KR101468123B1 - 탯줄 유래 줄기세포를 포함하는 근위축 질환 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포유동물 탯줄 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 근위축 질환 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포를 근육 내에 투여하는 경우, 투여된 줄기세포는 투여된 부위의 근육세포를 증식시키고, 근섬유 크기 및 근 수축력을 증가시킴으로써 근위축 질환의 개선 또는 치료에 유효하다. 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포는 혈청 대체물로서 탯줄 추출물을 포함하는 배지에서 배양하므로 우태아혈청 사용에 따른 종간 오염 등의 안전성 문제에 대한 우려없이 안전하게 임상적용이 가능하다.

Description

탯줄 유래 줄기세포를 포함하는 근위축 질환 개선 또는 치료용 조성물{Compositions for Improving or Treating Muscle Atrophy Diseases Comprising Stem Cells Derived from Umbilical Cord}

본 발명은 탯줄 유래 줄기세포를 포함하는 근위축 질환 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

탯줄은 두 개의 동맥, 하나의 정맥 및 세포외기질 부분인 워튼연육(Wharton's jelly)로 이루어져 있다. 이 세포외기질은 FGF(fibroblast growth factor), EGF(epidermal growth factor), IGF-I(insulin-like growth factor I), PDGF(platelet-derived growth factor) 및 TGF-β(transforming growth factor beta)를 포함하는 많은 성장인자를 함유하고 있으며(Sobolewski K. et al., Placenta 26, 747-752(2005)) 혈액운반의 촉진, 탯줄 내 혈관 압박 방지 및 분만 후 탯줄을 건조시키는데 도움을 주어 탯줄이 빨리 위축되도록 하는 기능을 한다.

근위축(muscle atrophy)은 기계적 자극의 부재, 운동 부재, 유전, 기아 및 암 등의 다양한 원인으로 발생된다. 근육 퇴화는 일차적으로 근원섬유 단백질의 유의적인 손실로부터 생기기 때문에, 근력 및 운동 능력이 감소한다. 예컨대, 비록 운동 또는 다른 대응책들(예를 들어, 전기 자극)이 계속적으로 가해진다고 해도(예를 들어, 장기간 우주 비행 동안 우주비행사들에서 일주일마다 근력의 1 내지 3% 손실), 우주비행 또는 장애조건들과 같이 불가피하게 근육 퇴화가 진행된다. 따라서, 기계적 자극의 대안 또는 기계적 자극에 대한 부가안 중 어느 것이든 우주 비행사를 돕거나 수행능력을 더 높이기 위한 장애 조건을 극복할 수 있는 다른 대응책에 대한 연구가 요구된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 근위축 질환을 효과적으로 치료할 수 있으며 인체에 안전하게 적용이 가능한 줄기세포를 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 탯줄에서 수득한 줄기세포가 근위축 질환을 개선 또는 치료하는 데 매우 유효하다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 근위축 질환(muscle atrophy disease)의 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, (a) 포유동물 탯줄 유래 줄기세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 근위축 질환 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 근위축 질환을 효과적으로 치료할 수 있으며 인체에 안전하게 적용이 가능한 줄기세포를 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 탯줄에서 수득한 줄기세포가 근위축 질환을 개선 또는 치료하는 데 매우 유효하다는 것을 규명하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 중간엽 줄기세포이다.

본 발명의 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 줄기세포 표지 표현 항원인 CD9, CD29, CD73, CD105, CD166 및 HLA-ABC로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종, 바람직하게는 최소 2종, 보다 바람직하게는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 4종, 보다 더욱 더 바람직하게는 최소 5종, 가장 바람직하게는 6종의 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 줄기세포 표지 표면 항원인 CD9, CD29, CD73, CD105, CD166 및 HLA-ABC를 70-100% 발현하며, 보다 바람직하게는 80-100% 발현하고, 보다 더 바람직하게는 85-95% 발현한다.

한편, 본 발명의 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 조혈모줄기세포 표지 표면 항원인 CD31, CD34 및/또는 CD45는 음성의 면역학적 특성을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 조혈모줄기세포 표지 표면 항원인 CD31, CD34 및/또는 CD45를 0-10% 발현하며, 보다 바람직하게는 0.1-7% 발현하고, 가장 바람직하게는 0.16-5.6% 발현한다.

상기 표면항원의 발현율을 언급하면서 사용되는 단위 “%”는 분석 대상의 세포들에서 표면항원을 발현하는 세포의 비율을 의미한다. 예를 들어, CD29 표면항원의 발현율이 95%라는 것은 분석 대상의 세포 시료에서 95% 세포가 CD29 표면항원을 발현한다는 것을 의미한다.

본 발명의 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 Oct4, Sox2, KLF4 및 Nanog로 구성된 군으로부터 선택되는 미분화 줄기세포 표지 단백질의 최소 1종, 바람직하게는 최소 2종, 보다 바람직하게는 최소 3종, 가장 바람직하게는 4종을 세포에서 발현한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 액티빈 A(activin A), ALCAM(activated leukocyte cell adhesion molecule), 안지오제닌(Angiogenin), CV-2(Crossveinless-2), 데코린(Decorin), Dkk-1(Dickkopf-related protein-1), Dkk-3, EDA-A2(Ectodysplasin A2), EMAP-Ⅱ( Endothelial-monocyte-activating polypeptide-Ⅱ), FGF-7(Epidermal growth factor-7), KGF(Keratinocyte growth factor), 엔도텔린(Endothelin), FGF-16, FSL1(Follistatin-like 1), 갈렉틴-3(Galectin-3), GCSF(Granulocyte colony-stimulating factor), GDF-15(Growth differentiation factor 15), GPC3(Glypican 3), GPC5(Glypican 5), GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), GRO(growth-related oncogene), GRO-a, HGF(Hepatocyte growth factor), IGFBP-1(IGF binding protein 1), IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-6, IGFBP-rp1, IGFBP-7, IGF-Ⅰ, IL-2 수용체 알파(Interleukin 2 receptor alpha), IL-6, IL-8, IL-12 수용체 베타 2, IL-13 수용체 알파 1, IL-15, IL-15 수용체 알파, IL-16, IL-23, IL-28A, 인히빈 B(Inhibin B), I-TAC(Interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant), LTBP1(Latent TGF-beta bp1), LIF(Leukaemia inhibitory factor), LRP-6(low density lipoprotein receptor-related protein 6), MCP-1(monocyte chemotactic protein-1), MCP-3, MIF(Macrophage migration inhibitory factor), MIP-1a, MIP 2(Macrophage inflammatory protein 2), MMP-1(matrix metalloproteinases-1), MMP-3, MMP-10, 니도겐-1(Nidogen-1), OPG(Osteoprotegerin), TNFRSF11B(tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B), 펜트락신3(Pentraxin3), PGRN(Progranulin), sFRP-4(Secreted frizzled-related protein 4), sgp130(soluble glycoprotein 130), Siglec-9(sialic acid binding immunoglobulin-like lectin 9), Smad 4(Sma and Mad related proteins 4), SPARC(secreted protein acidic and rich in cysteine), TFPI(tissue factor pathway inhibitor-1), TSP(Thrombospondin), TSP-1, TIMP-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1), TIMP-2, TIMP-3, uPA(urokinase type plasminogen activator), uPAR(urokinase plasminogen activator receptor) 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질, 보다 바람직하게는 액티빈 A(activin A), EDA-A2(Ectodysplasin A2), GRO, IGFBP-7(IGF binding protein 7), IL-6(Interleukin 6), MIP 2(Macrophage inflammatory protein 2), TSP(Thrombospondin), TSP-1, TIMP-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1) 및 TIMP-2로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 분비한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 2차원 배양시 액티빈 A, 안지오제닌, 데코린, Dkk-1, Dkk-3, EDA-A2, FGF-7, KGF, 엔도텔린, FSL1, GCSF, GDF-15, GPC3, GPC5, GRO, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-6, IGFBP-rp1, IGFBP-7, IGF-Ⅰ, IL-2 수용체 알파, IL-6, IL-8, IL-12 수용체 베타 2, IL-13 수용체 알파 1, IL-15, IL-15 수용체 알파, IL-16, IL-23, IL-28A, LRP-6, MCP-1, MCP-3, MIP-1a, MIP 2, TNFRSF11B, 펜트락신3, PGRN, sFRP-4, sgp130, Siglec-9, Smad 4, SPARC, TSP, TSP-1, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-3로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 분비한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 3차원 배양시 액티빈 A, ALCAM, CV-2, Dkk-1, Dkk-3, EDA-A2, EMAP-Ⅱ, 엔도텔린, FGF-16, 갈렉틴-3, GCSF, GDF-15, GM-CSF, GRO, GRO-a, HGF, IGFBP-1, IGFBP-rp1, IGFBP-7, IL-6, IL-8, 인히빈 B, I-TAC, LTBP1, LIF, MCP-1, MCP-3, MIF, MIP-1a, MIP 2, MMP-1, MMP-3, MMP-10, 니도겐-1, PGRN, sgp130, Smad 4, SPARC, TSP, TSP-1, TIMP-1, TIMP-2, uPA, uPAR 및 VEGF로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 분비한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 2차원 배양 및 3차원 배양시 Acivin A, Dkk-1, EDA-A2, GDF-15, GRO, IGFBP-7, IL-6, MCP-1, MIP 2, Smad4, SPARC, TSP, TSP-1, TIMP-1 및 TIMP-2를 공통적으로 분비한다.

본 발명에서 이용하는 탯줄 유래 줄기세포는 다양한 포유동물로부터 수득할 수 있다. 보다 바람직하게는 인간, 돼지, 말, 소, 마우스(mouse), 랫트(rat), 햄스터(hamster), 토끼, 염소 또는 양, 보다 더 바람직하게는 인간, 돼지 또는 마우스, 가장 바람직하게는 인간의 탯줄에서 수득할 수 있다.

본 발명에서 이용하는 탯줄 유래 줄기세포는 다양한 포유동물 탯줄의 워튼연육(Wharton's jelly) 조직으로부터 수득할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 탯줄 유래 줄기세포는 하기의 실시예에 기재된 방식으로 수득할 수 있다. 예를 들어, 탯줄에 있는 동맥과 정맥을 제거한 후, 워튼연육 조직을 절단하고 절단된 워튼연육 조직을 직접 배양하여 세포를 성장(outgrowth)시킨다. 이어, 상기 성장된 세포를 계대 배양함으로써, 줄기세포를 수득한다. 상기 배양 과정에서 이용되는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat . New Biol . 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc . Soc . Exp . Bio . Med ., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer . Med . Assoc . 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp . Cell Res . 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal . Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl . Cancer Inst . 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc . Soc . Exp . Biol . Med . 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 상기 배양 과정에서 이용되는 배지는 바람직하게는 탯줄 추출물을 추가적으로 포함한다.

본 발명자들은 우태아혈청 등의 동물 유래의 단백질원 사용에 따른 안전성 문제를 회피하면서 효율적이고 경제적으로 줄기세포를 배양하고자 탯줄로부터 단백질 변성을 최소화시켜 탯줄 추출물을 수득하고 이를 배지에 함유시켜 줄기세포 배양에 적용함으로써 혈청 대체물로서 사용하였다.

본 발명에서 줄기세포 배양에 이용한 탯줄 추출물의 제조 방법을 각 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

(a) 탯줄의 절단

본 발명에 따르면, 우선 탯줄을 절단한다. 본 발명에 있어서, 탯줄의 절단은 완충액과의 접촉 면적을 넓혀 탯줄 조직에 존재하는 유용물질의 용출을 용이하게 하기 위하여 실시한다.

탯줄 절단은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 탯줄은 0.5-3.0 cm, 보다 바람직하게는 0.5-2.5 cm, 보다 더 바람직하게는 1-2 cm의 길이로 절단한다.

(b) 절단된 탯줄을 완충액에 함침

이어, 절단된 탯줄을 완충액에 넣는다. 본 발명에서 이용되는 완충액은 완충력(buffering power)을 가지는 어떠한 완충액도 사용 가능하며 예를 들어, 소듐 아세테이트, 소듐 포스페이트, 글리신-HCl, Tris-HCl 및 PBS(Phosphate buffered saline)를 포함한다. 특히, PBS를 이용할 수 있고, pH는 2-11, 바람직하게는 4-10, 보다 바람직하게는 4-8, 보다 더 바람직하게는 6.8-7.6이다.

절단된 탯줄을 넣는(함침시키는) 완충액의 양은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 탯줄 중량의 2-5배, 보다 바람직하게는 2-4배, 보다 더 바람직하게는 2.5-3.2배의 완충액을 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 절단된 탯줄을 완충액에 넣기 전에 적합한 용액(예컨대, 완충액)으로 세척한다.

(c) 단계 (b)의 결과물의 교반

단계 (b)의 결과물을 교반한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 교반은 4℃-10℃, 보다 바람직하게는 4℃-6℃에서 실시한다. 바람직하게는 교반은 7-24시간, 보다 바람직하게는 12-24시간, 보다 더 바람직하게는 18-24시간 동안 실시한다.

교반은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있으며, 가장 바람직하게는 마그네틱 바를 이용하여 교반한다.

(d) 교반 결과물의 원심분리

교반 결과물을 원심분리하여 최종적으로 탯줄 추출물로서 상층액을 수득한다. 상기 상층액은 성장인자 및 싸이토카인 등 세포외기질에 결합되어 있는 다양한 유용 단백질을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 원심분리는 3,000-6,000 rpm, 보다 바람직하게는 4,000-4,500 rpm의 조건에서 실시한다. 원심분리는 4℃-10℃, 보다 바람직하게는 4℃-6℃에서 실시한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 원심분리는 5분-30분, 보다 바람직하게는 5분-20분, 보다 더 바람직하게는 10분-15분 동안 실시한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 방법에 의해 제조된 탯줄 추출물을 포함하는 세포 배양액에서 배양한 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포는 혈청을 포함한 배지에서 배양한 탯줄 유래 줄기세포와 구별되는 형태학적/면역학적 특성을 나타낸다(참조: 도 2 내지 4). 혈청을 포함한 배지에서 배양한 탯줄 유래 줄기세포는 계대배양 횟수가 증가함에 따라 세포 모양이 퍼지면서 펼쳐지는(spreading) 형태를 나타내는 반면, 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포는 계대배양 횟수 증가에도 초기 배양 시 세포 형태를 유지한다. 또한, 세포 계대배양 횟수가 증가함에 따라 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포에서는 혈청을 포함한 배지에서 배양한 탯줄 유래 줄기세포와 비교하여 줄기세포 표지 표면 항원(CD73, CD105 및 CD166)의 발현이 현저히 증가하며, 미분화 줄기세포 표지 단백질의 발현도 보다 오래 지속되는 특징을 나타낸다. 한편, 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포가 조골세포, 지방세포 및 근육세포로 분화되도록 유도한 결과, 조골세포, 지방세포 및 근육세포로의 분화가 각각 효과적으로 유도되어 각 세포에 특이적인 마커가 발현되었다. 따라서, 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포는 근육세포 뿐 아니라 조골세포 및 지방세포로의 분화능도 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포는 근육세포로 증식되거나 또는 분화되는 활성을 나타낸다. 즉, 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포는 줄기세포가 주입된 위치, 바람직하게는 근육 내에서 근육세포로 증식되거나 분화됨으로써 근육질환, 바람직하게는 근위축 질환, 보다 바람직하게는 근육의 결함(defects)에 의해 유발되는 다양한 근위축 질환에 대하여 치료 효능을 발휘한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료되는 근위축 질환은 유전적, 병리학적 또는 물리적 원인으로 인한 근육 조직의 손상으로부터 유래한 근육질환이며, 바람직하게는 근위축증, 근무력증, 근이영양증, 근경직증, 근긴장저하, 근력약화, 근디스트로피, 근육퇴행위축, 근위축성 측삭경화증 또는 중증 근무력증이고, 보다 바람직하게는 근위축증, 근무력증, 근이영양증, 근력약화 또는 중증 근무력증이며, 가장 바람직하게는 근위축증이다.

본 명세서에서 용어 “근위축”은 근육조직의 감소 또는 근육의 퇴행을 의미하며, 근위축 질환은 근위축이 직간접적인 원인이 되어 발생하는 질병을 말한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포는 근육세포의 증식을 촉진시킨다(참조: 실시예 4 및 6). 하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포를 하지현수 유발 동물에 투여한 경우 가자미근의 무게가 증가하였으며, 근육발생의 특이적 마커인 액틴 및 데스민의 발현이 증가하였다. 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포에 의한 근육세포 증식에서 기인한 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포는 근수축력을 증가시킨다(참조: 실시예 5). 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포를 하지현수 유발로 인해 근 수축력이 저하된 동물에 투여하였을 때, 가자미근의 강축능이 정상 대조군과 비슷한 수준으로 향상되었다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포는 근육 내 젖산 분해를 촉진시키며(참조: 실시예 7), 근섬유의 크기를 증가시킨다(참조: 실시예 9).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 근위축 질환 개선 또는 치료용 약제학적 조성물은 근육 내(intramuscular) 투여용 조성물이며, 상기 조성물을 근육 내에 투여하는 경우 투여된 탯줄 유래 줄기세포는 근육 내에서 근육세포의 증식 및 젖산 분해를 촉진시키고, 근섬유의 크기를 증가시키며 근수축력을 증가시킴으로써 근위축성 질환에 대해 개선 또는 치료 효능을 나타낸다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 탯줄 유래 줄기세포의 치료 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 또는 배지 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식, 보다 바람직하게는 근육 내(intramuscular) 투여 또는 혈관 내 투여이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 10²-10¹⁰ 세포이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 포유동물 탯줄 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 근위축 질환 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포를 근육 내에 투여하는 경우, 투여된 줄기세포는 투여된 부위의 근육세포를 증식시키고, 근섬유 크기 및 근 수축력을 증가시킴으로써 근위축 질환의 개선 또는 치료에 유효하다.

(ⅲ) 본 발명의 탯줄 유래 줄기세포는 혈청 대체물로서 탯줄 추출물을 포함하는 배지에서 배양하므로 우태아혈청 사용에 따른 종간 오염 등의 안전성 문제에 대한 우려없이 안전하게 임상적용이 가능하다.

도 1은 근위축 유발 동물모델을 확립하고 근위축 유발 여부를 확인하기 위해 근위축 유발 동물모델의 근섬유 면적을 측정하여 정상 대조군과 비교한 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 탯줄 추출물(Umbilical cord extract, UCE)을 첨가한 배지에서 배양한 탯줄 줄기세포의 형태를 촬영한 사진이다.
도 3은 탯줄 추출물을 첨가한 배지에서 탯줄 줄기세포를 배양할 때, 계대배양에 따라 MSCs 마커가 유지되는지 여부를 FACS 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 4는 탯줄 추출물을 첨가한 배지에서 탯줄 줄기세포를 배양할 때, 계대배양에 따라 ESCs 유전자의 발현이 유지되는지 여부를 PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 탯줄 추출물을 첨가한 배지에서 탯줄 줄기세포를 배양할 때, 줄기세포의 분화능이 유지되는지 여부를 PCR을 통해 확인한 결과이다
도 6은 탯줄 줄기세포의 2차원 배양 시 분비되는 싸이토카인 프로파일을 나타낸 그림이다.
도 7은 시간 별 인간 탯줄 간엽 줄기세포(human umbilical cord-mesenchymal stem cell)의 유전자 발현을 측정한 결과이다. (A) Myo D 및 Pax 3/7의 발현에 대한 웨스턴 블롯 결과, (B) 정량적 RT-PCR을 통해 측정한 mRNA 발현 레벨.
도 8은 표준화된 근육량(근육 분자량/몸무게, 식염수 그룹과 비교하여 **P<0.05, ***P<0.001, 탯줄 간엽 줄기세포 투여 후 정상생활로 돌아온 그룹과 비교하여 ^# P<0.05)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 탯줄 간엽 줄기세포 주사 후 1주일째에 가자미근의 강축능력을 측정한 결과이다.
도 10은 가자미근에서의 액틴 및 데스민 발현 레벨 측정 결과를 나타낸 그래프이다(식염수 그룹과 비교하여 *P=0.05, **P=0.005, 탯줄 간엽 줄기세포 투여 후 정상생활로 돌아온 그룹과 비교하여 ^# P= 0.05, ^## P=0.005).
도 11은 간엽 줄기세포 주사 후 1주일째에 하지 현수유발 동물모델로부터 젖산축적정도를 젖산 어세이를 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(대조군과 비교하여 ^&& P=0.05, ^&& P<0.05, 식염수 그룹과 비교하여 **P<0.05, ***P<0.005, 탯줄 간엽 줄기세포 투여 후 정상생활로 돌아온 그룹과 비교하여 ^## P<0.05).
도 12는 줄기세포 이식에 의한 근 섬유 재생 효과의 조직학적 분석 결과를 나타낸 그림이다. 근육 조직은 헤마톡시린 및 에오신(H&E)으로 염색함.
도 13은 줄기세포 이식에 의한 근 섬유 크기 변화의 측정 결과를 나타낸 그래프이다. CSA(Cross-sectional area)는 식염수 그룹보다 인간 탯줄 간엽줄기세포 투여 그룹에서 현저하게 높게 나타남(식염수 그룹과 비교하여 *P<0.05, **P<0.005, 탯줄 간엽 줄기세포 투여 후 정상생활로 돌아온 그룹과 비교하여 ^# P<0.05).
도 14는 인간 탯줄 간엽줄기세포 주사 1주일 후, 면역형광염색 수행 결과를 나타낸 그림이다. 데스민(적색), 인간 세포 핵(초록색), 핵(청색).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 근위축 유발 동물모델 확립 및 근위축 유발 검증

우주 미소중력 환경과 유사하게 지상에서 무부하(unloading) 환경을 만들기 위하여 특수케이지를 제작하였으며, 실험동물의 하지를 들어올려 360도 회전이 가능한 도르래의 중앙에 꼬리 길이와 비슷한 크기의 쇠줄을 인체 보정용 테이프를 사용하여 꼬리와 함께 고정시켰다. 실험동물의 몸 기울기는 실제 우주의 미소중력 환경과 유사하게 만들기 위하여 지표로부터 약 30도를 유지하였다.

하지현수 2주 후 항 중력근인 가자미근을 적출하여 4% 중성 완충 포르말린에 24시간 진탕 고정한 후 조직학적 관찰을 위하여 파라핀 블록을 제작하였다. 헤마톡실린-에오신 염색 결과 근내막(endomysium)에 둘러싸여 있는 근섬유의 크기가 대조군에 비해 작아져 있고, 근섬유의 크기를 비교 측정한 결과 약 2.5배 감소하였다(도 1). 또한, 데스민과 골격근 액틴의 감소는 하지현수에 의해 근 골격이 손상되었음을 나타낸다. 이상의 결과, 우주 미소중력환경과 유사한 하지현수 모델을 확립하였고 이 동물모델을 통하여 근위축증이 유발되는 것을 검증하였다.

실시예 2 : 세포 배양 및 실험 방법

2-1. 세포 배양

탯줄에 있는 동맥과 정맥을 제거한 후 워튼연육(Wharton's jelly) 조직을 0.5 cm³ 크기로 잘라서 100 mm 디쉬에 올려놓고 α-MEM 배지를 첨가하여 2주일간 배양하였다. 배양 후 세포가 워튼연육 조직으로부터 디쉬로 자라나오면 남아있는 조직은 제거하고 세포가 70% 포화상태가 될 때까지 계속 배양하였다. 이 세포를 계대 0으로 시작하여, 0.05% 트립신-EDTA로 세포를 떼어낸 후 1x10³ 세포/cm²의 농도로 계대 배양 하였다. 0.3 mg/ml 탯줄 추출물(UCE)을 배지에 첨가하여 세포를 배양하였다(도 2).

탯줄 추출물의 제조방법은 다음과 같다:

탯줄을 0.5-2.0 cm 길이로 절단하여, PBS(pH 7.0)로 2회 이상 세척한 후 약 8g의 탯줄에 약 15 ml의 PBS를 넣고 균질화(homogenization), 교반(stirring, 4℃에서 24시간) 또는 배양(incubation, 37℃에서 24시간)하였다. 4,500 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심 분리하여 수거한 상층액을 탯줄 유래 추출물로 사용하였고, 브래드포드 분석법으로 단백질 정량을 실시하였다.

2-2: FACS 분석

배양 중인 세포를 0.5% 트립신-EDTA을 이용하여 플라스크에서 분리시켜 D-PBS로 3회 세척한 후 세포를 3x10⁵ 세포/200 μL의 농도로 PBS에 부유시킨 후 각 항체를 10 μL씩 첨가하고 20분간 암실에서 반응시켰다. 그 후 PBS로 세포를 2회 세척하고, 동일한 PBS를 500 μL 첨가한 후 유세포분석기(FC 500; Beckman Coulter, 미국)로 측정하였다. 항체는 인간 간엽 줄기세포에서 양성을 나타내는 PE 마우스 항-인간 CD 105(BD Biosciences, MD., 미국), FITC 마우스 항-인간 CD9(BD Biosciences, MD., 미국), PE 마우스 항-인간 CD29(BD Biosciences, MD., 미국), PE 마우스 항-인간 CD166(BD Biosciences, MD., 미국), PE 마우스 항-인간 CD73(BD Biosciences, MD., 미국), PE 마우스 항-인간 HLA-ABC(BD Biosciences, MD., 미국)와 음성을 나타내는 FITC 마우스 항-인간 CD31(BD Biosciences, MD., 미국), FITC 마우스 항-인간 CD45(BD Biosciences, MD., 미국), FITC 마우스 항-인간 CD34(BD Biosciences, MD., 미국), FITC 마우스 항-인간 HLA-DR(BD Biosciences, MD., 미국)를 사용하였다(도 3).

2-3: RT-PCR 분석

각각의 FBS 또는 UCE가 포함된 배지에서 배양한 UC-MSC에 1 ml의 용해 버퍼를 첨가한 다음, 제조사의 지시에 따라 총 RNA를 분리하였다. ELPIS(Reverse transcription master premix)를 이용하여 1 μg의 RNA에서 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 주형으로 사용하여 관찰 대상 유전자를 PCR 방법으로 증폭하였다(표 1). 유전자 증폭은 총 32 사이클 수행하였으며, 각 사이클은 94℃에서 30초간의 변성, 30초간의 어닐링, 72℃에서 30초간의 신장 과정으로 구성되었다. 반응 종결 후, PCR 생성물들은 전기영동 후 브롬화 에티듐으로 염색하고 자외선을 조사하여 DNA 이미지를 얻었다(도 4).

리니지	유전자 / 유전자 수납 번호	방향	서열 (5’- 3’)	어닐링 온도 (℃)	PCR 결과물 크기(bp)
줄기성	Oct 4 / NM_002701	정방향	GAG TGA GAG GCA ACC TGG AG	60	256
		역방향	TAG CCT GGG CTA CCA AAA TG
	SOX 2 / NM_003106	정방향	AAT GCC TTC ATG GTG TGG TC	60	357
		역방향	GTT CAT GTG CGC GTA ACT GT
	Nanog / NM_024865	정방향	TTC TTC CAC CAG TCC CAA AG	60	354
		역방향	CAT CCC TGG TGG TAG GAA GA
	KLF4 / NM_004235	정방향	CCC AAT TAC CCA TCC TCC CT	60	309
		역방향	ACG GTA CTG CCT GGT CAG TT
골형성	Collagen typeⅠ / NM_000089	정방향	ACC TGG TCA AAC TGG TCC TG	60	306
		역방향	CGT CCT CTC TCA CCA GGA AG
	Osteopontin / NM_000582	정방향	CAT CAC CTG TGC CAT ACC AG	60	503
		역방향	CCA TGT GTG AGG TGA TGT CC
	ALP / BC021289	정방향	TGA CCT CCT CGG AAG ACA CT	60	242
		역방향	AGA CTG CGC CTG GTA GTT GT
지방세포화	LPL / NM_000237	정방향	AAG AAC CGC TGC AAC AAT CT	60	351
		역방향	ACT GCT CCA CCA GTC TGA CC
	Leptin / NM_000230	정방향	CAC ACA CGC AGT CAG TCT CC	60	298
		역방향	ACC ACC TCT GTG GAG TAG CC
	FABP4 / NM_001442	정방향	TGG AAA CTT GTC TCC AGT GAA	60	353
		역방향	GTG GAA GTG ACG CCT TTC AT
대조군	GAPDH / NM_002046	정방향	GAA GGT GAA GGT CGG ACT CA	60	448
		역방향	GGA GGC ATT GCT GAT GAT CT

LPL : lipoprotein lipase

ALP : alkaline phosphatase

FABP4 : fatty acid binding protein 4

KLF4 : Kruppel-like factor 4

2-4: 세포 분화

조골세포 분화( Osteoblast )

세포에 0.05% 트립신-EDTA를 처리하여 배양용기로부터 분리하여 배지 내에 부유시킨 후 6-웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰의 농도로 접종하고 3일 후, STEMPRO 골형성 분화 키트(Invitrogen, 미국)를 이용하여 분화를 유도하였다. 분화 유도배지는 3-4일에 한 번씩 새로운 것으로 갈아주었으며, 2주간 5% CO₂, 37℃ 조건으로 배양하였다. 조골세포로의 분화를 확인하기 위하여 조골세포를 특이적으로 염색하는 알리자린 레드 S 염색시약을 사용하여 관찰하였다. 또한 RT-PCR 방법을 이용하여 조골세포의 특이적인 유전자의 발현을 확인 하였다(도 5, 표 1).

지방세포 분화( Adipocyte )

6-웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰의 농도로 접종하고 3일 정도 후 과증식 (over-confluent)이 되었을 때, STEMPRO 지질형성 분화 키트(Invitrogen, 미국)를 이용하여 분화를 유도하였다. 분화 유도배지는 3-4일에 한 번씩 새 배지로 교환하였으며, 2주간 5% CO₂, 37℃ 조건에서 배양하였다. 지방조직의 지방소포(lipid droplet)의 발현 양상을 확인하기 위해 오일-레드 O 염색을 시행하여 관찰하였다. 또한, RT-PCR 방법을 이용하여 지방세포의 특이적인 유전자의 발현을 확인하였다(도 5, 표 1).

2-5 : 사이토카인 어레이

RayBio 인간 사이토카인 어레이 V 키트(RayBiotech, 미국)의 제조사 지시에 따라 탯줄 추출물에 존재하는 사이토카인을 분석하였다. 본 실험에서 사용한 어레이 멤브레인은 507개의 다른 성장인자/사이토카인을 분석할 수 있다. 간략히 설명하면, 바이오틴을 탯줄 추출물에 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응하여 바이오틴-라벨링 탯줄추출을 준비하였다. 어레이 멤브레인을 1시간동안 실온에서 블로킹 버퍼를 이용하여 블로킹 한 후, 버퍼 제거 후 바이오틴-라벨링 탯줄 추출물을 실온에서 2시간 반응하였다. 그 후 세척 버퍼로 3회 세척하고, 블로킹 버퍼에 HRP-결합 스트렙타비딘을 1:500으로 희석 후 실온에서 2시간 반응하였다. 세척 버퍼로 3회 세척 후 검출 버퍼를 처리하고, 화학발광 검출 시스템으로 관찰하였다. 얻은 닷 블롯 이미지는 Multi Gauge V3.0 프로그램을 이용하여 사이토카인 발현양을 분석 하였다(도 6).

실시예 3: 줄기세포의 근육 분화능 확인

줄기세포의 근육세포 분화능을 확인하기 위하여 5-아자시티딘 (sigma-Aldrich, 미국) 10 μM을 배양 중인 줄기세포에 시간별로 처리하고 근육 분화의 특이적인 마커인 MyoD1(Myoblast determination protein 1), Pax3/7(Paired box gene 3/7 protein) 단백질 발현을 확인하였다. 유전자 수준에서 확인하기 위하여 동일한 시간에 처리한 샘플을 가지고 근육발생의 특이적인 마커인 데스민, MHC(Myosin heavy chain), NKX2.5(Homeobox protein NK-2 homolog E)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 시간이 지남에 따라 MyoD1, Pax3/7은 약 2.1배 정도 증가하는 것을 확인하였으며 유전자 수준에서도 근육 특이적인 유전자들의 증가는 줄기세포가 근육세포로 분화 가능함을 확인하였다(도 7).

실시예 4: 줄기세포 이식에 따른 가자미근의 무게 변화 측정

하지현수 유발 후 각 실험군 별로 몸무게와 가자미근의 무게를 측정하였다. 측정된 무게를 기준으로 몸무게에 대비하여 가지미근 무게 변화를 분석하였다.

실험동물은 5주령 SD-rat 암컷을 사용하였으며 2주일의 하지현수 유도 기간을 거친 뒤, 탯줄 유래 줄기세포(umbilical cord-derived MSC), 지방 유래 줄기세포(adipose-derived MSC), 골수 유래 줄기세포(bone Marrow-derived MSC)를 1 × 10⁶ 세포/100 ㎕를 식염수에 현탁하여 0.25 mm (31G) × 8 mm(Insulin syringe, BD ULtra-Fine II) 주사기에 넣고, 줄기세포의 이동거리를 감안하여 비복근(gastronemius muscle) 사이에 아래와 위로 두 번 주사하였다.

하지현수 유발 후 각 실험군 별로 몸무게와 가자미근의 무게를 측정하고, 측정된 무게를 기준으로 몸무게에 대비하여 가지미근 무게 변화를 분석하였다.

실험결과, 하지현수 유발 동물에 식염수(Saline)를 투여한 경우, 정상생활을 한 그룹보다 가자미근의 무게가 약 2배 정도 감소하였다. 줄기세포 투여 2주 후 무게 변화가 뚜렷이 관찰되지는 않았지만 줄기세포 투여 후 정상생활을 한 그룹이 줄기세포를 투여하지 않고 정상생활을 한 그룹보다 가자미근의 무게가 더 증가하였다(도 8).

실시예 5: 줄기세포 이식에 따른 근수축력 증가

실험동물의 가자미근을 적출한 뒤 힘줄을 수술용 봉합사로 최대한 근육 쪽에 고정하고 생리식염수에 임시 보관하였다. 적출한 근육은 산소가 공급되는 생리식염수가 담긴 알루미늄 실험용 근 수조에 넣고, 온도가 25℃로 유지하도록 하였으며 봉합사로 연결된 근육의 한쪽을 미동나사에 연결하여 최대 근력이 나오는 적정 길이를 결정할 수 있도록 하였다. 근 수조 안쪽에 근육 양 옆으로 백금 전극을 설치하고 DCM(Dynamic Muscle Control, solwood Enterprise, Inc.) 소프트웨어를 이용하여 듀얼-모드 Laver Arm 시스템(Aurora scientific, Inc.)과 Grass S48 stimulator(Grass Instrument)를 통하여 백금 전극에 자극이 전달되어 가자미근이 근 수축 운동을 할 수 있도록 하였다. 자극에 의한 강축 능력(tetanic force)은 변환기(Aurora 300B-LR motor)를 통하여 전기신호로 전환된 후 컴퓨터에 입력되어 DMA(Dynamic Muscle Analysis, Solwood Enterprise, Inc.) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 줄기세포를 이식한 군의 가자미근의 강축능이 대조군과 비슷하게 향상된 것을 확인하였다(도 9).

실시예 6: 줄기세포에 의한 근육 특이적 유전자 발현 확인

줄기세포 투여 후 정상 생활을 하는 군과 다시 하지현수를 유발하는 군으로 나누었으며 대조군으로 줄기세포를 투여하지 않고 정상생활을 하는 군으로 실험을 진행하였다. 식염수를 투여한 대조군에 비해 줄기세포 투여 후 2주 동안 하지현수를 유지한 실험군에서 근육발생의 특이적인 마커인 액틴 및 데스민의 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 투여한 줄기세포 모두 근육 재생 효과를 나타냈지만, 그 중 탯줄 유래 줄기세포에서 현저한 근육 재생 효과가 나타났다. 줄기세포 투여 후 정상생활을 유지한 그룹에서도 근육 회복 정도가 빠르게 나타났으며 이는 중력의 영향을 받아 위축 되었던 근육이 다시 수축 이완작용을 통하여 본래의 기능으로 되돌아간 것을 의미한다. 줄기세포 투여없이 정상생활을 유지한 그룹에서도 근육 회복 능력을 나타냈지만 줄기세포를 투여한 그룹보다 액틴 및 데스민의 발현양은 낮게 나타났다(도 10).

실시예 7: 줄기세포 이식에 의한 젖산 분해 효과 확인

줄기세포 이식은 위축된 근육을 재생시키는데 이로 인해 축적된 젖산이 분해되고 젖산으로 인한 근육의 피로가 제거될 것으로 예상된다. 줄기세포 이식에 의한 젖산 분해 효과를 확인하기 위해 하지 현수유발 동물모델에서 젖산축적정도를 젖산 어세이를 이용하여 확인하였고, 사용된 샘플의 부피(SV, sample volume)를 젖산 양(La, Lactate acid amount)으로 나누어 분석하였다. 젖산의 함량은 하지현수 유발 후에 대조군에 비해 약 2배 정도 축적되는 것으로 나타났으며, 식염수 투여 1주일 후에는 3배 정도 증가하는 것으로 나타났다. 반면, 식염수 그룹에 비해 탯줄 유래 줄기세포를 투여한 그룹에서 약 0.5배, 지방 유래 줄기세포와 골수 유래 줄기세포를 투여한 그룹에서는 약 0.6배 정도 젖산의 함량이 감소하는 양상을 나타냈다(도 11).

실시예 8: 줄기세포에 의한 근 섬유 재생의 조직학적 분석

하지현수 유발 후 근위축의 줄기세포 치료 효과를 조직학적으로 분석하였다. H&E 염색 결과, 하지현수 유발 그룹에서 근섬유의 크기가 작아진 것을 관찰할 수 있으며 특이적으로 줄기세포를 투여한 그룹에서 근 섬유 크기가 증가하였으며 밀도도 높게 나타났다. 줄기세포 종류별로는 지방조직 유래 줄기세포투여 2주 후 근섬유 크기가 커지면서 밀집되어 있는 것을 볼 수 있으나 여전히 근내막(endomysium)이 정상 조직에 비해 넓게 퍼져있고, 위성세포(satellite cell)에 의해 재생되는 조직의 밀도는 높지 않은 것으로 확인되었다. 골수 유래 줄기세포를 투여한 그룹에서는 지방조직 유래 줄기세포를 투여한 그룹보다 근 섬유의 크기가 커진 것을 확인할 수 있다. 그러나 투여 2주 후에 위성세포에 의한 근육 재생은 관찰되지 않았다. 반면 탯줄 유래 줄기세포를 투여한 그룹은 초기 투여 1주부터 위성세포에 의해 재생 중인 근육의 수가 많으며, 2주 후에는 손상된 근육을 파괴하고 재생하는 근육의 모습을 보이고 있다. 탯줄 유래 줄기세포투여 후 정상생활을 유지한 그룹은 다른 줄기세포에 비해 근 섬유의 재생 빈도가 매우 높게 나타났다(도 12).

실시예 9: 줄기세포에 의한 근 섬유 크기 변화 측정

근위축증의 줄기세포 치료효과를 확인하기 위하여 하지현수 후 나타나는 근 섬유 크기 변화를 측정하였다. 조직 염색을 통해 육안으로 확인된 근섬유의 크기를 정량적으로 측정하기 위하여 이미지 J 프로그램을 이용, 각 군당 임의로 100개의 근섬유의 크기를 측정하여 분석하였다. 탯줄 유래 줄기세포를 투여한 경우, 식염수에 비해 약 1.7배, 지방 유래 줄기세포를 투여한 경우에는 1.1배, 골수 유래 줄기세포를 투여한 경우에는 1.3배 정도 근섬유 크기가 증가하였다(도 13). 또한, 줄기세포 투여 후 정상 생활을 유지한 그룹들은 오차 범위 내에서 비슷한 증가를 나타냈다. 이러한 결과는 조직학 분석 결과와 유의성을 가지고 있으며, 근 섬유 크기 증가는 위성세포의 활동으로 인해 근 섬유가 재생하고 있음을 나타낸다. 또한, 근육의 단면적은 근육의 힘을 결정하는 중요한 요인 가운데 하나이며, 근력에 작용하는 근육의 단면적과 근육이 발휘하는 힘 사이에 상관관계가 있다고 하는 것이 일반적이며, 근육 1 cm²가 발휘하는 생리적인 힘은 4-6 kg 으로서 근육의 단면적이 증가하면 근육의 힘 또한 증가하게 된다. 근육의 단면적이 클수록 더욱 많은 힘을 발휘할 수 있는 것은 근수축의 성분인 액틴과 미오신의 풍부한 양으로 인하여 근 수축을 위한 연결교(cross bridge) 작용이 충분하게 형성될 수 있기 때문이다.

실시예 10: 면역형광염색을 통한 줄기세포 확인

조직학 분석을 위해 제작한 샘플을 이용하여 면역 형광 염색을 실시하였다. 실제로 투여한 줄기세포가 작용하는지 확인하기 위하여 FITC가 라벨링된 인간 핵 항체를 사용하였으며, 근 섬유의 위축 또는 재생 정도를 확인하기 위하여 데스민 항체를 사용하여 면역형광염색을 실시하였다. 하지현수 2주 후 근섬유는 크기가 약 1/4 정도까지 줄어들면서 구조적으로는 매우 불규칙한 형태를 나타내는 것을 확인하였다. 이는 하지현수에 의해 근위축이 발생한 것이며 줄기세포를 투여한 그룹에서는 손상된 근섬유뿐만 아니라 재생되어 원래 모양의 근 섬유로 회복되는 구조도 확인되었다. 면역형광염색 결과, 줄기세포를 투여한 그룹에서만 위성세포가 위치한 기저판(basal lamina) 밑에서 형광이 관찰되었는데 이러한 결과는 줄기세포가 실험동물의 위성세포를 도와 근 재생을 유도하는 것으로 생각된다(도 14).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (18)

1. (a) 탯줄 추출물을 포함하는 무혈청 세포 배양액에서 배양된 포유동물 탯줄 유래 줄기세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 근위축 질환 개선 또는 치료용 약제학적 조성물로서 상기 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 (i) CD9, CD29, CD73, CD105, CD166 및 HLA(human leukocyte antigen)-ABC의 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성; (ⅱ) CD31, CD34 및 CD45의 표면항원에 대하여 음성의 면역학적 특성; 및 (ⅲ) 미분화 줄기세포 표지 단백질인 Oct4, Sox2, KLF4 및 Nanog를 발현하고, 상기 Sox2 및 Nanog는 계대(passage) 12까지 발현을 유지하며; 그리고 EDA-A2(Ectodysplasin A2), IGFBP-7(IGF binding protein 7), MIP 2(Macrophage inflammatory protein 2), TSP(Thrombospondin), TSP-1 및 3차원 배양 시 VEGF 단백질을 분비하는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 액티빈 A(activin A), ALCAM(activated leukocyte cell adhesion molecule), 안지오제닌(Angiogenin), CV-2(Crossveinless-2), 데코린(Decorin), Dkk-1(Dickkopf-related protein-1), Dkk-3, EMAP-Ⅱ( Endothelial-monocyte-activating polypeptide-Ⅱ), FGF-7(Epidermal growth factor-7), KGF(Keratinocyte growth factor), 엔도텔린(Endothelin), FGF-16, FSL1(Follistatin-like 1), 갈렉틴-3(Galectin-3), GCSF(Granulocyte colony-stimulating factor), GDF-15(Growth differentiation factor 15), GPC3(Glypican 3), GPC5(Glypican 5), GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), GRO(growth-related oncogene), GRO-a, HGF(Hepatocyte growth factor), IGFBP-1(IGF binding protein 1), IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-6, IGFBP-rp1, IGF-Ⅰ, IL-2 수용체 알파(Interleukin 2 receptor alpha), IL-6, IL-8, IL-12 수용체 베타 2, IL-13 수용체 알파 1, IL-15, IL-15 수용체 알파, IL-16, IL-23, IL-28A, 인히빈 B(Inhibin B), I-TAC(Interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant), LTBP1(Latent TGF-beta bp1), LIF(Leukaemia inhibitory factor), LRP-6(low density lipoprotein receptor-related protein 6), MCP-1(monocyte chemotactic protein-1), MCP-3, MIF(Macrophage migration inhibitory factor), MIP-1a, MMP-1(matrix metalloproteinases-1), MMP-3, MMP-10, 니도겐-1(Nidogen-1), OPG(Osteoprotegerin), TNFRSF11B(tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B), 펜트락신3(Pentraxin3), PGRN(Progranulin), sFRP-4(Secreted frizzled-related protein 4), sgp130(soluble glycoprotein 130), Siglec-9(sialic acid binding immunoglobulin-like lectin 9), Smad 4(Sma and Mad related proteins 4), SPARC(secreted protein acidic and rich in cysteine), TFPI(tissue factor pathway inhibitor-1), TIMP-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1), TIMP-2, TIMP-3, uPA(urokinase type plasminogen activator), uPAR(urokinase plasminogen activator receptor) 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 분비하는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 2차원 배양 시 액티빈 A, 안지오제닌, 데코린, Dkk-1, Dkk-3, EDA-A2, FGF-7, KGF, 엔도텔린, FSL1, GCSF, GDF-15, GPC3, GPC5, GRO, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-6, IGFBP-rp1, IGFBP-7, IGF-Ⅰ, IL-2 수용체 알파, IL-6, IL-8, IL-12 수용체 베타 2, IL-13 수용체 알파 1, IL-15, IL-15 수용체 알파, IL-16, IL-23, IL-28A, LRP-6, MCP-1, MCP-3, MIP-1a, MIP 2, TNFRSF11B, 펜트락신3, PGRN, sFRP-4, sgp130, Siglec-9, Smad 4, SPARC, TSP, TSP-1, TIMP-1, TIMP-2 및 TIMP-3로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 분비하는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
6. 제 4 항에 있어서, 상기 포유동물 탯줄 유래 줄기세포는 3차원 배양 시 액티빈 A, ALCAM, CV-2, Dkk-1, Dkk-3, EDA-A2, EMAP-Ⅱ, 엔도텔린, FGF-16, 갈렉틴-3, GCSF, GDF-15, GM-CSF, GRO, GRO-a, HGF, IGFBP-1, IGFBP-rp1, IGFBP-7, IL-6, IL-8, 인히빈 B, I-TAC, LTBP1, LIF, MCP-1, MCP-3, MIF, MIP-1a, MIP 2, MMP-1, MMP-3, MMP-10, 니도겐-1, PGRN, sgp130, Smad 4, SPARC, TSP, TSP-1, TIMP-1, TIMP-2, uPA, uPAR 및 VEGF로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 분비하는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
7. 제 4 항에 있어서, 상기 포유동물의 탯줄 유래 줄기세포는 2차원 및 3차원 배양시 액티빈 A, Dkk-1, EDA-A2, GDF-15, GRO, IGFBP-7, IL-6, MCP-1, MIP 2, Smad4, SPARC, TSP, TSP-1, TIMP-1 및 TIMP-2로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 공통으로 분비하는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 포유동물 탯줄의 워튼연육(Wharton's jelly) 조직으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
9. 제 1 항에 있어서, 상기 근위축 질환은 근위축증, 근무력증, 근이영양증, 근경직증, 근긴장저하, 근력약화, 근디스트로피, 근육퇴행위축, 근위축성 측삭경화증 또는 중증 근무력증인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
10. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 비경구 투여용인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 비경구 투여는 근육 내(intramuscular) 투여 또는 혈관 내 투여인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
    
12. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 근육세포의 증식을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
    
13. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 근수축력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
    
14. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 근육 내 젖산 분해를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
    
15. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 근섬유의 크기를 증가시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
    
16. 삭제
17. 제 1 항에 있어서, 상기 탯줄 추출물은 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물:
    (a) 탯줄을 절단하는 단계;
    (b) 상기 절단된 탯줄을 완충액에 넣는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 결과물을 교반하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물을 원심분리하여 탯줄 추출물로서 상층액을 수득하는 단계.
    
18. 제 1 항에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 돼지, 말, 소, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 염소 또는 양인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

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