KR101677293B1

KR101677293B1 - 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 고활성 줄기 세포

Info

Publication number: KR101677293B1
Application number: KR1020100035145A
Authority: KR
Inventors: 김효수; 이은주; 강현재
Original assignee: 서울대학교병원
Priority date: 2010-04-16
Filing date: 2010-04-16
Publication date: 2016-11-17
Also published as: WO2011129607A8; KR20110115688A; WO2011129607A3; WO2011129607A2

Abstract

본 발명은 인간 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 인간 줄기세포 배양시 엔도텔린-1(Endothelin-1)을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 고활성 인간 줄기세포, 상기 고활성 인간 줄기세포를 포함하는 세포치료제 등을 제공한다. 본 발명에 따르면, 다양한 기원의 인간 중배엽 줄기세포의 활성을 증대시키는 것이 가능하며, 궁극적으로 고효율성의 세포치료제를 개발하는데 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

줄기세포의 활성을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 고활성 줄기 세포{Method for increasing stem cell activity and stem cells produced by thereof}

본 발명은 인간 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 고활성 줄기세포, 및 상기 고활성 줄기세포를 포함하는 세포치료제 등에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 분화가 완료되어 세포분열이 정지된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있다. 만능줄기세포(pluripotent stem cells)는 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 전분화능(pluripotency)의 세포로서 배아줄기세포 (embryonic stem cells, ES cells) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPS) 등이 이에 해당된다. 다분화능 및 또는 단분화능 줄기세포로는 성체줄기세포를 예로 들 수 있다.

배아줄기세포는 배아발생초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)로부터 형성되며, 모든 세포로 분화가능한 잠재력을 가지고 있어 어떠한 조직 세포로도 분화될 수 있으며, 또한 사멸하지 않고 미분화상태에서 배양가능하며, 성체줄기세포와 달리 배세포(germ cell)의 제조도 가능하므로 다음 세대로 유전될 수 있는 특징을 가지고 있다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 18: 399-404, 2000).

인간 배아줄기세포는 인간 배아 형성시 세포내괴(inner cell mass) 만을 분리하여 배양함으로써 제조되는데, 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아줄기세포는 불임시술 뒤 남은 냉동배아로부터 얻어진 것이다. 모든 세포로 분화될 수 있는 전분화능을 가진 인간 배아줄기세포를 세포치료제로 이용하기 위한 다양한 시도가 이루어져 왔지만 아직 암발생의 위험과 면역거부반응의 높은 벽을 완전히 제어하지 못하고 있는 실정이다.

이에 대한 보완책으로 최근 보고 되고 있는 것으로 유도만능줄기세포 (iPS) 가 있다. 만능줄기세포의 개념으로 포함되고 있는 iPS 는 분화가 끝난 성체세포를 여러 가지 방법으로 역분화시켜, 분화 초기 단계인 배아줄기세포로의 상태로 회귀시킨 세포이다. 현재까지 iPS 는 유전자 발현과 분화능에서 만능줄기세포인 배아줄기세포와 거의 동일한 성격을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 이러한 iPS 의 경우, 자가 세포를 이용하여 면역거부반응의 위험성은 배제할 수 있으나 암발생의 위험성은 여전히 해결해야 할 과제로 남아있다.

최근 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 면역조절기능과 함께 암발생의 위험성이 없는 중배엽 줄기세포가 제시되고 있다. 중배엽 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포 등으로의 분화가 가능한 다능성을 가진 세포로 면역 반응을 조절하는 기능도 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

중배엽 줄기세포는 골수, 제대혈, 지방조직 등 다양한 조직에서 분리, 배양이 가능하나 각 기원에 따른 세포 표면 표지자가 조금씩 다르기 때문에 중배엽 줄기세포를 명확히 정의하는 것은 용이하지 아니하다. 다만 골세포, 연골세포, 근육세포로 분화가 가능하며, 소용돌이 모양의 형태를 가지고, 기본적인 세포표면 표지자인 CD73(+), CD105(+), CD34(-) 및 CD45(-)를 발현하는 경우 일반적으로 중배엽 줄기세포로 규정하고 있다.

이와 관련하여, 상이한 유전적 기원 및/또는 배경을 가지는 중배엽 줄기세포들의 경우, 위에서 언급한 기존의 중배엽 줄기세포를 규정하는 기준들에 대하여는 서로 유의적 차이를 나타내지 아니하지만 통상적으로 각각의 생체내 활성에 있어서는 차이를 나타내게 된다. 또한 중배엽 줄기세포를 타가 유래 세포치료제로 사용하는 경우, 사용가능한 pool 이 한정적이므로 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도가 낮아도 선택의 여지가 없어 대체가 불가능한 경우가 발생한다.

이에 더하여, 일반적으로 중배엽 줄기세포가 세포치료제로 이용되기 위해서는 재생의학 및/또는 세포치료 분야에서 요구되는 최소 세포수(약 1X10⁹ 정도)를 만족시켜야 하는데, 적정조건을 잡고 기준을 정하는 실험까지 고려한다면 필요한 세포수는 더욱 늘어나게 된다. 따라서 기존의 다양한 기원의 중배엽 줄기세포로부터 이 정도의 양을 공급하려면 in vitro(생체외)실험에서 최소 10번 이상의 계대배양이 필요하게 되는데 이 경우 세포가 노화되고 변형되어 더 이상 세포치료제로서의 목적을 달성하기에는 적합하지 아니하게 되는 문제가 발생한다.

상기의 문제점들을 고려해 볼 때, 중배엽 줄기세포의 활성을 극대화 하고, 아울러 효율이 증대된 줄기세포를 사용하여 적용 세포수를 줄일 수 있는 방안을 찾는 것이 재생의학 및 세포치료제 실용화를 위한 당업계의 과제라 할 수 있을 것이다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 인간 중배엽 줄기세포의 활성을 증대시키고 이로 인해 재생의학 및 세포치료분야에서 요구되는 줄기세포의 효율을 증가시킴으로써, 종래의 다양한 기원의 인간 중배엽 줄기세포의 효율의 한정성을 극복하고 나아가 중배엽 줄기세포의 세포치료제로서의 실용성을 증대시키고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 중배엽 줄기세포의 배양 배지에 엔도텔린-1(Endothelin-1, ET-1)을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 고활성 인간 줄기세포, 상기 고활성 줄기세포를 포함하는 세포치료제 등을 제공한다.

본 발명은 세포치료제의 가장 좋은 자원인 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 효율을 극대화 하는 방법으로 이용될 수 있으며, 또한 본 발명은 현재 사용되고 있는 여러 기원, 다양한 배양 조건의 인간 중배엽 줄기세포 모두에 적용될 수 있는 광범위한 규정화된 활성 증대 방법을 제공한다. 궁극적으로, 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 세포치료제로서의 효율성을 증대시킴으로서 세포치료제의 실용화를 앞당기는데 기여할 수 있을 것으로 기대되며, 나아가 심혈관계질환, 신경계질환 등의 난치병 치료제 개발에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 중배엽 줄기세포의 생장증대에 미치는 엔도텔린-1 의 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 중배엽 줄기세포의 세포주기의 변화에 미치는 엔도텔린-1의 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 중배엽 줄기세포의 분비능에 미치는 엔도텔린-1 의 효과(VEGF RNA level 의 변화)를 나타낸 것이다.
도 4는 중배엽 줄기세포의 분비능에 미치는 엔도텔린-1 의 효과(VEGF Protein level 의 변화)를 나타낸 것이다.
도 5는 엔도텔린 수용체 A 가 중배엽 줄기세포에서 특이적으로 발현됨을 나타낸 것이다.
도 6은 엔도텔린 수용체 A 특이적 블로커(blocker)인 BQ123 처리 후 VEGF 의 발현변화를 나타낸 것이다.
도 7은 엔도텔린 -1 을 처리한 중배엽 줄기세포를 허혈성 심혈관 래트(rat) 모델에 주입한 경우, 심장 크기를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 엔도텔린 -1 을 처리한 중배엽 줄기세포를 허혈성 심혈관 래트(rat) 모델에 주입한 경우, 심전도를 측정하여 이를 수치화한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 다양한 유전적 배경 및/또는 기원을 가지는 인간 중배엽 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 중배엽 줄기세포 배양 배지에 엔도텔린-1 을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 생체내 활성도가 상이한 인간 중배엽 줄기세포들에 대하여 DNA array(어레이)를 실시하여, 가장 큰 생체내 활성을 보이는 세포에서 상대적으로 높은 발현을 보이는 유전자들에 대하여 예의 연구한 결과, 엔도텔린-1 이 상기 중배엽 줄기세포의 활성을 증가시킨다는 사실을 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

엔도텔린-1 은 주로 혈관내피세포에서 생성되는 21개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 유전자 전사 후 처음 생기는 것은 212개의 아미노산으로 구성된 prepro ET-1 인데 효소의 작용으로 38개의 아미노산으로 이루어진 big ET-1이 생성된다. Big ET-1 은 ET 변환효소(endothelin converting enzyme, ECE)의 작용으로 C-terminal의 아미노산이 떨어져 나감으로써 최종산물인 엔도텔린-1 이 생성된다. 엔도텔린-1 은 강력하고도 지속적인 혈관수축작용을 가지고 있기 때문에 많은 연구자들의 관심을 집중시켰다. 엔도텔린-1 은 혈관평활근 세포에서도 생성되나 주된 생합성은 혈관내피세포 내에서 일어난다.

엔도텔린-1 의 생성은 thrombin, angiotensin Ⅱ, vasopressin, transforming growth factor β, tumor necrosis factor α, hypoxia 및 oxidized LDL 등에 의해서 촉진되며 endothelium-derived relaxing factor(EDRF 즉 nitric oxide)에 의해서는 억제된다. 또한 생리적 자극이라고 할 수 있는 shear stress(혈액이 진행하는 방향으로 혈관벽을 밀치는 힘)는 자극의 강도가 약할 때는 엔도텔린-1 의 생성을 촉진하나 클 때는 억제한다.

허혈성 심장질환은 관상동맥의 협착 혹은 폐쇄로 심근 기능의 장애나 괴사가 오는 질환으로서 엔도텔린-1 이 병태생리에 관여할 가능성을 시사하는 여러 가지 소견이 있다. 우선 심근경색증 환자의 급성기에 혈중 엔도텔린-1 이 증가한다는 점을 들 수 있다. 또한 허혈-재관류를 거친 심장의 심근세포는 엔도텔린 수용체 수가 증가하고, 심근으로부터 엔도텔린-1 의 생성-분비가 촉진되며 관상동맥의 엔도텔린-1 에 대한 수축 반응성도 증가된다고 알려져 있다. 이러한 사실들은 엔도텔린-1 이 심근경색에서 병태생리학적 역할을 할 가능성을 시사한다. 엔도텔린-1 이 심근경색의 크기에 영향을 미치리라는 가정 하에 동물을 대상으로 엔도텔린 길항제가 경색의 크기를 감소시킬 수 있는지 관찰한 연구들이 다수 있었다. 그러나 그 결과는 길항제 투여효과가 있다는 보고와 없다는 보고가 공존하여 뚜렷한 결론을 내리기 어렵다.

상기에서 고찰한 엔도텔린-1 의 작용을 고려해 볼 때, 본 발명은 역 발상적으로 엔도텔린을 인간 중배엽 줄기세포에 처리하여 활성을 증대시킨 후 허혈성 심근 경색증에 대한 효과를 본 것이다. 따라서 본 발명은 중배엽 줄기세포의 활성을 증대시켜 세포치료제로서의 효율성을 증대시킴과 아울러, 엔도텔린-1 의 새로운 활용도 및 적응증을 찾아낸 것에 그 의의가 있다 할 것이다.

본 발명은 인간 중배엽 줄기세포 배양 배지에 엔도텔린-1 을 전처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 중배엽 줄기세포의 활성을 증대시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 인간 중배엽 줄기세포는 그 유전적 배경 및/또는 기원에 있어서 제한이 없다. 예를 들면 인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포를 사용할 수 있다.

본 발명자들은 인간 중배엽 줄기세포 배양시 엔도텔린-1 을 전처리한 후 엔도텔린-1 이 중배엽 줄기세포의 활성에 미치는 효과를 살펴보았다. 먼저 중배엽 줄기세포의 생장증대에 미치는 효과를 살펴본 결과, 엔도텔린-1 을 전처리한 중배엽 줄기세포의 경우 엔도텔린-1 을 전처리하지 아니한 대조군에 비하여 세포수가 증대되는 것을 확인하였다(도 1 참조). 또한 세포주기의 변화에 미치는 효과를 살펴본 결과, S 기(합성기)가 증대되는 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

상기 결과로부터, 본 발명은 중배엽 줄기세포를 체외 배양시 노화에 빠지는 것을 막고 아울러 그 세포수를 증가시키는 방법이 될 수 있음을 의미한다. 즉, 엔도텔린-1 을 전처리하게 되면 재생의학 및 세포치료 분야에서 요구하는 세포수를 얻기 위해 중배엽 줄기세포를 계대배양 하는 경우, 노화를 지연시킬 수 있을 뿐만 아니라 보다 적은 수의 계대배양으로 목적하는 수량의 중배엽 줄기세포를 얻을 수 있게 될 것이다.

또한 엔도텔린-1 의 중배엽 줄기세포의 분비능에 미치는 효과를 살펴본 결과, 심혈관 질환을 호전시키는 데 있어서 주요 paracrine(주변분비) 요소인 VEGF(vascular endothelial growth factor, 혈관내피세포 성장인자) 가 엔도텔린-1 전처리에 의해 RNA 및 단백질 수준에서 모두 증대되는 것을 확인할 수 있었다(도 3 및 도 4 참조). 상기 VEGF의 증대가 엔도텔린-1 에 의한 것임을 검증하기 위하여, 먼저 엔도텔린 수용체 A와 B 중 A가 중배엽 줄기세포에서 특이적으로 발현됨을 확인하고(도 5 참조), 수용체 A 특이적 블로커(blocker)인 BQ 123을 처리하여 VEGF 의 발현변화를 관찰하였다. 상기 블로커 처리 후 VEGF 의 RNA 및 단백질 수준에서의 감소를 확인하였으며(도 6 참조), 상기 결과로부터 VEGF의 RNA 및 단백질 수준에서의 증대는 엔도텔린-1 에 의한 것임이 명백해졌다.

다음으로, 엔도텔린-1 이 중배엽 줄기세포의 생체내 활성에 미치는 효과를 살펴보았다. 생체내(in vivo) 활성도 평가를 위해서는 허혈성 심혈관 래트(rat) 모델을 이용할 수 있다. 허혈성 심혈관 래트 모델이라 함은 심장의 관상동맥을 결찰시켜 허혈상태를 유도하여 만든 동물 허혈성 심혈관 질환 모델을 의미한다. 본 발명자들은 엔도텔린 -1 을 전처리하여 배양한 중배엽 줄기세포를 상기 모델의 허혈 주위 심근육에 주입하고 그 결과를 관찰하였다. 먼저 심장의 크기를 비교한 결과, 엔도텔린-1 처리군이 대조군에 비해 심장의 크기가 현저히 작은 것이 관찰되었으며(도 7 참조), 이는 허혈성 심장 질환시 심근세포의 사멸에 따른 섬유화로 심장의 크기가 커지는 것을 상대적으로 현저히 감소시키는 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.

또한 상기 허혈성 모델에 중배엽 줄기세포를 주입하고 4주 후 심전도를 측정하여 생체내 활성도를 평가할 수 있다. 구체적으로, 좌심실 확장기내경(Left ventricular end-diastolic dimension(LVEDD)), 좌심실 수축기내경(Left ventricular end- systolic dimension(LVESD)), 좌심실 분획단축(Left ventricular end-Fractional Shortening(LVFS)), 좌심실 구혈률(Left ventricular end-Ejection Fraction(LVEF)) 을 수치화하여 호전도를 비교할 수 있다. 이때 좌심실 분획단축(LVFS) 은 LVEDD-LVESD/LVEDD으로 정의되며 좌심실 구혈률 (LVEF)은 LVEDD²-LVESD²/LVEDD²로 정의된다. 좌심실 확장기내경(LVEDD) 및 좌심실 수축기내경(LVEDD)이 작을수록, 좌심실 분획단축(LVFS) 및 좌심실 구혈률 (LVEF) 은 클수록 높은 호전도를 나타낸다. 엔도텔린-1 처리군에서 호전도의 표지인 좌심실 분획단축(LVFS) 및 좌심실 구혈률(LVEF)이 대조군에 비하여 현저하게 높게 나타났다(도 8 참조).

상기 결과로부터 엔도텔린-1 이 인간 중배엽 줄기세포의 활성을 증대시킴이 명백하고, 따라서 본 발명은 다양한 기원의 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성을 극대화 시키는 방법으로 이용될 수 있을 것이다.

따라서 본 발명은 고활성 인간 중배엽 줄기세포 제조방법을 제공하며, 상기 방법은 인간 중배엽 줄기세포 배양 배지를 사용하여 상기 중배엽 줄기세포를 부착 배양하는 단계; 및 상기 배양 배지에 엔도텔린-1 을 첨가하는 단계를 포함한다. 아울러 본 발명은 상기 방법에 의해 활성이 증대된 고활성 중배엽 줄기세포를 제공한다. 상기 고활성 줄기세포를 재생의학 및 세포치료분야에서 사용시, 종래의 줄기세포에 비하여 적은 수의 세포로 동일한 효과를 기대할 수 있을 것이다. 또한 본 발명은 상기 고활성 줄기세포를 함유하는 세포치료제를 제공한다.

이에 더하여 본 발명은 고활성 중배엽 줄기세포 제조 키트(kit)를 제공하며, 상기 키트는 α-MEM, FBS 및 엔도텔린-1 을 포함할 수 있다. 상기 키트의 사용은 종래의 여러 기원 및/또는 다양한 배양 조건의 인간 중배엽 줄기세포의 활성을 증대시키는 규정화된 방법이 될 수 있을 것이다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하겠으나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

본 발명에서는 MEDIPOST(주)에서 제공받은 인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포를 사용하였다. 상기 세포는 인간 중배엽 줄기세포 동정 실험을 실시하여 선별된 것으로, 중배엽 줄기세포의 양성 세포 표지자(CD29, CD44, CD73, CD105, CD166, HLA-ABC) 95%이상 표현과 음성 세포 표지자(CD34, CD45, HLA-DR) 5% 미만의 획일적 표현 확인, 및 중배엽 줄기세포의 다중 분화능을 확인한 후 “인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포”로 동정ㆍ분류된 것이다.

실시예 1. 인간 중배엽 줄기 세포의 생체외 ( in vitro ) 활성도 평가

엔도텔린-1 을 전처리하여 배양한 중배엽 줄기세포군과 엔도텔린-1 을 전처리하지 않은 대조군을 이용하여 생체외 활성도 평가를 실시하였다. 하기에서 구체적으로 설명하고자 한다.

(1) 생장 증대에 미치는 효과

상기 중배엽 줄기세포를 α-MEM(Minimum Essential Medium, Invitrogen 사 제조) +10% FBS(fetal bovine serum, 소혈청) 배지를 사용하여 부착 배양하였다 (5X10⁵/60@dish). 배양 24시간 후 10nM 의 엔도텔린-1 을 배지에 첨가하고 72시간 동안 배양하였다.

이후 trypsin 처리하여 단독세포로 분리한 다음, hematocytometer에서 counting 하여 세포수를 비교한 결과를 도 1에 나타내었다. 이때 엔도텔린-1 을 처리하지 않은 동일 세포군을 대조군으로 사용하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 엔도텔린-1 처리군에서 세포증식이 활발하게 일어났음을 알 수 있다.

(2) 세포 주기 변화에 미치는 효과

상기 중배엽 줄기세포를 α-MEM +10% FBS 배지를 사용하여 부착 배양하였다 (5X10⁵/60@dish). 배양 24시간 후 10nM 의 엔도텔린-1 을 배지에 첨가하고 72시간 동안 배양하였다.

이후 trypsin 처리하여 단독세포로 분리한 다음, 핵을 염색하는 PI 를 이용하여 세포 주기를 유세포 분석기(FACS)로 확인한 결과를 도 2에 나타내었다. 이때 엔도텔린-1 을 처리하지 않은 동일 세포군을 대조군으로 사용하였다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 세포의 활성 및 증식의 표지기인 합성기 S기가 엔도텔린-1 처리에 의해 2배 가량 증대되고 반면 휴지기인 G0-G1 기는 감소하는 것으로 나타났다.

(3) 분비능에 미치는 효과

심혈관 질환을 호전시키는 데 있어서 주요 paracrine(주변분비) 요소인 VEGF의 분비에 미치는 엔도텔린-1 의 영향을 살펴보았다. 먼저 RNA 수준에서의 변화를 보기 위하여 실시간 중합연쇄반응(Real-time PCR)을 실시하였다. 구체적으로, VEGF 특이적 primer 를 작성 하고 엔도텔린-1 처리 1, 6, 24, 72시간 후 RNA 를 추출하여 상보적 cDNA 를 합성한 다음, 이를 주형으로 하여 실시간 중합연쇄반응을 수행하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 엔도텔린-1 처리 후 1시간 째부터 VEGF RNA 양이 대조군에 비하여 현저하게 증가하였다.

또한 VEGF 의 단백질 수준에서의 변화를 확인하는 실험을 수행하였다. 구체적으로, RNA 실험군의 배양액을 수확한 후 항체 항원 반응을 이용한 ELISA 로 VEGF 의 분비량을 확인하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 엔도텔린-1 처리군에서 VEGF 의 분비량이 현저하게 증가됨을 알 수 있으며, 시간이 지남에 따라 대조군과의 차이가 더욱 커지는 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터, 엔도텔린-1 처리에 의해 증가된 VEGF RNA 가 VEGF 단백질로 합성되고 또한 안정적으로 잘 유지되고 있다는 것을 알 수 있다.

이에 더하여, 상기 VEGF의 증가가 엔도텔린-1이 엔도텔린 수용체에 결합하여 진행된 결과에 의한 것임을 검증하는 실험을 수행하였다.

먼저 인간 중배엽 줄기세포에서 엔도텔린 수용체(receptor) A 와 B 의 발현여부를 확인하였다. 구체적으로, 엔도텔린 수용체 A, B 특이적 primer 를 작성하고, RNA 를 추출하여 상보적 cDNA를 합성한 다음, 이를 주형으로 하여 중합반응을 수행하고 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이때 GAPDH 를 control 로 사용하였다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 엔도텔린 수용체(receptor) A 와 B 중, 수용체 A 가 중배엽 줄기세포에서 발현되는 것으로 확인되었다.

상기 결과에 따라, 엔도텔린 수용체 A의 블로커(blocker) 처리 시 VEGF 의 RNA 및 단백질 수준에서의 발현 변화를 관찰하였다. 구체적으로, 엔도텔린 수용체 A의 블로커(blocker) 중 통상적으로 쓰이고 있는 BQ123(cyclo(d-a-aspartyl-l-propyl-d-valyl-l-leucyl-d-tryptophyl, Sigma 사 제조)을 사용하여 엔도텔린-1 처리 전에 먼저 BQ123 10uM을 처리하고, 30분 후 엔도텔린-1 10nM을 배양배지에 첨가하여 24시간 배양한 다음, VEGF 의 RNA 및 단백질 수준의 변화를 확인하였다. 이때 BQ123 을 전처리 하지 않고 엔도텔린-1 만을 첨가한 군을 대조군(control)으로 사용하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 엔도텔린-1 에 의해 증가되었던 VEGF 의 RNA 및 단백질 수준이 엔도텔린 receptor A blocker 인 BQ123 에 의해 감소되는 것으로 나타났다.

결론적으로, 엔도텔린-1 이 엔도텔린 수용체에 결합하여 진행된 것에 기인하여 VEGF 의 RNA 및 단백질 수준이 증가되었음이 확인되었으며 이로부터 엔도텔린-1 이 중배엽 줄기세포의 분비능 조절에도 관여하고 있음이 명백하다.

실시예 2. 인간 중배엽 줄기 세포의 생체내 ( in vivo ) 활성도 평가

상기 엔도텔린-1 을 전처리하여 배양한 중배엽 줄기세포와 전처리 하지 않은 대조군을 이용하여 생체내 활성도 평가를 실시하였다.

상기 생체내 활성도를 평가하기 위하여 허혈성 심혈관 래트(rat) 모델을 이용하였다. 상기 허혈성 심혈관 래트 모델이라 함은 심장의 관상동맥을 결찰시켜 허혈상태를 유도하여 만든 동물 허혈성 심혈관 질환 모델을 의미한다.

엔도텔린-1을 전처리하여 배양한 중배엽 줄기세포 1X10⁵개/rat 를 상기 질환 모델 동물에 주입하였으며, 주입 후 4주째에 심초음파를 측정하여 질환의 호전여부를 분석하였다. 또한 심초음파 측정 후 래트를 희생시키고 심장 조직을 샘플링 하여 그 크기를 비교해 보았다. 이때 허혈성 손상 유도후 중배엽 줄기세포 주입군[대조군(엔도텔린-1 비처리 세포 주입군)과 엔도텔린-1 처리 세포 주입군)]에 대하여 허혈성 손상 유도 후 PBS 주입군을 control 로 하였으며, 세포 또는 PBS 의 주입없이 오로지 허혈유도만을 한 군을 상기 세포 또는 PBS 주입군에 대한 control 로 사용하였다. 상기 각각의 군에 대하여 최소 5마리 이상의 래트를 사용하였다.

상기 심장 크기를 비교한 결과를 나타낸 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 엔도텔린-1 처리군(허혈유도심장 +엔도텔린-1 처리 세포)이 비처리 대조군(허혈유도심장 +엔도텔린-1 비처리 세포)에 비해 심장의 크기가 현저히 작은 것이 관찰되었으며, 이는 정상적인 심장과 유사한 크기를 나타내었다. 허혈성 심장 질환시 심근세포의 사멸로 인해 심장의 크기가 증가하게 되는 것이 일반적인 현상이므로(도 7의 허혈유도심장 참조), 심장의 크기가 상대적으로 작다는 것은 심장질환이 호전되었다는 것을 의미한다.

또한 심초음파 결과를 수치화한 결과를 나타낸 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 엔도텔린-1 처리군에서 호전도의 표지인 좌심실 분획단축(LVFS) 및 좌심실 구혈률(LVEF) 이 현저하게 높게 나타났다. 이는 일반적으로 심장이 허혈에 노출되었을 경우, 심장벽의 섬유화로 인해 심벽이 얇아지고, 운동성 상실과 부피 확장이 일어나며 이때 좌심실 분획단축(LVFS) 및 좌심실 구혈률(LVEF)이 감소된다는 점을 고려해 볼 때, 엔도텔린-1 처리 세포를 주입시, 허혈에 노출 되었음에도 통상의 진행과 같은 심벽의 얇아짐, 운동성 상실 및 부피 확장 등과 같은 현상이 상대적으로 현저히 줄어 든 것을 알 수 있다.

상기 결과로부터, 엔도텔린-1 으로 전처리한 중배엽 줄기세포를 세포치료제로 사용하게 되면 엔도텔린-1 을 전처리하지 아니한 중배엽 줄기세포에 비하여 심장질환에 있어서 탁월한 호전 효과를 기대할 수 있음이 명백하다.

결론적으로 본 발명은 세포치료제의 가장 좋은 자원인 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 효율을 극대화 하는 방법으로 이용될 수 있으며, 또한 본 발명은 현재 사용되고 있는 여러 기원, 다양한 배양 조건의 인간 중배엽 줄기세포 모두에 적용될 수 있는 광범위한 규정화된 활성 증대 방법을 제공한다. 궁극적으로 본 발명의 방법에 의해 활성이 증대된 고활성 중배엽 줄기세포의 사용이 가능하게 됨으로써, 인간 중배엽 줄기세포의 세포치료제로서의 효율성을 증대시키고 나아가 세포치료제의 실용화를 앞당기는데 기여할 수 있을 것이다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정, 변경 및 치환이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예 및 첨부된 도면 등은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예 및 첨부된 도면 등에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니하는 것은 당업자에게 명백하다.

Claims

하기 단계를 포함하는, 세포생장 또는 성장인자 분비능이 증진된 인간 중배엽 줄기세포의 제조 방법:
a) 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함된 α-MEM(Minimum Essential Medium) 배양 배지를 사용하여 인간 중배엽 줄기세포를 부착 배양하는 단계; 및
b) 상기 배양 배지에 엔도텔린-1(Endothelin-1)을 첨가하는 단계.
삭제
제1항에 있어서, 상기 엔도텔린-1(Endothelin-1)을 상기 중배엽 줄기세포의 부착배양 24시간 후에 첨가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 인간 중배엽 줄기세포는 인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
삭제
삭제
하기를 포함하는, 세포생장 또는 성장인자 분비능이 증진된 인간 중배엽 줄기세포 제조 키트(kit):
a) α-MEM(Minimum Essential Medium);
b) FBS(Fetal Bovine Serum); 및
c) 엔도텔린-1(Endothelin-1).