BRPI0917993B1

BRPI0917993B1 - composições de célula-tronco mesenquimal purificada

Info

Publication number: BRPI0917993B1
Application number: BRPI0917993-3A
Authority: BR
Inventors: Alla Danilkovich; Robert E. Newman; Samson Tom; Christopher Ton; Zhanling Wang; Randal Young
Original assignee: Mesoblast International Sàrl
Priority date: 2008-08-14
Filing date: 2009-08-14
Publication date: 2020-12-29
Also published as: BRPI0917993A2; JP6025329B2; US20200197444A1; US20140105872A1; JP2023052211A; ES2608974T3; CA2733985A1; EP2318519A1; EP2318519A4; JP2012500214A; MX362512B; ZA201101858B; JP2018109052A; IL211214A0; JP2017081972A; WO2010019886A1; JP2015071610A; MX2011001730A; DK2318519T3; US8637004B2

Abstract

COMPOSIÇÕES DE CÉLULA-TRONCO MESENQUIMAL PURIFICADA E MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO DE COMPOSIÇÕES DE CÉLULA-TRONCO MESENQUIMAL PURIFICADA. A presente invenção refere-se a uma ou mais composições farmacêuticas de célula-tronco purificada e métodos de produção que utilizam a filtração centrífuga. São descritos também limiares para a administração intravenosa das composições farmacêuticas de célula-tronco mesenquimal que compreendem produtos animais residuais.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório U.S. Número de Série 61/088.898, depositado em 14 de Agosto de 2008, cujos conteúdos estão incorporados aqui por referencia.

PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO [Não Aplicável] [MICROFICHA/REFERENCIA A DIREITOS AUTORAIS] [Não Aplicável] ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] As células-tronco mesenquimais ("MSC" ou "MSCs") podem ser encontradas na medula óssea, sangue, derme, periósteo e outros tecidos do corpo e são capazes de se diferenciar em uma variedade de tipos celulares, incluindo as adiposas, areolares, ósseas, cartilaginosas, elásticas, do estroma da medula, músculo, tecido conjuntivo fibroso e tecido cardíaco, dependendo de vários fatores e influências in vivo ou in vitro. Tais células estão descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos: 5.197.985; 5.226.914; 5.486.359; 5.837.539 e 6.087.113, cada uma das quais está incorporada aqui, independentemente, pela referencia em sua totalidade.

[003] MSCs têm mostrado se enxertar e diferenciar seletivamente com base no meio ambiente do tecido, em linhagens tais como músculo, osso, cartilagem, estroma da medula, tendão e gordura. Devido à sua origem e fenótipo, essas células não provocam uma resposta imune adversa, permitindo o desenvolvimento de produtos derivados de doadores humanos não relacionados.

[004] Em geral, MSCs são isoladas do tecido a partir do qual elas são obtidas, purificadas e expandidas depois em um meio de cultura apropriado. O meio de cultura contém uma variedade de componentes que auxiliam na expansão das MSCs, tal como o soro, que compreende proteínas séricas (por exemplo, albumina sérica, tal como albumina sérica bovina); fatores do crescimento; e citocinas. Depois do isolamento, purificação e expansão da cultura, as MSCs são submetidas a uma série de lavagens e, opcionalmente, centrifugação. As MSCs podem ser congeladas ou armazenadas em um meio de conservação apropriado, por exemplo, um meio de criopreservação compreendendo sulfóxido de dimetila ("DMSO"). Subsequentemente, as MSCs são descongeladas pouco antes da administração a um paciente.

[005] O processo de produção para a expansão de MSCs envolve cultivar a células na presença de soro não autólogo e coletar a célula por tripsina não autóloga; em alguns processos, o soro não autólogo é soro fetal bovino ("FBS") e a tripsina não autóloga é a tripsina de porco. A expansão ex vivo de MSCs humanas ("hMSCs") usando reagentes de origem animal leva a presença de macromoléculas residuais de origem não humana (por exemplo, macromoléculas de origem porcina e bovina) no produto finalizado. Depois da expansão das hMSCs em meio que compreende produtos não humanos, uma quantidade aumentada de substâncias xenogênicas pode ser observada em relação à MSCs expandidas em meios que compreendem produtos humanos.

[006] A albumina sérica bovina ("BSA") é um componente significativo do FBS. Ambos, BSA e tripsina de porco são alérgenos conhecidos. Como tal, eles podem desencadear reações adversas em pacientes suscetíveis a macromoléculas bovinas e porcina e podem causar sensibilização em um paciente não alérgico levando a reações alérgicas depois de exposições múltiplas (Veja, por exemplo, Colten HR et al., N Engl J Med, 1975, 292:1050; Moneret-Vautrin A. et al., Allergy, 1991, 46:228; Orta M et al., Ann Allergy Asthma Immunol 2003, 90:446; de Benito V. et al., Allergologia et Immunopathologia, 2001, 29:272). Quantidades aumentadas de FBS presentes em MSCs expandidas em cultura também podem induzir efeitos colaterais indesejados em pacientes, tais como respostas imunes indesejáveis, embolia pulmonar, vasoconstricção, choque cardiogênico e morte. A presença de BSA ou de tripsina porcina residual pode aumentar a imunogenicidade e acelerar depuração ou eliminação de MSCs do receptor. Quantidades aumentadas de FBS presentes em composições farmacêuticas que compreendem MSCs expandidas em cultura podem aumentar o risco de transmissão de vírus, doenças por príon e proteínas xenogênicas em pacientes que recebem tais terapias baseadas em MSC. Quantidades aumentadas de FBS, particularmente de BSA, presentes em composições farmacêuticas que compreendem MSCs expandidas em cultura podem iniciar respostas imunes contra essas substâncias xenogênicas. Por exemplo, se a preparação de MSC administrada a um paciente contiver BSA ou outras proteínas xenogênicas, tais proteínas xenogênicas podem desencadear uma resposta imune indesejável. As proteínas xenogênicas podem fazer surgir respostas imunes mediadas por célula ou humorais (por exemplo, a geração de anticorpos anti-proteína sérica bovina), que podem resultar em um enxerto menos eficiente das MSCs, particularmente se tais proteínas xenogênicas tornarem-se associadas com as membranas da superfície celular de MSC. Como tal, uma nova abordagem torna-se necessária para reduzir a quantidade de substâncias xenogênicas, incluindo FBS e particularmente BSA, presentes em composições farmacêuticas que compreendem MSCs expandidas em cultura. Uma nova abordagem é necessária para reduzir a quantidade de substâncias xenogênicas, incluindo açúcares, proteínas e outras macromoléculas presentes em MSCs expandidas em cultura, que possa aumentar o perfil de segurança da composição de MSC resultante.

[007] Meios que compreendem soros alternativos tais como soro autólogo humano, têm sido propostos, entretanto, o uso de soro autólogo não é possível quando as quantidades de células necessárias no produto de MSC finalizado excedem aquela que pode ser cultivada em uma quantidade fixa de soro autólogo. Adicionalmente, o uso de soro autólogo humano pressupõe que o paciente terá tempo suficiente e estará saudável o suficiente para doar soro com o avanço da iniciação da terapia com MSC. O processo atual convencional de cultivo de MSC requer, tipicamente, 2 a 10 semanas para isolar, expandir, coletar e purificar um número adequado de células para constituir um tratamento farmacêutico. Em alguns casos, o tratamento farmacêutico consiste em 1 dose. Em outros casos, um tratamento farmacêutico consiste em 2 ou mais doses. Infelizmente, em alguns casos, a terapia com MSC é necessária em menos do que cerca de 2 semanas entre o diagnóstico ou a apresentação dos sintomas clínicos, ou em menos do que cerca de 1 semana entre o diagnóstico ou a apresentação dos sintomas clínicos ou em menos do que cerca de 48 horas entre o diagnóstico ou a apresentação dos sintomas clínicos. Quando a terapia com MSC é necessária dentro de um curto período de tempo entre o diagnóstico ou a apresentação dos sintomas clínicos, hMSCs que já tenham sido produzidas, purificadas e criopreservadas exibem o benefício significativo de estarem disponíveis no momento do diagnóstico ou da apresentação de uma doença aguda.

[008] Adicionalmente, o soro humano, incluindo o soro humano autólogo, exibe um aumento estatisticamente significativo no risco de transmissão de uma doença, por exemplo, uma doença viral, para o receptor da composição farmacêutica de MSC.

[009] Spees et al., mencionam combinações de meios que compreendem passagens seriadas em soro fetal bovino ("FCS") e soro humano autólogo (Spees et al., Mol Therapy, 2004, 9:747). Composições finais produzidas pelas combinações seriadas de meios fornecem uma margem 15 vezes maior de FCS residual por amostra de acordo com a eletroforese em SDS-PAGE de FCS marcado depois de 50 ciclos de lavagem. Protocolos que requerem soro humano autólogo e lavagem intensa que não forneçam composições finais mais reprodutíveis são academicamente interessantes, mas não fornecem a qualidade ou a consistência necessárias a fabricação de uma composição farmacêutica adequada para administração a um ser humano.

[0010] Doses e limiares de risco para a reatividade clínica entre pacientes alérgicos têm sido estabelecidos para vários antígenos. (Moneret-Vautrin A. & Kanny G., Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2004, 4:215; Bindslev-Jensen C et al., Allergy, 2002, 57:741). Embora esses limiares sejam estabelecidos para a administração oral de antígenos, os limiares para a exposição intravenosa ("IV") a alérgenos são desconhecidos. (Wensing M. et al., J Allergy Clin Immunol, 2002, 110:915; Taylor SL et al., Clin Exp Allergy, 2004, 34:689). As decisões terapêuticas com relação à administração IV de composições que compreendem MSCs são complicadas pela ausência de dados e relatos de limiares na literatura que mostrem que produtos derivados de células e animais podem causar reações adversas sérias (por exemplo, anafilaxia e doença semelhante à doença do soro). (Moneret-Vautrin A et al., Allergy, 1991, 46:228; Orta M et al., Ann Allergy Asthma Immunol 2003, 90:446; de Benito V. et al., Allergologia et Immunopathologia, 2001,29:272).

[0011] Como um exemplo, doses e limiares de risco para a reatividade clínica entre pacientes alérgicos têm sido estabelecidos para vários antígenos, à maioria dos quais se refere a categorias de alérgenos alimentares (Moneret-Vautrin A. & Kanny G., Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2004, 4:21). Como esses limiares foram estabelecidos para a administração oral de antígenos, eles são esperados ser diferentes dos limiares para a administração IV. Novamente, os limiares para a exposição IV a alérgenos permanecem desconhecidos. (Taylor SL et al., Clin Exp Allergy, 2004, 34:689). A ausência de dados e relatos de limiares na literatura que mostrem que produtos derivados de células e animais podem causar reações adversas sérias (por exemplo, anafilaxia e doença semelhante à doença do soro) exclui o uso de terapêuticos produzidos na presença de produtos bovinos ou porcinos. (Orta M et al., Ann Allergy Asthma Immunol 2003, 90:446).

[0012] Perotti et al. mencionam a filtração centrífuga como uma técnica útil para a remoção do crioconservante DMSO do sangue do cordão umbilical. (Perotti CG et al., Transfusion, 2004, 44(6):900-906). Calmels et al. mencionam a filtração centrífuga como uma técnica útil para a remoção de DMSO de enxertos de célula-tronco hematopoiética. (Calmels B et al., Bone Marrow Transplant., 2003, 31(9):823-828). Hampson et al. mencionam métodos para lavar células mononucleares cultivadas de medula óssea. (US 2008/0175825). Níveis residuais de BSA pós-lavagem do sobrenadante da cultura celular foram relatados ser menores do que cerca de 3 μg/ml. Usando um equipamento Cytomate para lavar células mononucleares de medula óssea, Hampson et al. obtiveram cerca de 70% de viabilidade celular pós-lavagem. Hampson et al. indicaram que essa queda significativa na viabilidade celular pode ser devida ao dano celular causado pelas forças mecânicas aplicadas durante o processo.

[0013] Protocolos que requerem a lavagem intensa das células não fornecem a qualidade ou a consistência necessárias para a fabricação de uma composição farmacêutica adequada para administração a um ser humano. Adicionalmente, os efeitos dos protocolos de lavagem intensiva sobre a viabilidade das células e a eficácia de uma composição farmacêutica que compreenda tais células são desconhecidos.

[0014] Adicionalmente, vários protocolos de purificação publicados compreendem pelo menos uma etapa que envolve transferir o produto intermediário que contém MSC, onde o produto é exposto ao meio ambiente externo (isto é, não é um sistema fechado). Como os sistemas fechados controlam cuidadosamente a quantidade e a qualidade dos materiais que entram e saem do sistema, assim como a maneira pela qual esses materiais entram ou saem, o desenvolvimento de um sistema de produção fechado para a preparação de composições farmacêuticas de MSC pode representar uma realização significativa na técnica.

[0015] Com esses desafios em mente, é necessário: 1) estabelecer uma dose limiar de componentes residuais no produto que irá minimizar o risco de reações alérgicas nos pacientes; 2) fornecer um método para a purificação de uma composição de MSC para reduzir a quantidade de componentes residuais, incluindo alérgenos, abaixo do nível limiar, enquanto se minimiza o dano celular e se mantém a viabilidade celular; e 3) fornecer uma composição de hMSC que compreenda menos do que a quantidade limiar de componentes residuais, incluindo alérgenos, com dano celular limitado e uma alta proporção de células viáveis.

[0016] Em suma, a técnica atual relacionada a métodos de preparação de composições farmacêuticas de MSC compreende uma necessidade significativa há muito sentida: reduzir a imunogenicidade das composições de MSC cultivadas em soro não humano. Além disso, a presente tecnologia descrita e reivindicada aqui identificou, surpreendentemente, um desafio que ainda não tinha sido previamente reconhecido na técnica convencional como uma deficiência significativa: reduzir a extensão da agregação de MSC.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0017] Algumas modalidades da presente tecnologia descrevem composições que compreendem MSCs que possuem imunogenicidade reduzida em relação a composições de MSC purificadas por centrifugação.

[0018] Algumas modalidades da presente tecnologia descrevem composições que compreendem MSCs que exibem D90 reduzida de quaisquer agregados de MSCs presentes na composição farmacêutica.

[0019] Algumas modalidades da presente tecnologia descrevem composições que compreendem MSCs que exibem adesão diminuída de MSCs individuais umas com as outras.

[0020] Algumas modalidades da presente tecnologia descrevem composições que compreendem MSCs onde as MSCs são purificadas por filtração centrífuga depois da expansão da cultura.

[0021] Algumas modalidades da presente tecnologia descrevem composições que compreendem MSCs purificadas por filtração centrífuga que simultaneamente (i) reduz a imunogenicidade das composições de MSC; e (ii) reduz o tamanho médio dos agregados de MSC pela diminuição das propriedades adesivas de MSCs individuais.

[0022] Algumas modalidades da presente tecnologia descrevem composições que compreendem MSCs purificadas com imunogenicidade reduzida e tendência reduzida a agregação. Outras modalidades da presente tecnologia descrevem composições farmacêuticas que compreendem MSCs purificadas por filtração centrífuga. O processo, simultaneamente, (i) reduz a imunogenicidade das composições de MSCs; e (ii) reduz o tamanho médio dos agregados de MSC.

[0023] Algumas modalidades da presente tecnologia descrevem composições farmacêuticas que compreendem MSCs e DMSO.

[0024] Adicionalmente, algumas modalidades da presente tecnologia descrevem composições farmacêuticas que compreendem MSCs que tenham sido purificadas para reduzir a quantidade de substâncias xenogênicas tais como proteínas presentes depois da expansão em meio de cultura compreendendo, por exemplo, BSA. Tais composições farmacêuticas exibem perfis de segurança superiores através, por exemplo, da redução da imunogenicidade de tais composições.

[0025] Outras modalidades da presente tecnologia descrevem composições farmacêuticas que compreendem MSCs que tenham sido purificadas para reduzir a quantidade de substâncias, incluindo moléculas da membrana da superfície da célula, ácidos nucleicos extranucleares (DNA/RNA) e outros restos celulares. Tais composições farmacêuticas podem exibir perfis de segurança superiores pela diminuição do tamanho médio dos agregados de MSC, por exemplo, pela redução das propriedades adesivas de MSCs individuais. Tal redução nas propriedades adesivas pode efetuar uma diminuição do tamanho médio dos agregados de MSC.

[0026] Além disso, algumas modalidades da presente tecnologia referem-se a composições que compreendem hMSCs expandidas em cultura que possuem quantidades reduzidas de componentes residuais de FBS, particularmente de BSA, em relação a um lote comparável de MSCs não purificadas, expandidas em cultura. Em algumas dessas modalidades, a quantidade de BSA nas composições que compreendem MSCs expandidas em cultura depois da purificação é cerca de 10 a 1000 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de MSCs não purificadas expandidas em cultura.

[0027] Outras modalidades adicionais da presente tecnologia referem-se a células-tronco mesenquimais humanas e a métodos de purificação de células-tronco mesenquimais humanas. Mais particularmente, certas modalidades referem-se a composições farmacêuticas que incluem hMSCs nas quais a quantidade de moléculas extracelulares, da superfície celular e transmembrana em tais composições está reduzida em 1 log (como usada aqui, a expressão "log" refere-se a log de base 10) em relação a um lote comparável de MSCs não purificadas expandidas em cultura. Outras modalidades referem-se a uma ou mais composições farmacêuticas que compreendem menos do que cerca de 10 μg/mL de BSA residual. Algumas modalidades dessa tecnologia referem-se a uma composição farmacêutica que compreende MSCs que exibem D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 25 μm.

[0028] Em modalidades adicionais, a presente tecnologia refere-se a métodos de produção de composições farmacêuticas que compreendem hMSCs expandidas em cultura, nas quais a quantidade de moléculas extracelulares, da superfície celular e transmembrana em tais composições está reduzida em 1 log em relação a um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Outras modalidades referem-se a um método de produção de composições farmacêuticas que compreendem hMSCs expandidas em cultura que compreendem menos do que cerca de 10 μg/mL de BSA residual. Modalidades adicionais referem-se a um método de produção de uma composição farmacêutica que compreende MSCs que exibem D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 25 μm. Algumas modalidades da presente tecnologia referem-se a composições farmacêuticas de MSC, em que a composição compreende menos do que cerca de 10 μg/mL de BSA residual e as MSCs exibem D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 25 μm.

[0029] Modalidades adicionais da presente tecnologia referem-se a composições farmacêuticas que compreendem hMSCs expandidas em cultura que compreendem quantidades reduzidas de substâncias xenogênicas, incluindo açúcares, proteínas e outras macromoléculas em relação a um lote comparável de MSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades, a quantidade de substâncias xenogênicas nas composições que compreendem MSCs expandidas em cultura depois da purificação é cerca de 1 log menor do que a quantidade presente em lote comparável de MSCs expandidas em cultura não purificadas.

[0030] Em modalidades adicionais, a presente tecnologia refere-se ao estabelecimento de uma quantidade limiar de componentes residuais em um produto de hMSC que minimizará o risco de reações alérgicas em pacientes, particularmente em pacientes que recebem tal produto por via IV.

[0031] Além disso, em algumas modalidades, a presente tecnologia refere-se a métodos de purificação de hMSCs, nos quais uma preparação de hMSC é purificada pelo contato da preparação com uma solução de lavagem, agitação da preparação e recuperação das MSCs purificadas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0032] A figura 1 é um aparelho exemplificador que pode ser usado para lavar e purificar células-tronco mesenquimais de acordo com uma modalidade da presente tecnologia.

[0033] A figura 2 é uma fotografia (ampliação de 10x) de uma composição de MSC não purificada.

[0034] A figura 3 é uma fotografia (ampliação de 10x) de uma composição de MSC purificada por centrifugação.

[0035] A figura 4 é uma fotografia (ampliação de 10x) de uma composição de MSC purificada por centrifugação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0036] Algumas modalidades da presente tecnologia solucionam o desafio previamente reconhecido do fornecimento de uma composição farmacêutica de MSC que possua quantidades reduzidas de substâncias xenogênicas. Algumas modalidades da presente tecnologia também identificam e solucionam o desafio não reconhecido até agora do fornecimento de uma composição farmacêutica de MSC que possua tendência reduzida à agregação. Individualmente e coletivamente, essas duas soluções fornecem composições farmacêuticas de MSC, particularmente composições farmacêuticas de hMSC, que exibem eficácia terapêutica aumentada e perfis de segurança superiores.

[0037] Em pelo menos um aspecto, a tecnologia presentemente descrita fornece uma composição que compreende MSCs purificadas, em que a composição compreende menos do que cerca de 55 μg/mL de BSA residual. Em algumas modalidades relacionadas a esse aspecto da presente tecnologia, a composição compreende menos do que cerca de 42 μg/mL de BSA residual. Em algumas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 25 μg/mL de BSA residual. Em algumas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 13 μg/mL de BSA residual. Em algumas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 10 μg/mL de BSA residual. Em outras modalidades, a composição compreende entre cerca de 8 μg/mL de BSA residual e cerca de 12 μg/mL de BSA residual. Em algumas modalidades relacionadas a esse aspecto da presente tecnologia, a composição compreende MSCs purificadas, em que a composição compreende menos do que cerca de 50 μg/mL de BSA residual; alternativamente, menos do que cerca de 45 μg/mL de BSA residual; alternativamente, menos do que cerca de 40 μg/mL de BSA residual; alternativamente, menos do que cerca de 35 μg/mL de BSA residual; alternativamente, menos do que cerca de 30 μg/mL de BSA residual; alternativamente, menos do que cerca de 25 μg/mL de BSA residual; alternativamente, menos do que cerca de 20 μg/mL de BSA residual; ou alternativamente, menos do que cerca de 15 μg/mL de BSA residual. A BSA residual que resulta dos métodos publicados é geralmente relatada ser cerca de 30 a 700 μg de BSA por 1 x 106 células (Spees et al., Mol Therapy, 2004, 9:747). Como ilustrado pelos exemplos abaixo, a redução maior do que 20 vezes em BSA entre as composições publicadas e os métodos relativos a presente tecnologia representa um aumento significativo e surpreendentemente inesperado na margem de segurança de composições farmacêuticas de MSC.

[0038] Durante a incubação de MSCs em um meio que contém BSA, BSA pode se associar com a MSC da superfície celular. A fim de avaliar exatamente os níveis totais de BSA depois da incubação de MSCs no meio de cultura celular suplementado com BSA, é necessário obter uma medida que contabilize BSA no sobrenadante assim como BSA que tenha se tornado associado com as MSCs. Por exemplo, as células em uma alíquota da suspensão podem ser lisadas antes de medir os níveis de BSA. Dessa maneira, os níveis totais de BSA, que compreendem ambas, BSA livre e BSA associada à célula, podem ser obtidos.

[0039] Algumas modalidades da presente tecnologia também fornecem uma composição que compreende MSCs purificadas, em que as MSCs exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 30 μm. Em algumas modalidades, as MSCs exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 25 μm. Em algumas modalidades, as MSCs exibem uma D90 entre cerca de 20 μm e cerca de 25 μm. Em algumas modalidades, as MSCs exibem uma D90 menor do que cerca de 30 μm; alternativamente, menor do que cerca de 25 μm; ou alternativamente menor do que cerca de 20 μm.

[0040] Algumas modalidades da presente tecnologia referem-se a composições farmacêuticas de MSC, em que a composição compreende menos do que cerca de 55 μg/mL de BSA residual e as MSCs exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 30 μm. Em outras modalidades relacionadas a esse aspecto da presente tecnologia, a composição compreende menos do que cerca de 42 μg/mL de BSA residual e as MSCs exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 30 μm. Em outras modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 25 μg/mL de BSA residual e as MSCs exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 30 μm. Em algumas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 13 μg/mL de BSA residual e as MSCs exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 30 μm. Em algumas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 10 μg/mL de BSA residual e as MSCs exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 30 μm. Em outras modalidades, a composição compreende entre cerca de 7 μg/mL de BSA residual e cerca de 15 μg/mL de BSA residual e as MSCs exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 30 μm. Em outras modalidades, a composição compreende entre cerca de 8 μg/mL de BSA residual e cerca de 12 μg/mL de BSA residual e as MSCs exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 30 μm. Em algumas modalidades, as MSCs exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 25 μm e a composição compreende menos do que cerca de 55 μg/mL de BSA residual. Em algumas modalidades, as MSCs exibem uma D90 entre cerca de 20 μm e cerca de 25 μm e a composição compreende menos do que cerca de 55 μg/mL de BSA residual. Algumas modalidades da presente tecnologia fornecem uma composição que compreende MSCs purificadas, em que as MSCs exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 25 μm e a composição compreende entre cerca de 8 μg/mL de BSA residual e cerca de 12 μg/mL de BSA residual. Em algumas modalidades, as MSCs exibem uma D90 entre cerca de 20 μm e cerca de 25 μm e a composição compreende entre cerca de 8 μg/mL de BSA residual e cerca de 12 μg/mL de BSA residual.

[0041] Como usado aqui, "agregado" significa o total de uma pluralidade de células individuais juntas em um cluster agrupadas por uma ou mais propriedades adesivas incluindo a agregação, aglomeração e aglutinação. Como usado aqui, "agregação" significa a tendência das células em se agregar. Foi originalmente conjecturado, e mais tarde evidenciado pelos experimentos detalhados na seção de Exemplos desse pedido de patente, que as populações de MSC purificadas exibem uma tendência reduzida em formar agregados. Sem estar ligado à teoria, acredita-se que esses agregados de MSC não se dispersam eficientemente depois da administração e têm um tamanho suficiente para potencialmente causar uma embolia pulmonar fatal.

[0042] A presente tecnologia reconheceu inicialmente que a formação de um agregado que compreende MSCs pode levar à embolia pulmonar. Quantidades aumentadas de substâncias xenogênicas podem causar, entre outras coisas, adesão celular aumentada presumivelmente devida a certas substâncias xenogênicas que interagem com açúcares, proteínas ou outras macromoléculas ligadas à membrana. Adicionalmente, as práticas atuais de produção de hMSC resultam em aumento das substâncias da superfície celular, incluindo açúcares, proteínas e outras macromoléculas (por exemplo, CD 105 e CD 166), presentes nas composições coletadas de hMSC. Certas macromoléculas, se endógenas ou exógenas, aumentam as características adesivas das MSCs. Conforme as MSCs se tornam mais adesivas, elas exibem uma tendência aumentada de se agregar umas com as outras. Tais agregados podem, potencialmente, aumentar o risco de embolismo pulmonar em receptores de composições farmacêuticas de hMSC. Por exemplo, acredita-se que BSA seja capaz de formar uma associação não covalente com a membrana da célula MSC aumentando a imunogenicidade da MSC e aumentando as propriedades adesivas da MSC. Como tal, a presente tecnologia identificou e solucionou um problema previamente não reconhecido pelo fornecimento de composições de MSCs com uma tendência reduzida a agregação.

[0043] Como tal, as técnicas que processam células simultaneamente selecionando por massa e tamanho, tal como a filtração centrífuga, são preferíveis a técnicas que selecionam seriadamente por massa e depois por tamanho ou vice versa. Algumas modalidades da presente tecnologia compreendem uma composição farmacêutica de MSC que consiste em uma pluralidade de MSCs, onde a composição compreende um ou mais agregados de células- tronco mesenquimais e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm. Algumas modalidades da presente tecnologia compreendem uma composição farmacêutica de MSC que consiste em uma pluralidade de MSCs, onde a composição compreende um ou mais agregados de células-tronco mesenquimais e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 100 μm. Algumas modalidades da presente tecnologia compreendem uma composição farmacêutica de MSC que consiste em uma pluralidade de MSCs, onde a composição compreende um ou mais agregados de células-tronco mesenquimais e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 50 μm. De fato, algumas modalidades da presente tecnologia compreendem uma composição farmacêutica de MSC que consiste em uma pluralidade de MSCs, onde a composição não compreende agregados de células- tronco mesenquimais.

[0044] Algumas modalidades da presente tecnologia referem-se a composições farmacêuticas de MSC, em que a composição compreende cerca de 55 μg/mL de BSA residual e em que a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm. Em outras modalidades relacionadas a esse aspecto da presente tecnologia, a composição compreende menos do que cerca de 42 μg/mL de BSA residual e a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm. Em outras modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 25 μg/mL de BSA residual e a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm. Em algumas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 13 μg/mL de BSA residual e a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm. Em algumas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 10 μg/mL de BSA residual e a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm.

[0045] Algumas modalidades da presente tecnologia compreendem uma composição farmacêutica de MSC que consiste em uma pluralidade de MSCs, em que a composição compreende um ou mais agregados de células-tronco mesenquimais, em que nenhum agregado compreende mais do que 1000 MSCs. Algumas modalidades da presente tecnologia compreendem uma composição farmacêutica de MSC que consiste em uma pluralidade de MSCs, em que a composição compreende um ou mais agregados de células- tronco mesenquimais, em que nenhum agregado compreende mais do que 750 MSCs. Algumas modalidades da presente tecnologia compreendem uma composição farmacêutica de MSC que consiste em uma pluralidade de MSCs, em que a composição compreende um ou mais agregados de células-tronco mesenquimais, em que nenhum agregado compreende mais do que 500 MSCs. Algumas modalidades da presente tecnologia compreendem uma composição farmacêutica de MSC que consiste em uma pluralidade de MSCs, em que a composição compreende um ou mais agregados de células-tronco mesenquimais, em que nenhum agregado compreende mais do que 200 MSCs. Algumas modalidades da presente tecnologia compreendem uma composição farmacêutica de MSC que consiste em uma pluralidade de MSCs, em que a composição compreende um ou mais agregados de células-tronco mesenquimais, em que nenhum agregado compreende mais do que 100 MSCs. Algumas modalidades da presente tecnologia compreendem uma composição farmacêutica de MSC que consiste em uma pluralidade de MSCs, em que a composição compreende um ou mais agregados de células-tronco mesenquimais, em que nenhum agregado compreende mais do que 50 MSCs. Algumas modalidades da presente tecnologia compreendem uma composição farmacêutica de MSC que consiste em uma pluralidade de MSCs, em que a composição compreende um ou mais agregados de células-tronco mesenquimais, em que nenhum agregado compreende mais do que 10 MSCs.

[0046] Depois de um período de incubação das hMSCs em meio de cultura, várias moléculas podem estar presentes no meio de cultura, incluindo moléculas extracelulares e associadas a membrana celular. Por exemplo, tais moléculas podem incluir substâncias xenogênicas, tais como BSA e outras moléculas de origem não humana. Adicionalmente, as substâncias produzidas pelas próprias hMSCs podem estar presentes no meio de cultura depois de um período de incubação. Por exemplo, tais moléculas podem incluir proteínas secretadas tais como citocinas e fatores do crescimento, assim como moléculas expressas sobre a superfície celular das hMSCs. Pode ser desejável purificar as hMSCs depois de um período de incubação em meio de cultura para remover as moléculas presentes no meio de cultura, incluindo moléculas extracelulares e associadas a membrana celular. Tal purificação pode reduzir ou evitar a tendência das hMSCs em se agregar, reduzir o tamanho de quaisquer agregados formados ou inibir completamente a formação de agregados de hMSCs.

[0047] Sem estar vinculado a teoria, não é desejável purificar as MSCs além dos limites mínimos de segurança aqui descritos, já que a purificação adicional pode diminuir a quantidade de moléculas de adesão, tais como as integrinas, que são expressas sobre a superfície das MSCs. Tais moléculas de adesão são necessárias para que as MSCs exerçam seu efeito terapêutico. MSCs excessivamente purificadas carecem da quantidade de moléculas de adesão necessárias para a adesão ao sítio-alvo dentro do corpo. Em algumas modalidades, as MSCs sistemicamente administradas residem nos sítios de inflamação dentro do corpo. Esses sítios de inflamação exibem perfis de expressão maiores das moléculas de adesão e, adicionalmente, induzem alterações conformacionais sobre as moléculas de adesão como um meio de aumentar a afinidade das MSCs com o tecido inflamado. Se as MSCs carecem das moléculas de adesão correspondentes, elas não aderem ao tecido inflamado e continuam a circular até a apoptose. Portanto, embora seja desejável reduzir a expressão das moléculas de adesão sobre as MSCs a medida do necessário para evitar a agregação, não é desejável reduzir a expressão das moléculas de adesão sobre as MSCs a tal grau que elas percam sua habilidade de aderir a um sítio de tecido inflamado.

[0048] As substâncias xenogênicas, tais como moléculas extracelulares e da membrana da superfície celular, que são desejáveis serem removidas incluem as proteínas séricas tais como BSA e outros reagentes de origem não humana para a cultura de hMSC tal como a tripsina de porco. Em algumas modalidades da presente tecnologia, a quantidade de substâncias xenogênicas nas composições que compreendem hMSCs expandidas em cultura depois da purificação é cerca de 1 log menor do que a presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades, a quantidade de substâncias xenogênicas nas composições depois da purificação é cerca de 2 log menor do que a presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades, a quantidade de substâncias xenogênicas nas composições depois da purificação é cerca de 3 log menor do que a presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades, a quantidade de substâncias xenogênicas nas composições depois da purificação é cerca de 4 log menor do que a presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades, a quantidade de substâncias xenogênicas nas composições depois da purificação é cerca de 5 log menor do que a presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades, a composição de hMSC expandida em cultura é substancialmente livre de substâncias xenogênicas. Em algumas modalidades, não há substâncias xenogênicas detectáveis na composição que compreende as hMSCs expandidas em cultura.

[0049] Em modalidades adicionais da presente tecnologia, a quantidade de substâncias xenogênicas nas composições que compreendem as hMSCs expandidas em cultura depois da purificação é cerca de 10 a cerca de 1000 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em modalidades, a quantidade de substâncias xenogênicas depois da purificação é cerca de 25 a cerca de 750 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em modalidades, a quantidade de substâncias xenogênicas depois da purificação é cerca de 50 a cerca de 500 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em modalidades, a quantidade de substâncias xenogênicas depois da purificação é cerca de 100 a cerca de 300 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em modalidades, a quantidade de substâncias xenogênicas depois da purificação é cerca de 200 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas.

[0050] Em outras modalidades da presente tecnologia, a quantidade de BSA nas composições que compreendem as hMSCs expandidas em cultura depois da purificação é cerca de 1 log menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades quantidade de BSA depois da purificação é cerca de 2 log menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades quantidade de BSA depois da purificação é cerca de 3 log menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades quantidade de BSA depois da purificação é cerca de 4 log menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades quantidade de BSA depois da purificação é cerca de 5 log menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Adicionalmente, em algumas modalidades, a composição de hMSC expandida em cultura pode ser substancialmente livre de BSA. Em outras modalidades, não há BSA detectável na composição que compreende hMSCs expandidas em cultura depois da purificação.

[0051] Em algumas modalidades da presente tecnologia, a quantidade de BSA nas composições que compreendem as hMSCs expandidas em cultura depois da purificação é cerca de 10 a cerca de 1000 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades, a quantidade de BSA depois da purificação é cerca de 25 a cerca de 750 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades, a quantidade de BSA depois da purificação é cerca de 50 a cerca de 500 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em modalidades, a quantidade de BSA depois da purificação é cerca de 100 a cerca de 300 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em modalidades, a quantidade de BSA depois da purificação é cerca de 200 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas.

[0052] Em algumas modalidades da presente tecnologia, a quantidade de ácidos nucleicos extracelulares nas composições que compreendem as hMSCs expandidas em cultura depois da purificação é cerca de 1 log menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades quantidade de ácidos nucleicos extracelulares depois da purificação é cerca de 2 log menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades quantidade de ácidos nucleicos extracelulares depois da purificação é cerca de 3 log menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades quantidade de ácidos nucleicos extracelulares depois da purificação é cerca de 4 log menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades quantidade de ácidos nucleicos extracelulares depois da purificação é cerca de 5 log menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em outras modalidades, a composição de hMSC expandida em cultura pode ser substancialmente livre de ácidos nucleicos extracelulares. Em algumas modalidades, não há ácidos nucleicos extracelulares detectáveis na composição que compreende hMSCs expandidas em cultura depois da purificação.

[0053] Em algumas modalidades da presente tecnologia, as quantidades de BSA e ácidos nucleicos extracelulares nas composições que compreendem as hMSCs expandidas em cultura depois da purificação são, cada uma, cerca de cerca de 10 a cerca de 1000 vezes menores do que as quantidades presentes em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades da presente tecnologia, as quantidades de BSA e ácidos nucleicos extracelulares nas composições que compreendem as hMSCs expandidas em cultura depois da purificação são, cada uma, cerca de cerca de 25 a cerca de 750 vezes menores do que as quantidades presentes em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades da presente tecnologia, as quantidades de BSA e ácidos nucleicos extracelulares nas composições que compreendem as hMSCs expandidas em cultura depois da purificação são, cada uma, cerca de cerca de 50 a cerca de 500 vezes menores do que as quantidades presentes em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades da presente tecnologia, as quantidades de BSA e ácidos nucleicos extracelulares nas composições que compreendem as hMSCs expandidas em cultura depois da purificação são, cada uma, cerca de cerca de 100 a cerca de 300 vezes menores do que as quantidades presentes em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades da presente tecnologia, as quantidades de BSA e ácidos nucleicos extracelulares nas composições que compreendem as hMSCs expandidas em cultura depois da purificação são, cada uma, cerca de 200 vezes menores do que as quantidades presentes em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas.

[0054] Adicionalmente, em algumas modalidades da presente tecnologia, a quantidade de ácidos nucleicos extracelulares nas composições que compreendem hMSCs expandidas em cultura depois da purificação é cerca de 10 a cerca de 1000 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades, a quantidade de ácidos nucleicos extracelulares depois da purificação é cerca de 25 a cerca de 750 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades, a quantidade de ácidos nucleicos extracelulares depois da purificação é cerca de 50 a cerca de 500 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades, a quantidade de ácidos nucleicos extracelulares depois da purificação é cerca de 100 a cerca de 300 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em algumas modalidades, a quantidade de ácidos nucleicos extracelulares depois da purificação é cerca de 200 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas. Em outras modalidades, a quantidade de ácidos nucleicos extracelulares depois da purificação é cerca de 1000 vezes menor do que a quantidade presente em um lote comparável de hMSCs expandidas em cultura não purificadas; alternativamente, cerca de 900 vezes menor; alternativamente, cerca de 800 vezes menor; alternativamente, cerca de 700 vezes menor; alternativamente, cerca de 700 vezes menor; alternativamente, cerca de 500 vezes menor; alternativamente, cerca de 400 vezes menor; alternativamente, cerca de 300 vezes menor; alternativamente, cerca de 200 vezes menor; alternativamente, cerca de 100 vezes menor; alternativamente, cerca de 50 vezes menor; ou alternativamente, cerca de 25 vezes menor.

[0055] Em algumas modalidades da presente tecnologia, as MSCs podem ser armazenadas em um meio de criopreservação apropriado, por exemplo um meio de criopreservação que compreenda DMSO. Por exemplo, em algumas modalidades, uma composição farmacêutica de MSC pode compreender MSCs e cerca de 20% de DMSO. Em outras modalidades, uma composição farmacêutica de MSC pode compreender MSCs e cerca de 10% de DMSO. Em outras modalidades, uma composição farmacêutica de MSC pode compreender MSCs e cerca de 3,8% de DMSO. Em algumas modalidades, o DMSO pode ser adicionado às MSCs purificadas.

[0056] Como usada aqui, a expressão "tratar" refere-se a reverter, prevenir, aliviar ou inibir o progresso de uma doença, distúrbio ou condição ou um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição. Como usado aqui, "tratar" também pode referir-se à diminuição da probabilidade ou incidência da ocorrência de uma doença, distúrbio ou condição em um mamífero, quando comparado com uma população de controle não tratada ou quando comparado com o mesmo mamífero antes do tratamento. Por exemplo, como usado aqui, "tratar" pode se referir a prevenção de uma doença, distúrbio ou condição e pode incluir retardar ou evitar o início de uma doença, distúrbio ou condição ou retardar ou evitar os sintomas associados com uma doença, distúrbio ou condição. Como usado aqui, "tratar" também pode referir-se a redução da severidade de uma doença, distúrbio ou condição ou de sintomas associados com tal doença, distúrbio ou condição antes de ser afligido com a doença, distúrbio ou condição. Tal prevenção ou redução da severidade de uma doença, distúrbio ou condição antes de ser afligido refere-se à administração da composição da presente tecnologia, como aqui descrita, a um indivíduo que no momento da administração não está acometido pela doença, distúrbio ou condição. Como usado aqui, "tratar" também pode referir-se a prevenção da recorrência de uma doença, distúrbio ou condição. As expressões "terapia", "tratamento" e "terapeuticamente", como usadas aqui, referem-se ao ato de tratar como definido acima.

[0057] A expressão "expandida em cultura" em referencia a hMSCs significa a passagem das hMSCs uma ou mais vezes sob condições padronizadas de crescimento celular em um meio mínimo essencial (i) essencialmente livre de células de origem hematopoiética; e (ii) suplementado com FBS 10% (por volume) o que resulta em um número aumentado de MSCs não diferenciadas.

[0058] A expressão "composição farmacêutica" refere-se a composições em qualquer estágio do processo de produção, incluindo o produto farmaceuticamente aceitável final e quaisquer intermediários em processamento desse.

[0059] As composições farmacêuticas da presente tecnologia podem ser produzidas pelo contato de uma preparação que inclua as células-tronco mesenquimais com uma solução de lavagem, agitando a preparação e a solução de lavagem e recuperando as células-tronco mesenquimais purificadas.

[0060] Em algumas modalidades, a solução de lavagem pode incluir uma solução eletrolítica compreendendo um ou mais compostos iônicos ou ionizáveis. Tais compostos incluem, mas não são limitados a cloreto de sódio, gliconato de sódio, tri-hidrato de acetato de sódio, cloreto de potássio e cloreto de magnésio, fosfato de sódio e fosfato de potássio. A solução de lavagem pode estar compreendida por uma solução eletrolítica balanceada, a solução eletrolítica balanceada sendo composta por uma concentração apropriada de sódio, potássio, cloreto ou suas combinações para manter a osmolalidade normal. Soluções eletrolíticas balanceadas incluem soluções salinas usadas em uma variedade de ajustes incluindo, por exemplo, terapia de reposição de fluido eletrolítico, lavagem de tecidos e células e diluentes para células e outros fatores.

[0061] Em uma modalidade, por exemplo, a solução de lavagem pode ser uma solução isotônica não pirogênica, a qual, para cada 100 ml de solução, há aproximadamente 526 mg de cloreto de sódio, 502 mg de gliconato de sódio (C6H11NaO7), 368 mg de tri-hidrato de acetato de sódio (C2H3NaO2.3H2O), 37 mg de cloreto de potássio e 30 mg de cloreto de magnésio. Uma solução eletrolítica isotônica comercialmente disponível é vendida como PlasmaLyte A, um produto da Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, Illinois.

[0062] Em outra modalidade, as células-tronco mesenquimais são lavadas em um equipamento que inclui, por exemplo, uma bolsa com a fonte da célula, uma bolsa com a solução de lavagem, uma bolsa de recirculação de lavagem, uma membrana filtrante centrífuga que possui aberturas de entrada e saída, uma bolsa para o filtrado, uma zona de misturação, uma bolsa para o produto final de células lavadas e tubos apropriados. O equipamento pode ser um sistema fechado, reduzindo dessa maneira o potencial de contaminação.

[0063] MSCs não lavadas da bolsa de fonte de célula podem ser misturadas com a solução de lavagem no dispositivo de filtração centrífuga. A suspensão resultante de células-tronco mesenquimais na solução de lavagem é alimentada através da abertura de entrada na membrana filtrante centrífuga. Um filtrado compreendendo a solução de lavagem é retirado da membrana filtrante centrífuga através de uma primeira abertura de saída e uma suspensão concentrada de MSCs é retirada da membrana filtrante centrífuga através de uma segunda abertura de saída e alimentada na bolsa de recirculação de lavagem. As MSCs são retiradas depois da bolsa de recirculação de lavagem, misturadas com uma solução de lavagem adicional e colocadas novamente na membrana filtrante centrífuga. Quando a lavagem de recirculação das MSCs é finalizada, as MSCs lavadas são colocadas na bolsa do produto.

[0064] A figura 1 mostra em equipamento exemplificador para lavagem ou purificação de MSCs. Um exemplo de tal equipamento é descrito adicionalmente em USPN 6.251.295. O equipamento, como relatado em USPN 6.251.295, pode incluir, por exemplo, uma bolsa de recirculação 5 que possui uma abertura superior 2 e uma abertura inferior 1; uma membrana filtrante centrífuga 6 que possui uma abertura superior 11 para a suspensão diluída de MSCs, uma abertura de saída 14 para a suspensão concentrada de MSCs e uma abertura de saída 24 para o filtrado; e a bolsa de filtrado 30 que possui uma abertura de entrada 29. Ele também pode incluir uma ou mais bolsas de célula lavada 46 que possuem uma abertura de entrada 47, uma bolsa de célula não lavada 44 que possui uma abertura de saída 45 e uma bolsa de solução de lavagem 7 que possui uma abertura de saída 21. A abertura superior 2 da bolsa 5 é conectada por um tubo 8 a um conector 49. A abertura 21 da bolsa de solução de lavagem 7 é conectada pelo tubo 15 a um conector em Y 55 e o último é conectado pelo tubo 20 que carrega uma braçadeira C1 ao conector 49. A abertura 45 da bolsa de célula não lavada é conectada pelo tubo 43 que carrega a braçadeira C3 ao conector em Y 53 e depois pelo tubo 51 ao conector 49. O conector 49 serve como uma zona de misturação das células não lavadas na solução de lavagem da bolsa 44, as células recirculam na solução de lavagem da bolsa 5 e na solução de lavagem da bolsa 7. O conector 49 é conectado pelo tubo 10 a abertura de entrada 11 da membrana filtrante centrífuga 6. A abertura de saída do filtrado 24 da centrífuga 6 é conectada pelo tubo 23 ao conector em Y 54 e pelo tubo 26 a abertura de saída 29 da bolsa de filtrado 30. O conector 55 é conectado pelo tubo 52 que carrega a braçadeira C2 ao conector 54. O conector 54 é conectado pelo tubo 41 a um transdutor de pressão 41. A abertura de saída 14 da centrífuga 6 é conectada pelo tubo 13 a abertura inferior 1 da bolsa 5. O conector em Y 53 é conectado pelo tubo 48 que carrega a braçadeira C4 a abertura de entrada 47 da bolsa de célula lavada 46.

[0065] Durante a lavagem de recirculação, uma suspensão de MSCs em solução de lavagem é retirada da bolsa 5 através da abertura superior 2 e flui através do tubo 8 para a zona de misturação 49. Uma suspensão de MSCs é retirada da bolsa 44 através da abertura 45 (com a braçadeira C3 aberta e a braçadeira C4 fechada) através do tubo 43 para o conector em Y 53 e depois através do tubo 51 para a zona de misturação 49 pela bomba de transferência P2. A solução de lavagem é retirada da bolsa 7 através da abertura 21 e do tubo 15 pelo conector 55 através da bomba de tampão P2. Com a braçadeira C1 aberta, a solução de lavagem flui através do tubo 20 para a zona de misturação 49. Uma suspensão de MSCs em solução de lavagem flui da zona de misturação 49 através do tubo 10 para a abertura de entrada 11 da centrífuga 6. Uma suspensão concentrada de MSCs em solução de lavagem flui através da abertura de saída 14 da centrífuga 6 através do tubo 13 e da abertura de entrada 1 para a bolsa 5 pela bomba de recirculação P3. O filtrado flui através da abertura de saída 24 na centrífuga 6 e pelo tubo 23 para o conector 54, com a braçadeira C2 fechada, através do tubo 26 e da abertura de entrada 29 para a bolsa de filtrado 30 pela bomba P4. A lavagem de recirculação é continuada até que a quantidade desejada de componente alvo tenha sido removida das MSCs. As braçadeiras C1, C2 e C3 são fechadas, a braçadeira C4 é aberta e a direção da bomba P1 é revertida, tal que a suspensão de MSCs lavadas flui da bolsa 5 através do tubo 8, 51 e 48 e da abertura 47 para a bolsa de célula lavada 46. Os tubos, bolsa e a centrífuga são então lavados pelo fechamento das braçadeiras C1 e C3, abertura das braçadeiras C4 e C2 e bombeando tampão com a bomba P2 em série com as bombas P1 e P3 para lavar a centrífuga, a bolsa e os tubos.

[0066] O processo de purificação pode incluir a centrifugação e filtração seqüenciais ou simultâneas.

[0067] Os dispositivos de filtração centrífuga que compreendem as membranas centrífugas foram desenvolvidos para remover as plaquetas e os anticorpos dos produtos de sangue. Dispositivos de filtração centrífuga exemplificadores incluem aqueles descritos, por exemplo, em USPN 5.034.135; 5.053.121; 5.234.608; 5.536.475 e 6.251.295, cada um dos quais está independentemente incorporado aqui por referencia em sua totalidade.

[0068] Em uma ou mais modalidades, o filtro de membrana centrífuga tem um tamanho do poro entre cerca de 3 μm a cerca de 7 μm. Em outra modalidade, a membrana do filtro tem um tamanho de poro de cerca de 4 μm.

[0069] Em algumas modalidades da presente tecnologia, a viabilidade das células depois da lavagem é maior do que cerca de 60%. Em outras modalidades, a viabilidade das células depois da lavagem é maior do que cerca de 70%. Em modalidades adicionais, a viabilidade das células depois da lavagem é maior do que cerca de 80%. Em outras modalidades ainda, a viabilidade das células depois da lavagem é maior do que cerca de 90%. Em modalidades adicionais, a viabilidade das células depois da lavagem é maior do que cerca de 95%.

[0070] Certas modalidades da presente tecnologia referem-se a composições farmacêuticas de MSC purificada, em que a composição compreende cerca de 55 μg/ml de BSA residual; em que a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm; e em que a viabilidade depois da purificação das MSCs é maior do que cerca de 80%. Em outras modalidades relacionadas a esse aspecto da presente tecnologia, a composição compreende menos do que cerca de 42 μg/mL de BSA residual; a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm; e em que a viabilidade depois da purificação das MSCs é maior do que cerca de 80%. Em outras modalidades ainda, a composição compreende menos do que cerca de 25 μg/mL de BSA residual; a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm; e em que a viabilidade depois da purificação das MSCs é maior do que cerca de 80%. Em algumas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 13 μg/mL de BSA residual; a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm; e em que a viabilidade depois da purificação das MSCs é maior do que cerca de 80%. Em algumas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 10 μg/mL de BSA residual; a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm; e em que a viabilidade depois da purificação das MSCs é maior do que cerca de 80%. Em algumas modalidades, a composição compreende entre cerca de 7 μg/mL de BSA residual e cerca de 15 μg/mL de BSA residual; a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm; e em que a viabilidade depois da purificação das MSCs é maior do que cerca de 80%. Em algumas modalidades, a composição compreende entre cerca de 8 μg/mL de BSA residual e cerca de 12 μg/mL de BSA residual; a composição compreende um ou mais agregados de célula- tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm; e em que a viabilidade depois da purificação das MSCs é maior do que cerca de 80%.

[0071] Certas modalidades da presente tecnologia referem-se a composições farmacêuticas de MSC purificada, em que a composição compreende cerca de 55 μg/ml de BSA residual; em que a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm; e em que a viabilidade depois da purificação das MSCs é maior do que cerca de 70%. Em outras modalidades relacionadas a esse aspecto da presente tecnologia, a composição compreende menos do que cerca de 42 μg/mL de BSA residual; a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm; e em que a viabilidade depois da purificação das MSCs é maior do que cerca de 70%. Em outras modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 25 μg/mL de BSA residual; a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm; e em que a viabilidade depois da purificação das MSCs é maior do que cerca de 70%. Em algumas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 13 μg/mL de BSA residual; a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm; e em que a viabilidade depois da purificação das MSCs é maior do que cerca de 70%. Em algumas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 10 μg/mL de BSA residual; a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm; e em que a viabilidade depois da purificação das MSCs é maior do que cerca de 70%. Em algumas modalidades, a composição compreende entre cerca de 7 μg/mL de BSA residual e cerca de 15 μg/mL de BSA residual; a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm; e em que a viabilidade depois da purificação das MSCs é maior do que cerca de 70%. Em algumas modalidades, a composição compreende entre cerca de 8 μg/mL de BSA residual e cerca de 12 μg/mL de BSA residual; a composição compreende um ou mais agregados de célula- tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm; e em que a viabilidade depois da purificação das MSCs é maior do que cerca de 70%.

[0072] A tecnologia presentemente descrita será agora descrita com relação ao exemplo a seguir; entretanto, o escopo da presente tecnologia não é pretendido ser limitado dessa maneira. É para ser entendido que o escopo da presente tecnologia não é para ser limitado às modalidades específicas descritas acima. A tecnologia pode ser praticada de maneira diferente daquela particularmente descrita aqui e ainda estar dentro do escopo das reivindicações.

Exemplo 1: Limiares para proteínas xenogênicas residuais em composições para administração IV

[0073] Ao documentar as propriedades de Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade ("ADMET") das composições farmacêuticas de MSC, mortes esporádicas e imprevisíveis de roedores de populações de teste foram relatadas. Ao estudar vários dos parâmetros, a quantidade residual de proteínas xenogênicas, a quantidade residual de outros resíduos que resultam da expansão em meio e o grau de agregação celular foram identificados, e os últimos provaram ser, como um fator contribuinte significativo para os eventos adversos observados em experimentos pré-clínicos.

[0074] A presente tecnologia revela e aprecia que embora os limiares de reatividade clínica sejam estabelecidos para a administração oral de antígenos, os limiares para a exposição IV a antígenos permanecem desconhecidos. Como tal, a presente tecnologia reconheceu que o problema do conhecimento de limiares para a exposição IV a antígenos precisava ser solucionado antes que uma composição farmacêutica de MSC e o processo de produção seguros pudessem, portanto, ser designados. Para entender as reações adversas associadas com produtos celulares e derivados de animal, tais como a anafilaxia e a doença semelhante à doença do soro, no contexto da administração IV de composições que compreendem MSCs, um modelo animal foi empregado para determinar o potencial antigênico de resíduos xenogênicos.

[0075] A albumina do ovo ("OVA") foi selecionada como uma proteína xenogênica representativa, já que ela é estruturalmente relacionada a BSA, significativamente mais imunogênica do que BSA e tripsina e documentada em um número significativo de relatos publicados. BSA tem um potencial alergênico significativamente menor em comparação com OVA (Hilton J. et al., Food Chem Toxicol, 1997, 35:1209).

[0076] A OVA é administrada por injeção intraperitoneal (IP), sistêmica, na mucosa já que essa via foi considerada mais relevante do que a administração IV. Foi mostrado que as vias IP e IV de administração de antígeno em animais resultam em efeitos similares (Shepard et al., Infection and Immunity, 1982, 38:673).

[0077] Para o cálculo dos limiares tolerância a BSA e tripsina em uma composição farmacêutica de BSA, foi selecionada a mais baixa dose cumulativa de OVA que não desencadeie uma resposta detectável de IgE. A dose cumulativa mais baixa de OVA que não desencadeia a sensibilização quando liberada IP é de 10 μg/camundongo, que corresponde a 500 μg/kg baseado no peso corporal médio de 20 g do camundongo. Portanto, uma dose cumulativa segura de resíduos de proteína animal em composições de MSC para pacientes não suscetíveis que recebem tratamento com MSCs é de 500 μg/kg. De acordo com esse limite de segurança, um paciente com 100 kg poderá seguramente ser tratado com uma composição farmacêutica de MSC que compreenda menos do que cerca de 50 mg de proteína animal; um paciente de 40 kg poderá seguramente ser tratado com uma composição farmacêutica de MSC que compreenda menos do que cerca de 20 mg de proteína animal; ou um paciente pediátrico com 5 kg poderá seguramente ser tratado com uma composição farmacêutica de MSC que compreenda menos do que cerca de 2,5 mg de proteína animal.

[0078] Tendo reconhecido e solucionado o problema associado com o limiar IV de exposição a antígenos, os parâmetros para o processo de produção adequado para produzir uma composição farmacêutica de MSC segura poderão agora ser implementados. Para a terapia que consiste em 2 infusões IV de 8 x 106 MSC/kg de peso corporal por tratamento, foi calculado um limiar para BSA e tripsina residuais por composição farmacêutica de MSC (830 μg correspondendo a 55 μg/mL), como descrito na Tabela 1.

Exemplo 2: Pureza da Composição Farmacêutica de MSC

[0079] Para avaliar os efeitos potenciais de MSCs expandidas em cultura sobre a alteração potencial da função pulmonar como uma função da pureza da composição farmacêutica de MSC, uma composição farmacêutica de hMSC consistindo essencialmente de: 1) uma população de MSCs; e 2) um veículo constituído por 85% de PlasmaLyte A, 10% de DMSO e 5% de FBS (por volume) foi preparada.

[0080] Os experimentos observados nesse Exemplo 2 foram realizados de acordo com U.S. Food & Drug Administrations Good laboratory Practice Regulations, como codificadas no 21 C.F. R. 58, exceto que não houve documentação da potencia, pureza e composição do componente PlasmaLyte A do veículo (que foi adquirido como um componente estéril). A fabricação do artigo de teste foi realizada de acordo com Good Manufacturing Practices. A seleção da espécie e o número de animais testados foram apoiados pelas normas da FDA para Expanded Acute Studies, ICH Harmonised Tripartite Guidelines, FDA Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy e pelos procedimentos geralmente aceitos para teste farmacêutico pré-clínico.

[0081] Uma população de MSCs derivadas de medula óssea de rato foi cultivada como se segue. A medula coletada foi irrigada com solução tamponada de Hank. As células foram agrupadas, contadas e centrifugadas a 100 g por 10 min. As células foram então semeadas em frascos a 120 x 10A6 células/cmA2 em FBS 10%, Ham’s F12 45%, Meio Mínimo Essencial alfa ("α-MEM") 45% suplementado com 100 U/ml de penicilina G e 100 ug/ml de sulfato de estreptomicina. Os frascos foram incubados em CO2 10% a 37°C. Depois de 8 dias, as células não aderentes foram removidas e as células remanescentes foram destacadas com tripsina de porco 0,05% e EDTA 0,53 mM. As células aderentes foram re-plaqueadas em 2000 células/cm2. Duas (2) passagens subsequentes foram realizadas em intervalos de 4 dias.

[0082] Depois da expansão, uma alíquota de suspensão de célula foi obtida para avaliar os níveis residuais de BSA. As células na alíquota foram lisadas antes de realizar um ELISA para determinar BSA residual, cujos resultados são exibidos na Tabela 2. As MSCs em α-MEM foram congeladas em criotubos contendo um número conhecido de MSCs.

[0083] Para preparar as formulações das dosagens para cada concentração, o volume final estimado da suspensão foi calculado a partir da concentração desejada de células e a contagem celular estimada por criotubo presumindo-se 90% de viabilidade das MSCs. A quantidade necessária de veículo para se obter o volume final estimado da suspensão foi transferido para um tubo cônico. Os criotubos contendo a população de MSCs foram transferidos do recipiente com nitrogênio líquido para um banho de água até descongelar como um semilíquido. Aproximadamente 0,5 mL de veículo foram transferidos para cada criotubo para facilitar o descongelamento completo. A população de MSCs foi transferida para o tubo cônico em cujo momento a população foi purificada por: (A) Centrifugação Básica ou (b) Filtração Centrífuga.

[0084] Centrifugação Básica. A suspensão de célula/veículo foi centrifugada por aproximadamente 10 minutos em 500 g de força a 4°C (1480-1540 3000 RPM em uma centrífuga Beckman GS-6R GH 3.8). O sobrenadante foi removido e retido em um frasco separado. As células peletizadas foram ressuspensas com veículo se necessário. As MSCs foram contadas e a viabilidade foi confirmada. Baseado na contagem do total de células, a quantidade de veículo necessária para se obter o volume final desejado da suspensão foi adicionada para fornecer uma composição farmacêutica de hMSC. As composições purificadas por centrifugação básica foram ensaiadas por ELISA para determinar BSA residual, cujos resultados são mostrados na Tabela 2.

[0085] Filtração Centrífuga. A suspensão de célula/veículo foi lavada por aproximadamente 25 minutos em temperatura ambiente em um Cytomate Cell Processing System (como vendido pela Baxter em 2007) que possui um filtro de membrana com um tamanho de poro de 4 μm e que usa um ajuste Residual Fold Reduction (RFR) de 150. As MSCs foram contadas e a viabilidade foi confirmada. As composições purificadas por filtração centrífuga foram ensaiadas por ELISA para determinar BSA residual, cujos resultados são mostrados na Tabela 3.

[0086] Baseado na contagem do total de células, a quantidade de veículo necessária para se obter o volume final desejado da suspensão foi adicionada para fornecer uma composição farmacêutica de hMSC. Todas as composições farmacêuticas de hMSC foram preparadas em menos do que 4 horas antes da administração. Os animais foram inoculados através de cateter femoral. Como mostrado na Tabela 2 abaixo, as composições farmacêuticas de MSC purificadas por filtração centrífuga não demonstraram mortes enquanto que as composições farmacêuticas de MSC purificadas pela centrifugação tradicional resultaram em 80% de mortalidade. As causas de morte foram determinadas serem por embolia pulmonar.

[0087] Dos vários parâmetros estudados subsequentemente, uma segunda análise que compara a quantidade de BSA residual presente em uma composição de MSC com os limites do Nível de Efeitos Adversos Não Observados ("No Observed Adverse Events Level, "NOAEL"), cujos resultados são exibidos na Tabela 3, forneceu os resultados mais surpreendentes.

[0088] Dos ratos infundidos com uma composição de MSC purificada por centrifugação básica referidos na Tabela 2, 7 ratos morreram imediatamente depois da infusão, 1 rato morreu no dia seguinte ao da infusão e 2 ratos sobreviveram 14 dias até a necropsia final planejada. Antes prosseguir com os estudos adicionais da fase pré-clínica ou clínica, houve um desejo de aumentar a margem de segurança fornecida pelas composições de MSC purificadas pela centrifugação básica.

[0089] Um teste toxicológico adicional foi realizado nas composições farmacêuticas de MSC purificadas por filtração centrífuga. Nesse experimento, 120 ratos foram tratados com 10 x 106 células/kg, 40 x 106 células/kg ou 75 x 106 células/kg. Dos 120 ratos estudados, houve apenas a morte de 2 animais durante o estudo. Além de reforçar os resultados binários totais (isto é, total de sobrevida ou total de fatalidade) desse experimento, também foi observado que os animais que receberam as composições farmacêuticas de MSC filtradas centrifugamente quase não demonstraram sintomas clínicos, mesmo em um nível de dose duas vezes tão alto (75 x 106 células/kg) quanto fatal quando purificada por centrifugação básica.

[0090] Depois que esse experimento foi realizado, todos os protocolos de processamento celular foram adaptados para a filtração centrífuga.

[0091] Como exibido na Tabela 3, as composições de MSC purificadas por centrifugação básica foram encontradas ter 1,29 μg/mL de BSA residual o que resultou em um NOAEL de 3 x 106células/kg. Em comparação, as composições de MSC purificadas por filtração centrífuga foram descobertas ter 0,13 μg/mL de BSA residual, o que resultou em um NOAEL de 40 x 106células/kg, exibindo portanto um aumento de aproximadamente 10 vezes nas margens de segurança. Como a diminuição de aproximadamente 20 vezes na BSA residual entre composições de MSC não purificadas e composições de MSC purificadas por filtração centrífuga não aumentou significativamente o limite de NOAEL para uma dose clinicamente significativa (por exemplo, 10 x 106 células/kg, 40 x 106 células/kg ou 75 x 106 células/kg) e ainda resultou em mortalidade total com 37,5 x 106 células/kg, é quase surpreendente observar que um aumento adicional de 10 vezes na pureza pudesse aumentar o limite de NOAEL em um adicional de 1 log e ainda resultar em sobrevida total da população animal testada.

[0092] Na análise de resíduos bovinos e porcinos em combinação com a filtração centrífuga houve uma redução no nível residual de proteínas animais de aproximadamente 1000 vezes em relação a centrifugação básica. Essa redução de 1000 vezes aumentou a dose máxima tolerada para infusão em bolo de 20 x 106 células/kg a 65 x 106 células/kg.

[0093] Fotografias tiradas sob uma ampliação de 10x de uma composição de MSC não purificada (Figura 2), uma composição de MSC purificada por centrifugação (Figura 3) e uma composição de MSC purificada por filtração centrífuga (Figura 4) exibiram uma tendência reduzida das composições de MSC purificadas por filtração centrífuga em formar agregados.

[0094] Modalidades adicionais da tecnologia presentemente descrita serão descritas agora; entretanto, o escopo da presente tecnologia não é pretendido estar limitado a elas. Deve ser compreendido que o escopo da presente tecnologia não é para ser limitado as modalidades específicas descritas abaixo. A tecnologia pode ser praticada de modo diferente daquele particularmente descrito e ainda estar dentro do escopo das reivindicações

[0095] anexas. As modalidades adicionais da presente tecnologia incluem:

[0096] Uma composição farmaceuticamente aceitável que compreende células-tronco mesenquimais, em que a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 150 μm.

[0097] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo, em que a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 100 μm.

[0098] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo , em que a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 50 μm.

[0099] A composição farmaceuticamente aceitável de qualquer um dos Parágrafos -, em que a viabilidade das células-tronco mesenquimais purificadas é maior do que cerca de 70%.

[00100] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo , em que a viabilidade das células-tronco mesenquimais purificadas é maior do que cerca de 80%.

[00101] A composição farmaceuticamente aceitável de qualquer um dos Parágrafos -, que compreende adicionalmente demitir sulfóxido (DMSO).

[00102] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo , compreendendo cerca de 10% de DMSO.

[00103] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo , compreendendo cerca de 3,8% de DMSO.

[00104] Uma composição farmaceuticamente aceitável que compreende células-tronco mesenquimais purificadas, em que a composição compreende menos do que cerca de 55 μg/mL de albumina sérica bovina residual e em que as células-tronco mesenquimais exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 30 μm.

[00105] A composição do Parágrafo [000102], em que a composição compreende menos do cerca de 42 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00106] A composição do Parágrafo [000103], em que a composição compreende menos do cerca de 25 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00107] A composição do Parágrafo [000104], em que a composição compreende menos do cerca de 13 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00108] A composição do Parágrafo [000105], em que a composição compreende menos do cerca de 10 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00109] A composição do Parágrafo [000102], em que a composição compreende entre cerca de 7 μg/mL e cerca de 15 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00110] A composição do Parágrafo [000107], em que a composição compreende entre cerca de 8 μg/mL e cerca de 12 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00111] A composição de qualquer um dos Parágrafos [000102]- [000108], em que as células-tronco mesenquimais exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 25 μm.

[00112] A composição do Parágrafo [000109], em que as células- tronco mesenquimais exibem uma D90 entre cerca de 20 μm e cerca de 25 μm.

[00113] A composição de qualquer um dos Parágrafos [000102]- [000110], em que as células-tronco mesenquimais são expandidas em cultura em meio que compreende soro animal.

[00114] A composição do Parágrafo [000112], em que o soro animal é soro humano.

[00115] A composição do Parágrafo [000112], em que o soro animal é soro não humano.

[00116] A composição do Parágrafo [000114], em que o soro não humano é soro bovino.

[00117] A composição do Parágrafo [000114], em que o soro não humano é soro porcino.

[00118] A composição de qualquer um dos Parágrafos [000102]- [000116], em que a viabilidade das células-tronco mesenquimais purificadas é maior do que cerca de 70%.

[00119] A composição do Parágrafo [000117], em que a viabilidade das células-tronco mesenquimais purificadas é maior do que cerca de 80%.

[00120] A composição de qualquer um dos Parágrafos [000102]- [000118], que compreende ainda dimetil sulfóxido (DMSO).

[00121] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo [000119], compreendendo cerca de 10% de DMSO.

[00122] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo [000119], compreendendo cerca de 3,8% de DMSO.

[00123] Um processo para a preparação de uma composição de célula-tronco mesenquimal purificada compreendendo as etapas de:

[00124] Obter uma preparação que contenha células-tronco mesenquimais cultivadas ex vivo;

[00125] Contatar a preparação com uma solução de lavagem para criar uma mistura;

[00126] Agitar a mistura em um dispositivo de filtração centrífuga; e,

[00127] Recuperar a composição de célula-tronco mesenquimal purificada.

[00128] O processo do Parágrafo [000122], em que as ditas células- tronco mesenquimais cultivadas ex vivo são cultivadas em meio que compreende albumina sérica bovina.

[00129] O processo do Parágrafo [000122], em que as ditas células- tronco mesenquimais cultivadas ex vivo são cultivadas em meio que compreende soro animal.

[00130] O processo do Parágrafo [000124], em que o soro animal é soro humano.

[00131] O processo do Parágrafo [000124], em que o soro animal é soro não humano.

[00132] O processo do Parágrafo [000126], em que o soro não humano é soro bovino.

[00133] O processo do Parágrafo [000127], em que o soro não humano é soro porcino. O processo de qualquer um dos Parágrafos [000122]-[000128], em que a dita composição de célula-tronco mesenquimal purificada compreende menos do que cerca de 55 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00134] O processo do Parágrafo [000129], em que a dita composição de célula-tronco mesenquimal purificada compreende menos do que cerca de 42 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00135] O processo do Parágrafo [000130], em que a dita composição de célula-tronco mesenquimal purificada compreende menos do que cerca de 25 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00136] O processo do Parágrafo [000131], em que a dita composição de célula-tronco mesenquimal purificada compreende menos do que cerca de 13 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00137] O processo do Parágrafo [000132], em que a dita composição de célula-tronco mesenquimal purificada compreende menos do que cerca de 10 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00138] O processo de qualquer um dos Parágrafos [000122]- [000128], em que a dita composição de célula-tronco mesenquimal purificada compreende entre cerca de 7 μg/mL e cerca de 15 μg/mL de albumina sérica bovina residual. O processo do Parágrafo [000134], em que a dita composição de célula-tronco mesenquimal purificada compreende entre cerca de 8 μg/mL e cerca de 12 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00139] O processo de qualquer um dos Parágrafos [000122]- [000135], compreendendo ainda adicionar DMSO a dita composição de célula-tronco mesenquimal purificada.

[00140] O processo do Parágrafo [000136], em que a dita composição compreende cerca de 10% de DMSO.

[00141] O processo do Parágrafo [000136], em que a dita composição compreende cerca de 3,8% de DMSO.

[00142] Uma composição de célula-tronco mesenquimal purificada obtida pelo processo de qualquer um dos parágrafos [000122]- [000138].

[00143] Uma composição de célula-tronco mesenquimal purificada produzida pelo:

[00144] Cultivo de células-tronco mesenquimais em meio que compreende soro;

[00145] Obtenção de uma preparação que compreenda as ditas células-tronco mesenquimais;

[00146] Contato da preparação com uma solução de lavagem para criar uma mistura;

[00147] Agitação da mistura com um dispositivo de filtração centrífuga; e

[00148] Recuperação da composição de célula-tronco mesenquimal purificada.

[00149] A composição do Parágrafo [000140], em que as células- tronco mesenquimais exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 30 μm.

[00150] A composição do Parágrafo [000141], em que as células- tronco mesenquimais exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 25 μm.

[00151] A composição do Parágrafo [000142], em que as células- tronco mesenquimais exibem uma D90 entre cerca de 20 μm e cerca de 25 μm.

[00152] A composição de qualquer um dos Parágrafos [000140]-

[000143], em que o dito soro é soro bovino e a dita composição compreende menos do que cerca de 55 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00153] A composição do Parágrafo [000144], em que a dita composição compreende menos do que cerca de 42 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00154] A composição do Parágrafo [000145], em que a dita composição compreende menos do que cerca de 25 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00155] A composição do Parágrafo [000146], em que a dita composição compreende menos do que cerca de 13 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00156] A composição do Parágrafo [000147], em que a dita composição compreende menos do que cerca de 10 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00157] A composição de qualquer um dos Parágrafos [000140]- [000143], em que o dito soro é soro bovino e a dita composição compreende entre cerca de 7 μg/ml e cerca de 15 μg/ml de albumina sérica bovina residual.

[00158] A composição do Parágrafo [000149], em que a dita composição compreende entre cerca de 8 μg/ml e cerca de 12 μg/ml de albumina sérica bovina residual.

[00159] Uma composição farmaceuticamente aceitável que compreende células-tronco mesenquimais purificadas, em que as ditas células-tronco mesenquimais sejam expandidas em cultura em meio contendo albumina sérica bovina; e em que a dita composição compreenda menos do que cerca de 55 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00160] A composição do Parágrafo [000151], em que a dita composição compreende menos do que cerca de 42 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00161] A composição do Parágrafo [000152], em que a dita composição compreende menos do que cerca de 25 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00162] A composição do Parágrafo [000153], em que a dita composição compreende menos do que cerca de 13 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00163] A composição do Parágrafo [000154], em que a dita composição compreende menos do que cerca de 10 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00164] A composição do Parágrafo [000151], em que a dita composição compreende entre cerca de 7 μg/ml e cerca de 15 μg/ml de albumina sérica bovina residual.

[00165] A composição do Parágrafo [000156], em que a dita composição compreende entre cerca de 8 μg/ml e cerca de 12 μg/ml de albumina sérica bovina residual.

[00166] Uma composição farmaceuticamente aceitável que compreende células-tronco mesenquimais purificadas, em que a composição compreende menos do que cerca de 55 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00167] A composição do Parágrafo [000158], em que a dita composição compreende menos do que cerca de 42 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00168] A composição do Parágrafo [000159], em que a dita composição compreende menos do que cerca de 25 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00169] A composição do Parágrafo [000160], em que a dita composição compreende menos do que cerca de 13 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00170] A composição do Parágrafo [000161], em que a dita composição compreende menos do que cerca de 10 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

[00171] A composição do Parágrafo [000158], em que a dita composição compreende entre cerca de 7 μg/ml e cerca de 15 μg/ml de albumina sérica bovina residual.

[00172] A composição do Parágrafo [000163], em que a dita composição compreende entre cerca de 8 μg/ml e cerca de 12 μg/ml de albumina sérica bovina residual.

[00173] A composição de qualquer um dos Parágrafos [000158]- [000164], que compreende adicionalmente DMSO.

[00174] A composição do Parágrafo [000165], compreendendo cerca de 10% de DMSO.

[00175] A composição do Parágrafo [000165], compreendendo cerca de 3,8% de DMSO.

[00176] Uma composição farmaceuticamente aceitável que compreenda células-tronco mesenquimais purificadas, em que a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e a D90 dos ditos agregados seja menor do que cerca de 150 μm; em que a composição compreenda entre cerca de 8 μg/ml e cerca de 12 μg/ml de albumina sérica bovina residual; e em que as células-tronco mesenquimais exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 30 μm.

[00177] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo [000168], em que a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 100 μm.

[00178] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo [000169], em que a D90 dos ditos agregados é menor do que cerca de 50 μm.

[00179] A composição farmaceuticamente aceitável de qualquer um dos Parágrafos [000168]-[000170], em que as células-tronco mesenquimais exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 25 μm.

[00180] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo [000171], em que as células-tronco mesenquimais exibem uma D90 entre cerca de 20 μm e cerca de 25 μm.

[00181] Um método de preparação de uma composição de células- tronco mesenquimais purificadas compreendendo as etapas de: [00182] Obter uma suspensão celular que compreenda uma pluralidade de células-tronco mesenquimais;

[00183] selecionar, simultaneamente, as células-tronco mesenquimais a partir da suspensão com base na massa e no diâmetro.

[00184] O método do Parágrafo [000173], compreendendo a etapa adicional de contatar a dita suspensão com uma solução de lavagem.

[00185] O método do Parágrafo [000174], em que a dita composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e os agregados exibem uma D90 menor do que cerca de 150 μm.

[00186] O método do Parágrafo [000175], em que os agregados exibem uma D90 menor do que cerca de 100 μm.

[00187] O método do Parágrafo [000176], em que os agregados exibem uma D90 menor do que cerca de 50 μm.

[00188] O método do Parágrafo [000173], em que a dita composição não compreende agregados de célula-tronco mesenquimal detectáveis.

[00189] Uma composição farmaceuticamente aceitável que compreenda células-tronco mesenquimais purificadas, em que as células-tronco mesenquimais exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 30 μm.

[00190] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo [000179], em que as células-tronco mesenquimais exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 25 μm.

[00191] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo [000180], em que as células-tronco mesenquimais exibem uma D90 entre cerca de 20 μm e cerca de 25 μm.

[00192] A composição de qualquer um dos Parágrafos [000179]- [000181], que compreende adicionalmente DMSO.

[00193] A composição do Parágrafo [000182], compreendendo cerca de 10% de DMSO.

[00194] A composição do Parágrafo [000182], compreendendo cerca de 3,8% de DMSO.

[00195] Um método de preparação de uma composição farmacêutica de células-tronco mesenquimais purificadas compreendendo as etapas de:

[00196] Obter uma suspensão de células-tronco mesenquimais que compreenda uma pluralidade de células-tronco mesenquimais e agregados de células-tronco mesenquimais;

[00197] Contatar a suspensão com uma solução de lavagem para criar uma suspensão mista;

[00198] Agitar a suspensão mista com um dispositivo de filtração centrífuga até que os agregados de célula-tronco mesenquimal exibam uma D90 menor do que cerca de 150 μm; e

[00199] Recuperar a composição farmacêutica de célula-tronco mesenquimal. O método do Parágrafo [000185], em que os agregados de célula- tronco mesenquimal exibem uma D90 menor do que cerca de 100 μm.

[00200] O método do Parágrafo [000186], em que os agregados de célula-tronco mesenquimal exibem uma D90 menor do que cerca de 50 μm.

[00201] O método de qualquer um dos Parágrafos [000185]- [000187], em que a dita composição farmacêutica de célula-tronco mesenquimal compreende células-tronco mesenquimais que exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 30 μm.

[00202] O método do Parágrafo [000188], em que a dita composição farmacêutica de célula-tronco mesenquimal compreende células-tronco mesenquimais que exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 25 μm.

[00203] O método do Parágrafo [000189], em que a dita composição farmacêutica de célula-tronco mesenquimal compreende células-tronco mesenquimais que exibem uma D90 entre cerca de 20 μm e cerca de 25 μm.

[00204] Uma composição que compreenda uma população de células-tronco mesenquimais purificadas obtida pelo método de qualquer um dos Parágrafos [000185]-[000190], na qual a viabilidade das células é maior do que cerca de 70%.

[00205] A composição do Parágrafo [000191], na qual a viabilidade das células é maior do que cerca de 80%.

[00206] A composição de qualquer um dos Parágrafos [000185]- [000192], que compreenda adicionalmente DMSO.

[00207] A composição do Parágrafo [000193], compreendendo cerca de 10% de DMSO.

[00208] A composição do Parágrafo [000193], compreendendo cerca de 3,8% de DMSO.

[00209] Uma composição farmaceuticamente aceitável que compreenda células-tronco mesenquimais purificadas, em que a composição compreende um ou mais agregados de célula-tronco mesenquimal e os ditos agregados exibam uma D90 menor do que cerca de 150 μm; e em que as células-tronco mesenquimais exibam uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 30 μm.

[00210] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo [000196], em que os ditos agregados exibam uma D90 menor do que cerca de 100 μm.

[00211] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo [000197], em que os ditos agregados exibam uma D90 menor do que cerca de 50 μm.

[00212] A composição farmaceuticamente aceitável de qualquer um dos Parágrafos [000196]-[000198], em que as células-tronco mesenquimais exibem uma D90 entre cerca de 18 μm e cerca de 25 μm.

[00213] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo [000199], em que as células-tronco mesenquimais exibem uma D90 entre cerca de 20 μm e cerca de 25 μm.

[00214] A composição farmaceuticamente aceitável de qualquer um dos Parágrafos [000196]-[000200], em que a dita composição compreende entre cerca de 7 μg/ml e cerca de 15 μg/ml de albumina sérica bovina residual.

[00215] A composição farmaceuticamente aceitável do Parágrafo [000201], em que a dita composição compreende entre cerca de 8 μg/ml e cerca de 12 μg/ml de albumina sérica bovina residual.

[00216] Um método para selecionar uma suspensão celular que contenha pelo menos uma proteína não humana para administração a um paciente, compreendendo as etapas de:

[00217] obter pelo menos uma amostra representativa da dita suspensão celular;

[00218] determinar o nível da dita proteína não humana presente na dita amostra; e

[00219] identificar a dita suspensão celular como adequada para administração a um paciente quando a dita amostra contiver menos do que cerca de 42 microgramas da dita proteína não humana por mililitro. O método do Parágrafo [000203], em que as ditas células humanas são células-tronco mesenquimais.

[00220] O método do Parágrafo [000203], em que a dita proteína não humana é a albumina.

[00221] O método do Parágrafo [000203], em que a dita proteína não humana é a albumina sérica bovina.

[00222] O método do Parágrafo [000205] ou [000206], em que a etapa (b) compreende:

[00223] contatar a dita amostra com pelo menos um anticorpo anti- albumina; e

[00224] quantificar o nível de albumina na dita amostra.

[00225] O método do Parágrafo [000203], em que a dita proteína não humana é a tripsina.

[00226] O método do Parágrafo [000203], em que a dita proteína não humana é a tripsina porcina.

[00227] O método do Parágrafo [000208] ou [000209], em que a etapa (b) compreende:

[00228] contatar a dita amostra com pelo menos um agente que se ligue seletivamente à tripsina; e

[00229] quantificar o nível de tripsina na dita amostra.

[00230] O método do Parágrafo [000210], em que o dito pelo menos um agente é um inibidor da tripsina.

[00231] O método do Parágrafo [000210], em que o dito pelo menos um agente é um anticorpo antitripsina.

[00232] O método do Parágrafo [000203] em que a etapa (b) compreende:

[00233] contatar a dita amostra com um inibidor de tripsina imobilizado para formar um conjugado de inibidor imobilizado de tripsina-tripsina;

[00234] contatar o dito conjugado imobilizado com um anticorpo antitripsina para formar um complexo de inibidor imobilizado de tripsina-tripsina-anticorpo; e

[00235] detectar o sinal gerado pelo dito complexo.

[00236] Uma composição farmacêutica selecionada pelo método de qualquer um dos Parágrafos [000203, [000208]-[000209] ou [000211]- [000213].

[00237] Um método para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio em um indivíduo, compreendendo as etapas de:

[00238] incubar células humanas em um meio que compreenda uma proteína não humana;

[00239] selecionar uma suspensão de células incubadas que contenha menos do que cerca de 42 microgramas da dita proteína não humana por mililitro; (c) administrar a dita suspensão de células ao dito indivíduo.

[00240] O método do Parágrafo [000215], em que as ditas células humanas são células-tronco mesenquimais.

[00241] O método do Parágrafo [000215], em que a dita proteína não humana é a albumina.

[00242] O método do Parágrafo [000215], em que a dita proteína não humana é a albumina sérica bovina.

[00243] O método do Parágrafo [000217] ou [000218], em que a etapa (b) compreende:

[00244] contatar a dita amostra com pelo menos um anticorpo anti- albumina; e

[00245] quantificar o nível de albumina na dita amostra.

[00246] O método do Parágrafo [000215], em que a dita proteína não humana é a tripsina.

[00247] O método do Parágrafo [000215], em que a dita proteína não humana é a tripsina porcina.

[00248] O método do Parágrafo [000220] ou [000221], em que a etapa (b) compreende:

[00249] contatar a dita amostra com pelo menos um agente que se ligue seletivamente à tripsina; e

[00250] quantificar o nível de tripsina na dita amostra.

[00251] O método do Parágrafo [000222], em que o dito pelo menos um agente é um inibidor da tripsina.

[00252] O método do Parágrafo [000222], em que o dito pelo menos um agente é um anticorpo antitripsina.

[00253] O método do Parágrafo [000215] em que a etapa (b) compreende:

[00254] contatar a dita amostra com um inibidor de tripsina imobilizado para formar um conjugado de inibidor imobilizado de tripsina-tripsina;

[00255] contatar o dito conjugado imobilizado com um anticorpo antitripsina para formar um complexo de inibidor imobilizado de tripsina-tripsina-anticorpo; e

[00256] detectar o sinal gerado pelo dito complexo.

[00257] Um método de fabricação de um produto para terapia celular compreendendo as etapas de:

[00258] incubar células humanas em uma solução que compreenda uma proteína não humana;

[00259] adicionar um volume de um veículo líquido às ditas células para obter uma suspensão celular farmaceuticamente aceitável;

[00260] obter pelo menos uma amostra representativa da dita suspensão celular farmaceuticamente aceitável;

[00261] quantificar uma quantidade da dita proteína não humana presente na dita amostra; e

[00262] reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita amostra contiver menos do que cerca de 42 microgramas da dita proteína não humana por mililitro.

[00263] O método do Parágrafo [000226], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita amostra contiver menos do que cerca de 30 microgramas da dita proteína não humana por mililitro.

[00264] O método do Parágrafo [000226], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita amostra contiver menos do que cerca de 25 microgramas da dita proteína não humana por mililitro.

[00265] O método do Parágrafo [000226], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita amostra contiver menos do que cerca de 13 microgramas da dita proteína não humana por mililitro.

[00266] O método do Parágrafo [000226], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita amostra contiver menos do que cerca de 10 microgramas da dita proteína não humana por mililitro.

[00267] O método do Parágrafo [000226], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita amostra contiver entre cerca de 7 a cerca de 15 microgramas da dita proteína não humana por mililitro.

[00268] O método do Parágrafo [000226], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita amostra contiver entre cerca de 8 a cerca de 12 microgramas da dita proteína não humana por mililitro.

[00269] O método do Parágrafo [000226], em que as ditas células humanas são células aderentes.

[00270] O método do Parágrafo [000226], em que as ditas células humanas são células-tronco mesenquimais.

[00271] O método do Parágrafo [000226], em que a dita proteína não humana é a albumina.

[00272] O método do Parágrafo [000226], em que a dita proteína não humana é a albumina sérica bovina.

[00273] O método do Parágrafo [000235] ou [000236], em que a etapa (d) compreende:

[00274] contatar a dita amostra com pelo menos um anticorpo anti- albumina; e

[00275] quantificar o nível de albumina na dita amostra.

[00276] O método do Parágrafo [000226], em que a dita proteína não humana é a tripsina.

[00277] O método do Parágrafo [000226], em que a dita proteína não humana é a tripsina porcina.

[00278] O método do Parágrafo [000238] ou [000239], em que a etapa (d) compreende:

[00279] contatar a dita amostra com pelo menos um agente que se ligue seletivamente à tripsina; e

[00280] quantificar o nível de tripsina na dita amostra.

[00281] O método do Parágrafo [000240], em que o dito pelo menos um agente é um inibidor da tripsina.

[00282] O método do Parágrafo [000240], em que o dito pelo menos um agente é um anticorpo antitripsina.

[00283] O método do Parágrafo [000238] ou [000239] em que a etapa (d) compreende:

[00284] contatar a dita amostra com um inibidor de tripsina imobilizado para formar um conjugado de inibidor imobilizado de tripsina-tripsina;

[00285] contatar o dito conjugado imobilizado com um anticorpo antitripsina para formar um complexo de inibidor imobilizado de tripsina-tripsina-anticorpo; e

[00286] detectar o sinal gerado pelo dito complexo.

[00287] Um método de fabricação de um produto para terapia celular compreendendo as etapas de:

[00288] incubar células humanas em uma solução que compreenda tripsina não humana;

[00289] adicionar um volume de um veículo líquido às ditas células para obter uma suspensão celular farmaceuticamente aceitável;

[00290] obter pelo menos duas amostras representativas da dita suspensão celular farmaceuticamente aceitável;

[00291] determinar o nível de tripsina em uma primeira amostra;

[00292] incubar uma segunda amostra em uma solução que compreenda pelo menos um agente que se ligue seletivamente a tripsina para obter um controle;

[00293] determinar o nível de tripsina no dito controle;

[00294] comparar o nível de tripsina na dita primeira amostra com o nível de tripsina no dito controle para obter um nível de tripsina na dita suspensão celular; e

[00295] reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita amostra contiver menos do que cerca de 30 microgramas de tripsina por mililitro.

[00296] O método do Parágrafo [000244], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita suspensão celular contiver menos do que cerca de 25 microgramas de tripsina por mililitro.

[00297] O método do Parágrafo [000244], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita suspensão celular contiver menos do que cerca de 13 microgramas de tripsina por mililitro.

[00298] O método do Parágrafo [000244], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita suspensão celular contiver menos do que cerca de 10 microgramas de tripsina por mililitro.

[00299] O método do Parágrafo [000244], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita suspensão celular contiver entre cerca de 7 a cerca de 15 microgramas de tripsina por mililitro.

[00300] O método do Parágrafo [000244], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita suspensão celular contiver entre cerca de 8 a cerca de 12 microgramas de tripsina por mililitro.

[00301] O método do Parágrafo [000244], em que as ditas células humanas são células-tronco mesenquimais.

[00302] O método do Parágrafo [000244], em que o dito pelo menos um agente é um inibidor da tripsina.

[00303] O método do Parágrafo [000244], em que o dito pelo menos um agente é um anticorpo antitripsina.

[00304] Um produto para terapia celular fabricado pelo método de qualquer um dos Parágrafos [000226]-[000236], [000238]-[000239] ou [000244]-[000252].

[00305] Um produto para terapia celular fabricado pelo método do Parágrafo [000237].

[00306] Um produto para terapia celular fabricado pelo método do Parágrafo [000240].

[00307] Um produto para terapia celular fabricado pelo método do Parágrafo [000241].

[00308] Um produto para terapia celular fabricado pelo método do Parágrafo [000242].

[00309] Um produto para terapia celular fabricado pelo método do Parágrafo [000243].

[00310] Uma suspensão celular farmaceuticamente aceitável compreendendo células-tronco mesenquimais humanas e pelo menos uma proteína não humana, em que a dita suspensão celular contém menos do que cerca de 42 microgramas da dita proteína não humana por mililitro.

[00311] A suspensão celular do Parágrafo [000259], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita amostra contiver menos do que cerca de 30 microgramas da dita proteína não humana por mililitro.

[00312] A suspensão celular do Parágrafo [000259], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita amostra contiver menos do que cerca de 25 microgramas da dita proteína não humana por mililitro.

[00313] A suspensão celular do Parágrafo [000259], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita amostra contiver menos do que cerca de 13 microgramas da dita proteína não humana por mililitro.

[00314] A suspensão celular do Parágrafo [000259], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita amostra contiver menos do que cerca de 10 microgramas da dita proteína não humana por mililitro.

[00315] A suspensão celular do Parágrafo [000259], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita amostra contiver entre cerca de 7 a cerca de 15 microgramas da dita proteína não humana por mililitro.

[00316] A suspensão celular do Parágrafo [000259], compreendendo ainda reter a dita suspensão celular para administração a um paciente quando a dita amostra contiver entre cerca de 8 a cerca de 12 microgramas da dita proteína não humana por mililitro.

[00317] A suspensão celular do Parágrafo [000259], em que a dita proteína não humana é a albumina.

[00318] A suspensão celular do Parágrafo [000259], em que a dita proteína não humana é a albumina sérica bovina.

[00319] A suspensão celular do Parágrafo [000259], em que a dita proteína não humana é a tripsina.

[00320] A suspensão celular do Parágrafo [000259], em que a dita proteína não humana é a tripsina porcina.

Claims

1. Composição farmaceuticamente aceitável, caracterizada pelo fato de que compreende células-tronco mesenquimais humanas, em que a composição compreende um ou mais agregados de célula- tronco mesenquimal e sulfóxido de dimetila (DMSO), em que o diâmetro de 90% ou mais (D90) dos ditos agregados é menor do que 150 μm.

2. Composição farmaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a D90 dos ditos agregados é menor do que 100 μm.

3. Composição farmaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a D90 dos ditos agregados é menor do que 50 μm.

4. Composição farmaceuticamente aceitável de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que a viabilidade das células-tronco mesenquimais purificadas é maior do que 70%.

5. Composição farmaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a viabilidade das células-tronco mesenquimais purificadas é maior do que 80%.

6. Composição farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que as células-tronco mesenquimais foram purificadas por filtração centrífuga.

7. Composição farmaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a filtração centrífuga utiliza uma membrana centrífuga, opcionalmente em que a membrana tem um tamanho do poro entre 3 μm a 7 μm ou um tamanho de poro de 4 μm.

8. Composição farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a composição compreende 0,13 μg/mL ou menos de albumina sérica bovina residual.

9. Composição farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a composição compreende 10% de sulfóxido de dimetila (DMSO).

10. Composição farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a composição compreende 3,8% de sulfóxido de dimetila (DMSO).

11. Composição farmaceuticamente aceitável, caracterizada pelo fato de que compreende células-tronco mesenquimais humanas purificadas e sulfóxido de dimetila (DMSO), em que a composição compreende um ou mais agregados de células- tronco mesenquimais e menos do que 55 μg/mL de albumina sérica bovina residual, e em que o diâmetro de 90% ou mais (D90) dos ditos agregados está entre 18 μm e 30 μm.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição compreende menos do que 42 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a composição compreende menos do que 25 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a composição compreende menos do que 13 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

15. Composição de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a composição compreende menos do que 10 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

16. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição compreende entre 7 μg/mL e 15 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

17. Composição de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a composição compreende entre 8 μg/mL e 12 μg/mL de albumina sérica bovina residual.

18. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizada pelo fato de que as células- tronco mesenquimais exibem uma D90 entre 18 μm e 25 μm.

19. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18, caracterizada pelo fato de que a viabilidade das células-tronco mesenquimais purificadas é maior do que 70%.

20. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a viabilidade das células-tronco mesenquimais purificadas é maior do que 80%.