgagttttatcagaaattttattattttgttcagtcctgtttggagaaagagatgatagaatacagacttaaatcttatgattggtggagaatgagattttatgaccagtgtttcatttgtgacctttcatga-3’。

所述步骤S1具体包括如下步骤：

S11、将Walvax-2二倍体细胞培养为单层细胞后，接种HAV：按照“1ml待测样品/25cm2”的接种量，将未灭活样品、已灭活样品（终浓度为1:4000的甲醛，37℃灭活14天）分别接种至细胞上。HAV中目的基因为甲肝病毒YN5D株（+）RNA基因组中编码RNA依赖的RNA聚合酶P3D蛋白的基因的一部分，其序列如下：5’-gtgatgttatctaagtattcattacctattgtagaagaaccagagaattataaagaggcttcaattttttatcaaaataaaatagtgggtaagactcagttagttgatgattttctagatcttgatatggccattacaggggccccaggaattgatgctatcaacatggattcatctcctggatttccttatgtccaggagaagttgaccaaaagagatttaatttggttggatgaaaatggtttattgctgggagttcatccaagattggctcagagaatcttattcaatactgtcatgatggaaaattgttctgatttggatgttgtttttacaacctgtccaaaagatgaattgagaccattagagaaagtgttggaatcaaaaacaagagctattgatgcttgtcctctggattacacaattttgtgccgaatgtattggggtccagctattagttattttcatttgaatccaggtttccatacaggtgttgctattggcatagatcctgatagacagtgggatgaattatttaaaacaatgataagattcggagatgttggtcttgatttagatttctctgcttttgatgctagtcttagtccatttatgattagagaagcaggtagaatcatgagtgaactatctggaactccatcccattttggcacagctcttatcaatactatcatttattccaagcatttgctgtataactgttgttaccatgtctgtggttcaatgccctctgggtctccttgtacagctttgctaaatt-3’，在36-38℃下吸附培养1-2h，吸弃吸附液。

S12、加入PBS清洗3次，洗去未吸附病毒，补加足量的维持液悬浮细胞，得到细胞悬浮液，在36-38℃下培养，期间，根据细胞维持状态，间隔7~12d更换维持液；培养结束后，弃维持液，用PBS清洗3次。所述维持液的配方包括MEM培养基、体积浓度2%的牛血清、体积浓度2-3%的GIn、体积浓度4-7%的NaHCO₃。一个培养瓶的细胞悬液平均分到2个或4个培养瓶中，补足细胞生长液，置37±1℃培养。分种到2个培养瓶的，细胞代次加1；分种到4个培养瓶的，细胞代次加2。

S12、维持液培养结束后，用细胞消化液消化细胞，收获带病毒细胞：未灭活样品细胞和已灭活样品细胞，以PBS为阴性对照的接种细胞，收获的阴性对照细胞，所述细胞消化液包括浓度为0.25%的胰蛋白酶、40mM的EDTA2Na。

S2、从步骤S1得到的带病毒细胞中提取总RNA，按照试剂盒和产品说明书进行未灭活样品细胞、已灭活样品细胞和阴性对照细胞的总RNA提取，得总RNA样品。

S3、以所述总RNA作为模板，采用第一引物（T1A）进行逆转录（RT）反应，用核糖核酸酶处理逆转录反应体系，降解RNA，37℃保温30min 后待用。

所述第一引物（T1A）YN5D 株(+)RNA ORF的5368~5384，其基因序列为：TCCTACGTAATATCCGTGATGTTATCTAAGTA，所述逆转录反应的反应条件和过程如表1所示。

表1

S4、以步骤S3得到的逆转录反应产物为模板，使用第二引物（T1）和第三引物（T2B）进行第一次聚合酶链式（PCR）反应，得到第一次聚合酶链式反应产物。所述第二引物（T1）为与YN5D 株(+)RNA不同源、不互补的序列，其基因序列为：TCCTACGTAATATCC。所述第三引物（T2B）为YN5D 株(+)RNA ORF的6129~6148的互补序列，其基因序列为：GTACCTATAATGCATCCTAATTTAGCAAAGCTGTACAA。

所述第一次聚合酶链式反应的反应条件和过程如表2所示。

表2

S5、以步骤S4得到的产物为模板，使用第四引物（C）和第五引物（T2）进行第二次聚合酶链式反应（PCR）反应，得到第二次聚合酶链式反应产物，所述第四引物（C）为YN5D 株(+)RNAORF的5798~5816，其基因序列为GCCGAATGTATTGGGGTCC，所述第五引物（T2）为与YN5D 株(+)RNA和T1不同源、不互补的序列，其基因序列为GTACCTATAATGCATCCT。所述第二次聚合酶链式反应的反应条件和过程如表3所示。

表3

S6、分别取5μL所述第一次聚合酶链式反应产物、第二次聚合酶链式反应产物与适量上样缓冲液（Loading Buffer）混合，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，判断是否存在负链RNA，电泳条件为：电压100V，检测时间15-30min。检测结果如图1所示，第一次PCR反应物条带大小为814bp，各样品均无电泳条带，第二次PCR反应条带大小为369bp，已灭活样品和阴性对照均无电泳条带，仅未灭活样品的第二轮PCR产物在250bp和500bp间有电泳条带，证明本法具有负链特异性，本法成立。图1中序号分别表示：1：未灭活样品-第二次， 2：未灭活样品-第一次，3：已灭活样品-第二次，4：已灭活样品-第一次，5：阴性对照-第二次， M：Marker，6：阴性对照-第一次。

上述检测方法可用于甲型肝炎病毒滴度滴定和灭活验证。

实验例

1、HAV灭活效果验证（1）：培养法（现行版《中国药典》的方法）

按照步骤S1的方法，将待测样品1（终浓度为1:4000的甲醛，37℃灭活14天）和待测样品2（终浓度为1:32000的甲醛，37℃灭活14天）接种到人二倍体细胞上，在35±1℃下培养24d，期间，根据细胞维持状态，间隔7~12d左右一次，更换维持液。培养结束后，用细胞消化液消化细胞，收获带病毒细胞，破碎/裂解带病毒细胞后得第一代样品，-70℃保存备检。同法，将第一代样品接种至人二倍体细胞进行第二代培养，收获带病毒细胞，破碎/裂解带病毒细胞后得第二代样品，-70℃保存备检。同法，将第二代样品接种至人二倍体细胞进行第三代培养，收获带病毒细胞，破碎/裂解带病毒细胞后得第三代样品，-70℃保存备检。

同法，以未灭活的HAV为阳性对照进行接种、培养、收获，得阳性对照的第一代、第二代、第三代样品。同法，以PBS进行接种、培养、收获，得阴性对照的第一代、第二代、第三代样品。

用酶联免疫法对待测样品1、待测样品2、阳性对照和阴性对照的第一代、第二代和第三代样品检测甲肝病毒。阴性对照样品的结果为阴性，阳性对照样品的结果为阳性，实验成立；待测样品1的三代的结果均为阴性，说明HAV灭活成功，待测样品2的结果第二代为弱阳性、第三代为强阳性，说明HAV灭活不完全，检测结果如表4所示。

表4

2、HAV灭活效果验证（2）：(-)RNA·RT-PCR法

按照步骤S1，将待测样品1、2接种到人二倍体细胞上，置35±1℃分别培养3d、5d、7d、10d、14d、24d；期间，根据细胞维持状态，间隔7~12d左右一次，更换维持液。培养结束后，用细胞消化液消化细胞，收获带毒细胞，得各培养天数的样品。

各培养天数的样品按照步骤S2-S6，用(-)RNA•RT-PCR法进行HAV(-)RNA的检测。阴性对照样品各天的结果均为为阴性；阳性对照样品从5d开始的样品的结果均为阳性；待测样品1的各天的结果均为阴性，说明HAV灭活成功，待测样品2的3d、5d的结果为阴性，7d代的为弱阳性，10d~24d的为阳性，说明HAV灭活不完全。检测结果如表5所示。

表5

上述检测结果表明：

（1）待测样品2和阳性对照均在10d左右达到增殖高峰，并维持至24d；

（2）(-)RNA•RT-PCR法的10d的结果已与培养法的相当，但仅耗时10天，仅为培养法的72天的1/7，且仅需要准备一次细胞、进行一次待测样品的接种、培养、收获。

3、HAV滴度滴定比较（1）：培养法（现行版《中国药典》的方法）

将4批HAV样品做10倍系列稀释，取10-5、10^-6、10^-7、10^-8等4个稀释度的病毒稀释液，按照实施例02的方法，分别接种人二倍体细胞，每个稀释度接种4瓶T25细胞，置35±1℃培养24d，收获带毒细胞后，破碎/裂解细胞释放甲肝病毒，用酶联免疫法测定，依据Reed-Muench法计算病毒滴度，测试结果如表6所示。

表6

5、HAV滴度滴定（2）：(-)RNA·RT-PCR法

将与实验例3中相同的4批HAV样品做10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-8等4个稀释度的病毒稀释液，按照实施例02的方法，分别接种人二倍体细胞，每个稀释度接种4瓶T25细胞，置35±1℃培养10d，收获带毒细胞后，破碎/裂解细胞释放甲肝病毒，按照实施例03~07，用(-)RNA•RT-PCR法测定，依据Reed-Muench法计算病毒滴度，计算结果如表7所示。

表7

由表6-7可看出，两种方法检测4 批冻干甲肝减毒活疫苗的病毒滴度接近，差异无统计学意义（t = 0.40627，P ＞ 0. 05），且(-)RNA•RT-PCR法需要的时间仅10天，是培养法（24天）的一半不到。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 云南沃森生物技术股份有限公司

<120> 一种甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法及应用

<130> 2018.12

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6684

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaacatgt ctagacaagg tattttccag actgttggga gtggtcttga ccacatcctg 60

tctttggcag acattgagga agagcaaatg attcaatcag ttgataggac tgcagtgact 120

ggttcttctt attttacttc tgtggatcaa tcttcagttc atacagctga ggttggatca 180

caccaggttg aacctttgag aacctctgtt gataaacccg gttcaaagag gactcaggga 240

gagaaatttt tcttgattca ttctgcagat tggcttacta cacatgctct tttccatgaa 300

gttgcaaaat tggatgtggt gaaattatta tacaatgagc agtttgctgt tcaagggttg 360

ttgagatacc atacatatgc aagatttggc attgaaattc aagttcagat aaaccctaca 420

cctttccaac aggggggatt gatttgtgct atggttcctg gtgaccagag ctatggttct 480

atagcatcat tgactgttta tcctcatggt ttgttaaatt gcaatattaa caatgtggtt 540

agaataaagg ttccatttat ttacacaaga ggtgcttacc actttaaaga tccacaatac 600

ccagtttggg aattgacaat tagagtttgg tcagaattaa atattgggac aggaacttca 660

gcttatactt cactcaatgt tttagctaga tttacagatt tggagttgca tggattaact 720

cctctttcta cacaaatgat gagaaatgaa tttagggtca gtactactga gaatgtggtg 780

aatctgtcaa attatgaaga tgcaagagca aagatgtctt ttgctttgga tcaggaagat 840

tggaaatctg atccgtccca gggtggtggg atcaaaatta ctcattttac tacttggaca 900

tctattccaa ctttggctgc tcagtttcca tttaatgctt cagactcagt tggtcaacaa 960

attaaagtta ttccagttga cccatatttt ttccaaatga caaatacaaa tcctgaccaa 1020

aaatgtataa ctgctttggc ttctatttgt cagatgtttt gtttttggag aggagatctt 1080

gtctttgatt ttcaagtttt tcccaccaaa tatcattcag gtagattact gttttgtttt 1140

gttcctggca atgagctaat agatgtttct ggaatcacat taaagcaagc aactactgct 1200

ccttgtgcag taatggatat tacaggagtg cagtcaactt tgagatttcg tgttccctgg 1260

atttctgaca ctccttacag agtgaacagg tatacaaagt cagcacatca gaaaggtgag 1320

tacactgcca ttgggaagct tattgtgtat tgttataaca gattgacctc tccttctaac 1380

gttgcttccc atgtcagagt gaatgtttat ctttcagcaa ttaacttgga atgttttgct 1440

cctctttatc atgctatgga tgttactaca caagttggag atgattctgg aggtttttca 1500

acaacagttt ctacagaaca gaatgttcca gatccccaag ttggtgtaac aaccatgaaa 1560

gatttgaaag gaaaagctaa cagagggaaa atggatgttt caggagtaca agcacctgtg 1620

ggagctatca caacaattga ggatccagtt ttagcaaaga aagtacctga gacatttcct 1680

gaattgaaac ctggagaatc cagacataca tcagatcata tgtccatcta caagtttatg 1740

ggaaggtctc atttcttgtg cacttttaca ttcaattcaa ataataaaga gtacacattt 1800

cctataacct tgtcttcaac ctctaatcct cctcatggtt tgccatcaac actgaggtgg 1860

tttttcaact tgtttcagtt gtatagaggg cctttagatc tgacaattat tattacagga 1920

gcaactgatg tagatggcat ggcctggttc actccagtag gtcttgccgt tgatactcct 1980

tgggtagaga aggagtcagc tttgtctatt gactacaaaa ctgctcttgg agctgtcaga 2040

tttaacacaa ggagaacagg gaacattcag attagattac catggtattc ttatttatat 2100

gctgtgtctg gagcactgga tggtttggga gacaagacag attctacatt tggattggtt 2160

tctattcaga ttgcaaatta caatcattct gatgaatact tgtcttttag ttgttatttg 2220

tctgtcacag aacaatcaga gttttatttt cccagagctc cattgaactc aaatgccatg 2280

ttatccactg tatcaatgat gagcagaatt gcagctggag acttggagtc atcagtggat 2340

gatcctagat cagaggaaga taaaagattt gagagtcata tagaatgcag gaagccatat 2400

aaagaactga gattagaagt tgggaaacaa agactcaagt atgctcagga agaattgtca 2460

agtgaagtac ttccaccccc taggaaaatg aagggactgt tttcacaagc caaaatttct 2520

cttttttata ctgaggagca tgaaataatg aagttttcct ggagaggtgt gactgctgat 2580

actagagctt taaggaggtt tggattctct ttggccgcag gcagaagtgt gtggactctt 2640

gaaatggatg ctggggttct tactgggaga ctgattagat tgaatgatga gaaatggaca 2700

gaaatgaagg atgacaaggt tgtttcattg attgaaaagt ttacaagtaa caaatattgg 2760

tccaaagtga atttcccaca tgggatgttg gatcttgaag aaattgctgc caattctaag 2820

gattttccta acatgtctga aacggatttg tgtttcttgc tgcattggtt aaatccaaag 2880

aaaattaatt tagcagatag aatgcttgga ttgtctggag ttcaggaaat taaagaacaa 2940

ggtgttggat taatagcaga gtgtagaact ttcttagatt ctattgctgg aactttaaaa 3000

tctatgatgt ttggatttca tcattctgtg actgttgaaa ttataaacac tgtgctctgt 3060

tttgttaaga gtggaatttt gctttatgta atacaacaat tgaatcagga tgaacattct 3120

cacataattg gtttgttgag agtcatgaat tatgtagaca ttggttgttc agttatttca 3180

tgtgccaaag ttttttccaa aatgctggaa acagtcttta attggcaaat ggactccaga 3240

atgatggagt taaggactca gagtttttcc aactggttaa gagatatttg ttctgggatc 3300

accattttca aaaacttcaa ggatgcaatt tattggcttt atacaaaatt aatggacttt 3360

tatgaagtga attatggcaa gaagaaggac attttaaata ttcttaaaga taaccaacaa 3420

aaaatagaga aagccattga ggaagccgat aaattttgca ttttgcaaat ccaagatgtg 3480

gaaaaatctg aacagtatca gaaaggggtt gacttgatac aaaaattgag aactgttcat 3540

tcaatggctc aggttgatcc aaatttaatg gttcatttgt cacctttgag agattgtata 3600

gcaagagttc atcagaaact taaaaacctt ggatctataa atcaggcaat ggtaacgaga 3660

tgtgagccag ttgtttgtta tttatatggc aaaagagggg gaggaaagag cttaacatca 3720

attgcattgg caaccaaaat ttgtaaacat tatggtgttg agcctgaaaa gaatatctat 3780

actaaacctg tggcttcaga ttactgggat ggatatagtg gacaattaat ttgcatcatt 3840

gatgatattg gccaaaacac aacagatgag gattggtcag atttttgtca gttagtgtca 3900

ggatgtccaa tgagattaaa catggcctct cttgaggaga agggtaggca tttttcttct 3960

ccttttataa tagcaacttc aaattggtca aatccaagtc caaaaacagt ttatgttaag 4020

gaagcaattg accgcagact ccatttcaag gttgaagtta aacctgcctc atttttcaaa 4080

aatcctcaca atgatatgtt gaatgttaat ttagctaaaa caaatgatgc aatcaaagat 4140

atgtcctgtg ttgatttgat aatggatgga cataatgttt cattgatgga tttgctcagt 4200

tctttagtca tgacagttga aattagaaaa caaaacatga ctgaattcat ggggttgtgg 4260

tctcagggaa tttcagatga tgataatgat agtgcagtag ctgagttttt ccagtctttt 4320

ccatctggtg aaccatcgaa ctctaaatta tctggctttt tccaatctgt tactaatcac 4380

aagtgggttg ctgtgggagc tgcagttggc attcttggag tgctcgttgg aggatggttt 4440

gtgtataagc atttctcccg caaagaggaa gaaccaatcc cagctgaagg ggtatattat 4500

ggtgtaacta agcccaagca agtgattaaa ttagatgcag atccagtaga atctcagtca 4560

actttggaaa tagcaggact ggttaggaag aacttggttc agtttggagt tggagagaag 4620

aatggatgtg tgagatgggt tatgaatgcc ttgggagtga aagatgattg gctgcttgtg 4680

ccttcccatg cttataaatt tgagaaagat tatgaaatga tggagtttta ttttaataga 4740

ggtggaactt actattcaat ttcagctggt aatgttgtta ttcaatcttt ggatgtggga 4800

ttccaggatg ttgttctgat gaaggttcct acaattccta agtttagaga tattactcag 4860

cattttatta agaaagggga tgtgcctaga gctttgaatc gcctggcaac attagtgaca 4920

actgtaaatg gaacccctat gttaatttct gagggcccac taaagatgga agagaaagct 4980

acttatgttc ataagaaaaa tgatggtaca gcagttgatt taactgtgga tcaggcatgg 5040

agaggaaaag gcgaaggtct tcctggaatg tgtggtgggg ccttggtttc atcgaatcaa 5100

tctatacaga atgcaatctt gggcatccat gttgctggag gaaattcaat tcttgttgca 5160

aaattggtta ctcaagaaat gttccaaaat attgataaga aaattgaaag tcagagaatt 5220

atgaaagtgg agtttactca gtgttcaatg aatgtggtct ccaaaacgct ttttagaaag 5280

agtcccattc atcatcacat tgataaaacc atgattaatt ttcctgcagc tatgcccttt 5340

tctaaagctg aaattgatcc aatggctgtg atgttatcta agtattcatt acctattgta 5400

gaagaaccag agaattataa agaggcttca attttttatc aaaataaaat agtgggtaag 5460

actcagttag ttgatgattt tctagatctt gatatggcca ttacaggggc cccaggaatt 5520

gatgctatca acatggattc atctcctgga tttccttatg tccaggagaa gttgaccaaa 5580

agagatttaa tttggttgga tgaaaatggt ttattgctgg gagttcatcc aagattggct 5640

cagagaatct tattcaatac tgtcatgatg gaaaattgtt ctgatttgga tgttgttttt 5700

acaacctgtc caaaagatga attgagacca ttagagaaag tgttggaatc aaaaacaaga 5760

gctattgatg cttgtcctct ggattacaca attttgtgcc gaatgtattg gggtccagct 5820

attagttatt ttcatttgaa tccaggtttc catacaggtg ttgctattgg catagatcct 5880

gatagacagt gggatgaatt atttaaaaca atgataagat tcggagatgt tggtcttgat 5940

ttagatttct ctgcttttga tgctagtctt agtccattta tgattagaga agcaggtaga 6000

atcatgagtg aactatctgg aactccatcc cattttggca cagctcttat caatactatc 6060

atttattcca agcatttgct gtataactgt tgttaccatg tctgtggttc aatgccctct 6120

gggtctcctt gtacagcttt gctaaattca attattaata atgtcaattt gtattatgtg 6180

ttttccaaga tatttggaaa gtctccagtt ttcttttgtc aggctttgaa gattctctgt 6240

tatggagatg atgttttaat agttttctct cgagatgttc agattgataa tcttgatctg 6300

attggacaaa aaattgtaga tgagtttaag aaacttggca tgacagctac ttctgctgac 6360

aagaatgtac ctcagctgaa accagtttcg gaattgactt ttctcaaaag atctttcaat 6420

ttggtagagg atagaattag acctgcaatt tcggaaaaaa caatttggtc tttaatagca 6480

tggcagagaa gtaacgctga gtttgagcag aatttagaaa ttgctcagtg gtttgctttt 6540

atgcatggct atgagtttta tcagaaattt tattattttg ttcagtcctg tttggagaaa 6600

gagatgatag aatacagact taaatcttat gattggtgga gaatgagatt ttatgaccag 6660

tgtttcattt gtgacctttc atga 6684

<210> 2

<211> 781

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgatgttat ctaagtattc attacctatt gtagaagaac cagagaatta taaagaggct 60

tcaatttttt atcaaaataa aatagtgggt aagactcagt tagttgatga ttttctagat 120

cttgatatgg ccattacagg ggccccagga attgatgcta tcaacatgga ttcatctcct 180

ggatttcctt atgtccagga gaagttgacc aaaagagatt taatttggtt ggatgaaaat 240

ggtttattgc tgggagttca tccaagattg gctcagagaa tcttattcaa tactgtcatg 300

atggaaaatt gttctgattt ggatgttgtt tttacaacct gtccaaaaga tgaattgaga 360

ccattagaga aagtgttgga atcaaaaaca agagctattg atgcttgtcc tctggattac 420

acaattttgt gccgaatgta ttggggtcca gctattagtt attttcattt gaatccaggt 480

ttccatacag gtgttgctat tggcatagat cctgatagac agtgggatga attatttaaa 540

acaatgataa gattcggaga tgttggtctt gatttagatt tctctgcttt tgatgctagt 600

cttagtccat ttatgattag agaagcaggt agaatcatga gtgaactatc tggaactcca 660

tcccattttg gcacagctct tatcaatact atcatttatt ccaagcattt gctgtataac 720

tgttgttacc atgtctgtgg ttcaatgccc tctgggtctc cttgtacagc tttgctaaat 780

t 781

<210> 3

<211> 32

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcctacgtaa tatccgtgat gttatctaag ta 32

<210> 4

<211> 15

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcctacgtaa tatcc 15

<210> 5

<211> 38

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtacctataa tgcatcctaa tttagcaaag ctgtacaa 38

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccgaatgta ttggggtcc 19

<210> 7

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtacctataa tgcatcct 18

Claims (10)

1.一种甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、培养人二倍体细胞，并接种HAV，得到带病毒细胞；

S2、从步骤S1得到的带病毒细胞中提取总RNA；

S3、以所述总RNA作为模板，采用第一引物进行逆转录反应，用核糖核酸酶处理逆转录反应体系，降解RNA；

S4、以步骤S3得到的逆转录反应产物为模板，使用第二引物和第三引物进行第一次聚合酶链式反应，得到第一次聚合酶链式反应产物；

S5、以步骤S4得到的产物为模板，使用第四引物和第五引物进行第二次聚合酶链式反应，得到第二次聚合酶链式反应产物；

S6、将所述第一次聚合酶链式反应产物、第二次聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，判断是否存在负链RNA。

2.根据权利要求1所述的甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法，其特征在于，所述第一引物的基因序列为TCCTACGTAATATCCGTGATGTT

ATCTAAGTA；所述第二引物的基因序列为TCCTACGTAATATCC；所述第三引物的基因序列为GTACCTATAATGCATCCTAATTTAGCAAAGCTGTA

CAA；所述第四引物的基因序列为GCCGAATGTATTGGGGTCC；所述第五引物的基因序列为GTACCTATAATGCATCCT。

3.根据权利要求2所述的甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法，其特征在于，所述步骤S1包括如下步骤：

S11、将人二倍体细胞培养为单层细胞，并接种HAV，在36-38℃下吸附1-2h；

S12、洗除未吸附病毒后加入维持液，在36-38℃下培养；

S13、用细胞消化液收获带病毒细胞。

4.根据权利要求3所述的甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法，其特征在于，所述步骤S3中所述的逆转录反应在逆转录反应体系中进行，所述逆转录反应体系包括：浓度为25mM的MgCl₂、10 x RNA PCR 缓冲液、RNase Free dH₂O、浓度为10mM的dNTP Mixture、逆转录抑制剂、AMV反转录酶、浓度为10 µmol/L的第一引物、总RNA。

5.根据权利要求4所述的甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法，其特征在于，所述逆转录反应包括在55℃下反应30min、在95℃下反应5min、在5℃下反应5min的步骤。

6.根据权利要求5所述的甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法，其特征在于，所述步骤S4所述的第一次聚合酶链式反应在第一次聚合酶链式反应体系中进行，所述第一次聚合酶链式反应体系包括：浓度为25mM的MgCl₂、10×LA PCR缓冲液、浓度为10mM的dNTPMixture、TaKaRa LA Taq、第二引物、第三引物、逆转录反应产物和灭菌水。

7.根据权利要求6所述的甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法，其特征在于，所述步骤S5所述的第二次聚合酶链式反应产物在第二次聚合酶链式反应体系中进行，所述第二次聚合酶链式反应体系包括：浓度为25mM的MgCl₂、10×LA PCR缓冲液、浓度为10mM的dNTP Mixture、TaKaRa LA Taq、第四引物、第五引物、第一次聚合酶链式反应产物和灭菌水。

8.根据权利要求7所述的甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法，其特征在于，所述第一次聚合酶链式反应、第二次聚合酶链式反应均包括：第一循环：在94℃下反应2min；第二循环：在94℃下反应30s、在55℃下反应30s、在72℃下反应1min；第三循环：在72℃下反应2min，其中第一循环的次数为1次，第二循环的次数为35次。

9.根据权利要求8所述的甲型肝炎病毒的负链RNA分子生物学检测方法，其特征在于，所述步骤S6所述的电泳条件为电压100V、反应时间15-30min。

10.一种如权利要求1-9任一项所述的方法在甲型肝炎病毒滴度滴定和灭活验证中的应用。