CN113699123B

CN113699123B - 靶向超敏广谱溶瘤病毒制备及应用

Info

Publication number: CN113699123B
Application number: CN202111259942.8A
Authority: CN
Inventors: 钟莉娉
Original assignee: Dandan Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Dandan Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2022-01-25
Anticipated expiration: 2041-10-28
Also published as: CN113699123A

Abstract

本发明公开了靶向超敏广谱溶瘤病毒制备及应用，所述靶向超敏广谱溶瘤病毒为一种包含重组新城疫病毒、α‑1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因质粒的重组病毒，所述重组病毒由重组新城疫病毒NDV‑GHF质粒与辅助质粒共转染BSR细胞拯救获得。所述重组新城疫病毒NDV‑GHF质粒是将NDV与α‑1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因进行重组后的重组新城疫病毒NDV‑GHF质粒；所述HPSE基因、FAP scFv基因、α‑1,3 GT基因的序列分别如SEQ ID NO:1~3所示。本发明还公开了上述重组病毒的制备方法及重组病毒在融化肿瘤物理屏障中的应用。

Description

靶向超敏广谱溶瘤病毒制备及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种熔化肿瘤物理屏障的靶向超敏广谱溶瘤病毒及其制备和应用。

背景技术

乙酰肝素酶（heparanase，HPSE）是哺乳动物细胞中唯一能切割细胞外基质中硫酸肝素蛋白多糖侧链（heparan sulfate chains，HS）的内源性糖苷酶（即在特定部位裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）。近年来研究发现，乙酰肝素酶在肿瘤免疫监视中起重要作用，一方面，激活自然杀伤细胞（natural killer，NKC）；另一方面，通过切割HS链和随后的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解而破坏肿瘤组织中的物理屏障，趋化因子得以进入肿瘤间质，吸引NK细胞、T细胞、树突状细胞（dendritic cells，DC）向肿瘤部位聚集，增强抗肿瘤免疫反应。

成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein FAP)是基质中的一种表面抗原，多种恶性肿瘤都有表达。肿瘤组织需要通过新生血管与活化的成纤维细胞等基质形成来获取肿瘤细胞存活和生长所必需的营养物质。肿瘤相关成纤维细胞中FAP含量丰富，可以激活基质中的生长因子等，以利于血管生成，从而促进肿瘤生长、转移。在以肿瘤基质为靶点的抗肿瘤免疫治疗中发挥作用，显著诱导肿瘤相关成纤维细胞的凋亡。FAP在肿瘤的发生、发展及转移中发挥着重要作用，同时作为一种理想的抗肿瘤靶分子。将FAPscFv重组入NDV，溶解肿瘤细胞的同时，破坏了肿瘤生长的外基质，破坏了种子成长所需要的土壤，干扰肿瘤细胞的生长和侵袭。

溶瘤病毒（oncolytic virus）是能特异性感染癌细胞并大量复制，最终裂解癌细胞后释放出来，再感染更多癌细胞的一类病毒。新城疫病毒是一种天然的单股负链RNA非致病性溶瘤病毒，在癌细胞内具有很高的复制效率（是正常细胞中的10000倍）和一定的溶瘤能力。NDV 通过与癌细胞表面所分布丰富的NDV 受体---唾液酸残基结合而进入细胞内。由于癌细胞缺乏抗病毒、凋亡途径和Ⅰ型INF信号传导通路，NDV选择性地只能在癌细胞内复制而不感染正常细胞，因而能广泛杀伤癌细胞，而不会伤及人类正常组织。此外，新城疫病毒使肿瘤细胞裂解后释放肿瘤特异性抗原，一定程度上能刺激免疫细胞活化而诱导肿瘤免疫反应。

既往专利报道新城疫病毒NDV杀伤力不强，抗癌作用尚不甚理想，靶向性差和基因药物组织特异性表达不理想。目前实体肿瘤治疗疗效差的原因之一就是药物无法进入肿瘤内部。

发明内容

为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种熔化肿瘤物理屏障病毒及其应用（一种熔化肿瘤物理屏障的靶向超敏广谱溶瘤病毒及其制备和应用）。

本发明提供了一种包含重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的重组病毒，所述重组病毒由重组新城疫病毒NDV-GHF质粒与辅助质粒共转染BSR细胞拯救获得。

本发明中所述包含重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的重组病毒是指包含重组新城疫病毒NDV、超敏基因α-1,3 GT、溶解细胞外基质的乙酰肝素酶基因HPSE和靶向肿瘤相关成纤维细胞的FAP scFv基因（NDV- GT-HPSE-FAP scFv，简称NDV-GHF）质粒的重组病毒。

所述辅助质粒包括N、P、L等。

所述N具体指表达NDV的NP蛋白的质粒。

所述P具体指表达NDV的P蛋白的质粒。

所述L具体指表达NDV的L蛋白的质粒。

所述重组新城疫病毒NDV-GHF质粒是将NDV与α-1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因进行重组后的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒；所述HPSE基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述FAPscFv基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述α-1,3 GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示。

所述新城疫病毒（野生型新城疫病毒）NDV的序列如GenBank FJ766530.1公布。

所述包含重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的重组病毒的序列是在野生型新城疫病毒NDV的序列（GenBank FJ766530.1）中插入α1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因的序列。

本发明还提供了上述重组病毒在融化肿瘤物理屏障中的应用。

本发明还提供了上述重组病毒制备预防和/或治疗新城疫病毒疫苗中的应用。

其中，所述重组病毒用于抑制肿瘤的生长、增殖、迁徙、转移，或促进肿瘤的凋亡。

本发明所述的包含重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的重组病毒能直接攻击物理屏障、肿瘤相关成纤维细胞和癌细胞，破坏细胞外基质，抑制新的胶原蛋白形成，又能产生HPSE清除已有的物理屏障，释放趋化因子吸引免疫细胞到肿瘤部位，增强抗肿瘤效果。

本发明还提供了一种重组新城疫病毒NDV-GHF质粒，其为将新城疫病毒NDV与α-1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因进行重组后的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒。

所述重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的载体是JS/0704/Pi，所述α-1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因插入的位点为Age I、SanD I。

所述HPSE基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述FAP scFv基因的序列如SEQ IDNO:2所示；所述α-1,3 GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示。

所述野生型新城疫病毒NDV的序列如GenBank FJ766530.1公布。

本发明还提供了所述的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒在构建包含重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的重组病毒中的应用。

本发明还提供了一种制备上述重组病毒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

步骤一、构建所述重组新城疫病毒NDV-GHF质粒；

步骤二、提取包含测序正确的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒；

步骤三、BSR细胞复苏、换液、传代和铺板；

步骤四、利用痘苗病毒感染BSR细胞，然后用步骤二中提取的重组NDV-GHF质粒对BSR细胞进行转染；

步骤五、取转染后的细胞上清接种到鸡胚中，拯救病毒；

步骤六、从步骤五中的鸡胚中收毒，检测血凝效价，确认获得重组病毒。

步骤一中，所述质粒的重组包括如下步骤：

（1）线性化超敏NDV载体：用Age I和SanD I双酶切超敏NDV骨架载体TVT/071204，回收载体大片段；

（2）扩增目的基因片段；所述目的基因的序列为α-1,3 GT、HPSE和FAP scFv的融合基因，由上海生工合成。

所述扩增中引物序列如下所示：

PF：

CCCAAGGTCCAACTCTGTTTAAACTTAGAAAAAATACGGGTAGAAGTGCCACCGACCCCCGGGTCCGCCCG

PR：AGGATTGCCGCTTGGGTTTAAACTCATTTGATTTCCACTTTGGTCC

所述扩增目的基因片段的PCR体系如下表3所示；所述扩增的条件如下表4所示。

（3）将所述步骤（1）回收的载体片段与所述步骤（2）的目的基因进行同源重组，连接产物转化至TransStbl3感受态细胞，抽提质粒，通过PCR和Age I、SanD I双酶切鉴定获得阳性重组NDV质粒，命名为重组新城疫病毒NDV-GHF质粒。

所述步骤二具体包括如下步骤：

（1）取250mL过夜培养的菌液，12000×g，离心2-5min，弃尽上清，收集菌体；所述菌液包括：LB培养基 250mL+含测序正确的重组α-1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因的NDV质粒的菌液500 uL；

（2）向留有菌体沉淀的离心管中加入10mL Buffer P1；所述Buffer P1中已加入RNase A，用涡旋振荡混匀；

（3）向步骤（2）中的菌悬液中加入10mL Buffer P2，上下颠倒混匀6-10次，室温放置5-10min；

（4）向步骤（3）中的菌悬液中加入10mL Buffer P4，立即上下颠倒6-10次让溶液彻底中和Buffer P2，11000×g，离心15min，小心吸取上清至新的50mL离心管中；

（5）加入2.0-2.5mL的内毒素清除剂到步骤（4）所得的上清，颠倒混匀，插入碎冰中放置5-10min直到溶液由浑浊变得清亮透明，中间混匀5次；

（6）室温放置10-15min，温度恢复室温后，继续将溶液颠倒混匀；

（7）室温下，12000×g，离心10-15min，在温度需大于25℃下分相；将含DNA的上层水相转移到新管，弃油状层；

（8）向上层水相中加入12mL异丙醇，充分颠倒混匀，分多次转入吸附柱中，12000×g，离心1-3min，倒掉吸附柱下方的收集管中的废液，直到所有混合溶液通过此吸附柱；

（9）加入10mL已加入无水乙醇的漂洗液PW，12000×g，离心1-3min，弃废液；将吸附柱重新放回收集管中，再加入15mL漂洗液PW，重复漂洗一次；

（10）将吸附柱放回空收集管中，12000×g，离心3-5min，打开盖子室温晾干3-5min；

（11）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加1-1.5mLBuffer TB，室温放置3-5min，12000×g，离心3-5min，洗脱质粒；

（12）测定浓度后，-20℃保存备用。

所述步骤三具体包括如下步骤：

BSR细胞复苏：

（1）37℃预热含10% FBS的DMEM培养基；

（2）-80℃冰箱中取出冻存的BSR细胞在37℃水浴锅中快速融化；

（3）将融化后的BSR细胞加入到已预热的DMEM培养基中，1000rpm，离心3min；

（4）弃上清，用2mL预热的10% FBS的DMEM培养基重悬，再加入100mg/mL的G-418溶液50-100μL，混匀后加入到装有10mL 10% FBS的DMEM培养基的培养皿中，37℃ 5% CO₂培养箱中培养观察；

（5）12h后进行换液处理；

BSR细胞换液：

（1）BSR细胞复苏12-15h后观察细胞状态；

（2）吸弃细胞培养上清，加入5ml PBS晃动；

（3）弃去上清，再加入5mL PBS重复清洗一次，弃上清；

（4）向皿中加入10mL 10% FBS的DMEM培养基，37℃ 5%CO₂培养箱中继续培养；

BSR细胞传代：

（1）BSR细胞长到90%左右进行传代；

（2）吸取细胞培养上清，加入5ml PBS清洗一次，弃上清；

（3）每皿加入1mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化酶，37℃ 5%CO₂培养箱消化2-3分钟；

（4）每皿加入4mL 10% FBS的DMEM培养基终止消化，1000rpm，离心3min；

（5）弃上清，加入5mL PBS重悬，1000rpm，离心3min；

（6）弃上清，用2mL的10% FBS的DMEM培养基重悬，同时加入100mg/mL的G-418溶液50μL，充分混匀；

（7）将上述的细胞悬液平均加入装有10-12mL 10% FBS的DMEM培养基的培养皿中，37℃ 5%CO₂培养箱中培养；

BSR细胞铺板：

（1）吸取上述培养箱中培养的细胞培养上清，加入5ml PBS清洗一次，弃上清；

（2）每皿加入1mL胰酶，37℃ 5% CO₂培养箱消化2-3分钟；

（3）每皿加入4mL 10% FBS的DMEM培养基终止消化，1000rpm，离心3min；

（4）弃上清，加入5mL PBS重悬，1000rpm，离心3min；

（5）弃上清，加入5mL PBS重悬，吸取10μL细胞悬液计数；

（6）根据计数情况，按每孔2mL 10% FBS的DMEM培养基、1×10⁵个细胞进行稀释；

（7）将稀释后的细胞悬液均匀的铺入六孔板中，37℃ 5% CO₂培养箱中培养观察。

所述步骤四具体包括如下步骤：

（1）待上述六孔板中的BSR细胞长到80%时进行转染；

（2）用无抗无血的DMEM按1:90-120的比例稀释痘苗病毒，按每孔200μL的用量进行配置，4℃储存备用；

（3）吸取培养上清，用不含血清的DMEM洗2次；

（4）每孔加入200μL稀释好的痘苗病毒，37℃ 5% CO2培养箱中感染40-80min，每隔20min晃一次；

（5）配置转染A、B液；其中，所述A液为375μL Opti-MEM+30μL的转染试剂（本发明所需转染试剂为Vazyme公司产品，货号为T202-01）；所述B液为375μL Opti-MEM+8~14μg的质粒；其中，所述质粒包含前述的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒和辅助质粒，所述重组质粒与辅助质粒N、P、L的比例为4:2:2:1；

（6）将B液加入A液中，并混匀，室温静置5~10min；

（7）吸取痘苗病毒悬液，每孔加入无抗无血的DMEM 2mL、混合后的A、B液各260-270μL（具体的根据混合后的A、B液总量而定）；

（8）混匀后，37℃ 5% CO₂培养箱中培养6-8h；

（9）6-8h后吸取上清，每孔加入2mL含5% FBS的DMEM、10μL 10mg/mL的阿糖胞苷，混匀后37℃ 5% CO2培养箱中继续培养；

（10）24h后吸取上清，每孔加入2mL无抗无血的DMEM、10μL 10mg/mL的阿糖胞苷、0.5~2uL 1mg/mL的TPCK，混匀后37℃ 5% CO₂培养箱中继续培养；

（11）24-48h收集细胞及上清，装入15mL离心管，封口膜封口，-20℃保存。

所述步骤五具体包括如下步骤：

（1）将上述-20℃保存的转染上清在冷水中快速融化；

（2）融化后的上清，4℃暂存；

（3）取9-11日龄的鸡胚用手电筒照射，画出接种线；

（4）先用碘酊棉球擦拭消毒，再用75%的酒精棉球擦拭脱碘；

（5）用锥子在画线处轻轻的敲出一个小洞，直径约1mm；

（6）用1mL的注射器吸取300-400μL的转染上清，从小孔处接入鸡胚中；

（7）用蜡块将小孔封住，做好标记，37℃ 50%湿度孵育箱中孵育；

（8）孵育24h后用手电筒照射接种后的鸡胚，将死胚取出丢弃，其他的鸡胚继续孵育。

所述步骤六具体包括如下步骤：

（1）待上述接种转染上清的鸡胚孵化5天后，将其取出放置在4℃冰箱；

（2）4h后从4℃冰箱中取出鸡胚，用酒精棉球进行擦拭消毒；

（3）用消毒后的镊子沿鸡胚气室敲击，并将气室上方的蛋壳取下；

（4）用100μL的移液枪吸取50μL的尿囊液于每孔装有50μL PBS的血凝板中；

（5）将第一个孔中的尿囊液与PBS混匀后吸出50μL于第二个孔中，依次进行倍比稀释至第6个孔；

（6）每孔加入50μL 1%鸡红细胞悬液并混匀，室温静置15min；

（7）15min后观察每孔的血凝情况，若出现鸡红细胞凝集现象则为血凝实验阳性，病毒拯救成功，将其尿囊液全部收集在15mL离心管中，-20℃保存。

所述制备方法还包括了RT-PCR验证、重组病毒扩增、重组病毒TCID₅₀测定等步骤。

本发明还提出了一种静脉注射制剂，所述静脉注射制剂包括如上所述的重组病毒。

本发明还提出了所述的静脉注射制剂在制备预防和/或治疗新城疫病毒疫苗中的应用。

本发明的有益效果包括：本发明公开了一种包含重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的重组病毒具有广谱、靶向性，所述重组病毒在体内能够有效抗肿瘤、破坏肿瘤物理屏障，可以破坏肿瘤微环境中骨架细胞成纤维细胞的同时还可以直接溶解细胞外基质，有利于药物进入肿瘤内部，杀灭癌细胞；同时趋化因子得以进入肿瘤间质，吸引免疫细胞（如NK细胞、T细胞、树突状细胞（dendritic cells，DC））向肿瘤部位聚集，增强抗肿瘤免疫反应，解决目前实体肿瘤抗癌疗效不佳的难题。

附图说明

图1是本发明重组病毒的构建示意图，在新城疫病毒NDV的P、M蛋白的AgeI和SanDI酶切位点之间依次插入α-1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因，其中，图1中的M、F、HN、NP、L、P均表示NDV的蛋白。

图2是本发明重组病毒的血凝结果图，血凝实验结果：新城疫病毒能与1%的鸡红细胞发生凝集反应，PBS不含NDV，所以鸡红细胞全部沉积于血凝板底部，将血凝板倾斜45°时，未凝集的红细胞会成线状。重组病毒与NDV阳性对照病毒均发生凝集现象，PBS未见血凝发生，证明重组病毒成功拯救。

图3是本发明重组病毒感染HepG2细胞后目的基因表达免疫荧光图，重组病毒组可见aGal和HPSE蛋白的荧光，PBS组未见，证明重组病毒能感染HepG2细胞，并且能表达目的蛋白。

图4是本发明重组病毒体外杀伤实验验证图。

图5是本发明重组病毒体内抗肿瘤效果图。

注：本发明附图中的NDV-α1,3 GT-HPSE-FAP scFv即为本发明的重组病毒。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例

实验所需试剂：

1、大提质粒试剂盒为Vazyme公司产品，货号为DC202。

2、DMEM为Solarbio公司产品，货号为12100-500ml。

3、G-418为Solarbio公司产品，货号为G8161。

4、Opti-MEM为Gibco公司产品，货号为31985088。

5、转染试剂为Vazyme公司产品，货号为T202-01。

6、阿糖胞苷为麦克林公司产品，货号为C805253-5g。

7、TPCK为美伦生物公司产品，货号为MB3477。

8、0日龄的鸡胚购自济南赛斯家禽科技有限公司。

9、RNA提取试剂盒为北京全式金公司产品，货号为AT411-02。

10、RT-PCR试剂盒为北京全式金公司产品，货号为AT411-02。

实验方法：

（一）重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的构建：

（1）线性化超敏NDV载体：用Age I和SanD I双酶切超敏NDV骨架载体TVT/071204（-80℃保存），回收大片段；

（2）扩增目的基因片段，目的基因由上海生工合成；

（3）将这两个回收的片段进行连接，连接产物转化至TransStbl3感受态细胞，小提质粒，通过PCR和Age I、SanD I双酶切鉴定获得阳性重组质粒，命名为重组新城疫病毒NDV-GHF质粒。

重组新城疫病毒NDV-GHF质粒中引物序列如下表1所示：

表1

重组新城疫病毒NDV-GHF质粒主要使用的试剂如下表2：

表2

扩增目的基因片段的PCR体系如下表3所示：

表3

扩增条件如下表4所示：

表4

（二）重组新城疫病毒NDV-GHF质粒提取：

1、取250mL过夜培养的菌液（补充该菌液的成分：LB培养基 250mL+含测序正确的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的菌液500 uL，来源：送测序前保留甘油菌），12000×g，离心3min，弃尽上清，收集菌体。

2、向留有菌体沉淀的离心管中加入10mL Buffer P1（Buffer P1中已加入RNaseA）（Vazyme公司，货号DC202），用涡旋振荡混匀。

3、向步骤2中的菌悬液中加入10mL Buffer P2（Vazyme公司，货号DC202），温和地上下颠倒混匀10次，室温放置10min。

4、向步骤3中的菌悬液中加入10mL Buffer P4（Vazyme公司，货号DC202），立即温和地上下颠倒8次让溶液彻底中和Buffer P2，11000×g，离心15min，小心吸取上清至新的50mL离心管中。

5、加入2.0mL的内毒素清除剂（Vazyme公司，货号DC202）到步骤4所得的上清，颠倒混匀，插入碎冰中放置8 min直到溶液由浑浊变得清亮透明，中间混匀5次。

6、室温放置10min，温度恢复室温后溶液很快又变为浑浊，并颠倒混匀。

7、室温下，12000×g，离心15min分相(温度需大于25℃) 。将含DNA的上层水相转移到新管，弃油状层。

8、向上层水相中加入12mL异丙醇，充分颠倒混匀，分多次转入吸附柱中，12000×g，离心3min，倒掉吸附柱下方的收集管中的废液,直到所有混合溶液通过此吸附柱。

9、加入10mL漂洗液PW(已加入无水乙醇) （Vazyme公司，货号DC202），12000×g，离心3min，弃废液。将吸附柱重新放回收集管中，再加入15mL漂洗液PW，重复漂洗一次。

10、将吸附柱放回空收集管中，12000×g，离心5min，打开盖子室温晾干5min。

11、取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加1.5mL BufferTB（Vazyme公司，货号DC202），室温放置5min，12000×g，离心5min，洗脱质粒。

12、测定浓度后，-20℃保存备用。

（三）BSR细胞复苏：

1、37℃预热含10% FBS的DMEM培养基（DMEM为Solarbio公司产品，货号为12100-500ml）。

2、-80℃冰箱中取出冻存的BSR细胞（实验室保存）在37℃水浴锅中快速融化。

3、将融化后的BSR细胞加入到已预热的DMEM培养基中，1000rpm，离心3min。

4、弃上清，用2mL预热的10% FBS的DMEM培养基重悬，再加入100mg/mL的G-418溶液100μL，混匀后加入到装有10mL 10% FBS的DMEM培养基的培养皿中，37℃ 5% CO₂培养箱中培养观察。

5、12h后进行换液处理。

（四）BSR细胞换液：

1、将步骤（三）中的BSR细胞复苏15h后观察细胞状态。

2、吸弃细胞培养上清，加入5ml PBS轻柔晃动。

3、弃去上清，再加入5mL PBS重复清洗一次，弃上清。

4、向皿中加入10mL 10%FBS的DMEM培养基，37℃ 5%CO₂培养箱中继续培养。

（五）BSR细胞传代：

1、待所述步骤（四）中的在培养箱中培养的BSR细胞长到90%左右进行传代。

2、吸取细胞培养上清，加入5ml PBS清洗一次，弃上清。

3、每皿加入1mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化酶（Solarbio，货号T1320），37℃ 5%CO₂培养箱消化2分钟。

4、每皿加入4mL 10% FBS的DMEM培养基终止消化，1000rpm，离心3min。

5、弃上清，加入5mL PBS重悬，1000rpm，离心3min。

6、弃上清，用2mL的10% FBS的DMEM培养基重悬，同时加入100mg/mL的G-418溶液50μL，充分混匀。

7、将上述的细胞悬液平均加入装有12mL 10% FBS的DMEM培养基的培养皿中，37℃5% CO₂培养箱中培养。

（六）BSR细胞铺板：

1、吸取所述步骤（五）中的细胞培养上清，加入5ml PBS清洗一次，弃上清。

2、每皿加入1mL胰酶，37℃ 5% CO₂培养箱消化2分钟。

3、每皿加入4mL 10% FBS的DMEM培养基终止消化，1000rpm，离心3min。

4、弃上清，加入5mL PBS重悬，1000rpm，离心3min。

5、弃上清，加入5mL PBS重悬，吸取10μL细胞悬液计数。

6、根据计数情况，按每孔2mL 10% FBS的DMEM培养基、1×10⁵个细胞进行稀释。

7、将稀释后的细胞悬液均匀的铺入六孔板中，37℃ 5% CO₂培养箱中培养观察。

（七）重组NDV-GHF质粒转染BSR细胞：

1、待所述步骤（六）中的六孔板中的BSR细胞长到80%左右时进行转染。

2、用无抗无血的DMEM按1:100的比例稀释痘苗病毒（实验室保存），按每孔200μL的用量进行配置，4℃储存备用。

3、吸取培养上清，用不含血清的DMEM轻柔的洗2次。

4、每孔加入200μL稀释好的痘苗病毒，37℃ 5% CO2培养箱中感染60min，每隔20min轻柔的晃一次。

5、配置转染A、B液。A液：375μL Opti-MEM+30μL的转染试剂。B液：375μL Opti-MEM+14μg的质粒，其中，质粒包括重组质粒与辅助质粒，重组质粒与辅助质粒N、P、L的比例为4:2:2:1）（补充重组质粒的来源：本发明实施例前述提到的提取重组质粒；辅助质粒的来源：实验室保存）。

6、将B液轻柔的加入A液中，并轻轻的混匀，室温静置10min。

7、吸取痘苗病毒悬液，每孔加入无抗无血的DMEM 2mL、混合后的A、B液各265 μL。

8、轻轻混匀后，37℃ 5% CO₂培养箱中培养6-8h。

9、6-8h后吸取上清，每孔加入2mL含5% FBS的DMEM、10μL 10mg/mL的阿糖胞苷，轻轻混匀后37℃ 5% CO₂培养箱中继续培养。

10、24h后吸取上清，每孔加入2mL无抗无血的DMEM、10μL 10mg/mL的阿糖胞苷、1μL1mg/mL的TPCK，轻轻混匀后37℃ 5% CO₂培养箱中继续培养。

11、48h收集细胞及上清，装入15mL离心管，封口膜封口，-20℃保存。

（八）转染上清接种鸡胚：

1、将所述步骤（七）中在-20℃保存的转染上清在冷水中快速融化。

2、融化后的上清，4℃暂存。

3、取10日龄的鸡胚用手电筒照射，画出接种线。

4、先用碘酊棉球擦拭消毒，再用75%的酒精棉球擦拭脱碘。

5、用锥子在画线处轻轻的敲出一个小洞（针头大小即可）。

6、用1mL的注射器吸取300μL的转染上清，从小孔处接入鸡胚中。

7、用蜡块将小孔封住，做好标记，37℃ 50%湿度孵育箱中孵育。

8、孵育24h后用手电筒照射接种后的鸡胚，将死胚取出丢弃，其他的鸡胚继续孵育。

（九）鸡胚收毒并检测血凝效价：

1、待所述步骤（八）中接种转染上清的鸡胚孵化5天后，将其取出放置在4℃冰箱。

2、4h后从4℃冰箱中取出鸡胚，用酒精棉球进行擦拭消毒。

3、用消毒后的镊子轻轻的沿鸡胚气室敲击，并将气室上方的蛋壳取下。

4、用100μL的移液枪吸取50μL的尿囊液于血凝板中（血凝板中每孔装有50μL的PBS）。

5、将第一个孔中的尿囊液与PBS混匀后吸出50μL于第二个孔中，依次进行倍比稀释至第6个孔。

6、每孔加入50μL 1%鸡红细胞悬液并混匀，室温静置15min。

7、15min后观察每孔的血凝情况，若出现鸡红细胞凝集现象则为血凝实验阳性，病毒拯救成功，将其尿囊液全部收集在15mL离心管中，-20℃保存，具体实验结果见图2。

图2是本发明重组病毒的血凝结果图，血凝实验结果为：新城疫病毒NDV能与1%的鸡红细胞发生凝集反应，而PBS中因不含NDV，所以鸡红细胞全部沉积于血凝板底部；将血凝板倾斜45°时，未凝集的红细胞会成线状。本发明重组病毒与NDV阳性对照病毒均发生凝集现象，PBS未见血凝发生，证明本发明重组病毒成功拯救。

（十）RT-PCR验证：

1、取高压灭菌的1.5mL EP管，向其中加入200μL上述步骤（九）保存的尿囊液、350μL的Buffer RLT（已含有β-巯基乙醇）、550μL的70%的乙醇，移液枪吹打混匀。

2、将混合液移入RNeasy红色离心柱中，11000rpm，离心30s，弃滤过液，直到将所有的混合液全部通过离心柱。

3、将700μL的Buffer RW₁加入离心柱中，11000rpm，离心30s，弃滤过液。

4、将500μL的Buffer RPE加入离心柱中，11000rpm，离心30s，弃滤过液。

5、重复步骤4一次。

6、12000rpm，空离2min。

7、将过滤柱移入新的无菌EP管中，向其中加入35μL RNase water，室温静置2min，11000rpm，离心2min。

8、将洗脱后的液体再次加入过滤柱中，室温静置2min，11000rpm，离心2min。

9、配置40μL的RT-PCR体系

上游引物 0.8μL

下游引物 0.8μL

RNA模板（步骤8的洗脱液） 18μL

2×one-step Reaction mix 20μL

Trans script-Ⅱone-step Enzyme mix 0.8μL

10、进行PCR，反应条件如下。

50℃ 22min

94℃ 3min

94℃ 30s (30cyc)

55℃ 30s (30cyc)

72℃ 2min 30s (30cyc)

72℃ 10min

11、PCR产物-20℃保存，准备测序验证。

（十一）重组病毒的扩增：

1、用含双抗的PBS将第一代的重组病毒尿囊液进行1:10倍的稀释，4℃暂存。

2、取10日龄的鸡胚用手电筒照射，画出接种线。

3、先用碘酊棉球擦拭消毒，再用75%的酒精棉球擦拭脱碘。

4、用锥子在画线处轻轻的敲出一个小洞（针头大小即可）。

5、用1mL的注射器吸取100μL稀释后的重组病毒尿囊液，从小孔处接入鸡胚中。

6、用蜡块将小孔封住，做好标记，37℃ 50%湿度孵育箱中孵育。

7、孵育24h后用手电筒照射接种后的鸡胚，将死胚取出丢弃，其他的鸡胚继续孵育。

8、待鸡胚孵化5天后，将其取出放置在4℃冰箱。

9、4h后从4℃冰箱中取出鸡胚，用酒精棉球进行擦拭消毒。

10、用消毒后的镊子轻轻的沿鸡胚气室敲击，并将气室上方的蛋壳取下。

11、用100μL的移液枪吸取50μL的尿囊液于血凝板中，检测其血凝效价，其余的尿囊液收集入50mL离心管中，-80℃保存。

12、将重组病毒按上述扩增方法连续扩增5代以上，-80℃保存备用。

（十二）重组病毒TCID₅₀测定：

1、取培养至3代的BSR细胞观察，待细胞生长到80%左右时，进行传代。

2、吸取培养上清，用PBS轻柔的洗2次，弃液。

3、向皿中加入1mL的胰酶，37℃ 5% CO₂培养箱消化2分钟。

4、每皿加入4mL 10%FBS的DMEM培养基终止消化，1000rpm，离心3min。

5、弃上清，加入5mL PBS重悬，1000rpm，离心3min。

6、弃上清，加入5mL PBS重悬，吸取10μL细胞悬液计数。

7、根据计数情况，按每孔1500个细胞的密度将BSR细胞均匀的铺入96孔板中（每孔都要铺），37℃ 5% CO₂培养箱中过夜培养。

8、将重组病毒进行倍比稀释。取无菌的1.5mL EP管10个，依次向管中加入900μL2% FBS的DMEM培养基，向第一个管中加入100μL的重组病毒尿囊液，混匀后吸出100μL加入第二个管中，依次进行10倍的稀释，直到稀释到10¹⁰倍。

9、将过夜培养的96孔板取出，吸去每孔的培养上清，每孔加入100μL步骤8倍比稀释到尿囊液，同时每个稀释倍数做7个重复孔，并设置正常细胞对照，正常细胞对照作16个孔。

10、36小时后免疫荧光检测。

11、按Reed-Muench两氏法计算TCID₅₀，并更具TCID₅₀的结果计算MOI=1的重组病毒尿囊液的用量。

体外细胞杀伤实验：

1、取传至第三代的HepG-2细胞进行铺板，吸取培养上清，用PBS轻柔的洗2次，弃液。

2、向皿中加入1mL的胰酶，37℃ 5% CO₂培养箱消化2分钟。

3、每皿加入4mL 10%FBS的DMEM培养基终止消化，1000rpm，离心3min。

4、弃上清，加入5mL PBS重悬，1000rpm，离心3min。

5、弃上清，加入5mL PBS重悬，吸取10μL细胞悬液计数。

6、根据计数情况，按每孔1×10⁵个细胞的密度将HepG-2细胞均匀的铺入6孔板中，37℃ 5% CO₂培养箱中过夜培养。

7、过夜培养后将六孔板中的细胞培养上清吸出，用PBS洗两次，每孔加入2mL的2%FBS的DMEM培养基，并加入10μL的重组病毒尿囊液，混匀后37℃ 5% CO₂培养箱中培养。

结果如图4所示，重组溶瘤NDV-α1,3 GT-HPSE-FAP scFv作用肿瘤细胞后72小时，大量细胞死亡，细胞膜溶解，大量细胞脱落。

重组新城疫病毒的体内抗癌效果：

结果如图5所示，免疫重建SCID/beige鼠（Hu-PBMC-SCID）荷人肝癌模型实验动物随机分为3 组，当小鼠肿瘤平均体积达到150 mm³时每隔一天进行300ul PBS、1*10⁷ pfu /Kg 重组NDV静脉注射，共治疗5次。观察小鼠肿瘤生长情况，探究重组病毒对肿瘤的治疗效果（图5）。结果可以看出，小鼠分别经过 PBS、重组NDV治疗后，随时间的延长，PBS 组肿瘤体积不断增加，无治疗或抑制肿瘤的效果。重组病毒治疗组肿瘤体积均增长缓慢。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

序列表

<110> 旦旦生物科技（上海）有限公司

<120> 靶向超敏广谱溶瘤病毒制备及应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1629

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgctgctgc gctcgaagcc tgcgctgccg ccgccgctga tgctgctgct cctggggccg 60

ctgggtcccc tctcccctgg cgccctgccc cgacctgcgc aagcacagga cgtcgtggac 120

ctggacttct tcacccagga gccgctgcac ctggtgagcc cctcgttcct gtccgtcacc 180

attgacgcca acctggccac ggacccgcgg ttcctcatcc tcctgggttc tccaaagctt 240

cgtaccttgg ccagaggctt gtctcctgcg tacctgaggt ttggtggcac caagacagac 300

ttcctaattt tcgatcccaa gaaggaatca acctttgaag agagaagtta ctggcaatct 360

caagtcaacc aggatatttg caaatatgga tccatccctc ctgatgtgga ggagaagtta 420

cggttggaat ggccctacca ggagcaattg ctactccgag aacactacca gaaaaagttc 480

aagaacagca cctactcaag aagctctgta gatgtgctat acacttttgc aaactgctca 540

ggactggact tgatctttgg cctaaatgcg ttattaagaa cagcagattt gcagtggaac 600

agttctaatg ctcagttgct cctggactac tgctcttcca aggggtataa catttcttgg 660

gaactaggca atgaacctaa cagtttcctt aagaaggctg atattttcat caatgggtcg 720

cagttaggag aagattttat tcaattgcat aaacttctaa gaaagtccac cttcaaaaat 780

gcaaaactct atggtcctga tgttggtcag cctcgaagaa agacggctaa gatgctgaag 840

agcttcctga aggctggtgg agaagtgatt gattcagtta catggcatca ctactatttg 900

aatggacgga ctgctaccaa ggaagatttt ctaaaccctg atgtattgga catttttatt 960

tcatctgtgc aaaaagtttt ccaggtggtt gagagcacca ggcctggcaa gaaggtctgg 1020

ttaggagaaa caagctctgc atatggaggc ggagcgccct tgctatccga cacctttgca 1080

gctggcttta tgtggctgga taaattgggc ctgtcagccc gaatgggaat agaagtggtg 1140

atgaggcaag tattctttgg agcaggaaac taccatttag tggatgaaaa cttcgatcct 1200

ttacctgatt attggctatc tcttctgttc aagaaattgg tgggcaccaa ggtgttaatg 1260

gcaagcgtgc aaggttcaaa gagaaggaag cttcgagtat accttcattg cacaaacact 1320

gacaatccaa ggtataaaga aggagattta actctgtatg ccataaacct ccataatgtc 1380

accaagtact tgcggttacc ctatcctttt tctaacaagc aagtggataa ataccttcta 1440

agacctttgg gacctcatgg attactttcc aaatctgtcc aactcaatgg tctaactcta 1500

aagatggtgg atgatcaaac cttgccacct ttaatggaaa aacctctccg gccaggaagt 1560

tcactgggct tgccagcttt ctcatatagt ttttttgtga taagaaatgc caaagttgct 1620

gcttgcatc 1629

<210> 2

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggaggtgc aattgttgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 60

ctctcctgtg cagcctccgg attcaccttt agcagttatg ccatgagctg ggtccgccag 120

gctccaggga aggggctgga gtgggtctca gctattagtg gtagtggtgg tagcacatac 180

tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 240

tatctgcaga tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgaaaggg 300

tggctgggta attttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagtggcggc 360

ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg aaatcgtgtt aacgcagtct 420

ccaggcaccc tgtctttgtc tccaggggaa agagccaccc tctcttgcag ggccagtcag 480

agtgttagcc gcagctactt agcctggtac cagcagaaac ctggccaggc tcccaggctc 540

ctcatcattg gggcctccac cagggccact ggcatcccag acaggttcag tggcagtgga 600

tccgggacgg acttcactct caccatcagc agactggagc ctgaagattt tgcagtgtat 660

tactgtcagc agggtcaggt tattccccct acgttcggcc aggggaccaa agtggaaatc 720

aaatga 726

<210> 3

<211> 1077

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaatgtca aaggaagagt ggttctgtca atgctgcttg tctcaactgt aatggttgtg 60

ttttgggaat acatcaacag aaacccagaa gttggcagca gtgctcagag gggctggtgg 120

tttccgagct ggtttaacaa tgggactcac agttaccacg aagaagaaga cgctataggc 180

aacgaaaagg aacaaagaaa agaagacaac agaggagagc ttccgctagt ggactggttt 240

aatcctgaga aacgcccaga ggtcgtgacc ataaccagat ggaaggctcc agtggtatgg 300

gaaggcactt acaacagagc cgtcttagat aattattatg ccaaacagaa aattaccgtg 360

ggcttgacgg tttttgctgt cggaagatac attgagcatt acttggagga gttcttaata 420

tctgcaaata catacttcat ggttggccac aaagtcatct tttacatcat ggtggatgat 480

atctccagga tgcctttgat agagctgggt cctctgcgtt cctttaaagt gtttgagatc 540

aagtccgaga agaggtggca agacatcagc atgatgcgca tgaagaccat cggggagcac 600

atcctggccc acatccagca cgaggtggac ttcctcttct gcatggacgt ggatcaggtc 660

ttccaaaaca actttggggt ggagaccctg ggccagtcgg tggctcagct acaggcctgg 720

tggtacaagg cacatcctga cgagttcacc tacgagaggc ggaaggagtc cgcagcctac 780

attccgtttg gccaggggga tttttattac cacgcagcca tttttggggg aacacccact 840

caggttctaa acatcactca ggagtgcttc aagggaatcc tccaggacaa ggaaaatgac 900

atagaagccg agtggcatga tgaaagccat ctaaacaagt atttccttct caacaaaccc 960

actaaaatct tatccccaga atactgctgg gattatcata taggcatgtc tgtggatatt 1020

aggattgtca agatagcttg gcagaaaaaa gagtataatt tggttagaaa taacatc 1077

<210> 4

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccaaggtcc aactctgttt aaacttagaa aaaatacggg tagaagtgcc accgaccccc 60

gggtccgccc g 71

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggattgccg cttgggttta aactcatttg atttccactt tggtcc 46

Claims

1.一种包含重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的重组病毒，其特征在于，所述重组病毒由重组新城疫病毒NDV-GHF质粒与辅助质粒共转染BSR细胞拯救获得；所述重组新城疫病毒NDV-GHF质粒是将新城疫病毒NDV与α-1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因进行重组后的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒；所述辅助质粒选自辅助质粒N、辅助质粒P和辅助质粒L。

2.如权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，所述新城疫病毒NDV的基因序列见GenBank FJ766530.1；所述HPSE基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述FAP scFv基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述α-1,3 GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示。

3.如权利要求1或2所述的重组病毒在制备融化肿瘤物理屏障的药物中的应用。

4.重组新城疫病毒NDV-GHF质粒，其特征在于，在新城疫病毒NDV中重组包含α-1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒；所述重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的载体是TVT/071204，所述α-1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因插入的位点为Age I、SanD I。

5.如权利要求4所述的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒，其特征在于，所述HPSE基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述FAP scFv基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述α-1,3 GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示。

6.如权利要求4或5所述的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒在构建包含重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的重组新城疫病毒中的应用。

7.一种如权利要求1或2所述的重组病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一、构建所述的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒；

步骤二、提取测序正确的所述的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒；

步骤三、BSR细胞复苏、换液、传代和铺板；

步骤四、利用痘苗病毒感染BSR细胞，然后用所述步骤二中提取的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒对BSR细胞进行转染；

步骤五、取所述步骤四转染后的细胞上清接种到鸡胚中，拯救病毒；

步骤六、从所述步骤五中的鸡胚中收毒，检测血凝效价，确认获得重组病毒。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤一中，所述的重组新城疫病毒NDV-GHF质粒的构建方法包括以下步骤：

（2）扩增目的基因片段；所述目的基因的序列如SEQ ID NO:1~3所示；

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述扩增中引物的序列如下所示：

PF：

CCCAAGGTCCAACTCTGTTTAAACTTAGAAAAAATACGGGTAGAAGTGCCACCGACCCCCGGGTCCGCCCG

PR：AGGATTGCCGCTTGGGTTTAAACTCATTTGATTTCCACTTTGGTCC。

10.一种静脉注射制剂，其特征在于，所述静脉注射制剂包括如权利要求1或2所述的重组病毒。

11.如权利要求1或2所述的重组病毒、或如权利要求10所述的静脉注射制剂在制备新城疫病毒疫苗中的应用。