CN115040693B

CN115040693B - 含cd56+亚细胞群来源外泌体的生物材料及其制备方法

Info

Publication number: CN115040693B
Application number: CN202210691152.5A
Authority: CN
Inventors: 胡建中; 孙一; 吕红斌; 柳泉波; 许琰
Original assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2022-06-17
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2042-06-17
Also published as: CN115040693A

Abstract

本发明属于生物医用材料领域，尤其涉及一种含CD56⁺亚细胞群来源外泌体的生物材料及其制备方法。包括：甲基丙烯酸酐明胶、脊髓脱细胞基质和外泌体；所述外泌体来源于带有CD56⁺标记的细胞亚群；所述外泌体表达有信号素7A。外泌体表达的促进神经轴突再生的蛋白种类多，外泌体活性高，并且具有信号素7A蛋白，通过活化整合素/MAPK信号通路的作用，可以达到快速促进神经轴突再生，诱导神经轴突再生的能力强；天然的脊髓脱细胞基质成分，能够模拟脊髓的组织微环境，并具有良好的组织相容性和极低的免疫排斥反应；缓释的外泌体保留了生物活力，可以很大程度上发挥干细胞治疗所带来的治疗作用，避免了干细胞移植所带来的相关不良反应，比如免疫排斥等。

Description

含CD56+亚细胞群来源外泌体的生物材料及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，尤其涉及一种含CD56⁺亚细胞群来源外泌体的生物材料及其制备方法。

背景技术

脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是一种严重的中枢神经系统创伤性疾病。脊髓损伤发生后将导致神经功能丧失，严重致残。目前，临床上主要采用脊柱固定和髓内减压、激素应用等治疗减少继发损伤；细胞治疗、神经因子、基因治疗等治疗手段多数处于实验阶段。

多项研究表明间充质干细胞移植可以在衰老，脑损伤和神经退行性疾病等条件下可以促进脊髓损伤的功能恢复。目前临床间充质干细胞的主要来源为骨髓、脐带等。与骨髓来源间充质干细胞相比，人脐带组织作为医疗废物，华通胶含量丰富。但是干细胞治疗在常规临床治疗中，仍有很多问题有待解决，包括移植细胞存活率低，细胞去分化和肿瘤形成等。所以当前迫切需要去寻找一种可以发挥干细胞的积极治疗效果，同时也可以减少相关风险的治疗手段与方法。

外泌体(Exosomes,EXOs)是一种可由多种细胞分泌的纳米级小囊泡，其体内携带着母体细胞核酸和miRNA，蛋白质等多种具有生物活性的成分。外泌体植入也可以避免干细胞直接移植导致的肿瘤等风险和自体的神经干细胞移植涉及的诸多医学伦理问题。干细胞来源外泌体具有与干细胞相似的功能，可以有效促进组织修复及再生，在中枢神经系统损伤修复领域表现出了强大的保护能力，开启了无细胞治疗的新途径。

目前，具有全分化潜能的胚胎干细胞(ESC)、诱导型多能干细胞(iPS)，虽可再生神经，但ESC涉及伦理及致畸胎瘤，iPS涉及致肿瘤以及免疫排斥等风险，均不能用于临床。

现急需一种可以促进神经轴突再生的材料对脊髓损伤处的神经进行修复和再生。

发明内容

本申请提供了一种含CD56⁺亚细胞群来源外泌体的生物材料及其制备方法，以解决如何促使脊髓处神经轴突再生的技术问题。

第一方面，本申请提供了一种含CD56⁺亚细胞群来源外泌体的生物材料，包括：甲基丙烯酸酐明胶、脊髓脱细胞基质和外泌体；所述外泌体来源于带有CD56⁺标记的细胞亚群；所述外泌体表达有信号素7A蛋白。

甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)，是一种光敏性的生物材料，配合光引发剂使用时能在蓝光或紫外光下迅速交联固化，形成具有一定强度的三维结构，结构上具有细胞黏附位点及基质金属蛋白酶水解位点，可良好支持细胞的增殖及迁移，可负载肿瘤细胞、心肌细胞、软骨细胞等多种细胞。可通过改变GelMA材料的浓度来调整交联后水凝胶的力学性能，在负载外泌体时，可以维持和提高外泌体活性，同时，确保外泌体的缓释作用。

脊髓脱细胞基质是脊髓组织经人工萃取及去细胞等处理而来的细胞外基质，具备天然生物材料的优点。脊髓脱细胞基质成分多样，IV型胶原、层粘连蛋白和蛋白多糖不仅可以粘附大量促进神经细胞、血管等组织修复的重要因子，创造适宜神经轴突等细胞生长的微环境，促进细胞的新陈代谢与增殖，还可适度降解、吸收，促进神经轴突再生，重建脊髓的连续性。

外泌体为CD56⁺人脐带华通胶间充质干细胞(Human umbilical cord Wharton'sjelly mesenchymal stem cells，HUCWJMSC)外泌体；来源于带有CD56⁺标记的细胞亚群，其表面表达有CD56蛋白，尤相比于其他细胞来源的外泌体，高表达信号素7A，通过活化整合素/MAPK信号通路，可以增强对神经轴突的再生和修复作用。

优选的，本申请实施例的生物材料包含：以质量分数计，10％的GelMA、5％的脱细胞基质、0.4％的光引发剂、以及终浓度为100μg/mL的外泌体。

本申请实施例中，甲基丙烯酸酐明胶、脊髓脱细胞基质和亚细胞群外泌体组合形成生物材料，甲基丙烯酸酐明胶为作为脊髓脱细胞基质及亚群外泌体的载体，形成缓释体系，脊髓脱细胞基质作为天然成分一方面为内源性神经细胞的粘附提供微环境，另一方面与亚群外泌体协同发挥诱导神经轴突再生。

在一些实施方式中，所述生物材料还包含光引发剂，具体为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂，光引发剂在所述生物材料中的质量分数为0.25-0.5％。

本申请实施例中，控制光引发剂在所述生物材料中的质量分数为0.25-0.5％，具有快速光固化的积极效果，可以避免化学毒性等不利效果。

本申请实施例中，含CD56⁺亚细胞群来源外泌体的生物材料可以用来作为生物墨水，制成生物支架。

在本申请第一方面的实施例中，所述外泌体在所述生物材料中的质量浓度为100-200ug/mL，优选100ug/mL。

在本申请第一方面的实施例中，甲基丙烯酸酐明胶在所述生物材料中的质量分数为10％-15％。

本申请实施例中，控制甲基丙烯酸酐明胶在所述生物材料中的质量分数为10％-15％，具有快速成胶的积极效果，可以避免机械硬度过高不利于神经轴突再生的效果。

在本申请第一方面的实施例中，脱细胞基质在所述生物材料中的质量分数为5-10％。

本申请实施例中，控制脱细胞基质在所述生物材料中的质量分数为5-10％，具有有效诱导神经轴突再生的积极效果，可以避免成胶失败等不利效果。

在本申请第一方面的实施例中，所述CD56⁺标记的细胞亚群来源于人脐带华通胶间充质干细胞。

在本申请第一方面的实施例中，所述生物材料具有光敏固化性能。

在本申请第一方面的实施例中，外泌体的直径≤150nm。

在本申请第一方面的实施例中，所述生物材料以敷料形式涂覆损伤脊髓局部，所述生物材料的用量为80-100ul/cm²。

在本申请第一方面的实施例中，所述外泌体在损伤脊髓局部中的数量为1.5×10⁷～2.5×10⁷个/cm²。

本申请实施例中，控制所述外泌体在损伤脊髓局部中的数量为1.5×10⁷～2.5×10⁷个/cm²，可发挥促进轴突再生的积极效果，可以避免不良反应的发生。

在本申请第一方面的实施例中，所述脊髓脱细胞基质的组分包括：IV型胶原蛋白、层粘连蛋白和蛋白多糖。

本申请实施例中，脊髓脱细胞基质的组分包括IV型胶原蛋白、层粘连蛋白和蛋白多糖，不同组分协同作用可诱导神经轴突再生。

第二方面，本申请提供了一种含CD56⁺亚细胞群来源外泌体的生物材料的制备方法，所述方法包括以下步骤：

得到母体分离后人脐带样本；

将所述人脐带华通胶样本中细胞进行分选，得到标志物为CD56⁺的间充质干细胞亚群；

将间充质干细胞亚群进行培养，收获细胞上清液；

将所述细胞上清液进行过滤、分离和重悬沉淀，得到外泌体；

将外泌体中的蛋白含量进行检测，得到含目标蛋白量的外泌体；

得到脊髓脱细胞基质；

将所述外泌体、脊髓脱细胞基质与甲基丙烯酰化明胶混合，进行共孵育，得到生物材料。

具体地，所述方法包括以下步骤：(1)称取适量GelMA和光引发剂加入磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)中，60℃溶解40min；

(2)称取适量的脊髓脱细胞基质并加入，37℃搅拌溶解，

(3)向所述脊髓脱细胞基质生物墨水中加入CD56⁺HUCWJMSC外泌体，使得其终浓度达到预期浓度，得到目标生物材料；

在一些实施例中，生物材料的制备方法可以包括：

(1)称取1g甲基丙烯酸酐明胶和0.04g光引发剂加入10mL的PBS中，60℃搅拌溶解40min；

(2)向上述获得溶液中加入0.05g脊髓脱细胞基质，37℃搅拌溶解；

(3)向所述脊髓脱细胞基质生物墨水的中加入CD56⁺HUCWJMSC外泌体，使得其终浓度为100μg/mL；

在本申请第二方面的实施例中，所述目标蛋白为信号素7A。

CD56⁺HUCWJMSC的获取

具体地，所述方法包括以下步骤：(1)取新鲜脐带标本，PBS充分洗涤至无血迹，切成3-4厘米长的片段，并将羊膜和脐静脉和脐动脉分离获取华通胶。将华通胶切成1mm³碎块，加入1g/LⅡ型胶原酶中，37℃恒温振荡仪持续消化30min后，随即用0.25％胰酶37℃恒温振荡仪持续消化30min。以70um细胞筛过滤消化液，滤液400G离心5min，弃上清液以PBS洗2次。

(2)使用200μL FACS buffer(2％PBS)重悬细胞，按照2：100的比例分别加入封闭液，孵育10分钟后400G离心5min，收获沉淀。

(3)将上述沉淀用100μL FACS buffer重悬，加入0.1ul zombie活死染料，常温孵育15min，400G离心5min后收获沉淀。

(4)使用100μL standing buffer重悬沉淀，按照1：100的比例加入配制CD31、CD235a、CD45、CD90、CD73和CD56抗体，避光孵育30min。

(5)400G的转速下离心5min，使用500μL FACS buffer重悬细胞。

(6)使用细胞筛过滤细胞悬液为单细胞悬液，上机检测，获得CD56⁺HUCWJMSC。CD56⁺HUCWJMSC外泌体的提取

(1)当CD56⁺HUCWJMSC长至约80％密度时，弃去培养上清，使用PBS洗2遍后，更换含10％无外泌体FBS的MEM-α培养基继续培养48h,收集细胞上清即条件培养基。随后条件培养基按以下步骤处理：

(2)条件培养基在4℃，500G离心10min，收集上清。

(3)在4℃，2000G离心30min，收集上清。

(4)在4℃，10000G离心60min，收集上清。

(5)使用0.22μm孔径的滤器过滤上清。

(6)4℃，110000G离心90min，小心吸出上清，预冷的PBS重悬沉淀。

(7)4℃，110000G离心90min，小心吸出PBS，加入100-200μL预冷的PBS重悬底部沉淀，分装后于-80℃保存。

在本申请第二方面的实施例中，所述分选通过流式细胞仪分选间充质干细胞亚群。

本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本申请实施例提供的生物材料，包括：甲基丙烯酸酐明胶、脊髓脱细胞基质和外泌体；所述外泌体来源于带有CD56+标记的细胞亚群；所述外泌体表达有信号素7A蛋白；从中提取的外泌体中，外泌体表达的促进神经轴突再生的蛋白种类多，外泌体活性高，并且具有信号素7A蛋白，通过活化整合素/MAPK信号通路，可以达到快速促进神经轴突再生，诱导神经轴突再生的能力强；天然的脊髓脱细胞基质成分，能够模拟脊髓的组织微环境，并具有良好的组织相容性和极低的免疫排斥反应；经光固化后形成缓释体系，缓释的外泌体保留了生物活力，可以很大程度上发挥干细胞治疗所带来的治疗作用，同时也避免了干细胞移植所带来的相关不良反应，比如免疫排斥等；使用时，添加光引发剂进行固化。。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例提供的人脐带华通胶间充质干细胞亚群(CD56⁺HUCWJMSCs)的分选图；

图2为本申请实施例提供的人脐带华通胶间充质干细胞亚群外泌体的提取和鉴定图；

图3为本申请实施例提供的CD56⁺HUCWJMSC-EXOs促脊髓损伤小鼠的功能恢复作用；

图4为本申请实施例提供的CD56⁺HUCWJMSC-EXOs对神经轴突再生的影响；

图5为根据本发明一个实施例的方法制备的脊髓脱细胞基质的去细胞表征图；

图6示出本发明一个实施例的生物材料对外泌体的缓释曲线图；

图7为本申请实施例提供的生物材料对脊髓损伤小鼠的功能恢复作用图。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请实施例所用的脐带样本在分娩后健康母亲那里获得，本研究经中南大学湘雅医院伦理评审委员会批准，并在采集样本前获得所有参与者的知情同意；实验仪器和试剂均为市售。

实施例1

人脐带华通胶间充质干细胞CD56⁺亚群(CD56⁺HUCWJMSC)的制备。

本研究经中南大学湘雅医院伦理评审委员会批准，并在采集样本前获得所有参与者的知情同意。在分娩后从健康母亲那里获得人脐带样本，并在收集后6小时内进行处理。首先用含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤脐带两次以除去期待上残留的血液。在培养皿中将冲洗过的脐带切成3-4厘米长的片段，并将羊膜和脐静脉和脐动脉分离获取华通胶。然后，将华通胶切成1mm³碎块并加入1g/LⅡ型胶原酶中，37℃恒温振荡仪持续消化30min后，随即用0.25％胰酶37℃恒温振荡仪持续消化30min。以70um细胞筛过滤消化液，滤液400G离心5min，弃上清液以PBS洗2次。

以流式细胞仪分离CD56⁺HUCWJMSC，首先利用通用技术分离一些杂质细胞，然后利用CD73抗体、CD90抗体，实施流式细胞仪法分选人脐带华通胶间充质干细胞。CD56⁺HUCWJMSC代表了高度富集CD56人脐带华通胶间充质干的细胞亚群，其中HUCWJMSC代表了人脐带华通胶间充质干细胞。

根据需要利用抗CD56抗体，实施流式细胞仪法分选人脐带华通胶间充质干细胞亚群。人脐带华通胶间充质干细胞亚群标志物为CD56⁺。

将人脐带华通胶间充质干细胞亚群并转移至DMEM/F-12中，并补充10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

如图1所示，图1中的6幅图按箭头标号依次为：①去除碎片得到细胞过程图(横坐标为前向散射光-曲线下面积信号相对强度，反映细胞的体积，纵坐标为侧向散射光信号相对强度，反映细胞的颗粒度)、②获得单个细胞图(框内得到单个细胞比率较高，横坐标为前向散射光-曲线下面积信号相对强度，纵坐标为前向散射光-宽度信号相对强度)、③获得活细胞图(框内为活细胞，框外为死细胞；DAPI为4',6-二脒基-2-苯基吲哚，横坐标为DAPI荧光信号相对强度，纵坐标为侧向散射光信号相对强度，反映细胞的颗粒度)、④获得CD45/235a/31^-细胞图(横坐标为CD45/235a/31的荧光信号相对强度，纵坐标为侧向散射光信号相对强度，反映细胞的颗粒度，此过程去掉了内皮细胞，免疫细胞和血细胞)、⑤获HUCWJMSC细胞图(框内的为人脐带华通胶间充质干细胞，横坐标为CD90⁺荧光信号相对强度，纵坐标为CD73⁺荧光信号相对强度，CD90⁺和CD73⁺为HUCWJMSC的标志物)、⑥获得CD56+HUCWJMSC的图(框内为带有CD56⁺标记的细胞亚群，横坐标为CD56⁺荧光信号相对强度，纵坐标为侧向散射光信号相对强度)，其中，通过图中圈出来的部分为目标细胞，6个图为目标亚细胞群的获得过程；分选后细胞的干细胞的标志物CD73、CD90的阳性率为25.5％(是从图中可直接测得阳性率)；分选后细胞的CD56阳性率为6.57％，通过两个阳性率说明了得到了CD56⁺HUCWJMSC亚群。

而现有技术中，往往只得到了人脐带华通胶间充质干细胞，没有得到具有特定标记物的人脐带华通胶间充质干细胞亚群，而本申请的带有CD56⁺标记的细胞亚群，其从中提取的外泌体，相比其他未分选的人脐带华通胶间充质干细胞，经研究，具有明显更强的促进神经轴突再生的能力。

实施例2

人脐带华通胶间充质干细胞中CD56⁺细胞亚群外泌体制备

待CD56⁺细胞亚群生长至60-％70％汇合度时，集培养上清液经0.22μm滤膜过滤后，依次经4℃，500G离心10min；4℃，2000g离心30min；4℃，10000g离心60min；110000g离心90min后，弃上清，使用磷酸盐缓冲液重悬沉淀；再次110000g离心90min，弃上清，少量磷酸盐缓冲液重悬沉淀，得到外泌体后保存于-80℃，图2中，A.光镜下CD56⁺标记的细胞亚群培养7天的图片，显微镜放大倍率为100×，通过图，说明了分选后的CD56⁺标记的细胞亚群具有典型间充质干细胞长梭形形态特点。B.为透射电镜观察CD56⁺HUCWJMSC-EXOs的形态。C.使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)获得CD56⁺HUCWJMSC-EXOs的粒径分布和图像，横坐标为外泌体的粒径，纵坐标为相对浓度。D对外泌体的特异性标记物进行蛋白质印迹(WB)分析，结果显示CD63和TSG101明显存在。

实施例3

亚群外泌体促进小鼠脊髓损伤模型功能修复能力

所有动物操作由中南大学动物伦理委员会授权。常规麻醉、备皮、消毒、铺单。以T10棘突为中心依次切开皮肤、皮下、肌肉和椎板，显露脊髓。采用背侧半切法，背侧切断1mm建立脊髓半切模型。冲洗伤口，逐层关闭切口，敷料覆盖伤口并固定。所有小鼠均饲养于动物实验室内，环境温度22～24℃，相对湿度60％～80％。术后分笼饲养，标准饲料和饮水让其自行摄食。术后3d常规予以青霉素2WU/Bid肌内注射抗感染。每天挤压膀胱2～4次帮助排尿，直到排尿反射恢复。

在脊髓损伤后1、3、7、14、21、28、42和56天分别使用BMS(Basso Mouse Scale)主评分和副评分系统评估脊髓损伤后小鼠后肢的运动功能和运动协调及稳定功能，BMS主评分一共9分，从0分到9分，评分越高运动功能恢复越好；BMS副评分一共11分，评分越高运动稳定性和协调性越好。由两名熟悉BMS评分的研究者在实验设计中双盲观察每只小鼠5分钟。然后记录每只小鼠的平均得分。

图3中A图横坐标为Pre-sur(脊髓损伤前的时间点)、SCI 1D、SCI 3D、SCI 7D、SCI14D、SCI 21D、SCI28D、SCI42D和56D(依次为脊髓损伤后第1，3，7，14，21，28,42及56天的时间点)，纵坐标代表了BMS主评分，从0-9分，评分越高，说明了小鼠后肢运动功能恢复越好；B图横坐标为Pre-sur(脊髓损伤前的时间点)、SCI 1D、SCI 3D、SCI 7D、SCI 14D、SCI 21D、SCI28D、SCI42D和56D(依次为脊髓损伤后第1，3，7，14，21，28，42及56天的时间点)，纵坐标代表了BMS主副评分，从0-11分，评分越高，说明了小鼠后肢运动稳定性和协调性恢复越好；图中0/50/100/150/200分别代表了外泌体的不同浓度(单位是ug/mL)。

通过图3可知，100-200μg/ml CD56⁺HUCWJMSC-EXOs治疗可显著改善小鼠脊髓损伤后的双下肢运动功能和运动的稳定性和协调性。

实施例4

外泌体促进神经轴突再生能力

解剖孕13-14天孕鼠，取出孕囊，取胎鼠大脑皮层组织经消化、离心、重悬后，使用完全培养基(高糖DMEM培养基、10％FBS、1％青霉素/链霉素双抗)，接种于多聚赖氨酸预先包被的6孔板中。4小时后更换神经元特异性培养基(含有2％B27，0.24％GLUTA-MAX和100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Neurobasel培养基)，三天换液一次。分别用实施例2制得的亚群外泌体(浓度100-200μg/ml)，未分选HUCWJMSC-EXOs(浓度100-200μg/ml)以及PBS(对照组)处理皮层神经元细胞，3天后固定，进行Tuj-1染色，观察轴突再生情况。通过图4可知，本申请的亚群外泌体具有更强的促进神经轴突再生的能力。

实施例5

脊髓脱细胞基质的制备

(1)取12周龄SD雌性大鼠，脱颈处死后切开背侧皮肤，剥离肌肉、韧带后暴露椎管，用椎板钳去除椎骨，将胸段脊髓组织完整取出，置于盛有无菌生理盐水的培养皿中，用显微镊及显微剪仔细剥除硬膜及表面血管，获得新鲜的胸段脊髓组织。

(2)将上述获得的脊髓组织用PBS清洗3次，每次30min，用纱布包裹；将脊髓组织在液氮中冷冻2min，37℃恒温水浴锅中解冻10min，循环5次；随后用1％双抗/PBS漂洗30min，重复3次，37℃核酸酶溶液中消化2小时；样品经冻干、球磨仪磨成粉末，消毒后保存与-80℃冰箱。

(3)脱细胞脊髓组织切片DAPI染色：取脊髓脱细胞组织，4％多聚甲醛固定12h，依次经20％和30％蔗糖梯度脱水。OCT包埋，于冰冻切片机切片，切片厚度16μm。将切片复温1h后，PBS洗涤3次，每次 3min，将DAPI染色液滴加于标本处，室温下避光孵育3min，封片后使用荧光显微镜拍摄图像。通过图5可知，本申请的脊髓脱细胞基质中DNA含量低，脱细胞效果较好。

实施例6

含亚群外泌体的生物墨水构建及应用

(1)脱细胞基质生物墨水的制备：称取1g甲基丙烯酸酐明胶和0.04g光引发剂加入10mL的PBS中，60℃搅拌溶解40min；向上述获得溶液中加入0.02g脊髓脱细胞基质，37℃搅拌溶解。

(2)含亚群干细胞外泌体生物墨水的制备：向所述脊髓脱细胞基质生物墨水的中加入CD56+HUCWJMSC外泌体，使得其终浓度为100μg/mL。

(3)构建小鼠脊髓背侧半切模型，将上述获得的含亚群干细胞外泌体生物墨水加热到37-40℃，使其处于水相，在损伤脊髓局部以敷料形式按照100ul/cm²覆盖亚群外泌体-凝胶缓释制剂，此外，分别覆盖PBS-凝胶制剂、HUCWJMSC-EXOs-凝胶制剂和脊髓脱细胞基质-凝胶制剂作为对照。于365 405nm60mW/cm²条件下光照至少30s，使水凝胶从水相转变为固相，缝合伤口。CD56⁺HUCWJMSC-EXOs代表了CD56⁺人脐带华通胶间充质干细胞外泌体。

(4)外泌体的释放测定：将光固化后的含亚群干细胞外泌体生物墨水置于Transwell上室(8μm)，在下室加入150μL 的PBS，放入37℃的培养箱中孵育。在预定时间从下室取出15μL PBS并加入等体积PBS。使用micro BCA试剂盒测量各时间点取出的PBS的蛋白质含量，进而计算外泌体的释放百分比。

图6中横坐标为时间，纵坐标代表了外泌体释放率，数值越高，说明外泌体释放越多。

通过图6可知，含亚群干细胞外泌体生物材料可以稳定释放外泌体长达24天以上。

(5)在实施例3基础上在脊髓损伤后1、3、7、14、21、28、42和56天使用BMS评分系统评估含亚群干细胞外泌体生物材料对脊髓损伤后小鼠后肢的运动功能的治疗作用。

通过图7可知，其横坐标和纵坐标含义与图3相同，图中，A.含亚群干细胞外泌体生物材料可显著改善小鼠脊髓损伤后的双下肢运动功能。B.含亚群干细胞外泌体生物材料可显著提高小鼠脊髓损伤后的双下肢运动稳定性和协调性。

此外，为了研究不同变量浓度对生物墨水的影响，发明人在这个实例的基础上进行了若干组对照试验，试验变量的具体变化如下表所示：

变量名称	第一组	第二组	第三组	单位
					GelMA	10％	12.5％	15％	质量百分比
DCM	5％	7.5％	10％	质量百分比
					光引发剂	0.25％	0.4％	0.5％	质量百分比
外泌体终浓度	100	150	200	μg/mL

每个变量选择一个具体数值，作为一个实验组，例如：

GelMA(12.5％)、DCM(5％)、光引发剂(0.4％)、以及终浓度为100μg/mL的CD56+HUCWJMSC外泌体作为一个实验组，实验结果表明，这些实验方案均可以获得生物墨水，使用这些生物材料可以得到用于神经轴突再生，性能测试结果与前述实例类似，实验结果重复较多，不再赘述。

通过实验证实，外泌体在质量浓度为100-200ug/mL时，相比其他浓度，促进神经轴突功能恢复效果更好。通过BMS评分和Tuj-1染色实验证实，所述CD56⁺亚群外泌体，相比未分选细胞外泌体，促进脊髓神经功能恢复效果更好，原因在于促进轴突再生能力更强。

通过BMS评分系统实验证实，本申请的生物材料以敷料形式涂覆损伤脊髓局部，所述外泌体水凝胶混合体系的用量为80-100ul/cm²。此时所述损伤脊髓局部中具有活性的外泌体的数量约为1.5×10⁷～2.5×10⁷个/cm²，可以通过促进神经轴突再生至损伤前70％左右，达到促进脊髓神经恢复的效果。

需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种含CD56^₊亚细胞群来源外泌体的生物材料，其特征在于，包括：甲基丙烯酸酐明胶、脊髓脱细胞基质和外泌体；所述外泌体来源于带有CD56^₊标记的细胞亚群；所述外泌体表达有信号素7A蛋白；所述外泌体的直径≤150nm；所述外泌体在所述生物材料中的质量浓度为100-200ug/mL。

2.根据权利要求1所述的生物材料，其特征在于，甲基丙烯酸酐明胶在所述生物材料中的质量分数为10％-15％；和/或，

脱细胞基质在所述生物材料中的质量分数为5-10％。

3.根据权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述CD56 ^₊标记的细胞亚群来源于人脐带华通胶间充质干细胞；

和/或，所述生物材料具有光敏固化性能。

4.根据权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料以敷料形式涂覆损伤脊髓局部，所述生物材料的用量为80-100ul/cm ^₂。

5.根据权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述外泌体在损伤脊髓局部中的数量为1.5×10 ⁷～2.5×10⁷ 个/cm ^₂。

6.根据权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述脊髓脱细胞基质的组分包括：IV型胶原蛋白、层粘连蛋白和蛋白多糖。

7.一种如1-6中任意一项所述的含CD56^₊亚细胞群来源外泌体的生物材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

得到母体分离后人脐带样本；

将所述人脐带样本中细胞进行分选，得到标志物为CD56^₊的间充质干细胞亚群；

将间充质干细胞亚群进行培养，收获细胞上清液；

得到脊髓脱细胞基质；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白为信号素7A。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分选通过流式细胞仪分选间充质干细胞亚群。