JP7108537B2 - Cd201、cd46、cd56、cd147及びcd165からなる群より選択される少なくとも1種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞及びその調製方法、並びに上記間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法 - Google Patents
Cd201、cd46、cd56、cd147及びcd165からなる群より選択される少なくとも1種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞及びその調製方法、並びに上記間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法 Download PDFInfo
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Description
(2)CD29、CD73、CD90、CD105及びCD166陽性である、(1)記載の間葉系幹細胞。
(3)クロスべインレスー2(Crossveinless-2)及びエクトジスプラシン-A2(Ectodysplasin-A2)を分泌する(1)又は(2)記載の間葉系幹細胞。
(4)アクチビンA、Dkk-3、デコリン、HGF、Dkk-1、プログラニュリン、GDF-15、アンジオポエチンー1、CCL28(VIC)、潜在型TGF-β結合タンパク質1(Latent TGF-beta bp1)、GDF1、VEGF-C、BTC(ベタセルリン)、ニドゲン-1(Nidogen-1)、GLO-1(グリオキサラーゼ-1)、sgp130(可溶型gp130)、コルディン様-2(Chordin-Like 2)及びEMAP-IIからなる群より選択される少なくとも1種をさらに分泌する、(1)から(3)のいずれかに記載の間葉系幹細胞。
(5)臍帯、脂肪又は骨髄由来である、(1)から(4)のいずれか記載の間葉系幹細胞。
(6)(1)から(5)のいずれか記載の間葉系幹細胞及び/又はその培養上清を含む、医薬組成物。
(7)医薬組成物が間葉系幹細胞を含む場合、CD201、CD46、CD56、CD147及びCD165からなる群より選択される少なくとも1種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の70%以上である、(6)記載の医薬組成物。
(8)医薬組成物が間葉系幹細胞を含む場合、CD201、CD46、CD56、CD147及びCD165からなる群より選択される少なくとも1種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の90%以上である、(7)記載の医薬組成物。
(9)癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、循環器疾患、心疾患、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患、腎疾患及び口腔疾患からなる群より選択される疾患の予防又は治療のために用いられる、(6)から(8)のいずれか記載の医薬組成物。
(10)癌、前癌性症状、炎症性疾患、循環器疾患、心疾患、肺疾患、肝疾患及び口腔疾患からなる群より選択される疾患の予防又は治療のために用いられる、(9)記載の医薬組成物。
(11)肺癌、心筋炎、心肥大症、動脈硬化、肺・呼吸器炎症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肝炎、肝硬変及び歯周病からなる群より選択される疾患の予防又は治療のために用いられる、(10)記載の医薬組成物。
(12)上皮若しくは内皮のバリア機能の低下に起因する疾患、又はIL-1が関与する疾患の予防又は治療のために用いられる、(6)から(11)のいずれか記載の医薬組成物。
(13)バリア機能の低下が、上皮又は内皮細胞層におけるタイトジャンクション機能の低下に起因する、(12)記載の医薬組成物。
(14)CD201、CD46、CD56、CD147及びCD165からなる群より選択される少なくとも1種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、上記マーカーを発現する間葉系幹細胞の調製方法。
(15)CD201、CD46、CD56、CD147及びCD165からなる群より選択される少なくとも1種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、疾患の予防又は治療のために用いられる医薬組成物の調製方法。
(16)疾患が、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、循環器疾患、心疾患、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患、腎疾患及び口腔疾患からなる群より選択される、(15)記載の医薬組成物の調製方法。
(17)CD201、CD46、CD56、CD147及びCD165からなる群より選択される少なくとも1種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞及び/又はその培養上清を用いる、疾患の予防又は治療方法。
(18)間葉系幹細胞が、CD29、CD73、CD90、CD105及びCD166陽性である、(17)記載の方法。
(19)間葉系幹細胞が、クロスべインレスー2(Crossveinless-2)及びエクトジスプラシン-A2(Ectodysplasin-A2)を分泌する(17)又は(18)記載の方法。
(20)間葉系幹細胞が、アクチビンA、Dkk-3、デコリン、HGF、Dkk-1、プログラニュリン、GDF-15、アンジオポエチンー1、CCL28(VIC)、潜在型TGF-β結合タンパク質1(Latent TGF-beta bp1)、GDF1、VEGF-C、BTC(ベタセルリン)、ニドゲン-1(Nidogen-1)、GLO-1(グリオキサラーゼ-1)、sgp130(可溶型gp130)、コルディン様-2(Chordin-Like 2)及びEMAP-IIからなる群より選択される少なくとも1種をさらに分泌する、(19)記載の方法。
(21)間葉系幹細胞が、臍帯、脂肪又は骨髄由来である、(17)から(20)のいずれかに記載の方法。
(22)疾患が、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、循環器疾患、心疾患、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患、腎疾患及び口腔疾患からなる群より選択される、(17)から(21)のいずれかに記載の方法。
(23)疾患が、癌、前癌性症状、炎症性疾患、循環器疾患、心疾患、肺疾患、肝疾患及び口腔疾患からなる群より選択される、(22)記載の方法。
(24)疾患が、肺癌、心筋炎、心肥大症、動脈硬化、肺・呼吸器炎症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肝炎、肝硬変及び歯周病からなる群より選択される、(23)記載の方法。
(25)疾患が、上皮若しくは内皮のバリア機能の低下に起因する疾患、又はIL-1が関与する疾患である、(17)から(24)のいずれか記載の方法。
(26)バリア機能の低下が、上皮又は内皮細胞層におけるタイトジャンクション機能の低下に起因する(25)記載の方法。
本発明において間葉系幹細胞とは、骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞等の間葉系に属する細胞への分化能を有し、この分化能を維持したまま増殖できる細胞を意味する。例えば骨髄、脂肪、血液、骨膜、真皮、臍帯、胎盤、羊膜、絨毛膜、脱落膜、筋肉、子宮内膜、真皮、歯小嚢、歯根膜、歯髄、歯胚等由来の間葉系幹細胞が挙げられ、好ましくは臍帯由来、脂肪由来、骨髄由来の間葉系幹細胞であり、より好ましくは臍帯由来の間葉系幹細胞である。ここで、「由来」とは、上記細胞が、供給源である組織から獲得され、成長、或いはin vitroで操作された細胞であることを示す。なお、本発明の特定マーカーを発現する間葉系幹細胞は、上記間葉系幹細胞の集合体であり、互いに異なる特性を有する複数種の間葉系幹細胞を含む集合体であってもよいし、実質的に均一な間葉系幹細胞の集合体であってもよい。
特定マーカーを発現する本発明の間葉系幹細胞は、未分化性の指標となるCD29、CD73、CD90、CD105及びCD166を発現している。
本発明における特定マーカーを発現する間葉系幹細胞は、特定マーカー遺伝子に加えて、他の遺伝子発現の有無によって特徴付けられてもよい。本発明の特定マーカーを発現する間葉系幹細胞が発現している遺伝子としては、例えば、MT1X、NID2、CPA4、DKK1、ANKRD1、TIMP3、MMP1、オステオプロテゲリン(Osteoprotegerin;TNFRSF11B)、IGFBP5、SLC14A1等が挙げられる。特定マーカーを発現する本発明の間葉系幹細胞は、MT1X、NID2、CPA4、DKK1、ANKRD1、TIMP3、MMP1、オステオプロテゲリン(Osteoprotegerin;TNFRSF11B)、IGFBP5及びSLC14A1からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子を発現していることが好ましい。より好ましくは2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、さらに好ましくは6種以上、7種以上、8種以上、9種以上の、特に好ましくは、上記の全ての遺伝子を発現している。
特定マーカーを発現する本発明の間葉系幹細胞は、miRNAの発現の有無によってさらに特徴付けられてもよい。本発明の間葉系幹細胞が発現しているmiRNAとしては、例えば、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-503-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-let-7d-5p等が挙げられる。本発明の間葉系幹細胞は、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-503-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-382-5p、及びhsa-let-7d-5pからなる群より選択される少なくとも1種のマイクロRNAを発現していることが好ましい。より好ましくは2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上の、さらに好ましくは7種以上、8種以上、9種以上、10種以上、11種以上、12種以上の、特に好ましくは、上記の全てのマイクロRNAを発現している。
特定マーカーを発現する本発明の間葉系幹細胞は、以下の特定のサイトカイン分泌の有無によってさらに特徴付けられてもよい。本発明の間葉系幹細胞は、クロスべインレス-2(Crossveinless-2)及びエクトジスプラシン-A2(Ectodysplasin-A2)を分泌する。
特定マーカーを発現する本発明の間葉系幹細胞は、骨、脂肪、軟骨への分化能を有する。それぞれの分化能については、当業者に公知の分化誘導条件により上記間葉系幹細胞集団を培養して、判断することができる。
特定マーカーを発現する間葉系幹細胞の調製方法は特に限定されないが、例えば以下のようにして調製することができる。すなわち、臍帯、脂肪組織、骨髄等の組織から、当業者に公知の方法に従って、間葉系幹細胞を分離、培養し、特定マーカーに特異的に結合する抗体(抗CD201抗体、抗CD46抗体、抗CD56抗体、抗CD147抗体及び/又は抗CD165抗体)を用いて、特定マーカー陽性細胞をセルソーター、磁気ビーズ等で分離する等の方法により取得することができる。これらの方法によって得られる細胞集団において、細胞集団の70%以上が特定マーカー陽性であることが好ましく、80%以上が特定マーカー陽性であることがより好ましく、90%以上が特定マーカー陽性であることがさらに好ましく、95%以上が特定マーカー陽性であることが特に好ましく、99%以上が特定マーカー陽性であることが最も好ましい。以下に、特定マーカーを発現する間葉系幹細胞の調製方法を具体的に説明する。
本発明の医薬組成物は、特定マーカーを発現する間葉系幹細胞及び/又はその培養上清を含むことを特徴とする。上述のとおり、特定マーカーを発現する本発明の間葉系幹細胞は、IL-6等の炎症性サイトカインの産生抑制作用等の抗炎症作用、バリア機能亢進作用、抗線維化作用に優れる、といった特性を有する。また、未分化性を維持していると同時に、分化条件下では目的の機能を有する細胞に効率よく分化することができる。このような特定マーカーを発現する間葉系幹細胞及び/又はその培養上清を含む本発明の医薬組成物は、種々の疾患に対する優れた治療効果を奏する。本発明の医薬組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で、特定マーカーを発現する間葉系幹細胞及び/又はその培養上清に加えて、その他の成分を含んでいてもよい。
本発明は、特定マーカーを発現する間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、疾患の予防又は治療のために用いられる医薬組成物の調製方法も含む。上記疾患としては、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、循環器疾患、心疾患、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患、腎疾患及び口腔疾患からなる群より選択される疾患が挙げられる。
(培養上清のバリア機能亢進作用)
特定マーカーを発現する本発明の間葉系幹細胞の培養上清は、特定マーカー陰性の従来の間葉系幹細胞の培養上清と比較して、より優れた細胞のバリア機能亢進効果を示す。即ち、本発明における特定マーカーを発現する間葉系幹細胞の培養上清は、炎症によって障害を受けた細胞のバリア機能を回復させる顕著な効果を有するため、本発明の特定マーカーを発現する間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物は、炎症に関連する疾患の治療に好適に用いることができる。また、特定マーカーを発現する間葉系幹細胞又はその培養上清は、化粧品用組成物、食品用組成物等としても用いることもできる。
特定マーカーを発現する本発明の間葉系幹細胞は、炎症状態において、マクロファージからの炎症性サイトカインの産生を抑制する効果を有する。この効果は、特定マーカー陰性の従来の間葉系幹細胞と比較して、有意に高いものである。そのため、本発明の特定マーカーを発現する間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物は、炎症に関連する疾患の治療に好適に用いることができる。また、特定マーカーを発現する間葉系幹細胞又はその培養上清は、化粧品用組成物、食品用組成物等としても用いることもできる。
特定マーカーを発現する本発明の間葉系幹細胞は、ヒト血管内皮細胞(HUVEC)に対して作用し、線維化に関連する遺伝子であるTGFβ及びCOL3A1の発現を抑制する効果を示す。したがって、本発明の間葉系幹細胞は、血管内皮細胞の線維化が関与する動脈硬化等の疾患に有効であるといえる。
本発明の間葉系幹細胞の培養上清は、ヒト肺上皮癌細胞(A549等)に対して作用し、炎症に関連する遺伝子であるLITAF、線維化に関連する遺伝子であるCOL1A1の発現を抑制する効果を示す。したがって、本発明の間葉系幹細胞は、肺上皮細胞の炎症、線維化が関与する肺・呼吸器炎症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)等の疾患に有効であるといえる。さらに、肺癌に対する効果も期待できる。
本発明の間葉系幹細胞の培養上清は、ヒト肝星細胞(Human Hepatic Stellate Cells;hHsteC)に対して作用し、炎症に関連する遺伝子であるIL-1β、LITAF、IL-8、線維化に関連する遺伝子であるCOL1A1の発現を抑制する効果を示す。したがって、本発明の間葉系幹細胞は、肝星細胞の炎症、線維化が関与する肺・呼吸器炎症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)等の疾患に有効であるといえる。
本発明の間葉系幹細胞の培養上清は、ヒト心筋細胞(Human Cardiac Myocytes;hCM)に対して作用し、炎症に関連する遺伝子であるLITAF、TNFα、線維化に関連する遺伝子であるTGFβの発現を抑制する効果を示す。したがって、本発明の間葉系幹細胞は、心筋細胞の炎症、線維化が関与する心筋炎、心肥大症等の疾患に有効であるといえる。
本発明の間葉系幹細胞の培養上清は、ヒト歯肉線維芽細胞(Human Gingival Fibroblasts;hGF)に対して作用し、炎症に関連する遺伝子であるLITAFの発現を抑制し、線維化に関連する遺伝子であるCOL1A1、COL3A1の発現を増強する効果を示す。hGFについては、歯周病の改善のためには線維化が促進されることが好ましいと考えられる。すなわち、COL1A1、COL3A1の発現が増強される場合、歯周病改善効果があると判断できる。したがって、本発明の間葉系幹細胞は、歯肉線維芽細胞が関与する歯周病等の疾患に有効であるといえる。
臍帯由来間葉系幹細胞(UC-MSC;Umbilical Cord derived Mesenchymal Stem Cells Wharton’s Jelly(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine社)、脂肪由来間葉系幹細胞(AD-MSC;Adipose derived Mesenchymal Stem Cells、FC-0034、LifeLine社)、又は骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC;Bone Marrow derived Mesenchymal Stem Cells, LifeLine社)を、37℃、5%CO2の条件下、LifeLine社推奨培地(以下、単に「推奨培地」ともいう)にて馴化した後、2~3日おきに継代しながら培養を続けた。培養過程の途中で、必要に応じて抗CD201抗体、抗CD46抗体、抗CD56抗体、抗CD147抗体又は抗CD165抗体で染色後、セルソーターによりそれぞれの抗原陽性の細胞を選別する。
(FACS解析)
得られた間葉系幹細胞(臍帯由来、脂肪由来、骨髄由来)について、FACSにてCD201、CD46、CD56、CD147及びCD165の発現を解析した。結果を図1に示す。また、細胞の未分化性を確認する目的で、FACSにて細胞表面マーカー(CD29、CD73、CD90、105及び/又はCD166)の発現を解析した。結果を図2に示す。
上記で得られた特定マーカー発現臍帯由来間葉系幹細胞から常法によりmRNAを調製し、miRNAアレイ(miScript miRNA PCR array;MIHS-105Z及びMIHS-117Z(inflammatory response & autoimmunity及びFibrosis、QIAGEN社製)により、細胞中のmiRNA発現を解析した。同様の実験を2回行った。
本発明のUC-MSC(継代8回目)を1.5×106cells/plateとなるよう100mm plateに播種した。翌日、培地を0.2%FCS含有DMEM/F-12培地(2ml/well)に交換した。48時間後に培養上清を回収した。
[特定マーカー発現臍帯由来間葉系幹細胞培養上清の回収]
上記で得られた特定マーカー発現臍帯由来間葉系幹細胞の継代8回目の細胞を1.5×105cells/wellとなるよう6well plateに播種した。翌日、培地を非馴化培地(10%FCS含有DMEM/F-12培地、2ml/well)に交換した。24時間後に培養上清(Sup-1)を回収し、新しい培地を2ml/well注ぎ、培養を継続した。さらに24時間後に再び培養上清(Sup-2)を回収した。
ヒト結腸癌由来細胞株Caco-2を10%FCS含有DMEM培地で継代培養し、継代数3回目の細胞を本実験に用いた。Caco-2を、トランスウェル(Corning Costar #3460)に6×104cells/wellで播種し、翌日、細胞がトランスウェルに付着していることを確認し、培地を除去した。上記特定マーカー発現臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清(Sup-1)を10%FCS含有DMEM培地で10倍希釈したものをトランスウェルに添加した。翌日、培地を除去し、上記特定マーカー発現臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清(Sup-2)を10%FCS含有DMEM培地で4倍希釈したものを添加した。さらに、IL-1βを1.5ng/mlとなるよう添加し、さらに20時間培養した後、TER(経上皮電気抵抗値)を測定した。同じ条件で培養したCaco-2の細胞数(吸光度)を細胞増殖アッセイキット(WST-8、#343-07623、同仁化社)により測定し、得られたTERを細胞数で除した値をTER値(TER Value)として図3に示した。各実験例の条件を下記表3に示す。
上記で得られた特定マーカー発現臍帯由来間葉系幹細胞を下記の試験に用いた。
上記で得られた特定マーカー発現間葉系幹細胞(臍帯由来又は脂肪由来)を、クラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて、骨細胞分化用培地(ヒト間葉系幹細胞用 骨細胞分化用培地:OsteoLife Complete Osteogenesis Medium (Lifeline, LM-0023))を用いて、24well plate (cellbind, 3337, Corning)に播種した。骨分化のための培養では、分化培養用播種から48時間後に培地交換を行い、以後、28日まで3-4日ごとに培地交換を行った。染色方法としては、播種後21日目以降に、染色するwellをPBSで1回洗浄した後、無水エタノールを添加し30分間室温で置くことで細胞の固定を行った。無水エタノールを吸引し、クリーンベンチ内で約30分間静置、乾燥させた。2%アリザリンレッド溶液を添加し、15分間室温で静置した後、DW(蒸留水)で2回洗浄し、乾燥させた。染色写真は顕微鏡(Olympus IX70)を用いて撮影した。アリザリンレッド染色の結果、特定マーカー発現間葉系幹細胞は、骨への分化能を有していることがわかった。
上記で得られた特定マーカー発現間葉系幹細胞(臍帯由来又は脂肪由来)を、クラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて、分化培地{ヒト間葉系幹細胞用 脂肪細胞分化用培地:AdipoLife DfKt-1 (Lifeline, LL-0050) or AdipoLife DfKt-2 (Lifeline , LL-0059)を用いて、24well plate (cellbind, 3337, Corning)、に播種した。脂肪分化のための培養では、分化培養用播種から48時間後に培地交換を行い、以後、28日まで3-4日ごとに培地交換を行った。染色方法としては、播種後21日目以降に、染色するwellをPBSで1回洗浄した後、4% (v/v) パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で培地を少し残すようにしながら2回洗浄した。4% (v/v) パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を再度添加し、20分間室温で静置した。その後、培地を少し残すようにしながら、DW(蒸留水)で2回洗浄し、100%イソプロパノールで1回洗浄した。DW(蒸留水)で60%に希釈したオイルレッドO染色原液を添加し、30分間37℃で静置後、完全に吸引した。その後60%イソプロパノールを添加し、10秒ほど待ち、DW(蒸留水)を加えた。DW(蒸留水)で2回洗浄後、顕微鏡(Olympus IX70)で写真撮影した。なお、AdipoLife DfKt-2のAdipoLife BM (100ml) にDifFactor 3 (10ml)を加えて分化培地とした。 オイルレッドO染色の結果、特定マーカー発現間葉系幹細胞は、脂肪細胞への分化能を有していることがわかった。
上記で得られた特定マーカー発現間葉系幹細胞(臍帯由来又は脂肪由来)を、クラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて、分化培地(ヒト間葉系幹細胞用 軟骨細胞分化用培地:ChondroLife Complete Chondrogenesis Medium (Lifeline, LM-0023))を用いて、24well plate (3527, Corning)に播種した。軟骨分化のための培養では、マイクロマス法で播種を行った。具体的には、回収した細胞を各維持培地で1.6 × 107 cells/mlに濃縮し、24well plate (3526, Corning)に5ulずつ4drops/wellで滴下し、2時間37℃, 5%CO2で静置した後、500ul/wellで軟骨分化培地を添加した。その後、21日まで3日ごとに培地交換を行った。染色方法としては、播種後21日目以降に、染色するwellをPBSで1回洗浄した後、10%中性緩衝ホルマリン液を添加し、30分間室温で置くことで細胞の固定を行った。その後、DW(蒸留水)で1回洗浄し、3%酢酸を添加し、1分間静置した。アルシアンブルー染色液を添加後20分間室温で静置した後、染色液を吸引し、3%酢酸を添加して3分間待った。最後にDW(蒸留水)で2回洗浄し、デジタルカメラで撮影した。その結果、特定マーカー発現間葉系幹細胞は、軟骨細胞への分化能を有することがわかった。
[特定マーカー発現間葉系幹細胞の培養上清の回収]
上記特定マーカー発現臍帯由来間葉系幹細胞(推奨培地に馴化後、培地交換した細胞)の凍結保存後の細胞を解凍し、上記推奨培地又は処方培地(DMEM/F-12培地に、L-グルタミン、アスコルビン酸、ヒト組み換え型アルブミン、ウシ血清由来Fetuin、炭酸水素ナトリウム、HEPES、Lipid混合液、ITSE混合液、bFGF、プロゲステロン、ハイドロコルチゾン、VO-OHPic、Pifithrin-α(ピフィスリン-α)、SB203580、塩化リチウム及びY-27632を加えた培地)中で培養し、3日後に播種し直した。翌日培地を0.2%FBS、1%AB(Antibiotic-Antimycotic(Gibco社))含有DMEM/F12に交換し、2日後(48時間後)、培養上清を回収した。上記推奨培地で培養した細胞から得られた培養上清をMSCsup1、上記処方培地で培養した細胞から得られた培養上清をMSCsup2とした。以下の実験に用いるコントロール培地としては、0.2%FBS含有DMEM/F-12培地(細胞なし)を48時間培養器に入れておいたものを用いた。
ヒト肺上皮癌細胞株A549を、6well plateに1×105cells/wellで播種し、翌日、培地を除き、上記培養上清(MSCsup1又はMSCsup2)若しくは上記コントロール培地又はこれらを培養用培地で1/2に希釈したもの、又は上記培養培地(MSCsup1又はMSCsup2)のみ、若しくは上記コントロール培地のみを各wellに添加した。24時間後に細胞を回収し、常法に従いRNAを分離し、リアルタイムPCRによってLITAF、COL1A1の発現の程度を確認し、コントロールでの発現強度を1とした場合のそれぞれの強度を図7、図8に示した。
ヒト肝星細胞(Human Hepatic Stellate Cells;hHsteC)を、6well plateに1×105cells/wellで播種し、翌日、培地を除き、上記培養上清(MSCsup1又はMSCsup2)若しくは上記コントロール培地を各wellに添加した。24時間後にLPSを100ng/mLになるよう添加し、添加の24時間後に細胞を回収し、常法に従いRNAを分離し、リアルタイムPCRによってIL-1β、LITAF、IL-8、COL1A1の発現の程度を確認し、コントロールでの発現強度を1とした場合のそれぞれの強度を図9~12に示した。
ヒト心筋細胞(Human Cardiac Myocytes;hCM)を、6well plateに1×105cells/wellで播種し、翌日、培地を除き、上記培養上清(MSCsup1)又は上記コントロール培地を各wellに添加した。48時間後に細胞を回収し、常法に従いRNAを分離し、リアルタイムPCRによってLITAF、TNFα、TGFβの発現の程度を確認し、コントロールでの発現強度を1とした場合のそれぞれの強度を図13~15に示した。
ヒト歯肉線維芽細胞(Human Gingival Fibroblasts;hGF)を、6well plateに1×105cells/wellで播種し、翌日、培地を除き、上記培養上清(MSCsup1、MSCsup2)又は上記コントロール培地を各wellに添加した。48時間後に細胞を回収し、常法に従いRNAを分離し、リアルタイムPCRによってLITAF、COL1A1、COL3A1の発現の程度を確認し、コントロールでの発現強度を1とした場合のそれぞれの強度を図16~18に示した。なお、hGFについては、歯周病の改善のためには線維化が促進されることが好ましいと考えられる。すなわち、COL1A1、COL3A1の発現が増強される場合、歯周病改善効果があると判断できる。
Claims (11)
- CD201、CD46、CD56、CD147及びCD165の細胞表面マーカーを発現し、クロスべインレスー2(Crossveinless-2)及びエクトジスプラシン-A2(Ectodysplasin-A2)を分泌する、臍帯由来間葉系幹細胞。
- CD29、CD73、CD90、CD105及びCD166陽性である、請求項1記載の臍帯由来間葉系幹細胞。
- アクチビンA、Dkk-3、デコリン、HGF、Dkk-1、プログラニュリン、GDF-15、アンジオポエチンー1、CCL28(VIC)、潜在型TGF-β結合タンパク質1(Latent TGF-beta bp1)、GDF1、VEGF-C、BTC(ベタセルリン)、ニドゲン-1(Nidogen-1)、GLO-1(グリオキサラーゼ-1)、sgp130(可溶型gp130)、コルディン様-2(Chordin-Like 2)及びEMAP-IIからなる群より選択される少なくとも1種をさらに分泌する、請求項1又は2記載の臍帯由来間葉系幹細胞。
- 請求項1から3のいずれか1項記載の臍帯由来間葉系幹細胞を含む、医薬組成物。
- 医薬組成物が間葉系幹細胞を含む場合、CD201、CD46、CD56、CD147及びCD165の細胞表面マーカーを発現し、クロスべインレスー2(Crossveinless-2)及びエクトジスプラシン-A2(Ectodysplasin-A2)を分泌する臍帯由来間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の70%以上である、請求項4記載の医薬組成物。
- 医薬組成物が間葉系幹細胞を含む場合、CD201、CD46、CD56、CD147及びCD165の細胞表面マーカーを発現し、クロスべインレスー2(Crossveinless-2)及びエクトジスプラシン-A2(Ectodysplasin-A2)を分泌する臍帯由来間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の90%以上である、請求項5記載の医薬組成物。
- 癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、循環器疾患、心疾患、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患、腎疾患及び口腔疾患からなる群より選択される疾患の予防又は治療のために用いられる、請求項4から6のいずれか1項記載の医薬組成物。
- 癌、前癌性症状、炎症性疾患、循環器疾患、心疾患、肺疾患、肝疾患及び口腔疾患からなる群より選択される疾患の予防又は治療のために用いられる、請求項7記載の医薬組成物。
- 肺癌、心筋炎、心肥大症、動脈硬化、肺・呼吸器炎症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肝炎、肝硬変及び歯周病からなる群より選択される疾患の予防又は治療のために用いられる、請求項8記載の医薬組成物。
- 上皮若しくは内皮のバリア機能の低下に起因する疾患、又はIL-1が関与する疾患の予防又は治療のために用いられる、請求項4から9のいずれか1項記載の医薬組成物。
- バリア機能の低下が、上皮又は内皮細胞層におけるタイトジャンクション機能の低下に起因する、請求項10記載の医薬組成物。
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