CN110624115B

CN110624115B - 钙网蛋白calr在猪抗病中的应用

Info

Publication number: CN110624115B
Application number: CN201910848326.2A
Authority: CN
Inventors: 谢胜松; 赵书红; 李新云; 肖天贺; 赵长志; 刘海龙; 王子畅; 聂雄伟; 阮进学; 张金福
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-09-09
Filing date: 2019-09-09
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2039-09-09
Also published as: CN110624115A

Abstract

本发明提供了一种钙网蛋白(CALR)的应用，用于抑制病毒尤其是日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)在宿主细胞中复制,从而抵抗JEV病毒复制引起的疾病，提供针对流行性乙型脑炎的抗病性。本发明还提供了一种对抗病毒感染的细胞株和一种非人哺乳动物的抗流行性乙型脑炎动物模型及其制备方法。CALR在哺乳动物中高度保守，因此可以广泛应用于人畜共患传染疾病的预防与治疗，同时可以作为基因编辑动物设计的潜在靶点，减少药物滥用，避免疫情发生，具有丰富的经济价值。

Description

钙网蛋白CALR在猪抗病中的应用

技术领域

本发明涉及动物抗病育种领域，具体涉及钙网蛋白CALR在猪抗病中的应用。

背景技术

流行性乙型脑炎(简称乙脑病)是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus,JEV)感染引起的一种人畜共患病，该病毒又被称为日本脑炎病毒，属于国家二类动物疫病。流行性乙型脑炎是严重危害人畜健康的神经性传染疾病。蚊虫是该种疾病的中间传播媒介，主要通过带毒的蚊虫叮咬患病猪传播疾病，以蚊虫、猪、蚊虫的形式在猪场中广泛传播。因此猪乙型脑炎有着典型的季节性，多发生于蚊虫较多，大量繁殖的夏秋季节，属于自然疫源性疾病。猪场中暴发猪乙型脑炎后，公猪睾丸肿大，精子可带毒通过配种传染；怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎；初生仔猪脑炎、共济失调、发热、死亡。目前该种疾病还没有特效治疗药物，发病后要及时采取措施，需将患病猪扑杀进行无害化处理。尽管乙脑疫苗是预防流行性乙型脑炎的有效措施，但由于JEV感染机制尚不清楚，目前尚无有效的治疗药物，尤其缺乏有效分子靶点。

因此，本领域迫切需要开发一种新的有效调控动物尤其是猪的流行性乙型脑炎抗病性的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的有效调控动物尤其是猪的流行性乙型脑炎抗病性的方法。

本发明的第一方面提供了一种CALR抑制剂的用途，其特征在于，用来制备抗流行性乙型脑炎的化合物或药物组合物。

在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：靶向CALR蛋白的抗体或小分子抑制剂、CALR基因靶向核酸分子或基因编辑器、或其组合。

在另一优选例中，所述基因编辑器包括DNA基因编辑器和RNA基因编辑器。

在另一优选例中，所述基因编辑器包括gRNA和基因编辑蛋白。

在另一优选例中，所述gRNA是引导基因编辑蛋白特异性结合CALR基因的RNA。

在另一优选例中，所述gRNA引导基因编辑蛋白特异性结合于CALR基因的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白选自下组：CasRx、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、或其组合。

本发明的第二方面提供了一种组合物，其特征在于，包括：

(a)基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自下组：CasRx、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、或其组合；和

(b)gRNA或其表达载体，其中所述gRNA是引导所述基因编辑蛋白特异性结合CALR基因的RNA。

在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。

在另一优选例中，所述组合物还包括：

(c)其他预防和/或治疗流行性乙型脑炎的药物活性成分。

在另一优选例中，所述组分(a)和/或(b)中的所述表达载体包括病毒载体。

在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、SV40、痘病毒、或其组合。

在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、或其组合，较佳地，所述载体为腺相关病毒(AAV)。

在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物的剂型为液体制剂。

在另一优选例中，所述组合物的剂型为注射剂型。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白的表达载体和gRNA的表达载体为同一载体或不同载体。

在另一优选例中，所述组分(a)与组分(b)的重量比为100:1-0.01:1，较佳地，10:1-0.1:1，更佳地，2:1-0.5:1。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(a)的含量为0.0001-99wt％，较佳地，0.1-90wt％，更佳地，1-70wt％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(b)的含量为0.0001-99wt％，较佳地，0.01-90wt％，更佳地，0.1-70wt％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(c)的含量为0.1-99wt％，较佳地，10-90wt％，更佳地，30-70wt％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(a)和组分(b)和任选的组分(c)占所述组合物总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

本发明的第三方面提供了一种药盒，其特征在于，包括：

(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自下组：CasRx、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、或其组合；

(b1)第二容器，以及位于所述第二容器中的gRNA或其表达载体，所述gRNA是引导基因编辑蛋白特异性结合于CALR基因的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述药盒还包括：

(c1)第三容器，以及位于所述第三容器中的其他预防和/或治疗流行性乙型脑炎的药物活性成分。

在另一优选例中，所述的第一容器、第二容器、和第三容器是相同或不同的容器。

在另一优选例中，在所述的第三容器中，所述的药物活性成分以药物制剂形式(包括单方制剂或复方制剂)存在。

在另一优选例中，所述药物的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书。

本发明的第四方面提供了一种如第二方面所述的组合物或如第三方面所述的药盒的用途，其特征在于，用于制备(i)用于预防和/或治疗流行性乙型脑炎的药物、或(ii)抑制JEV病毒感染的药物。

在另一优选例中，所述的药物被施用于人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括猪、啮齿动物。

在另一优选例中，所述预防和/或治疗流行性乙型脑炎,包括提高人或非人哺乳动物对JEV病毒感染性疾病的抗病性，改善所述JEV病毒感染性疾病的症状。

在另一优选例中，所述的JEV病毒感染性疾病包括人流行性乙型脑炎、和/或猪流行性乙型脑炎，尤其是猪流行性乙型脑炎。

在另一优选例中，所述抑制JEV病毒感染包括阻断或减少日本脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)在宿主细胞中复制。

在另一优选例中，所述宿主细胞的来源选自猪、小鼠、大鼠和/或猴。

在另一优选例中，所述宿主细胞的来源选自猪。

在另一优选例中，所述细胞包括体细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自猪源肾细胞(例如PK-15)。

在另一优选例中，所述的JEV病毒包括野生型和突变型。

本发明的第四方面提供了一种分离的对JEV病毒感染有抗性的基因工程化细胞，其特征在于，所述细胞为体细胞，并且所述细胞中内源性的CALR基因被敲除或敲减，从而使得内源性CALR的表达或活性下降。

在另一优选例中，所述基因工程化细胞中CALR完全不表达。

在另一优选例中，所述细胞包括人或猪的细胞。

在另一优选例中，所述的体细胞是原本表达CALR的细胞。

在另一优选例中，所述细胞选自猪源肾细胞(例如PK-15)。

在另一优选例中，在所述基因工程化细胞的基因组中，CALR的核酸序列存在移码突变或提前中止。

在另一优选例中，所述细胞的CALR的ORF核酸序列插入或缺失3n-1、或3n-2个碱基，n为正整数。

在另一优选例中，所述细胞的CALR的ORF核酸序列存在1、2、4或5个碱基插入和/或缺失。

在另一优选例中，所述细胞的CALR核酸序列的编码区插入1个碱基。

在另一优选例中，所述细胞用选自下组的方法进行基因敲除：巨型核酸酶(Meganuclease)方法、锌指核酸酶(ZFN)法、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)方法、和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)基因编辑方法。

在另一优选例中，所述方法为利用CRISPR/Cas9直接对目的基因CALR进行移码突变。

本发明的第五方面提供了一种抗流行性乙型脑炎的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括：

(a)JEV病毒；以及

(b)如本发明的第四方面所述的分离的对JEV病毒感染有抗性的基因工程化细胞。

在另一优选例中，所述培养体系中还包含培养基。

本发明的第六方面提供了一种抗流行性乙型脑炎的非人哺乳动物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(m1)提供一种非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的CALR蛋白失活，得到CALR蛋白失活的非人哺乳动物细胞；和

(m2)利用步骤(m1)中得到的CALR蛋白失活的细胞，制备得到CALR蛋白失活的抗流行性乙型脑炎的非人哺乳动物。

在另一优选例中，步骤(m1)中的细胞为体细胞，较佳地，成纤维细胞。

在另一优选例中，步骤(m1)还包括：筛选CALR位点存在纯合失活的单克隆细胞株。

在另一优选例中，所述筛选纯合子的单克隆细胞株的方法包括手工挑选，优选地通过流式分选技术。

在另一优选例中，所述方法还包括：(m3)对步骤(m2)获得的非人哺乳动物进行杂交，从而获得CALR失活的纯合子代。

本发明的第七方面提供了一种抗流行性乙型脑炎的非人哺乳动物，其特征在于，所述非人哺乳动物的体细胞中，内源性的CALR基因被敲除或敲减，从而使得内源性CALR的表达或活性下降。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是用本发明的第六方面所述的方法制备的。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物选自下组：猪、啮齿动物(如小鼠、大鼠)。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物为猪。

本发明的第八方面提供了一种筛选预防和/或治疗流行性乙型脑炎的候选化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a3)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中CALR的表达量(E1)和/或活性(A1)；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中CALR的表达量(E0)和/或活性(A0)；

其中，如果测试组中细胞的CALR的表达量(E1)和/或活性(A1)显著低于对照组，就表明该测试化合物是对CALR的表达和/或活性有抑制作用的预防和/或治疗流行性乙型脑炎的候选化合物。

在另一优选例中，所述的CALR的表达量是通过qPCR法测定。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(b3)对于步骤(a3)中获得的候选化合物，在宿主细胞中，进一步测试其对日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)复制是否有抑制作用。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c3)：将步骤(a3)中所确定的候选化合物施用于非人哺乳动物模型，测定所述候选化合物对日本脑炎病毒感染哺乳动物的是否有抑制作用。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物患有流行性乙型脑炎，或所述非人哺乳动物接种过或待接种日本脑炎病毒。

在另一优选例中，所述“显著低于”指E1/E0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。

在另一优选例中，所述“显著低于”指A1/A0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明：

图1.TA克隆测序检测CALR敲除细胞系的基因型。WT代表野生型细胞，CALR-KO代表采用CRISPR/Cas9慢病毒策略构建的CALR基因敲除细胞，+1bp代表插入一个碱基A。PAM代表protospacer adjacent motif的缩写，sgRNA代表small guide RNA的缩写。

图2.利用Western blot技术检测CALR敲除细胞中蛋白的表达。GAPDH为内参基因，kDa表示千道尔顿，WT代表野生型细胞，CALR-KO#9代表采用CRISPR/Cas9慢病毒策略构建的CALR基因敲除细胞

图3.利用空斑实验检测CALR敲除细胞中JEV感染12和24h后病毒滴度变化。WT代表野生型细胞，CALR-KO代表采用CRISPR/Cas9慢病毒策略构建的CALR基因敲除细胞。

图4.利用绝对荧光定量PCR技术检测敲除CALR细胞中JEV感染不同时间点的copy数变化。WT代表野生型细胞，CALR-KO代表采用CRISPR/Cas9慢病毒策略构建的CALR基因敲除细胞。

图5.利用免疫荧光实验检测JEV在MOI为1的感染条件下在CALR敲除细胞中NS3蛋白的表达变化。MOI为病毒感染复数，hpi为病毒感染时间，WT代表野生型细胞，CALR-KO代表采用CRISPR/Cas9慢病毒策略构建的CALR基因敲除细胞。DAPI代表对细胞核进行染色，NS3代表JEV编码的基因，Merge代表DAPI和NS3合并。

图6.利用Edu细胞增殖实验评估CALR敲除对细胞生长的影响。WT代表未进行CRISPR/Cas9编辑的对照组细胞。CALR-KO代表CALR敲除基因。

图7.JEV感染CALR基因敲除细胞株第72h细胞存活状态成像。WT代表未进行CRISPR/Cas9编辑的对照组细胞，MOI代表病毒感染复数，hpi代表病毒感染后的时间，CALR-KO代表流式分选富集的GFP阳性细胞。

图8.RTCA实时监测JEV感染CALR基因敲除细胞存活数量。WT代表未进行CRISPR/Cas9编辑的对照组细胞。CALR-KO代表CALR敲除基因，JEV代表病毒感染，MOCK代表空白对照组。

图9.猪CALR蛋白编码氨基酸序列在不同物种中的保守性分析。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现CALR基因进行编辑后抑制JEV在宿主细胞中复制。利用CRISPR/Cas9技术构建了CALR基因敲除细胞系，利用JEV-RP9毒株接种CALR敲除细胞，通过空斑实验、绝对定量、免疫荧光、RTCA实时监测的方法，发现敲除CALR基因能显著降低JEV在宿主细胞中的复制能力，由此提供了一个可抑制JEV复制的分子新靶点。

在此基础上，发明人完成了本发明。

术语说明

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

基因失活

对于功能未知基因的研究可采用许多方法，例如使有待研究的基因失活，分析所得的遗传修饰的表型变化，进而获得该基因的功能信息。这一研究方法的另一优点是可以将基因功能和疾病进行关联，从而在获得基因功能的同时也能获得该基因作为潜在药物或者药物靶点所能治疗的疾病信息和疾病动物模型。基因失活的方法可通过基因剔除、基因中断或基因插入的方式来完成。其中，基因剔除技术是研究人类基因在整体中的功能的非常强有力的手段。

如本文所用，术语“基因失活”、“基因敲除”可互换使用，指通过对某一目的基因进行中断、敲除等遗传操作，从而使得该目的基因的表达和/或活性大幅下降甚至完全丧失。

基因编辑器

在本发明中，所述基因编辑器包括DNA基因编辑器和RNA基因编辑器。在一优选实施方式中，本发明的基因编辑器包括基因编辑蛋白和任选的gRNA。

基因编辑蛋白

在本发明中，基因编辑蛋白的核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。在本发明的一个优选例中，所述基因编辑蛋白包括，但并不限于Cas13(如CasRx)、Cpf1、SaCas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c。

表达

如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cDNA，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。

CRISPR/Cas系统

CRISPR/Cas系统(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated protein)是原核生物中一种抵抗外源基因侵入的获得性免疫防御机制。由细菌和古生菌在抵御外来病毒和噬菌体入侵的过程中不断进化而来。该系统能够整合外援侵入宿主的DNA片段到CRISPR位点，然后通过相应的CRISPR RNAs(crRNAs)引导Cas核酸内切酶对外源DNA序列进行切割，从而抵抗病毒或者噬菌体的入侵。CRISPR/Cas基因簇由一系列Cas蛋白(Cas 1、Cas2、Cas4和效应蛋白如Cas9、Cpf1等)的编码基因和一段CRISPR序列组成，

CRISPR序列由一段前导序列(leader)、众多短而保守的重复序列区(repeat)和间隔区(spacer)组成。重复序列区含有回文序列，能够形成发卡结构。而间隔区就是被宿主俘获的外源DNA序列。这些被俘获的外源DNA序列相当于免疫系统的“黑名单”，当这些外源的遗传物质再次入侵宿主时，细菌开始转录CRISPR，形成初级转录产物pre-crRNA，再由核糖核酸酶或Cas蛋白在重复序列位点内切割形成成熟的crRNA，与特异的CRISPR效应蛋白形成核糖核蛋白复合体，识别并切割能与crRNA互补配对的外源DNA，造成双链断裂，引发宿主细胞的自我修复。

根据Cas基因的组成和效应蛋白的数量，CRISPR被分为了2类5型，共16种亚型。1类为利用多个效应蛋白复合物干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；2类为利用单一的效应蛋白干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅱ型和Ⅴ型。目前研究和利用最广泛的为2类Ⅱ型，即为CRISPR/Cas9系统。该系统2013年在哺乳动物细胞中成功实现了基因编辑。Ⅱ型系统可以通过crRNA的引导利用单个Cas9核酸酶对DNA靶位点进行精确充分地切割。该系统操作简单，实验周期短，效率高，且广泛适用于多个物种。该系统需要设计一段特殊的引导RNA，即sgRNA(single guide RNA)，sgRNA的序列设计是在基因组序列中的PAM(NGG)区的一段20nt左右核苷酸序列。在sgRNA的引导下，Cas9蛋白可以对基因组实现定点切割，引起DNA双链断裂，激活细胞的非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组(Homologous recombination，HR)两种修复机制，从而实现基因的敲除、随机的片段缺失或插入，或者利用特定的模板修复，从而实现对基因组的永久性修饰。

流行性乙型脑炎与日本脑炎病毒

流行性乙型脑炎(简称乙脑病)是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus,JEV)感染引起的一种人畜共患病，该病毒又被称为日本脑炎病毒，属于国家二类动物疫病。流行性乙型脑炎是严重危害人畜健康的神经性传染疾病。蚊虫是该种疾病的中间传播媒介，主要通过带毒的蚊虫叮咬患病猪传播疾病，以蚊虫、猪、蚊虫的形式在猪场中广泛传播。因此猪乙型脑炎有着典型的季节性，多发生于蚊虫较多，大量繁殖的夏秋季节，属于自然疫源性疾病。猪场中暴发猪乙型脑炎后，公猪睾丸肿大，精子可带毒通过配种传染；怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎；初生仔猪脑炎、共济失调、发热、死亡。

日本脑炎病毒属于披盖病毒科黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属。JEV为单股正链RNA病毒，病毒呈球形，有囊膜，全长约为11kb，有3432个氨基酸组成，编码3个结构蛋白，分别为囊膜糖蛋白E，非糖基化囊膜蛋白M(PrM膜前体)和衣壳蛋白C(核心蛋白)；7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)，其中PrM蛋白和E蛋白具有免疫源性，能诱导机体产生持久的抗体和T记忆细胞，囊膜蛋白E有8种抗原决定簇，能够显示乙脑的特性。

钙网蛋白

钙网蛋白(calreticulin，CALR)由417个氨基酸组成，分子量为46kDa，CALR蛋白主要结构包括了保守的P-结构域，N-结构域，C-结构域和KDEL基序。CALR蛋白参与多种细胞过程，是一种多功能蛋白，主要参与分子伴侣和调控钙稳态平衡。它主要存在于细胞内质网中，且是高度进化保守的钙结合蛋白。通过参与干预主要组织相容性抗原Ⅰ类分子(MHC-Ⅰ)及装配因子的加工折叠，影响抗原递呈细胞毒性T淋巴细胞，促进吞噬细胞对异物的摄取和吞噬，此外还与细胞间信号传导、补体系统及巨噬细胞对肿瘤细胞的作用相关。多序列比对分析发现，CALR基因和蛋白质序列在猪，人和小鼠中高度保守。

目前未见关于靶向修饰CALR基因能显著抑制JEV复制的研究报道。

CALR抑制剂和药物组合物

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CALR基因或蛋白发生相互作用的物质，尤其是抑制剂等。

可用于本发明的CALR抑制剂(或拮抗剂)包括任何可以抑制CALR基因或其编码蛋白的表达和/或活性的物质。

例如，所述CALR的抑制剂包括CALR的抗体、CALR核酸的反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA、基因编辑器、或CALR的活性抑制剂。一种优选的CALR的抑制剂指的是能够抑制CALR表达的基因编辑器。

优选的，本发明的CALR的抑制剂包括靶向CALR基因序列的抑制剂。本发明CALR抑制剂所作用的对象包括体细胞，尤其是CALR高表达的体细胞。

在一种优选的实施方式中，抑制CALR的方法和步骤包括利用CALR的抗体中和其蛋白，利用病毒(如腺相关病毒)携带的shRNA或siRNA或基因编辑器进行CALR基因的沉默。

对CALR的抑制率一般为达到至少50％以上的抑制，优选为60％、70％、80％、90％、95％的抑制，可以基于常规技术，例如流式细胞术、荧光定量PCR或Western blot等方法对CALR的抑制率进行控制和检测。

本发明CALR蛋白的抑制剂(包括抗体、反义核酸、基因编辑器以及其他抑制剂)，当在治疗上进行施用(给药)时，可抑制CALR蛋白的表达和/或活性，进而抑制JEV病毒复制，从而预防和/或治疗流行性乙型脑炎。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：局部、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、局部给药、自体细胞提取培养后回输等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明抑制剂(如抗体、基因编辑器、反义序列(如siRNA)、或抑制剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。

候选药物或治疗剂

在本发明中，还提供了一种利用本发明的动物模型，筛选治疗流行性乙型脑炎的候选药物或治疗剂的方法。

在本发明中，候选药物或治疗剂是指已知具有某种药理学活性或正在被检测的可能具有某种药理学活性的物质，包括但不限于核酸、蛋白、糖类、化学合成的小分子或大分子化合物、细胞等。候选药物或治疗剂的给药方式可以是口服、静脉注射、腹腔注射、皮下注射、椎管给药或直接脑内注射。

本发明的技术方案，具有如下有益效果：

1.本发明提供了一种钙网蛋白(CALR)抑制剂的新应用，用于抑制病毒尤其是日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)在宿主细胞中复制,从而抵抗JEV病毒复制引起的疾病，提供针对流行性乙型脑炎的抗病性。

2.本发明提供了一种分离的对JEV病毒感染有抗性的基因工程化细胞及其制备方法。所述细胞株可以不影响细胞正常功能的情况下，抵抗病毒感染，可以作为离体实验模型，减少化学添加剂对细胞实验的影响。

3.本发明提供了一种抗流行性乙型脑炎的非人哺乳动物的制备方法。利用此方法制备抗流行性乙型脑炎非人哺乳动物或非人哺乳动物模型，能大幅减少流行性乙型脑炎的发病率和死亡率，有利于畜牧业和科研发展。

4.本发明提供了一种筛选预防和/或治疗流行性乙型脑炎的候选化合物的方法。CALR在哺乳动物中高度保守，因此可以广泛应用于人畜共患传染疾病的预防与治疗，同时可以作为转基因动物设计的潜在靶点，减少药物滥用，避免疫情发生，具有丰富的经济价值。

5.相比传统的RNAi和siRNA等技术降低或者沉默目的基因的表达，本发明采用了CRISPR/Cas9技术直接对目的基因CALR进行移码突变，使CALR在PK-15细胞中完全不表达，制备了CALR基因敲除细胞株。

6.利用流式分选技术制备单克隆细胞株，相比于传统的手工挑取或者无限稀释法，提高了单克隆细胞的纯合子效率，优化了实验方法，减小了对细胞的损伤。

7.通过TA克隆测序鉴定细胞基因型，排除非移码突变的细胞株，只是对移码突变类型单克隆细胞进行后期western blot验证，为单克隆细胞制备提供了优化的方法。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：采用CRISPR/Cas9慢病毒策略构建猪CALR基因敲除细胞系

1.1靶向CALR基因的特异sgRNA设计与表达载体构建

为了研究CALR基因是否参与介导JEV感染猪的PK-15细胞，分别从Ensemble数据库(www.ensembl.org)下载CALR基因(登录号：ENSSSCT00000015020)和猪的全基因组序列(版本号：Sus_scrofa.Sscrofa11.1)。随后，利用sgRNAcas9软件(https://sourceforge.net/projects/sgrnacas9/)设计sgRNA，再根据特异性评估结果，选择靶向猪CALR基因外显子的sgRNA，挑选的sgRNA的序列为：

CALR-sgRNA

5'-GTCTGACCCTTGTTGCTGAA-3'

其中,识别靶点的PAM序列为“GGG”。全基因组脱靶评估发现其不存在1，2和3个碱基错配的脱靶位点(图1)。

接着，利用lenti-sgRNA-eGFP为骨架，构建sgRNA慢病毒载体，设计并合成的正向和反向引物对为：

CALR-sgr-f	5'-caccGTCTGACCCTTGTTGCTGAA-3'
		CALR-sgr-r	5'-aaacTTCAGCAACAAGGGTCAGAC-3'

将合成的CALR-sgr-f和CALR-sgr-r寡核苷酸引物稀释并进行变性与退火，使之与通过BbsI(NEB)酶切且纯化回收的线性化lenti-sgRNA-GFP载体进行连接，其反应体系和条件为：分别吸取浓度为10mM的CALR-sgr-f和CALR-sgr-r引物对各5μl，在涡旋仪上进行震荡混匀，随后在PCR仪上进行退火反应，设置条件为：95℃，10min；65℃，30min；冷却至4℃。将退火的引物对与BbsI酶切线性化的lenti-sgRNA-eGFP载体进行连接，其反应体系为：1μl退火引物对产物，50ng线性化酶切的lenti-sgRNA-eGFP载体，5μl ligation Mix，加ddH2O补齐至10μl。混匀后在16℃条件下连接1.5h。连接后的产物转化进DH5a大肠杆菌中，之后均匀平铺在Amp+抗性的琼脂糖平皿上，37℃过夜培养。挑取单克隆并扩大培养约12h，随后进行菌液PCR检测，将检测结果为阳性的菌液后送公司进行测序，采用的测序引物为：

U6-seq

5'-ATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3'

对测序鉴定成功的菌液使用去内毒素试剂盒提取质粒，将构建成功的sgRNA慢病毒表达载体命名为“lenti-CALR-KO-eGFP”。

1.2制备高滴度的sgRNA慢病毒

采用三质粒系统包装靶向CALR基因的sgRNA慢病毒。目标质粒为lenti-CALR-KO-eGFP，辅助系统质粒为pspax2和pmd2.g。所有质粒均采用OMEGA公司的无内毒素质粒小提中量试剂盒(Endo-free Plasmid DNA Mini Kit II，货号#D6950-01)进行提取。慢病毒包装采用的细胞转染试剂为

细胞株为HEK293T细胞。

sgRNA慢病毒包装实验流程如下：(1)取3代左右生长状态良好的HEK293T细胞进行慢病毒包装。转染前一天将细胞接种至10cm培养皿，待细胞长至90％-95％汇合度时进行转染。(2)转染前吸弃除旧培养基，加入5mL新鲜无抗生素2％FBS培养基继续放回培养箱培养。(3)对于一个10cm培养皿，慢病毒包装时质粒总量为24μg，三者的比例为pmd2.g：pspax2：目的质粒＝1：2：3；(4)向500μl Jetprime Buffer依次加入对应体积的质粒，轻轻吹打混匀后，加入40μl Jetprime regent，轻轻吹打混匀，室温静置10min；小心加入到培养皿中，轻轻摇匀放回培养箱。(5)质粒转染6-8h后，补加5ml含有1％双抗的2％FBS培养基，混匀后放回培养箱；第一次补液后24h观察细胞状态，再补加10ml含有1％双抗的2％FBS培养基,混匀后放回培养箱。(6)质粒转染第60h观察细胞状态及荧光表达情况，显微镜拍照记录；(7)收集细胞上清液(每2盘于一管)，封口膜密封后4℃，3000rpm离心10min，使用0.45μm滤器过滤，然后30000rpm，4℃超高速离心2.5h。(8)倒尽上清液，倒扣于吸水纸上吸尽残液，每管再加入120μL预冷的PBS重悬，混匀后将同种病毒浓缩液转至同一收集管中4℃过夜溶解病毒颗粒；之后将病毒悬液分装并置于-80℃长期保存。

1.3构建与鉴定CALR基因敲除细胞株

复苏实验室前期制备好的Cas9稳定表达的PK-15细胞株，使用靶向CALR基因的sgRNA慢病毒感染目标细胞。待sgRNA慢病毒感染48h后，利用流式细胞分选仪分选和富集GFP阳性表达细胞，并挑取一定数量的单克隆细胞进行扩大培养。随后进行DNA和蛋白表达水平进行检测，利用软件设计sgRNA靶向基因组区域，引物对为：

CALR-PCR-f	5'-AGGAACACACGGGGTTTCAG-3'
		CALR-PCR-r	5'-CAAACTAGAGGCCGGGGTAG-3'

参考天根DNA提取试剂盒的方法(KG203)提取细胞的DNA，再进行PCR反应，PCR反应体系和条件如下：PCR反应体系如下：5μL 10×Buffer；dNTPs；1μL10μmol/L CALR-PCR-f；1μL 10μmol/L CALR-PCR-r；0.5U LaTaq酶；～200ngDNA模板；补加H₂O至50μL。PCR反应条件为：95℃，5min；(95℃，30s；60℃，30s；72℃，45s)，进行35个循环，72℃，5min；15℃，2min。反应完成后，利用DNA产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，然后连接进pMD19-T Vector载体中，转化DH5a大肠杆菌，涂Amp+抗性的平皿，37℃过夜培养后，挑取5～10个单克隆细菌扩大培养和送公司测序。

对测序数据与野生型(WT)的对照组比对，发现第9号菌液“CALR-KO#9”中，对应的基因编辑细胞系CALR存在1个碱基插入(图1)，推测会造成该基因发生移码突变。

接着，利用Western blot技术，对基因编辑细胞中CALR基因蛋白的表达水平进行检测。首先提取细胞总蛋白。收细胞提总蛋白前，吸弃培养基，六孔板每孔加入1mL PBS清洗2遍。六孔板每孔加入1mLPBS，用细胞刮刀把细胞刮下，移至1.5mL离心管中，置于冰上备用。5000rpm，4℃，离心5min，吸弃上清，留取细胞余团。加细胞裂解液和蛋白酶抑制剂。六孔板每孔的细胞量加入100μL的裂解液，蛋白酶抑制剂PMSF和100×正钒酸钠各加1μL。用移液器反复吹吸，重悬细胞余团至无沉淀。置于冰上裂解30-40min，每隔10min用移液器吹吸混匀。13000rpm，4℃，离心10min取上清，并使用碧云天BCA蛋白浓度，对提取的细胞蛋白进行总蛋白浓度测定。最后分别利用CALR抗体和GAPDH内参抗体对细胞CALR蛋白含量进行检测。

结果：如图2可见，与野生型(WT)对照组细胞比较，发现编号为CALR-KO#9的基因编辑细胞系中，CALR的蛋白完全不表达，表明成功构建了CALR敲除细胞株。

实施例2：发现CALR敲除细胞能显著抑制JEV在猪PK-15细胞中复制

2.1采用空斑实验法检测CALR对JEV复制的影响

利用病毒空斑实验和绝对定量实验，分别研究了CALR敲除细胞对JEV复制的影响。病毒空斑实验流程为采用低熔点琼脂糖法，操作如下：将BHK细胞接种至6孔细胞培养板中，培养至单层。细胞生长至汇合度～50％以上进行接毒；配制病毒稀释液：取100μL病毒原液于1.5mL的EP管中，用高糖培养基DMEM对其进行连续10倍稀释(10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8)，轻轻吹打混匀，且每管吹打次数应相同，注意枪头不要伸到EP管最底部。注：梯度稀释时，如果病毒效价很高，则可省略10^-1-10^-3倍稀释的操作。将细胞从培养箱内取出，吸弃孔内的培养基，用PBS洗1-2次。吸取上述稀释的病毒液800μL加至培养板中，再补加200μL高糖培养基DMEM，每个孔做3个重复。加好后摇匀放至37℃培养箱培养2h使病毒吸附细胞，期间每隔15-20分钟轻摇混匀。吸附2h后，取出6孔板，吸弃培养基，加入琼脂糖培养基。不同底面积培养皿加入培养基的量不同，6孔板加2mL。注意该过程不要产生气泡，否则会影响后续空斑计数。室温放置直至琼脂糖培养基凝固，或于4℃冰箱放置几分钟至琼脂糖培养基凝固，然后于37℃培养箱继续培养。继续培养48h后或待细胞发生病毒，能肉眼观察到空斑后，取出细胞进行固定。加10％中性甲醛固定。6孔板每孔加1mL，放置通风橱内，打开风机，室温固定4h以上。倒掉中性甲醛及琼脂糖。琼脂糖一定倒干净，且不可用急水冲洗，防止冲掉细胞。加结晶紫进行染色。每孔加入适量的结晶紫溶液至完全覆盖培养皿底部，六孔板每孔加3-4滴结晶紫，约200μL-400μL。放置水平摇床染色20分钟以上。倒掉结晶紫，用自来水冲洗至无紫色，倒立烘干。取空斑个数在肉眼可计数范围的孔，进行空斑计数。病毒毒价计算公式：毒价＝空斑平均数x5/相应稀释倍数(PFU/mL)。

结果：如表1和图3可见，发现利用CRISPR/Cas9技术构建的CALR基因敲除的PK-15细胞中，与野生型对照组相比，CALR-KO#9中的JEV滴度显著降低。

表1.在JEV的MOI为1的感染条件下CALR敲除细胞中病毒滴度的变化

2.2利用绝对定量PCR技术检测CALR敲除对JEV编码基因表达的影响

通过绝对定量荧光PCR，进一步比较CARL敲除细胞和野生型对照组细胞中JEV编码的C基因的转录情况，由此评估CALR对JEV复制的影响。先利用软件针对JEV编码的C基因，设计特异的引物对并送公司合成：

JEV-C-F	5'-GAGCTTGTTGGACGGCAGAG-3'
		JEV-C-R	5'-CACGGCGTCGATGAGTGTTC-3'

利用JEV分别感染CARL敲除与野生型对照组细胞，利用TAKARA试剂盒(货号：9766)提取细胞感染液的病毒RNA，随后采用TAKARA公司的PrimeScript RT reagent Kit withgDNA Eraser试剂盒(货号：RR047A)进行反转录，以不同时间点提取的病毒RNA为模板，每个反应反转录2μl RNA。首先去除基因组DNA反应。按如下成分于冰上配制反应液10μL：2μL 5×gDNA Eraser Buffer,1μL gDNA Eraser,Total RNA 2μl,补RNase Free dH2O至10μL。置于PCR仪上，反应程序为：42℃2min；4℃。反转录反应。按如下成分于冰上配制反应液20μL：10μL RT反应液，1μL PrimeScript RT Enzyme Mix 1,4μL RT Primer Mix,4μL 5×PrimeScript Buffer 2,补RNase Free dH₂O至10μL。置于PCR仪上，反应程序为：37℃,15min；85℃,5s；4℃。以反转录的cDNA为模板，荧光定量PCR扩增的试剂为Bio-Rad公司的SYBR Green染料，进行荧光定量PCR扩增，操作时注意避光处理。

使用已知浓度的标准品进行梯度稀释，试验样品和梯度稀释的标准品在同一荧光PCR实验中进行反应，将稀释标准品得到的Ct值构建标准曲线，通过标准曲线可以推算出未知样品的量。标准品的梯度稀释：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii；1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii；1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv；1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v；标准品拷贝数的计算：待测样本浓度(ng/μl)＝OD260×40×稀释倍数；样本分子量＝碱基数×324；待测样本拷贝数(copies/μl)＝待测样本浓度/样本分子量×6×1014。荧光定量PCR扩增，反应体系为：10μL SYBR Green染料；7.8μL H2O；0.6μLJEV-C-F；0.6μL JEV-C-R；1μL cDNA。反应液混匀后进行定量PCR扩增，反应程序如下：95℃，10min；(95℃，10s；60℃，10s；72℃,10s)，45个循环.

结果：对获得的绝对荧光定量PCR数据进行分析，如图4可见，JEV感染12h，24h和48h后，CALR-KO#9和对照组细胞相比，JEV编码的C基因mRNA表达水平均显著下降，说明敲除CALR基因后影响JEV在宿主PK-15细胞中复制。

实施例3：CALR基因敲除细胞中JEV编码的NS3基因无法表达

通过免疫荧光技术，进一步比较了CALR基因敲除和对照组细胞中JEV感染后NS3基因的表达。大致实验流程为：(1)溶液配制：0.3％TritonX-100(现配现用)；封闭液：终浓度3％BSA，0.3％TritonX-100，10％FBS，4℃保存。抗体稀释液：3％BSA，0.3％TritonX-100，4℃保存。(2)操作流程：细胞固定：在12孔板中，当细胞密度达到70％-80％时，用预冷的PBS洗细胞2次，然后用预冷的4％多聚甲醛室温静置固定15min。去除多聚甲醛，用预冷的PBS漂洗细胞2次后加入预冷0.3％TritonX-100，室温静置10min后去除TritonX-100。漂洗细胞：加入预冷的PBS，在室温摇床上孵育5分钟，重复此步骤3次；去除PBS后加入封闭液，室温1-2h。漂洗细胞和一抗孵育：按抗体说明书稀释一抗，然后加入相应的一抗(Eg:NS3 Antibody稀释比例为1:100)，4℃静置过夜。回收一抗，漂洗细胞；二抗孵育：按说明书比例稀释二抗(Eg:Anti-mouse IgG的稀释比例为1:1000)，然后加入相应的二抗，摇床室温孵育1-2h(此时将12孔板用锡箔纸包好)。弃去二抗，漂洗细胞，细胞核染色：加入DAPI，室温避光染色10min(避光)。弃去DAPI，用PBS避光洗细胞(避光)，加入1mL PBS，在荧光显微镜下观察荧光。

结果：与对照组相比(图5)，结果发现发现CALR基因敲除后，JEV蛋白编码的NS3基因无法表达，表明JEV依赖CALR在宿主中复制。

实施例4：敲除CALR后的细胞正常生长但能抵抗JEV诱导的细胞死亡

利用EdU增殖实验检测CALR敲除对细胞正常生长的影响，采用的方法步骤如下:首先进行EdU标记：用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基；每孔细胞样品加入500μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基；预冷的PBS清洗细胞3次，每次5分钟。其次进行细胞固定化，每孔细胞样品加入500μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟；预冷的PBS清洗细胞3次，每次5分钟。每孔细胞样品加入500μL渗透剂(0.3％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗3次，每次5分钟。Apollo染色(避光)：每孔加入500μL的1X

染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；PBS脱色摇床清洗3次，每次5分钟。细胞核染色：加入DAPI，室温避光染色10min(避光)。弃去DAPI，PBS脱色摇床清洗3次，每次5分钟(避光)。3.加入1mL PBS，尽快在荧光显微镜下观察荧光。结果发现，CALR基因敲除细胞增殖情况与对照组细胞无显著差异(图6)。

一定剂量的JEV感染PK-15细胞后，会导致宿主细胞发生病变甚至诱导死亡。分别测试MOI为0.03和1的条件下，敲除CALR细胞抵抗JEV诱导细胞死亡的能力。先在六孔板中接种相同数量的细胞，如图7所示，在JEV感染72h后，在显微镜下观察低MOI组和高MOI组细胞生长和增殖情况，发现与对照组细胞相比，CALR基因编辑敲除细胞，在JEV的MOI为0.03和1的感染条件下，细胞的存活率显著增高。进一步，通过实时细胞分析仪(仪器型号：RocheRTCA DP)实时监测和比较JEV感染CALR基因敲除和对照组细胞增殖。

结果：JEV病毒感染复数MOI为1，与对照相比，CALR-KO#9细胞在JEV感染24h之后细胞依然增殖，而JEV感染24h后，对照组细胞全部死亡。实验结果表明，敲除CALR后能抵抗JEV诱导的细胞死亡(图8)。

实施例5.猪CALR基因序列在不同物种中的保守性分析

从NCBI核酸数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，分别下载来自猪(登录号：NM_001174133.1)，人(登录号：NM_004343.3)和小鼠(登录号：NM_007591.3)的CALR基因的mRNA序列。

将mRNA序列输入NCBI的ORF在线软件

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)翻译为蛋白编码的氨基酸序列，然后再利用多序列比对程序CLUSTALW

(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)进行比对。

结果:

如图9可见，CALR基因的蛋白质序列长度为417个氨基酸。猪和人CALR基因的氨基酸序列比对相似性得分为87.7193、猪和小鼠的为83.9329，而人和小鼠的为86.8106。表明CALR的蛋白质序列在不同物种相似性相对高。同样利用CLUSTALW程序对CALR基因的多序列比对分析，结果发现猪的CALR基因CDS序列长度均为1254个核苷酸，猪和人的EMC的CDS序列比对相似性得分为90.4077，猪和小鼠的为91.1058，而小鼠和人的为92.0673，表明CALR基因的蛋白编码氨基酸序列非常保守。推测CALR基因在猪、人和小鼠中功能高度一致。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种CALR抑制剂的用途，其特征在于，用来制备抗流行性乙型脑炎的化合物或药物组合物；

其中，所述的流行性乙型脑炎是猪流行性乙型脑炎。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制剂选自下组：靶向CALR蛋白的抗体或小分子抑制剂、CALR基因靶向核酸分子或基因编辑器、或其组合。

3.一种组合物，其特征在于，包括：

(a)基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自下组：CasRx、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、或其组合；

(b)gRNA或其表达载体，其中所述gRNA是引导所述基因编辑蛋白特异性结合CALR基因的RNA；和

(c)其他预防和/或治疗流行性乙型脑炎的药物活性成分；

其中，所述的流行性乙型脑炎是猪流行性乙型脑炎。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为注射剂型。

5.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述基因编辑蛋白的表达载体和gRNA的表达载体为同一载体或不同载体。

6.一种药盒，其特征在于，包括：

(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自下组：CasRx、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas 13c、或其组合；

(b1)第二容器，以及位于所述第二容器中的gRNA或其表达载体，所述gRNA是引导基因编辑蛋白特异性结合于CALR基因的核苷酸序列；和

(c1)第三容器，以及位于所述第三容器中的其他预防和/或治疗流行性乙型脑炎的药物活性成分；

其中，所述的流行性乙型脑炎是猪流行性乙型脑炎。

7.一种如权利要求3所述的组合物或如权利要求6所述的药盒的用途，其特征在于，用于制备(i)用于预防和/或治疗流行性乙型脑炎的药物、或(ii)抑制JEV病毒感染的药物；

其中，所述的流行性乙型脑炎或JEV病毒感染是猪流行性乙型脑炎。

8.一种分离的对JEV病毒感染有抗性的基因工程化细胞的用途，其特征在于，用于制备抗流行性乙型脑炎的化合物或药物组合物，其中所述细胞为体细胞，并且所述细胞中内源性的CALR基因被敲除或敲减，从而使得内源性CALR的表达或活性下降；

其中，所述的流行性乙型脑炎是猪流行性乙型脑炎。

9.一种抗流行性乙型脑炎的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括：

(a)JEV病毒；以及

(b)如权利要求8所述的分离的对JEV病毒感染有抗性的基因工程化细胞；

其中，所述JEV病毒感染是猪流行性乙型脑炎。

10.一种抗流行性乙型脑炎的非人哺乳动物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(m2)利用步骤(m1)中得到的CALR蛋白失活的细胞，制备得到CALR蛋白失活的抗流行性乙型脑炎的非人哺乳动物；

其中，所述的流行性乙型脑炎是猪流行性乙型脑炎。

11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(m1)还包括：筛选CALR位点存在纯合失活的单克隆细胞株。

12.一种筛选预防和/或治疗流行性乙型脑炎的候选化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a3)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中CALR的表达量E1和/或活性A1；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中CALR的表达量E0和/或活性A0；

其中，如果测试组中细胞的CALR的表达量E1和/或活性A1显著低于对照组，就表明该测试化合物是对CALR的表达和/或活性有抑制作用的预防和/或治疗流行性乙型脑炎的候选化合物；

其中，所述的流行性乙型脑炎是猪流行性乙型脑炎。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤(c3)：将步骤(a3)中所确定的候选化合物施用于非人哺乳动物模型，测定所述候选化合物对日本脑炎病毒感染哺乳动物是否有抑制作用。