BR112016009753B1

BR112016009753B1 - Métodos in vitro de cultura de amostras de células estromais mesenquimais e para a preparação de células estromais mesenquimais

Info

Publication number: BR112016009753B1
Application number: BR112016009753-0A
Authority: BR
Inventors: Marian June Sturm
Original assignee: Isopogen Pty Ltd
Priority date: 2013-11-04
Filing date: 2014-11-03
Publication date: 2023-11-28
Also published as: RU2016119489A; JP2017501740A; BR112016009753A2; KR20160070167A; CN105765059A; US11041144B2; JP6643999B2; JP2020022486A; AU2014344795A1; WO2015061839A1; KR102314825B1; AU2014344795B2; CA2929333C; SG11201603407VA; MX2016005824A; US20180112181A1; EP3066193A4; IL245392B; CA2929333A1; CN105765059B

Abstract

MÉTODO DE CULTURA CELULAR PARA UTILIZAÇÃO EM TERAPIA, MÉTODO DE CULTURA DE CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS HUMANAS PARA UTILIZAÇÃO EM TERAPIA CELULAR, MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE CÉLULAS PARA A TERAPIA CELULAR ALOGÊNICA EM UM PACIENTE, COMPOSIÇÃO PARA USO EM TERAPIA CELULAR E KIT A COMPREENDENDO, BEM COMO MÉTODO DE TERAPIA CELULAR, USO DE CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS HUMANAS E DISPOSITIVO MÉDICO IMPLANTÁVEL A presente invenção é direcionada a métodos para a produção de composições de células e tecidos adequadas para aplicações terapêuticas a um mamífero em necessidade de um tratamento terapêutico de célula ou tecido. Em particular, a invenção é direcionada para um método de cultura celular para utilização em terapia, método esse que compreende (i) cultura de uma amostra de células em um primeiro meio de cultura celular que compreende um primeiro soro, substituto do soro e/ou a fração do soro e (ii) antes da colheita de células para utilização na terapia, promover a cultura das células em um segundo meio de cultura.

Description

CAMPO

[001] A presente invenção refere-se a métodos e composições novos e melhorados para terapia de células e tecidos. A invenção refere-se a métodos para a produção de composições de células e tecidos adequadas para aplicações terapêuticas a um mamífero em necessidade de um tratamento terapêutico de célula ou tecido.

FUNDAMENTO

[002] A terapia celular é um tratamento cada vez mais importante para vários tipos de distúrbios, lesões, malignidades e doenças. A terapia celular envolve a infusão, aplicação ou transplante de células a um paciente, em que as células infundidas, aplicadas ou transplantadas são tanto derivadas de um doador diferente do paciente (alogênica) quanto a partir do próprio paciente (autóloga). As células estromais mesenquimais (MSC) são um tipo de célula que tem se mostrado promissora para utilização terapêutica.

[003] Apesar de sua promessa, os resultados clínicos obtidos até agora com MSC têm sido, geralmente, ruins. A principal razão para estes resultados clínicos ruins parece ser devido a forma como as MSC foram produzidas. Por exemplo, a maioria das MSCs são cultivadas em soro bovino fetal, que é então removido por, simplesmente, lavagem das células pós-colheita. No entanto, esta lavagem simples pode não remover proteínas bovinas ligadas à superfície da célula ou aquelas localizadas no interior das células, que podem, posteriormente, ser incorporadas na superfície externa da célula. Essas células, mediante implante, aparecerão então estranhas para pacientes com anticorpos para proteínas bovinas presentes no sangue (com uma incidência de aproximadamente 40-50% da população australiana), sendo reconhecidas pelo sistema imunológico do paciente e sendo destruídas antes de entregar o seu benefício terapêutico.

[004] Assim, existe uma necessidade contínua de métodos de produção de células para a terapia celular.

SUMÁRIO

[005] Os inventores descobriram que as células podem ser produzidas de tal modo que os problemas com os métodos atuais de produção são melhorados ou resolvidos, o que levou a resultados clínicos melhorados.

[006] Em conformidade, em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um método de cultura celular para utilização em terapia compreendendo os passos de: (i) promover a cultura de uma amostra de células em um primeiro meio de cultura celular que compreende um primeiro soro, primeiro substituto de soro e/ou primeira fração de soro durante o tempo suficiente para permitir as células a alcançarem um nível desejado de expansão; e (ii) antes da colheita de células para utilização na terapia, o referido primeiro meio de cultura celular é substituído por um segundo meio de cultura celular que compreende um segundo soro, um segundo substituto do soro e/ou segunda fração de soro e as células são cultivadas por um período adicional de tempo.

[007] Em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um método de cultura de células estromais mesenquimais humanas para utilização em terapia celular, compreendendo os passos de: (i) promover a cultura de células estromais mesenquimais em um primeiro meio de cultura celular compreendendo DMEM suplementado com soro bovino fetal inativado pelo calor (HIFCS) até que as referidas células atinjam cerca de 70-85% de confluência; e (ii) cerca de 24 horas

[008] Em um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona um método de cultura de células estromais mesenquimais humanas para utilização em terapia celular, compreendendo os passos de: (i) cultivar a entre 1,0 x 103 células por cm2 de recipiente de cultura e 1,0 x 1010 células por cm2 de recipiente de cultura de células estromais mesenquimais em um primeiro meio de cultura celular compreendendo DMEM suplementado com soro bovino fetal inativado pelo calor (HIFCS) até as referidas células atingirem cerca de 70-85% de confluência; e (ii) cerca de 24 horas antes da colheita de células para utilização na terapia, o referido primeiro meio de cultura celular é removido e substituído por um segundo meio de cultura celular compreendendo DMEM isento devermelho de fenol e cerca de 2% de albumina de soro humano e as células são, então, cultivadas durante as referidas cerca de 24 horas.

[009] Em um quarto aspecto, a presente invenção proporciona um método para a preparação de células para a terapia celular alogênica em um paciente, compreendendo os passos de: (i) proporcionar uma amostra de células de um doador saudável; (ii) promover a cultura da referida amostra de células em um primeiro meio de cultura celular que compreende um primeiro soro, primeiro substituto de soro e/ou primeira fração de soro durante o tempo suficiente para permitir as células a alcançarem um nível desejado de expansão; e (iii) antes da colheita de células para utilização na terapia, o referido primeiro meio de cultura celular é substituído por um segundo meio de cultura celular que compreende um segundo soro, um segundo substituto do soro e/ou segunda fração de soro e as células são cultivadas por um período adicional de tempo; e (iv) colheita das referidas células.

[010] Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que o passo (i) do método requer que a amostra de células metabolize, expanda ou prolifere em número de células até que o recipiente de cultura que prende as células atinja um nível de confluência para serem colhidas. Assim, as condições de cultura incluindo meios devem ser suficientes para permitir a expansão ótima das células cultivadas.

[011] Em algumas formas de realização, o soro preferido no primeiro meio de cultura celular é soro bovino fetal (FCS) ou soro bovino fetal inativado pelo calor (HIFCS). No entanto, será apreciado que outras fontes de nutrientes, hormônios e proteínas podem ser utilizadas em vez de FCS, incluindo a albumina de soro, que é um componente importante de FCS. Também outros substitutos de soro, tal como lisado de plaquetas e produtos comerciais, tal como substituto de soro Ultroser™ G (Pall Corporation, Nova Iorque, EUA); substituto de soro HIT™, que contém albumina de soro humano, insulina e transferrina em MDM de Iscove (Stemcell Technologies, BC, Canadá); Serum Substitute Suplement™ (SSS™) consiste de 6% de proteína total: contendo aproximadamente 84% de albumina de soro humano, 16% de alfa e beta globulina e <1% de gamaglobulinas (Irvine Scientific, CA, EUA) e substitutos de proteínas do soro Quinn Advantage® (CooperSurgical Inc, CT, EUA). Todos esses substitutos do soro fornecem os fatores de crescimento potenciais osmóticos certos e nutrientes/proteínas para permitir a amostra de células a aderir ao recipiente de cultura e expandir no número de células.

[012] Em algumas formas de realização, o primeiro meio de cultura celular compreende uma fração de soro, tal como albumina do soro.

[013] O segundo meio compreende um segundo soro ou segunda fração de soro que tem a mesma origem de espécie que as células sendo cultivadas. Por exemplo, se células humanas estão sendo cultivadas, em seguida, o segundo meio irá compreender soro humano, substituto de soro humano ou albumina de soro humano. Se células equinas estão sendo cultivadas, em seguida, o segundo meio será composto de soro de cavalo, substituto de soro de cavalo ou albumina de soro de cavalo. Da mesma forma, se células caninas estão sendo cultivadas, em seguida, o segundo meio irá compreender soro canino, etc.

[014] Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que a amostra de células pode compreender qualquer célula que possa ser utilizada na terapia de células, incluindo células alogênicas e hepáticas autólogas, células alogênicas e hematopoiéticas autólogas, células alogênicas e fibroblastos autólogos, células alogênicas e adiposas autólogas, células alogênicas e mesenquimais autólogas, células alogênicas e cardíacas autólogas, células alogênicas e endoteliais autólogas, células alogênicas e epiteliais autólogas, células alogênicas e neuronais autólogas, células alogênicas e gliais autólogas, células alogênicas e endócrinas autólogos ou células progenitoras das mesmas.

[015] De preferência, as células da presente invenção são as células progenitoras mesenquimais nas células estromais mesenquimais (MSC) particulares.

[016] É para ser entendido que os métodos e composições da presente invenção podem ser utilizados para a terapia celular em qualquer animal mamífero. Portanto, a amostra de células pode ser isolada a partir de um ser humano, um camelino, um equino, um canino e um felino ou qualquer outro animal mamífero comercialmente ou economicamente valioso.

[017] Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que primeiro meio, enquanto contém um primeiro soro, um primeiro substituto do soro e/ou primeira fração de soro, conforme discutido supra, também irá compreender um meio de base. Há muitos meios de base conhecidos na arte, mas meios de base preferidos podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em DMEM (alto ou baixo teor de glicose), meio basal de Eagle (MEM), meio F10 de Ham (F10), meio F12 de Ham (F12), meio de Dulbecco modificado por Iscove, M-199, Meio de Crescimento de Célula Tronco Mesenquimatosa (MSCGM), meio L-15 de Liebovitz, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM Advanced (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma) e célula-GRO livre ou uma combinação dos mesmos. De um modo preferido, o primeiro meio de base é DMEM.

[018] De um modo preferido, o primeiro meio de base é suplementado com soro bovino fetal inativado pelo calor (HIFCS).

[019] Os métodos de cultura de células ou de tecidos são métodos padrão bem conhecidos na técnica. Estes incluem intervalo de temperatura de, por exemplo, cerca de 37°C, concentração de CO2 de, por exemplo, 10% de CO2 e semelhantes. Além disso, a quantidade de células na amostra de células será, aproximadamente, aquelas utilizadas nos processos de cultura celular padrão. Por exemplo, em algumas formas de realização, o número de células na amostra celular irá estar compreendido entre 1,0 x 103 células por cm2 de recipiente de cultura e 1,0 x 1010 células por cm2 de recipiente de cultura. Este número de células vai equivaler a, aproximadamente, 12 x 106 por 80 cm2 de recipiente de cultura de tecidos ou 28 x 106 por 175 cm2 de recipiente de cultura de tecidos.

[020] Em algumas formas de realização, a amostra de células no passo (i) do método preferido é cultivada até que as células estejam cerca de 85% confluentes. Será apreciado por pessoas técnicas no assunto que isso pode incluir mudanças simples do meio de base para manter o primeiro meio fresco. Nesta fase, as células são tanto adicionalmente processadas, por exemplo, o passo (ii) do método da invenção, quanto passadas.

[021] Se as células são colhidas para utilização em terapia celular, o primeiro meio de cultura é removido e substituído por um segundo meio de cultura. O passo (ii) é realizado, pelo menos, 12 horas antes das células serem colhidas para utilização em terapia celular. De um modo preferido, o passo (ii) é realizado, pelo menos, 18 horas antes das células serem colhidas para utilização em terapia celular. Ainda mais preferivelmente, o passo (ii) é realizado, pelo menos, 24 horas antes das células serem colhidas para utilização em terapia celular.

[022] Será também apreciado que as células não podem ser permitidas permanecer em contato com o segundo meio de cultura durante mais do que cerca de 48 horas, uma vez que as células começam a se tornar senescentes. Por conseguinte, em algumas formas de realização, o passo (ii) é realizado entre cerca de 24 horas e cerca de 36 horas antes das células serem colhidas para utilização em terapia celular.

[023] Em alguns aspectos, as células no passo (ii) irão ser cultivadas na presença do segundo meio de cultura por 12, 13, 14, 15, 16, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 e 48 horas.

[024] O segundo meio no passo (ii) compreende, tipicamente, um meio de base selecionado a partir do grupo que consiste em DMEM (alto ou baixo teor de glicose), meio basal de Eagle (MEM), meio F10 de Ham (F10), meio F12 de Ham (F12), meio de Dulbecco modificado por Iscove, M-199, Meio de Crescimento de Células Tronco Mesenquimais (MSCGM), meio L-15 de Liebovitz, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM Advanced (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma) e célula-GRO livre ou uma combinação dos mesmos. De um modo preferido, o segundo meio de base é DMEM isento de vermelho de fenol.

[025] Em algumas formas de realização, o segundo meio de base é suplementado com soro humano ou albumina de soro humano. Embora a quantidade de soro humano ou albumina de soro humano utilizada na segunda forma não seja restrita, ou seja, qualquer quantidade de soro pode ser utilizada, em algumas formas de realização a quantidade de soro humano ou albumina de soro humano é de cerca de 2%.

[026] Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que os métodos da presente invenção podem ser utilizados em células em uma configuração alogênica ou autóloga. Na configuração alogênica, o doador e o receptor podem ou não ser compatíveis.

[027] Em um quinto aspecto, a presente invenção proporciona uma composição para utilização em terapia celular compreendendo células produzidas pelo processo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 4.

[028] Em algumas formas de realização, as células têm um fenótipo, compreendendo expressão de >90% de CD73, >90% de CD90, >90% de CD105 e expressão de <5% de CD34, <5% de CD45, <5% de CD14. Em outras formas de realização, as células têm um fenótipo compreendendo expressão CD54, CD61, CD89, CD201 e CD140A. As expressões CD54, CD61, CD89, CD201 e CD140A são aumentadas em relação a células estromais mesenquimais humanas que foram cultivadas em métodos diferentes dos métodos da invenção conforme aqui descritos.

[029] Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que as células podem ser fornecidas em uma variedade de dispositivos de administração. Por exemplo, em algumas formas de realização, as células são suspensas em uma seringa, enquanto que em outros, as células são suspensas em um recipiente flexível. De preferência, as células são suspensas em um meio adequado para administração terapêutica a um paciente.

[030] Em um sexto aspecto, a presente invenção proporciona um método de terapia celular compreendendo: (i) o fornecimento de uma amostra de células a partir de um doador saudável; (ii) promover a cultura da referida amostra de células em um primeiro meio de cultura celular que compreende um primeiro soro, primeiro substituto de soro e/ou primeira fração de soro durante tempo suficiente para permitir as células a alcançarem um nível desejado de expansão; e (iii) antes da colheita de células para utilização na terapia, o referido primeiro meio de cultura celular é substituído por um segundo meio de cultura celular que compreende um segundo soro, um segundo substituto do soro e/ou segunda fração de soro e as células são cultivadas por um período adicional de tempo; (iv) colheita das referidas células; e (v) implantação ou administração das referidas células a um paciente em necessidade das mesmas.

[031] Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que uma vez que as células expandidas da presente invenção forem produzidas, elas podem ser armazenadas para posterior utilização. Além disso, as células expandidas podem ser fornecidas sob a forma de um kit, compreendendo uma amostra de células e reagentes relevantes, tal como meios de cultura, e instruções para cultura e utilização.

[032] Em conformidade, em um sétimo aspecto, a presente invenção proporciona um kit que compreende uma população expandida de células produzidas pelo método do primeiro aspecto.

[033] Em algumas formas de realização, as células da presente invenção podem ser incubadas em uma cultura de monocamada ou tridimensional. A fim de se obter culturas tridimensionais, será apreciado por aqueles técnicos no assunto que scaffolds adequados podem ser utilizados. scaffolds adequados para incluir Vitrogen™, uma solução contendo colágeno que gelifica para formar uma matriz preenchida por células, e os scaffolds de tecido conjuntivo de Hwang (Pedido de Patente dos EUA no 20040267362), (Pedido de Patente dos EUA no 20050177249) Kladaki et al. e Binette et al.(Pedido de Patente dos EUA no 20040078077).

[034] As células da presente invenção também podem ser aplicadas a qualquer uma de uma ampla variedade de superfícies de contato de dispositivos médicos. Superfícies de contato incluem, mas não estão limitadas, a superfícies que se destinam a contatar as células do sangue ou outros fluidos corporais ou tecidos de um animal, incluindo, especificamente, um ser humano. As superfícies de contato adequadas incluem uma ou mais superfícies de dispositivos médicos que são destinadas a contatar sangue ou outros tecidos. Os dispositivos médicos incluem bobinas de aneurisma, vasos sanguíneos artificiais, corações artificiais, válvulas artificiais, rins artificiais, tendões e ligamentos artificiais, bolsas de sangue, oxigenadores de sangue, substituições ósseas e cardiovasculares, próteses ósseas, ceras ósseas, enxertos cardiovasculares, dispositivos de substituição de cartilagem, cateteres, microesferas, guias de crescimento do nervo, implantes oftálmicos, implantes ortopédicos, próteses, shunts, stents, revestimentos de ferida, dispositivos de cura de ferida e outros dispositivos médicos conhecidos na técnica.

[035] A superfície de contato pode incluir uma malha, bobina, fio, balão inflável ou qualquer outra estrutura que seja capaz de ser implantada em um local alvo, incluindo locais intravasculares, locais intralumenais, locais dentro de tecido sólido e similares. O dispositivo implantável pode ser destinado para a implantação permanente ou temporária. Tais dispositivos podem ser entregues por, ou incorporados em, cateteres intravasculares e outros cateteres médicos.

[036] Por conseguinte, no oitavo aspecto, a presente invenção proporciona um dispositivo médico que compreende uma população expandida de células produzidas pelo método do primeiro aspecto.

[037] Em um nono aspecto, a presente invenção proporciona uma utilização de células estromais mesenquimais humanas na fabricação de um medicamento útil em terapia celular, em que as referidas células estromais mesenquimais humanas são produzidas por: (i) cultura das referidas células estromais mesenquimais em um primeiro meio de cultura celular compreendendo DMEM suplementado com soro bovino fetal inativado pelo calor (HIFCS) até que as referidas células atinjam cerca de 70-85% de confluência; (ii) cerca de 24 horas antes da colheita de células para utilização na terapia, o referido primeiro meio de cultura celular é removido e substituído por um segundo meio de cultura celular compreendendo DMEM isento de vermelho de fenol e cerca de 2% de albumina de soro humano e as células são então cultivadas durante um adicional cerca de 24 horas; (iii) colheita das referidas células estromais mesenquimais em um meio aceitável, diluente ou transportador farmaceuticamente adequado para administração terapêutica a um paciente.

[038] Em um décimo aspecto, a presente invenção proporciona um meio de cultura celular para a cultura in vitro de células estromais mesenquimais humanas para utilização em terapia humana, o meio de cultura compreendendo soro humano ou albumina de soro humano em uma quantidade suficiente para permitir um aumento na expressão de um ou mais marcadores de adesão na superfície das células estromais mesenquimatosa humana em relação a células estromais mesenquimais humanas que não são cultivadas na presença de soro humano ou albumina de soro humano.

[039] Em algumas formas de realização, os marcadores de superfície de células que têm expressão aumentada são selecionados a partir do grupo constituído por CD54, CD61, CD89, CD201 e CD140A.

[040] Em um décimo primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma célula estromal mesenquimal humana cultivadas in vitro, célula esta que expressa na sua superfície celular um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em CD54, CD61, CD89, CD140A e CD201, em que os referidos marcadores são, preferencialmente, expressos do que células estromais mesenquimais que ocorrem naturalmente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[041] Figura 1: Sobrevida atuarial, tempo desde a primeira infusão com MSC.

[042] Figura 2a: Sobrevida atuarial por resposta, casos agudos e tempo desde a primeira infusão com MSC.

[043] Figura 2b: sobrevida atuarial por resposta, casos crônicos e tempo desde a primeira infusão com MSC.

[044] Figura 3: Índice de Atividade da Doença de Crohn médio (CDAI) durante o período de estudo.

[045] Figura 4: Índice de Atividade da Doença de Crohn (CDAI) pré e pós tratamento com MSC.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS DA INVENÇÃO

[046] Antes de descrever a presente invenção em detalhe, é para ser entendido que esta invenção não é limitada a métodos particularmente exemplificados de produção, que podem, claramente, variar. É também para ser compreendido que a terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrever formas de realização particulares da invenção apenas, e não se destina a ser limitativa, que será limitada apenas pelas reivindicações anexas.

[047] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados, quer supra ou infra, são aqui incorporados por referência na sua totalidade. No entanto, as publicações aqui mencionadas são citadas para a finalidade de descrever e divulgar os protocolos e reagentes que estão relatados nas publicações e que possam ser utilizados em ligação com a invenção. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não está autorizada a antecipar esta revelação por virtude de invenção anterior.

[048] Além disso, a prática da presente invenção emprega, a menos que indicado de outra forma, técnicas imunológicas convencionais de biologia celular, cultura de tecidos e técnicas médicas e técnicas no âmbito da técnica no assunto. Tais técnicas são bem conhecidas do técnico, e estão completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher e Wingfield "Current Protocols in Protein Science" (1999) Volume I e II (John Wiley & Sons Inc.); e Bailey, J.E. e Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, Nova Iorque, 1986; Immunochemical methods in cell and molecular biology (Mayer e Walker, editora, Academic Press, Londres, 1987); Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds., 1986); Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Celular imunoterapia, por G. Morstyn & W. Sheridan editora, Cambridge University Press, 1996; e Hematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, de 2000.

[049] Deve-se notar que tal como se utiliza aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um,""uma," e "o" incluem referência ao plural, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, uma referência a "uma célula"inclui uma pluralidade de tais células e uma referência a "um animal"é uma referência a um ou mais animais, e assim por diante. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados como comumente entendidos por um vulgar técnico no assunto ao qual essa invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados para a prática ou para testar a presente invenção, os materiais e métodos preferidos são agora descritos.

[050] Em um dos aspectos mais amplos, a presente invenção refere-se a um método de cultura celular para utilização em terapia.

[051] Os termos "promoção da cultura", "cultura" e "feito (a) em cultura"são aqui utilizados alternadamente e, geralmente, referem-se a técnicas de cultura de células e tecidos normais utilizadas para crescer células in vitro. As técnicas padrão incluem, mas não estão limitadas a, técnicas de isolamento para a obtenção de células, clonagem e seleção de tipos de células específicos, destruição seletiva de células indesejadas (seleção negativa), separação com base a capacidade de aglutinação de células diferenciais na população mista, procedimentos de congelamento-descongelamento, propriedades de aderência diferenciais das células na população mista, filtração, centrifugação convencional e zonal, elutriação centrífuga (centrifugação de contra-fluxo), separação por gravidade de unidade, distribuição em contracorrente, separação de células ativada por eletroforese e fluorescência. Para uma revisão de técnicas de seleção e de separação de células clonais, ver Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2a Ed., A.R. Liss, Inc., New York, 1987, cap. 11 e 12, páginas 137-168.

[052] A frase "uma amostra de células"ou "células da invenção"refere-se ao isolamento ou fornecimento de células para a cultura e, em seguida, a terapia. Como os métodos da invenção podem ser utilizados em qualquer célula de mamíferos, a amostra de células pode ser isolada a partir de quaisquer espécies de mamíferos incluindo, mas não limitado a, um ser humano, um camelino, um equino, um canino ou felino, ou qualquer outro mamífero comercialmente ou economicamente valioso.

[053] O termo "isolado" indica que a célula ou população de células a que se refere não está no seu ambiente natural. A célula ou população de células foi, substancialmente, separada do tecido circundante. Em algumas formas de realização, a célula ou população de células é substancialmente separada do tecido circundante, se a amostra contiver, pelo menos, cerca de 75%, em algumas formas de realização, pelo menos, cerca de 85%, em algumas formas de realização, pelo menos, cerca de 90% e, em algumas formas de realização, pelo menos, cerca de 95% de células. Em outras palavras, a amostra de células é substancialmente separada do tecido circundante e a amostra contém menos do que cerca de 25%, em algumas formas de realização menos do que cerca de 15% e, em algumas formas de realização, menos do que cerca de 5% de outros materiais diferentes das células. Tais valores percentuais referem-se a porcentagem em número de células. O termo abrange as células que foram removidas do organismo a partir do qual foram produzidas, e existem na cultura. O termo também engloba as células que foram removidas do organismo a partir do qual foram produzidas, e, subsequentemente, reinseridas em um organismo. O organismo que contém as células reinseridas pode ser o mesmo organismo a partir do qual as células foram removidas, ou pode ser um organismo diferente.

[054] Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que a amostra de células pode compreender qualquer célula que pode ser utilizada na terapia de células, incluindo células alogênicas e hepáticas autólogas, células alogênicas e hematopoiéticas autólogas, células alogênicas e fibroblastos autólogos, células alogênicas e adiposas autólogas, células alogênicas e mesenquimais autólogas, células alogênicas e cardíacas autólogas, células alogênicas e endoteliais autólogas, células alogênicas e epiteliais autólogas, células alogênicas e neuronais autólogas, células alogênicas e gliais autólogas, células alogênicas e endócrinas autólogos ou células progenitoras das mesmas.

[055] Em algumas formas de realização, as células da presente invenção são as células progenitoras mesenquimais nas células estromais mesenquimais (MSC) particulares. Em algumas formas de realização, as MSC não são produzidas a partir de material embrionário, mas compreendem células estromais mesenquimais adultas.

[056] A população de células da invenção pode também ser caracterizada por as células não expressarem uma determinada seleção de marcadores a um nível detectável. Tal como aqui definido, estes marcadores são ditos serem marcadores negativos.

[057] Em algumas formas de realização, a população de células da invenção é considerada para não expressar um marcador, se, pelo menos, cerca de 70% das células da população de células isoladas não devessem mostrar expressão detectável do marcador. Em outras formas de realização, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou 100% das células da população de células não deve mostrar qualquer expressão detectável do marcador. Mais uma vez, a ausência de expressão detectável pode ser comprovada através da utilização de um teste de RT-PCR ou utilizando FACS.

[058] Os marcadores negativos acima descritos são considerados como não serem expressos por uma população de células da invenção, se a expressão não pode ser razoavelmente detectada a um nível de 30 ciclos de PCR, que corresponde a um nível de expressão na célula de menos do que cerca de 100 cópias por célula.

[059] Em uma forma de realização, a população de células é ainda caracterizada pelo fato de as células não expressarem um, dois ou todos os três marcadores CD4, CD34 e CD45 a um nível detectável. Tal como descrito acima, é possível que estes marcadores não sejam expressos, apesar de uma pequena quantidade de expressão residual persistir.

[060] A população de células da invenção pode também ser caracterizada por as células expressarem uma determinada seleção de marcadores a um nível detectável. Tal como aqui definido, estes marcadores são ditos serem marcadores positivos.

[061] Em algumas formas de realização, a população de células da presente invenção é considerada expressar um marcador se, pelo menos, cerca de 70% das células da população de células isolado mostra a expressão detectável do marcador. Em outras formas de realização, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou 100% das células da população de células mostra expressão detectável do marcador. A expressão detectável pode ser comprovada através da utilização de um teste de RT-PCR ou utilizando FACS.

[062] Os marcadores positivos descritos acima são considerados serem expressos por uma população de células da invenção, se a expressão é razoavelmente detectada a um nível de 30 ciclos de PCR, que corresponde a um nível de expressão na célula de mais do que cerca de 100 cópias por célula.

[063] Em uma forma de realização, a população de células é ainda caracterizada pelo fato de as células expressarem um, dois ou todos os três dos marcadores CD73, CD90 e CD105 a um nível detectável.

[064] O termo CD73 inclui CD73 e quaisquer ortólogos deste, incluindo, mas não limitado a NT5E, 5'-nucleotidase, ecto, RP11-321N4.1, E5NT, NT, NT5, NTE, eN, eNT, 5'- nucleotidase (CD73), 5'-nucleotidase, OTTHUMP00000040565, purina 5-Prime-nucleotidase e ecto-5'-nucleotidase.

[065] O termo CD90 inclui CD90 e quaisquer ortólogos deste, incluindo, mas não se limitando a Thy-1, 5E10.

[066] O termo CD105 inclui CD105 e quaisquer ortólogos deste, incluindo, mas não se limitando a ENG, endoglina, RP11-228B15.2, FIM, FLJ41744, HHT1, ORW e ORW1.

[067] Em algumas formas de realização, as células têm um fenótipo, compreendendo expressão de >90% de CD73, >90% de CD90, >90% de CD105 e expressão de <5% de CD34, <5% de CD45, <5% de CD14.

[068] Em algumas formas de realização, a amostra de células preferida é a de células mononucleares de medula óssea isoladas a partir de aspirado de medula óssea. O aspirado de medula óssea pode ser coletado para uma seringa heparinizada da agulha de colheita. Se o tempo entre a coleta e o processamento será mais longo do que 2 horas, a medula é, de preferência armazenada refrigerada (2-8°C) e tratamento iniciado no prazo de 24 horas.

[069] Em algumas formas de realização, as células mononucleares de medula óssea são separadas por centrifugação de gradiente de densidade e lavadas em PBS antes de serem ressuspensas em um primeiro meio de cultura celular e plaqueadas.

[070] O número de células que são plaqueadas vai depender do tipo de células e do tipo de recipiente de cultura. No entanto, o número de células será tipicamente entre 1,0 x 103células por cm2 do recipiente de cultura e 1,0 x 1010células por cm2 do recipiente de cultura. Em algumas formas de realização, o número de células equivale a aproximadamente 12 x 106 por 80 cm2 do recipiente de cultura de tecidos ou 28 x 106 por 175 cm2 do recipiente de cultura de tecidos.

[071] A frase "primeiro meio de cultura celular"é aqui utilizada para referir-se ao meio de cultura padrão que permite a amostra de células a metabolizar, expandir ou proliferar no número de células até que o recipiente de cultura que prende as células atinja um nível de confluência para ser colhido.

[072] Os termos "meio de cultura" ou "meio"são reconhecidos na técnica e referem-se, geralmente, a qualquer substância ou preparação utilizada para a cultura de células vivas. O termo "meio", tal como utilizado em referência a uma cultura celular, inclui os componentes do meio circundante às células.

[073] O "primeiro meio de cultura celular", tipicamente, compreenderá um primeiro meio de base (por exemplo, meio comercialmente disponível), tal como DMEM (elevado ou baixo teor de glicose), meio basal de Eagle (MEM), meio F10 de Ham (F10), meio F12 de Ham (F12), meio de Dulbecco modificado por Iscove, M-199, Meio de Crescimento de Células Tronco Mesemquimais (MSCGM), meio L- 15 de Liebovitz, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM Advanced (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma) e célula-GRO livre ou uma combinação dos mesmos. Em algumas formas de realização, o primeiro meio de base é DMEM.

[074] O "primeiro meio de cultura celular"também inclui, tipicamente, um primeiro soro, um primeiro substituto de soro, uma primeira fração de soro ou combinação dos mesmos. O termo "primeiro soro" inclui fontes de soro comercialmente disponíveis, tal como soro bovino fetal (FCS) ou soro bovino fetal inativado pelo calor (HIFCS). De um modo preferido, o primeiro meio de base é suplementado com soro bovino fetal inativado pelo calor (HIFCS).

[075] O termo "primeiros substitutos de soro" incluem lisado de plaquetas e produtos comerciais, tal como substituto de soro Ultroser™ G (Pall Corporation, Nova Iorque, EUA); substituto de soro HIT™, que contém albumina de soro humano, insulina e transferrina em MDM de Iscove (Stemcell Technologies, BC, Canadá); Serum Substitute Supplement™ (SSS™) consiste de 6% de proteína total: contendo aproximadamente 84% de albumina de soro humano, 16% de alfa e beta globulina e <1% de gamaglobulinas (Irvine Scientific, CA, EUA) e substituto de proteína sérica Quinn Advantage® (CooperSurgical Inc, CT, EUA). Todos esses substitutos do soro fornecem os potenciais osmóticos, fatores de crescimento e nutrientes/proteínas certos para permitir a amostra de células a aderir ao recipiente de cultura e expandir no número de células.

[076] O termo "primeira fração de soro" inclui componentes do soro, tal como albumina do soro.

[077] Uma vez que a primeira amostra de células é plaqueada, as células são incubadas sob condições padrão de cultura celular durante um tempo suficiente para expandir e atingir um nível necessário de confluência. Um conjunto típico de condições de cultura celular é de cerca de 37°C, cerca de 5% de CO2 e cerca de 70% de umidade.

[078] A frase "tempo suficiente" refere-se ao período de tempo para as células conseguirem um "nível desejado de expansão". Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que o tempo necessário para atingir um nível desejado de expansão dependerá de vários fatores, tal como o tipo de célula, a densidade celular de plaqueamento inicial, o tipo de meio de primeira cultura celular e o número de células necessário para a terapia de utilização final. No entanto, em algumas formas de realização, as células são incubadas por entre 18 e 72 h, antes das células aderentes serem lavadas com PBS e meios substituídos por cultura contínua.

[079] A frase "nível desejado de expansão"envolve, tipicamente, o passo de crescimento das células até que as células atinjam 70-90% de confluência, com troca de meio a cada 3-4 dias.

[080] Em algumas formas de realização, as células podem ser cultivadas em fábricas de células, tal como fábricas CellSTACK (Corning, EUA). As células são semeadas nestas fábricas a densidades celulares típicas de cerca de 5000 células/cm2. Tal como descrito infra, o número de células utilizado em terapia é entre cerca de 1 x 106células/kg de peso corporal a cerca de 15 x 106células/kg de peso corporal. Assim, para uma pessoa de 80 kg, aproximadamente, 80 x 106células a 1200 x 106células, no total, serão necessárias. Assim, em algumas formas de realização, a frase "nível de expansão desejado" significa cultura das células até um volume desejado de células ter sido produzido, tal como 80 x 106células a 1200 x 106células.

[081] Uma vez que as células tenham atingido o nível desejado de expansão, as células podem ser preparadas para a colheita. A frase "antes da colheita de células", tal como aqui utilizado refere-se à substituição do "primeiro meio de cultura celular" por um "segundo meio de cultura celular". O período de tempo para o qual o termo "anterior" refere-se é, tipicamente, pelo menos, 12 horas antes das células serem colhidas para utilização em terapia celular. De preferência, esta etapa é realizada, pelo menos, 18 horas antes das células serem colhidas para utilização em terapia celular. Ainda mais preferivelmente, o passo (ii) é realizado, pelo menos, 24 horas antes das células serem colhidas para utilização em terapia celular. Assim, tipicamente, o primeiro meio de cultura celular é removido e substituído por um segundo meio de cultura celular e as células são, em seguida, incubadas a cerca de 37°C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2, durante cerca de 24 h. Será também apreciado que as células não podem ser permitidas permanecer em contato com o segundo meio de cultura celular durante mais tempo do que cerca de 48 horas, uma vez que as células começam a se tornar senescentes.

[082] Faz-se observar que a frase "células são cultivadas durante um período adicional de tempo" refere-se ao mesmo período de tempo, tal como abrangido pelo termo "anterior".

[083] A frase "segundo meio de cultura celular", tal como aqui utilizada, refere-se a um meio de cultura de tecido que compreende um meio de base selecionado a partir do grupo que consiste em DMEM (alto ou baixo teor de glicose), meio basal de Eagle (MEM), meio F10 de Ham (F10), meio de Ham F-12 (F12), meio de Dulbecco modificado por Iscove, M-199, Meio de Crescimento de Células Tronco Mesenquimais (MSCGM), meio L-15 de Liebovitz, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM Advanced (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma) e célula-GRO livre ou uma combinação dos mesmos. De um modo preferido, o segundo meio de base é DMEM isento de vermelho de fenol.

[084] O "segundo meio de cultura celular"também irá compreender "um segundo soro", "um segundo substituto de soro", "uma segunda fração de soro" ou combinação dos mesmos. No entanto, é fundamental que o segundo soro e/ou segunda fração de soro tenham a mesma origem de espécie como as células a serem cultivadas. Por exemplo, se células humanas estão sendo cultivadas, em seguida, o segundo meio irá compreender soro humano, substituto de soro humano ou albumina de soro humano. Se células equinas estão sendo cultivadas, em seguida, o segundo meio será composto de soro de cavalo, substituto de soro de cavalo ou albumina de soro de cavalo. Da mesma forma, se células caninas estão sendo cultivadas, em seguida, o segundo meio irá compreender soro canino, etc.

[085] Em algumas formas de realização, o segundo meio de base é suplementado com soro humano ou albumina de soro humano para utilização em cultura de células humanas. Embora a quantidade de soro humano ou albumina de soro humano utilizada na segunda forma não seja restrita, ou seja, qualquer quantidade de soro pode ser utilizada, em algumas formas de realização, a quantidade de soro humano ou albumina de soro humano é de cerca de 2%.

[086] Sem desejar estar limitado por qualquer teoria ou hipótese, os inventores acreditam que promover a cultura de células para a terapia em soro que não sejam "compatíveis" com a espécie de origem, por exemplo, soro humano para as células humanas, soro canino para células caninas, etc., as células cultivadas produziram marcadores de superfície expressos que são reconhecidos pelo sistema imunológico do paciente como "estranho", o que conduz a problemas de rejeição do tecido e, finalmente, a falha do tratamento. No entanto, a promoção da cultura de células em soro compatível com a espécie, por exemplo, soro humano, por muito tempo é (i) dispendiosa e (ii) produziu células suficientes para a terapia muito lentamente. Por conseguinte, é preferencial promover a cultura de células para terapia em meio de cultura de tecido "padrão", tal como DMEM e soro bovino fetal e, em seguida, remover o "primeiro meio de cultura celular" para ser substituído pelo "segundo meio de cultura celular" da presente invenção, o que permite a remoção dos marcadores de superfície celular errôneos.

[087] Com o acima em mente, note-se que, após o passo de cultivar as células da invenção no segundo meio de cultura celular, as células têm um "aumento da expressão de um ou mais marcadores de adesão". O termo "aumento na expressão"refere-se a um aumento na quantidade de ARNm detectável que codifica para uma proteína marcadora de adesão ou a detecção de proteína marcadora de adesão por si só. O aumento é em relação ao nível da detecção de ARNm e/ou proteína para estes marcadores de adesão nas células que não foram cultivadas na presença do segundo meio de cultura celular ou, mais especificamente, foram cultivadas na presença de meio de soro bovino fetal suplementado, tal como o meio utilizado no primeiro meio de cultura celular. As técnicas para medir o aumento de ARNm e/ou proteína são bem conhecidos no campo, e são referidos supra.

[088] Os termos "colheita" e "coleta"são aqui utilizados para se referir ao processo de recolha das células expandidas para utilização em terapia. Técnicas convencionais para a remoção de células a partir de balões e fábricas de cultura celular podem ser utilizadas. Por exemplo, é sabido que a tripsina pode ser utilizada para remover as células aderentes a partir de frascos de cultura celular de plástico. Um método preferido envolve a remoção do segundo meio de cultura celular a partir da fábrica de células por aspiração; lavagem das células com PBS; acrescentando TrypLE™ Select (Life Technologies Inc, CA, EUA); incubação a 37°C até que todas as células tenham se destacado, geralmente dentro de 30 minutos, mas em menos de 1 hora. As células são, em seguida, isoladas nos meios. As células são, em seguida, centrifugadas durante 5 minutos a 450g (1500 rpm) e ressuspensas no meio de suspensão adequado e contadas.

[089] As células, no meio de suspensão apropriado, a um número de células apropriado para a terapia, constituem uma composição de terapia celular, conforme aqui definido.

[090] O "meio de suspensão apropriado"dependerá da terapia, via de administração, tipo de célula e semelhantes, mas, tipicamente, o meio de suspensão é uma solução isotônica adequada para utilização intravenosa. De preferência, a solução isotônica compreende ainda cerca de 2% de HSA.

[091] O "número de células apropriado"é novamente dependente da terapia a ser realizada, via de administração, tipo de célula e semelhantes.

[092] Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que, uma vez as células expandidas da presente invenção tenham sido produzidas, elas podem ser armazenadas para utilização posterior. As técnicas para preparar as células da invenção para a criopreservação irão depender da utilização final para as células. Se, por exemplo, a criopreservação é por subcultura, em seguida, as células podem ser recolhidas, como descrito supra, em meios apropriados, por exemplo, DMEM suplementado com 10% de HIFBS e 5 µg/mL de gentamicina, e um volume igual de uma solução de criopreservação de meio de cultura celular de 80%, por exemplo, DMEM suplementado com 10% de HIFBS e 5 µg/mL de gentamicina, mais 20% de DMSO (sulfóxido de dimetila). Alternativamente, se, por exemplo, a criopreservação é para futura administração a paciente, em seguida, as células podem ser recolhidas em uma solução isotônica, que contém, de preferência, 2% de HSA, em seguida, centrifugada e o sobrenadante removido. As células podem ser então ressuspensas em uma solução isotônica e um volume igual de uma solução de criopreservação que compreende, por exemplo, 40% de solução isotônica, 40% de HSA (20% de solução) e 20% de DMSO. As células são, inicialmente, arrefecidas a 2-8°C, em seguida, taxa controlada congelada a -160°C.

[093] O procedimento para o descongelamento das células irá novamente depender da utilização final. Por exemplo, as células de descongelamento que estão sendo cultivadas, tipicamente, envolve a descongelação rápida em um banho de água contendo solução salina estéril, pré-aquecida a 36- 40°C, até quase descongelada. As células são, em seguida, lavadas em PBS, centrifugadas a 450g (1500 rpm) durante 5 minutos e ressuspensas em meios para obter a concentração de células desejada.

[094] Para a utilização no paciente, as células criopreservadas são descongeladas rapidamente em banho- maria contendo solução salina estéril, pré-aquecida a 36 40°C, até quase descongelada. As células são, então, diluídas com uma quantidade igual de uma solução isotônica e infundidas dentro de 5 horas de descongelamento.

[095] Conforme descrito acima, os métodos da presente invenção podem ser utilizados em células alogênicas ou autólogas. Assim, em algumas formas de realização, o "doador"é um doador compatível, enquanto que em outras formas de realização do "doador"não é compatível. Por exemplo, o doador pode ter uma compatibilidade de tecido de menos do que ou igual a 50% para o paciente, mas em outras circunstâncias não haverá compatibilidade nenhuma, isto é, doador alogênico.

[096] Em algumas formas de realização, as células da presente invenção são misturadas com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. A frase "farmaceuticamente aceitável" é aqui empregue para referir àqueles compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do âmbito do são juízo médico, adequadas para utilização em contato com os tecidos de seres humanos e animais, sem excessiva toxicidade, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, comensurável com uma relação benefício/risco razoável.

[097] A frase "veículo farmaceuticamente aceitável", tal como aqui utilizada, significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um enchimento líquido ou sólido, diluente, excipiente ou material de encapsulação de solvente, envolvido em carregar ou transportar as células objeto a partir de um órgão, ou porção do corpo, para outro órgão, ou porção do corpo. Cada veículo deve ser "aceitável"no sentido de ser compatível com os outros ingredientes do material a ser administrado e não prejudicial para o paciente.

[098] O veículo farmaceuticamente aceitável pode compreender um meio de cultura celular que suporta a viabilidade das células. O meio será, geralmente, livre de soro, a fim de não provocar uma resposta imunológica no receptor. O veículo será, geralmente, tamponado e/ou livre de pirogênio.

[099] Os veículos e diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina, soluções tampão aquosas, solventes e/ou meios de dispersão. A utilização de tais veículos e diluentes é bem conhecida na técnica. A solução é, de preferência, esterilizada e fluida na medida em que exista uma fácil seringabilidade. Em muitas formas de realização, a solução é estável sob as condições de fabricação e armazenagem e preservada contra a ação contaminante de microrganismos, tal como bactérias e fungos, através da utilização de, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal. Esta lista é fornecida a título de ilustração unicamente, e não se destina a ser limitativa. As soluções que são as composições celulares da invenção podem ser preparadas por incorporação de células, tal como aqui descrito, em um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável e, se necessário, outros ingredientes enumerados acima, que tenham sido esterilizados por filtração.

[100] Alguns exemplos de materiais e soluções que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, tal como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tal como amido de milho e amido de batata; (3) celulose, e seus derivados, tal como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tal como manteiga de cacau e ceras para supositórios; (9) óleos, tal como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de sésamo, azeite, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tal como propilenoglicol; (11) polióis, tal como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; (12) ésteres, tal como oleato de etila e laurato de etila; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tal como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água isenta de pirogênio; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções de pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; e (22) outras substâncias compatíveis não tóxicas utilizadas em formulações farmacêuticas. Esta lista é fornecida a título de ilustração unicamente, e não se destina a ser limitativa.

[101] Uma vez que as células foram preparadas como aqui descrito, em seguida, elas podem ser utilizadas em terapia para o tratamento de pacientes. Em geral, os termos "tratar", "tratamento" e similares são aqui utilizados para significar afetar um indivíduo ou animal, seus tecidos ou células para se obter uma ação farmacológica e/ou efeito fisiológico desejados. O efeito é, especialmente, terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa de uma doença e/ou distúrbio. "Tratar", tal como aqui utilizado, cobre qualquer tratamento de uma condição e/ou distúrbio em um vertebrado, um mamífero, particularmente um humano, e inclui: (a) inibir o estado e/ou distúrbio, ou seja, deter o seu desenvolvimento; ou (b) aliviar ou melhorar os sintomas da condição e/ou distúrbio.

[102] Os termos "condição"e/ou "distúrbio" são aqui utilizados alternadamente e referem-se a condições anormais que afetam os animais, incluindo os seres humanos, que podem ser tratadas utilizando as células da presente invenção.

[103] Como descrito ao longo da especificação, as células da presente invenção são, particularmente, adequadas para terapias celulares, incluindo a indução de reparação/regeneração de tecidos in vivo. Por conseguinte, a invenção proporciona um método de tratamento de um paciente, em que o método compreende administrar células da invenção para o paciente em uma quantidade apropriada.

[104] Geralmente, as células da presente invenção ou sua progénie são introduzidas no corpo do paciente através de infusão, injeção ou implantação. As células podem ser infundidas ou diretamente injetadas ou implantados no tecido em que se destinam a atuar. Uma seringa contendo as células da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável está incluído dentro do âmbito da invenção. Um cateter ligado a uma seringa contendo as células da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável está incluído dentro do âmbito da invenção.

[105] Conforme discutido acima, as células da invenção podem ser utilizadas na regeneração do tecido. A fim de alcançar esta função, as células podem ser injetadas ou implantadas diretamente no tecido danificado, onde exercem uma ação, podem multiplicar-se e, eventualmente, podem diferenciar-se em células do tipo necessário, de acordo com a sua localização no corpo. Os tecidos que são susceptíveis de tratamento incluem todos os tecidos danificados, particularmente incluindo os que podem ter sido danificados por doença, lesão, trauma, uma reação autoimune, ou por uma infecção viral ou bacteriana.

[106] Em uma forma de realização, as células da invenção ou progénie da mesma, quer em solução, em microesferas ou micropartículas de uma variedade de composições, será administrada na artéria, irrigando o tecido ou parte do órgão danificado com necessidade de regeneração. Geralmente, essa administração será realizada utilizando um cateter. O cateter pode ser de uma das grandes variedades de cateteres de balão utilizados para angioplastia e/ou distribuição de célula ou um cateter concebido para a finalidade específica de entregar as células para um determinado local do corpo. Embora as células exibam um forte tropismo para certos tecidos (por exemplo, miocárdio) para certas indicações, pode ser desejável notar que a maioria das células administradas ao paciente não atravessam a rede capilar e para a circulação sistêmica. Para certas utilizações, as células podem ser encapsuladas dentro de microesferas feitas de um número de diferentes compostos biodegradáveis, e com um diâmetro de cerca de 15 µm. Este método pode permitir que células administradas por via intravascular permaneçam no local da lesão, e não atravessem da rede capilar e para a circulação sistêmica na primeira passagem. A retenção no lado arterial da rede capilar pode também facilitar a sua translocação para o espaço extra vascular.

[107] Em uma outra forma de realização, as células podem ser injetadas retrógradas na árvore vascular, quer através de uma veia para liberá-las para o corpo inteiro ou localmente na veia particular que drena para o tecido ou parte do corpo ao qual as células são direcionadas. Para esta forma de realização, muitas das preparações descritas acima podem ser utilizadas.

[108] Uma forma de realização alternativa para o tratamento do miocárdio é uma injeção transcateter de forma transendocardíaca, com ou sem mapeamento elétrico com um sistema tal como o sistema Noga ou qualquer sistema de injeção semelhante.

[109] Em uma outra forma de realização, as células da presente invenção, ou sua progénie, podem ser implantadas no tecido danificado aderido a um implante biocompatível. Dentro desta forma de realização, as células podem ser aderidas ao implante biocompatível in vitro, antes da implantação no paciente. Como será claro para uma pessoa técnica no assunto, qualquer um de um número de aderentes pode ser utilizado para fazer aderir a células para o implante, antes da implantação. A título apenas de exemplo, tais aderentes podem incluir fibrina, um ou mais membros da família da integrina, um ou mais membros da família da caderina, um ou mais membros da família das selectinas, uma ou mais moléculas de adesão celular (CAMs), uma ou mais da família das imunoglobulinas e um ou mais aderentes artificiais. Esta lista é fornecida a título de ilustração unicamente, e não se destina a ser limitativa. Será claro, para uma pessoa técnica no assunto, que qualquer combinação de um ou mais aderentes pode ser utilizada.

[110] Em uma outra forma de realização, as células da presente invenção, ou sua progénie, podem ser incorporadas em uma matriz, antes da implantação da matriz para o paciente. Geralmente, a matriz vai ser implantada no tecido danificado do paciente. Exemplos de matrizes incluem matrizes à base de colágeno, matrizes à base de fibrina, matrizes à base de laminina, matrizes à base de fibronectina e matrizes artificiais. Esta lista é fornecida a título de ilustração unicamente, e não se destina a ser limitativa.

[111] Em uma outra forma de realização, as células da presente invenção, ou sua progénie, podem ser implantadas ou injetadas no paciente em conjunto com um componente formador de matriz. Isto pode permitir as células a formar uma matriz após a injeção ou implante, assegurando que as células permaneçam no local apropriado dentro do paciente. Exemplos de componentes formadores de matriz incluem alquil líquido de cola de fibrina, os monômeros de cianoacrilato, plastificantes, polissacarídeos tal como dextrano, oligômeros contendo óxido de etileno, copolímeros em bloco, tal como poloxâmero e Pluronics, tensoativos não iônicos tal como Tween e Triton '8' e componentes formadores de matriz artificial. Esta lista é fornecida a título de ilustração unicamente, e não se destina a ser limitativa. Será claro para uma pessoa técnica no assunto, que qualquer combinação de componentes que formam uma ou mais matrizes pode ser utilizada.

[112] Em uma outra forma de realização, as células da presente invenção, ou sua progénie, podem estar contidas dentro de uma microesfera. Dentro desta forma de realização, as células podem ser encapsuladas dentro do centro da microesfera. Também, dentro desta forma de realização, as células podem ser incorporadas no material da matriz da microesfera. O material da matriz pode incluir qualquer polímero biodegradável apropriado, incluindo, mas não se limitando a alginatos, polietilenoglicol (PLGA) e poliuretanos. Esta lista é fornecida a título de exemplo apenas, e não se destina a ser limitativa.

[113] Em uma outra forma de realização, as células da presente invenção, ou sua progénie, podem ser aderidas a um dispositivo médico destinado a ser implantado. Exemplos de tais dispositivos médicos incluem stents, pinos, pontos, splits, marca-passos, articulações protéticas, pele artificial e hastes. Esta lista é fornecida a título de ilustração unicamente, e não se destina a ser limitativa. Será evidente para um técnico no assunto, que as células podem ser aderidas ao dispositivo médico por uma variedade de métodos. Por exemplo, as células podem ser aderidas ao dispositivo médico através de fibrina, um ou mais membros da família da integrina, um ou mais membros da família da caderina, um ou mais membros da família das selectinas, uma ou mais moléculas de adesão celular (CAMs), uma ou mais da família das imunoglobulinas e um ou mais aderentes artificiais. Esta lista é fornecida a título de ilustração unicamente, e não se destina a ser limitativa. Será claro para uma pessoa técnica no assunto, que qualquer combinação de um ou mais aderentes pode ser utilizada.

[114] Em uma outra forma de realização, as células da invenção podem ser administradas na circulação periférica e, através do seu tropismo, para o tecido de origem, pode ser esperado que as células retornarão para o órgão/tecido a ser tratado.

[115] Tal como descrito acima, para utilização em medicina, as células serão administradas ao paciente em uma quantidade terapeuticamente eficaz. O número de células a ser entregues in vivo ou ex vivo pode ser baseado em um número de parâmetros, incluindo: o peso corporal do paciente, a gravidade dos danos do tecido, bem como o número de células sobreviventes dentro do indivíduo. Um número típico de células pode ser de cerca de 106 a 109 células. Pode ser necessário repetir a infusão, injeção ou implantação das células durante vários anos para atingir a massa total cumulativa necessária e/ou para substituir as células que estão morrendo. Geralmente, o número total de células entregues ao paciente em um único regime de tratamento será maior do que cerca de 1 x 106. No entanto, o número total de células entregues pode ser maior do que 1 x 1010. O paciente ou receptor irá, normalmente, receber, pelo menos, uma dose de células. De preferência, o paciente ou receptor receberá, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais doses.

[116] As células podem ser dadas como uma dose única, múltiplas doses, durante período de tempo definido, ou até, e incluindo, a dose de manutenção crônica de rotina. As doses de células irão, tipicamente, ser espaçadas. Por exemplo, as doses podem ser de 1 a 2 dias de intervalo ou semanalmente ou mensalmente. Em algumas formas de realização, as doses são por semana, durante 4 semanas.

[117] Além disso, no âmbito da invenção, as células isoladas da presente invenção são utilizadas na fabricação de um medicamento para utilização na regeneração do tecido ou terapia celular, incluindo, mas não se limitando a doença de Crohn, doença do enxerto contra hospedeiro, regeneração do fígado, certas áreas do sistema nervoso, tal como aquelas associadas com a doença de Parkinson, e o pâncreas. Tal regeneração pode permitir o tratamento da doença de Parkinson, diabetes tipo II, úlceras crônicas da pele, e distúrbios autoimunes. As células da presente invenção também podem ser utilizadas para tratar glioma primário de alto grau ou tumores cerebrais recorrentes de menor grau, tal como glioma, ependimoma, meduloblastoma ou tumores teratogênicos, doença arterial periférica grave, reparação de tendão, mieloma múltiplo, leucemia, danos da córnea, esclerodermia, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico (LES), vasculite, doença de Behcet, osteoartrite, reparação da cartilagem e artrite reumatoide. Esta lista é fornecida a título de ilustração, e não se destina a ser limitativa.

[118] As células da presente invenção também podem ser aplicadas a qualquer um de uma ampla variedade de superfícies de contato com dispositivos médicos. Superfícies de contato incluem, mas não estão limitadas a superfícies que se destinam a contatar as células do sangue, ou outros fluidos corporais ou tecidos de um animal, incluindo, especificamente, as humanas. As superfícies de contato adequadas incluem uma ou mais superfícies de dispositivos médicos que são destinadas a contatar sangue ou outros tecidos. Os dispositivos médicos incluem bobinas de aneurisma, vasos sanguíneos artificiais, corações artificiais, válvulas artificiais, rins artificiais, tendões e ligamentos artificiais, bolsas de sangue, oxigenadores de sangue, substituições ósseas e cardiovasculares, próteses ósseas, ceras ósseas, enxertos cardiovasculares, dispositivos de substituição de cartilagem, cateteres, lentes de contato, recipientes para cultura e regeneração de células e tecidos, partículas de embolização, sistemas de filtração, enxertos, canais de guia, cateteres, instrumentos de laboratório, microesferas, guias de crescimento de nervo, implantes oftálmicos, implantes ortopédicos, marca-passo, sondas, próteses, shunts, stents, suportes para peptídeos, instrumentos cirúrgicos, suturas, seringas, substituições das vias urinárias, coberturas para feridas, curativos para feridas, dispositivos de cicatrização de feridas e outros dispositivos médicos conhecidos na técnica.

[119] Outros exemplos de dispositivos médicos que se beneficiariam com a aplicação da presente invenção serão prontamente evidentes para os técnicos no assunto dos procedimentos cirúrgicos e médicos e, portanto, são contemplados pela presente invenção. A superfície de contato pode incluir uma malha, bobina, fio, balão inflável ou qualquer outra estrutura que seja capaz de ser implantada em um local alvo, incluindo locais intravasculares, locais intralumenais, locais dentro de tecido sólido e similares. O dispositivo implantável pode ser destinado para a implantação permanente ou temporária. Tais dispositivos podem ser entregues por, ou incorporados em, cateteres intravasculares e outros cateteres médicos.

[120] Além disso, as células expandidas podem ser fornecidas sob a forma de um kit, sistema ou pacote de procedimento, contendo produtos terapêuticos embalados individualmente e pode incluir combinações de medicamentos, dispositivos médicos e biológicos.

[121] Por "compreendendo" significa incluindo, mas não limitado a, ao que quer que siga a palavra "compreendendo". Assim, a utilização do termo "compreendendo" significa que os elementos listados são necessários ou obrigatório, mas que outros elementos são opcionais e podem ou não pode estar presente. Por "consiste em", se entende incluindo e limitado a, ao que quer que siga a frase "consiste em". Assim, a frase "consiste em", indica que os elementos enumerados são necessários ou obrigatórios, e que não há outros elementos que possam estar presentes. Por "consistindo essencialmente de", se entende incluindo quaisquer elementos listados após a expressão, e limitado a outros elementos que não interfiram com, ou contribuam, para a atividade ou ação especificada na divulgação dos elementos listados. Assim, a expressão "consistindo essencialmente de", indica que os referidos elementos são necessários ou obrigatórios, mas que outros elementos são opcionais e podem ou não estar presente, dependendo se afetam ou não a atividade ou a ação dos elementos listados.

[122] A invenção será agora, adicionalmente, descrita por meio de referência apenas aos seguintes exemplos não limitativos. Deve ser entendido, no entanto, que os exemplos que se seguem são apenas ilustrativos, e não deve ser tomado de qualquer maneira como uma restrição à generalidade da invenção descrita acima.

Exemplo 1 - Processo de Fabricação de Células Estromais Mesenquimais (MSC) da Invenção

[123] Células mononucleares da medula óssea foram separadas por centrifugação em gradiente de densidade e as células lavadas foram ressuspensas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen, Austrália) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (SABC Biosciences, Austrália) (um exemplo representativo do "primeiro meio de cultura celular" da presente invenção, tal como aqui descrito) e plaqueadas a uma densidade de 160.000 células por cm2.

[124] As culturas foram mantidas a 37°C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2 durante 18-72 h, antes das células aderentes serem lavadas com PBS (DKSH, Austrália) e os primeiros meios frescos substituídos por cultura contínua. As células foram cultivadas até 80-90% de confluência com meios trocados a cada 3-4 dias e, em seguida, passados utilizando TrypLE Select (Invitrogen, Austrália) e ressemeadas a uma densidade de 5000 células/cm2 em fábricas CellSTACK (Corning, EUA). Após a expansão, geralmente na passagem 2 ou 3, o meio compreendendo FBS foi removido e substituído com meio de Eagle modificado por Dulbecco isento de vermelho de fenol (Invitrogen, Austrália) suplementado com albumina de 2% de soro humano (HSA) (ARCBS) (um exemplo representativo de um "segundo meio de cultura celular" da presente invenção, tal como aqui descrito). As MSCs produzidas por este método foram, depois, incubadas a 37°C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2 durante 24 h. As células foram então colhidas e administradas ou criopreservadas em 10% de sulfóxido de dimetila (WAK-Chemie, Alemanha), 50% de Plasma-Lyte (Baxter Health Care, Sydney, Austrália), 20% de solução de cloreto de sódio e 20% de albumina de soro humano e armazenada a -196°C. a expansão celular foi limitada a passagem 5 com análise citogenética realizada na passagem final. As células foram preparadas para permitir a doses de 1-10 x 10 células/kg de peso corporal do paciente.

[125] MSC foram consideradas disponíveis para utilização clínica desde que cumpridos os seguintes critérios de liberação: teste de micro-contaminação do produto final pela cultura aeróbia e anaeróbia (Bactec plus aerobe/F e Bactec plus anaerobe/F, BD) foi negativo, a viabilidade celular em exclusão por trypan blue foi maior do que 70% e havia expressão de imunofenotipagem de MSC característica (expressão de CD73, CD90 e CD105 e isenção de expressão de CD45, CD34 e CD14), tal como analisado por citometria de fluxo em uma máquina de FACS Canto, utilizando o software FACS Diva.

Exemplo 2 - Expressão de superfície celular

[126] A fenotipagem da superfície celular foi realizada por meio de painéis de triagem da Becton Dickinson BD Lyoplate™, que são os primeiros sistemas completos disponíveis para o perfil eficiente de centenas de marcadores da superfície celular de murino e humanos por citometria de fluxo ou geração de bioimagem. Os painéis foram utilizados, seguindo as instruções dos fabricantes. As células da presente invenção foram produzidas utilizando a metodologia descrita no Exemplo 1 e como um comparador outras amostras de MSC foram cultivadas durante o mesmo período de tempo como no Exemplo 1, mas sem o passo final de cultura na presença de albumina de soro humano. A expressão de 242 marcadores foi então pesquisada através de citometria de fluxo de alto rendimento e verificou-se que uma série de marcadores de superfície celular foram diferencialmente expressos. Por exemplo, CD54, CD61, CD89, CD201 e CD140A tiveram expressão aumentada em células cultivadas em meio contendo albumina de soro humano, em comparação com meio contendo soro bovino fetal. Estes marcadores são, principalmente, marcadores de adesão.

Exemplo 3 - Utilização de Células Estromais Mesenquimais da Invenção em Terapia para Esteroide- Refratária Aguda e Doença do Enxerto contra hospedeiro Crônica

[127] Avanços significativos na compreensão da biologia, e na prevenção e tratamento da doença de enxerto contra hospedeiro (DECH) têm sido feitas ao longo das duas últimas décadas, levando à introdução de agentes de segunda linha, tal como o fator de necrose antitumoral (TNF) e anti-CD25 biológicos. No entanto, o prognóstico para DECH esteroide-refratária aguda permanece ruim com a sobrevivência de cerca de 20% a longo prazo (Deeg, (2007), Blood, 109(10):4119-26). A incidência de DECH aguda graus II-IV é de, aproximadamente, 50% após o transplante alogênico de células estaminais hematopoiéticas (HSCT). O tratamento padrão é com doses elevadas de corticosteroides, geralmente metilprednisolona 2 mg/kg IV ou equivalente por via oral, o que induz a uma resposta completa durável em cerca de 30-40% dos pacientes (MacMillan et al., (2002), Biol. Blood Marrow Transplant; 8. (7): 387-94). Com DECH esteroide-refratária crônica (DECH CRÔNICA), a sobrevivência a longo prazo é diminuída e morbidades incapacitante são comuns.

[128] Investigou-se se as MSCs produzidas pelo método do Exemplo 1 foram capazes de tratar a doença enxerto contra hospedeiro esteroide-refratária aguda e crônica.

[129] Entre março de 2007 e julho de 2010, os pacientes com aguda e DECHAc que assinaram o consentimento informado serem elegíveis para receber MSC em um ensaio clínico de segurança de fase 1 de instituição única. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Royal Hospital Perth e concedeu uma Notificação de Ensaios clínicos (CTN) pela autoridade reguladora australiana, o Therapeutics Goods Administration (TGA). O julgamento foi inscrito no Registro de Ensaios Clínicos da Austrália e Nova Zelândia (ANZCTR12610000068066).

[130] Todos os pacientes transplantados de forma alogênica receberam profilaxia contra a DECH aguda com um inibidor da calcineurina e 4 doses de metotrexato. O condicionamento pré-transplante foi mieloablativo em 14 pacientes e não-mieloablativo em 7 pacientes. A fonte de células estaminais hematopoiéticas foi células do sangue periférico mobilizadas em todos os pacientes.

[131] Pacientes com DECH aguda com idades entre 18 anos ou mais eram elegíveis para o estudo se os graus de DECH aguda II-IV tiver falhado em responder ou progrediu após o tratamento de 7 dias com a infusão intravenosa de metilprednisolona 2 mg/kg ou prednisolona oral de 2,5 mg/kg. DECH aguda foi avaliada pela classificação do consenso (Przepiorka et al. (1995), Bone Marrow Transplant; 15 (6):825-8). Todos os pacientes continuaram com a terapia esteroide e um inibidor da calcineurina e todos começaram a terapia de segunda linha concomitante com etanercept 25 mg, por via subcutânea, duas vezes por semana. Etanercept é um receptor 2 de TNFa solúvel dimérico, que compete pela ligação do TNF e torna TNF inativo. Foi necessário um diagnóstico confirmado por biópsia de DECH aguda para a entrada do ensaio. Pacientes com baixa capacidade de desempenho, que não eram esperados sobreviver 7 dias, foram excluídos.

[132] Os pacientes com DECH crônica tiveram doença extensa apesar da prednisolona 2,5 mg/kg e um inibidor da calcineurina e micofenolato habitualmente recebidos, mas não eram obrigados a fazê-lo como parte do protocolo. Eles foram classificados de acordo com os Critérios NIH de consenso com o (s) principal (is) órgão (ãos) alvo ter (ndo) uma pontuação de 2 ou mais (Filipovich et al., (2005), Biol Blood Marrow Transplant; 11(12):945-56).

[133] O desfecho primário do estudo foi a segurança, e os desfechos secundários foram melhor resposta e sobrevida global. Para DECH aguda, resposta completa foi a perda de todos os sintomas e sinais de DECH aguda, e resposta parcial foi, pelo menos, uma melhoria de um grau ou mais. Para DECH crônica, resposta completa foi como para a DECH aguda e resposta parcial foi um melhoramento na pontuação de consenso de NIH de pelo menos 1 (Filipovich et al., (2005), supra).

[134] Os doadores eram obrigados a ter menos de 60 anos de idade, não ter comorbidades médicas e assinar o consentimento informado. Eles também tinham que ter marcadores de doenças infecciosas negativos, conforme exigido pela TGA para doação de sangue e tecidos.

[135] Dezenove pacientes foram incluídos entre janeiro de 2007 e junho de 2010, 12 com DECH aguda e 7 com DECH crônica. As características do paciente e resposta são mostradas na Tabela 1 para DECH aguda e na Tabela 2 para DECH crônica. Tabela 1 - Características e Resposta de Indivíduos com DECH aguda MUD: doador compatível não aparentado, Sib: irmão compatível, Cy: ciclofosfamida, TBI: irradiação total do corpo, Bu: busulfan, Mel: melfalano, Flu: fludarabina, M: mieloablativo, NM: não-mieloablativo, CALL: leucemia linfoblástica aguda comum, MDS: mielodisplasia, CLL: leucemia linfocítica crônica, AML: leucemia mieloide aguda, NHL: linfoma de não-Hodgkin, RAEBT: anemia refratária com excesso de blastos em transformação, CML BC: leucemia mieloide crônica em crise explosão, PRV: policitemia rubra vera, MF: mielofibrose, CR: completa, PR: parcial. Tabela 2 - Características e resposta do indivíduo com DECH crônica MUD: doador compatível não aparentado, Sib: irmão compatível, Haploide: haploidentico, Bu: busulfan, Mel: melfalano, Cy: ciclofosfamida, TBI: irradiação total do corpo, AML: leucemia mieloide aguda, ALL: leucemia linfoblástica aguda positiva de Philadelphia, CML BC: leucemia mieloide crônica em crise blástica, OB: bronquiolite obliterante, KCS: ceratoconjuntivite seca, CR: resposta completa, PR: parcial.

[136] Todos os pacientes tiveram uma malignidade hematológica. Os pacientes que receberam um transplante de doador compatível não aparentado representaram 10 dos 12 com DECH aguda e 2 de 7 com DECH crônica.

[137] Inicialmente, os pacientes receberam 8 infusões de MSC, duas vezes por semana, durante 4 semanas, por via intravenosa, quer como pacientes internados no caso de DECH aguda quer em um centro diurno para os pacientes com DECH crônica e foram monitorados relativamente a reações relacionadas com a perfusão. Posteriormente, após a publicação de um estudo randomizado comparando duas doses da MSC para DECH aguda (Kebriaei et al., 2009), Biol Blood Marrow Transplant; 15(7):804-11), uma emenda do ensaio foi feita para duas infusões em intervalos semanais e nove pacientes receberam infusões com base nisso. Os pacientes que atingiram, mas não mantiveram uma resposta completa, foram elegíveis para o retratamento com duas infusões em intervalos semanais. A resposta completa foi a perda de todos os sinais de DECH, resposta parcial foi melhoria de um nível, doença estável houve alteração nos sintomas ou sinais de DECH, e a progressão foi uma deterioração em um grau ou mais.

[138] A segurança foi avaliada pela observação do paciente durante 4 h após cada infusão, monitoramento de sinais vitais para reações de infusão. Os pacientes também foram convidados, em visitas posteriores para infusão, sobre os sintomas experimentados durante o intervalo após a perfusão anterior e monitorados para eventos adversos em forma regular e acompanhamento constante.

[139] Tendo em conta que este foi um estudo de fase I, restringimos os métodos estatísticos para métodos descritivos que indicam a experiência geral dos pacientes estratificados em categorias agudas e crônicas. A sobrevida foi descrita como o tempo desde a primeira infusão de MSC. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar o tempo de sobrevivência, separadamente, para casos agudos e crônicos. O teste de log-rank não paramétrico foi utilizado para examinar as diferenças na sobrevivência entre os grupos e para examinar as tendências nos padrões de sobrevivência para grupos ordenados.

[140] MSCs para este estudo foram obtidas a partir de um aspirado de medula óssea de um total de 16 membros da família haploidênticos ou HLA-incompatíveis, doadores aparentados ou não aparentados. MSCs foram fabricadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1.

[141] Um total de 109 infusões foram administradas aos 19 pacientes com um número médio de infusões de 2 por paciente. Dois pacientes necessitaram de mais infusões para recaída da DECH aguda com um paciente tendo um episódio de reinfusão e o segundo recebendo 7 infusões ao longo de 3 anos. Seis pacientes com DECH crônica receberam 2 infusões em um episódio de tratamento e um paciente com DECH crônica teve mais de um episódio de tratamento, recebendo um total de 11 infusões. Além de anomalias ligeiras no paladar, devido ao crioprotetor dimetilsulfóxido, notado em vários pacientes, as infusões foram bem toleradas sem toxicidades relacionadas à infusão aguda e sem toxicidade subsequente atribuível a infusão das CTMs observadas.

[142] A resposta pelo órgão envolvido e a resposta geral são mostrados na Tabela 1 para DECH aguda e Tabela 2 para DECH crônica. A taxa de resposta global para a DECH aguda foi completa em 7, parcial em 4, e nenhuma resposta em um paciente. Todos os pacientes que não tiveram uma resposta completa morreram: 5 de infecção oportunista e um de um acidente vascular cerebral hemorrágico. Dos sete pacientes que obtiveram uma resposta completa, 6 estão vivos e um morreu de sepsia bacteriana.

[143] Dois pacientes com DECH crônica atingiram uma resposta completa, enquanto que 2 tiveram respostas parciais e 3 não tiveram resposta. Houveram 5 mortes neste grupo, 3 de bronquiolite obliterante progressiva associada a infecções no peito, um de insuficiência hepática devido a DECH crônica e um de recaída de leucemia linfoblástica aguda. A sobrevivência atuarial de ambos os grupos é mostrada na Figura 1, com sobrevivência de 3 anos de 55% para o grupo agudo e a sobrevivência mediana para DECH crônica de 8 meses. Na DECH aguda, resposta completa foi importante para a sobrevivência. O teste de logrank mostrou que a resposta foi um preditor estatisticamente significativo de sobrevivência para pacientes de DECH aguda (x2 = 11,3, p = 0,0008) (Figura 2a), mas não para os casos crônicos (x2 = 2,79, p = 0,100) (Figura 2b).

[144] Este estudo relata a infusão segura de 109 doses de MSC derivada de doador cultivadas e armazenadas sob condições GMP. A falta de toxicidade relacionada com a perfusão inicial e tardia reflete tanto na qualidade dos produtos fabricados como no estado imunológico privilegiado inato da MSC. Em resumo, não se identificou nenhuma problema de segurança, precocemente ou tardiamente no nosso grupo de 1 pacientes.

Exemplo 4 - Utilização de Células Estromais Mesenquimais Alogênicas da Invenção em Terapia para a Doença de Crohn Luminal Refratária à Terapia Biológica

[145] Apesar do advento da terapia biológica para a doença de Crohn (CD), cerca de um quarto dos pacientes ainda precisam de cirurgia abdominal principal dentro de cinco anos após o diagnóstico 1. A fim de evitar a cirurgia, terapia celular por transplante de medula óssea ou células estaminais do sangue periférico, tanto alogênicas quanto autólogas, tem sido utilizada com sucesso em pequenos números de pacientes, mas requer terapia mieloablativa ou mobilização de células estaminais hematopoiéticas antes (Hommes et al. (2011), J Crohn Colite; 5:543-549).

[146] Em contraste, as MSCs são células estaminais multipotentes adultas que são consideradas não terem imunogenicidade e, portanto, escapam do reconhecimento imunológico; elas têm baixo nível de expressão de HLA de classe I, carecem de antígeno de HLA de classe II e não expressam moléculas co-estimuladoras.

[147] Por conseguinte, na administração alogênica, o a compatibilidade de doador a receptor não é nem necessária, nem condicionado da medula quimioterapêutico (Le Blanc et al., (2003), Exp Hematol; 31:890-896).

[148] Como foi demonstrado supra no Exemplo 2, as MSCs da nossa invenção trataram com sucesso DECH refratário esteroide. Colocamos a hipótese de que as nossas MCSs também poderiam ser utilizadas para tratar a doença de Crohn luminal que foi refratário a outra terapia biológica.

[149] Nosso estudo de fase 2, aberto, multi-centro incluiu 16 pacientes (21-55 anos de idade; 6 do sexo masculino) com refratário de infliximab ou adalimumab, confirmado por endoscopia, CD luminal ativa (índice de atividade de CD [CDAI] >250). Foram dadas aos indivíduos infusões intravenosas de MSC alogênica, conforme preparado no Exemplo 1 (2 X 106células/kg de peso corporal) por semana, durante 4 semanas. O desfecho primário foi a resposta clínica (diminuição no CDAI > 100 pontos) 42 dias após a primeira administração de MSC; desfechis secundários foram remissão clínica (CDAI <150), melhoria endoscópica (um índice de CD endoscópico da gravidade [CDEIS] valor <3 ou uma diminuição de > 5), qualidade de vida, nível de proteína C-reativa, e segurança.

[150] Os seguintes critérios de inclusão aplicaram: CD intestinal do cólon ou delgado (com base em endoscopia e histologia); CDAI >250; doença ativa por via endoscópica; doença refratária à indução com infliximab ou adalimumab, ou perda de resposta para ambos, ou efeitos colaterais a um ou ambos esses medicamentos que impossibilitam a utilização posterior. A falha para induzir a remissão foi definida como a falha de remissão clínica quatro semanas depois de um mínimo de três doses de infliximab (5 mg/kg) às 0, 2 e 6 semanas; ou três doses de adalimumab (160 mg, semana 0, 80 mg, semana 2; 40 mg, semana 4). Os seguintes critérios de exclusão foram aplicados: doença de restrição crônica sem inflamação; entero-colite bacteriana co-existente ou infecção pelo citomegalovírus (CMV); malignidade prévia; gravidez ou relutante ao controle de natalidade durante o tratamento; amamentação; estoma (CDAI não mensurável); ou sepse ativo, incluindo sepse perianal ou doença perfurante. O seguinte foi aplicado sobre a terapêutica concomitante de fármacos: último biológico (infliximab ou adalimumab) quatro ou mais semanas antes; e entre t = -14 dias e o dia 42, doses estáveis de corticosteroides (variação dentro de 10 mg de prednisolona), imunomodulador (azatioprina, 6- mercaptopurina, metotrexato) ou antidiarreico.

[151] Dentre os 15 pacientes que completaram o estudo, a pontuação CDAI média foi reduzida de 370 (média de 327; intervalo, 256-603) a 203 (média de 129) no dia 42 (<0,0001). A pontuação CDAI média diminuiu após cada infusão de MSC (370 antes da administração, 269no dia 7, 240 no dia 14, 209 no dia 21, 182 no dia 28 e 203 no dia 42) . A Figura 3 mostra o Índice de Atividade da Doença de Crohn (Activity Crohn Disease) (CDAI) médio durante o período de estudo. Doze pacientes tiveram uma resposta clínica (80%; 95% intervalo de confiança, 72%-88%; redução média na CDAI, 211; intervalo 102-367), 8 tiveram remissão clínica (53%; intervalo, 43% - 64%; CDAI média no dia 42, 94; intervalo 44-130). A Figura 4 mostra o Índice de Atividade da Doença de Crohn (CDAI) pré e pós-tratamento com MSC. Sete pacientes tiveram melhora endoscópica (47%), para os quais as pontuações CDEIS médias diminuíram de 21,5 (intervalo de 3,3-33) para 11,0 (intervalo, 0,3-18,5). Um paciente teve um grave evento adverso (2 lesões associadas a displasia), mas isso provavelmente não foi causado pelas MSCs.

[152] A Tabela 3 mostra os dados demográficos do estudo, enquanto que as Tabelas 4 e 5 mostram as avaliações de resultados. Tabela 3 * Falha primária de um único biológico; todos os outros pacientes falharam em ambos biológicos. #onde variação da dose de prednisolona é dada, a figura da dose inicial representa dose de entrada no estudo e última figura a dose final do estudo.

[153] Nossos dados sugerem eficácia da MSC alogênica intravenosa em CD luminal. Em 15 pacientes com doença ativa moderada a grave, refratários à terapia anti-TNF, quatro infusões de 2 X 106células/kg, a intervalos semanais, levou a resposta clínica em 12 (80%), a remissão clínica em oito (53%) e melhoria endoscópica em sete (47%). A qualidade de vida melhorada, em paralelo com a melhoria do CDAI (Irvine et al., (1994), Gastroenterol, 106:287-296.). Nossos dados são os primeiros a demonstrar a eficácia para a doença luminal de uma forma convincente.

Claims

1. Método in vitro de cultura de amostras de células estromais mesenquimais para utilização em terapia caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) a cultura de uma amostra de células estromais mesenquimais em um primeiro meio de cultura celular que compreende um primeiro soro, primeiro substituto de soro e/ou primeira fração de soro selecionado do grupo que consiste em soro bovino fetal (FCS) e soro bovino fetal inativado por calor (HIFCS) entre 18h e 72h, e então a substituição do meio com o primeiro meio de cultura fresco para cultura contínua até que as células alcancem 70 a 90% de confluência; e (ii) antes da colheita de células para utilização na terapia, o referido primeiro meio de cultura celular é substituído por um segundo meio de cultura celular que compreende um segundo soro, um segundo substituto do soro e/ou segunda fração de soro, cujo soro ou fração de soro tem a mesma origem de espécie que as células sendo cultivadas, e as células são cultivadas por entre 20 horas a 36 horas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células da etapa (ii) são cultivadas por 20h ou por 21h, ou por 22h, ou por 23h, ou por 24h ou entre 24h a 36h antes da referida colheita para uso.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa (i) compreende a cultura da amostra de células estromais mesenquimais no primeiro meio de cultura de células por entre 18 horas e 72 horas, em seguida, lavar as células aderentes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes do meio ser substituído pelo primeiro meio de cultura de células fresco para cultura contínua até que as células tenham atingido 70% a 90% de confluência.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa (i) compreende a mudança do meio com primeiro meio de cultura fresco a cada 3 a 4 dias até que as células tenham atingido a confluência de 70% a 90%.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as células estromais mesenquimais na etapa (i) são cultivadas até que as células tenham alcançado entre 70% a 85% de confluência.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a amostra de células na etapa (i) compreende entre 1,0 x 103 células por cm2 de recipiente de cultura e 1,0 x 10 células por cm2 de recipiente de cultura.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o fornecimento de uma amostra de células estromais mesenquimais.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a amostra de células estromais mesenquimais compreende células estromais mesenquimais de um doador.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a amostra de células compreende ainda a colheita in vitro das células cultivadas na etapa (ii).

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o primeiro meio e/ou o segundo meio compreende(m) um meio de base selecionado a partir do grupo que consiste em DMEM (alto ou baixo teor de glicose), meio basal de Eagle (MEM), meio F10 de Ham (F10), meio F12 de Ham (F12), meio de Dulbecco modificado por Iscove, M-199, Meio de Crescimento de Célula Tronco Mesenquimatosa (MSCGM), meio L-15 de Liebovitz, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM Advanced (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma) e célula-GRO livre ou uma combinação dos mesmos.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o meio na etapa (i) é DMEM e o meio na etapa (ii) é DMEM livre de vermelho de fenol.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o primeiro soro, primeiro substituto de soro e/ou primeira fração de soro na etapa (i) é soro bovino fetal inativado pelo calor (HIFCS).

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que após a etapa (ii) as referidas células cultivadas expressam um ou mais marcadores de superfície celular selecionados do grupo que consiste em CD54, CD61, CD89, CD140A e CD201.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que após a etapa (ii) as referidas células cultivadas são suspensas em meios adequados para administração terapêutica a um paciente e/ou em que as referidas células são suspensas dentro de uma seringa ou um recipiente flexível.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a amostra de células compreende células estromais mesenquimais humanas.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a amostra de células compreende células estromais mesenquimais de medula óssea.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o segundo soro, segundo substituto de soro e/ou segunda fração de soro na etapa (11) é soro humano ou albumina de soro humano.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o soro humano ou albumina de soro humano é 2% v/v.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o segundo soro, segundo substituto de soro e/ou segunda fração de soro na etapa (i) é albumina de soro humano.

20. Método in vitro de cultura de amostras de células estromais mesenquimais humanas para utilização em terapia celular, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) cultura de amostras de células estromais mesenquimais em um primeiro meio de cultura celular compreendendo DMEM suplementado com soro bovino fetal inativado pelo calor (HIFCS) entre 18h e 72h e, então, substituído com primeiro meio de cultura fresco para cultura continua até que as referidas células alcancem 70 85% de confluência; e (ii) antes da colheita de células para utilização na terapia, o referido primeiro meio de cultura celular é removido e substituído por um segundo meio de cultura celular compreendendo DMEM isento de vermelho de fenol e 2% albumina de soro humano e as células são, então, cultivadas durante um adicional de 24 horas a 36 horas.

21. Método in vitro de cultura de amostras de células estromais mesenquimais humanas para utilização em terapia celular, caracterizadopelo fato de que compreende as etapas de: (i) cultivar uma amostra de entre 1,0 x 103 células por cm2 do recipiente de cultura e 1,0 x 1010 células por cm2 do recipiente de cultura de células estromais mesenquimais em um primeiro meio de cultura celular compreendendo DMEM suplementado com soro bovino fetal inativado pelo calor (HIFCS) entre 18h e 72h e, então, substituído com primeiro meio de cultura fresco para cultura continua até que as referidas células alcancem 70-85% de confluência; e (ii) antes da colheita de células para utilização na terapia, o referido primeiro meio de cultura celular ser removido e substituído por um segundo meio de cultura celular compreendendo DMEM isento de vermelho de fenol e 2% de albumina de soro humano e as células serem, então, cultivadas por um adicional de 24 horas a 36 horas.

22. Método in vitro para a preparação de amostras de células estromais mesenquimais para a terapia celular alogênica em um paciente, caracterizadopelo fato de que compreende as etapas de: (i) promover a cultura de uma amostra de células estromais mesenquimais em que a amostra compreende células estromais mesenquimais de um doador saudável, em um primeiro meio de cultura celular que compreende um primeiro soro, primeiro substituto de soro e/ou primeira fração de soro selecionados do grupo que consiste em soro bovino fetal (FCS) e soro bovino fetal inativado por calor (HIFCS) entre 18h e 72h, e então substituir o meio com o primeiro meio de cultura fresco para cultura continua até que as células alcancem 70 a 90% de confluência; e (ii) antes da colheita de células para utilização na terapia, o referido primeiro meio de cultura celular ser substituído por um segundo meio de cultura celular que compreende um segundo soro, um segundo substituto do soro e/ou segunda fração de soro, o qual soro ou fração de soro tem a mesma origem de espécie que as células na cultura e as células são cultivadas por 24 horas a 36 horas; e (iii) colheita in vitro das células cultivadas na etapa (ii).