TW202113069A - 包括脂肪幹細胞和明膠的生物材料和產生該生物材料之方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於包括脂肪幹細胞(ASC)、細胞外基質及明膠的生物材料，本發明亦關於用於產生上述生物材料的方法及上述生物材料的用途。

Description

包括脂肪幹細胞和明膠的生物材料和產生該生物材料之方法

本發明關於幹細胞領域及其於產生多維度生物材料的用途。特別地，本發明關於包括脂肪幹細胞(ASC)的生物材料、用於製備及使用該生物材料於治療的方法。

組織工程化涉及經由利用活細胞的組織結構或功能的回復。一般過程係由細胞單離及增殖，接著為其中使用支架材料的再植入程序所組成。間葉系幹細胞提供成熟組織細胞的良好替代品且具有多種優勢作為例如骨及軟骨組織再生的細胞來源。

藉由定義，幹細胞係特徵化為其進行自我更新的能力以及其進行多譜系分化及形成終分化細胞的能力。理想地，用於再生醫學應用的幹細胞應符合下列要件：(i)應可見於豐富的量(數百萬至數十億的細胞)；(ii)可藉由最低地侵入性程序收集及收獲；(iii)只要細胞譜系途徑為可複製方式即可分化；(iv)可安全地及有效地移植至自體的宿主或同種異體的宿主。

研究已顯示幹細胞具能力分化為中胚層、內胚層及外胚層起源的細胞。MSC的可塑性最常指稱幹細胞內保留的跨譜系障礙及適用獨特於其他組織的細胞的表現型性質、生化性質及功能性質的固有能力。成年人的間葉系幹細胞，例如，可單離自骨髓及脂肪組織。

脂肪幹細胞(Adipose-derived stem cell)為多能性且具有深厚的再生能力。已使用下述用語以鑑定相同脂肪組織細胞族群：脂肪幹細胞/基質細胞(ASC)；脂肪組織衍生的成年幹細胞(ADAS)、脂肪組織衍生的成年基質細胞、脂肪組織衍生的基質細胞(ADSC)、脂肪組織基質細胞(ASC)、脂肪組織間葉系幹細胞(AdMSC)、脂母細胞、周細胞、前脂肪細胞、脂肪組織提取細胞(Processed Lipoaspirate(PLA)Cells)。此多歧化命名學的使用已導致文獻中的顯著混淆。解決此議題，國際脂肪應用技術學會達成共識採用用語「脂肪幹細胞(Adipose-derived Stem Cells(ASC))」以鑑定經單離、塑料-黏附、多能性細胞族群。

組織重建涵括骨及軟骨的重建，然而也涵括真皮、表皮及肌肉的重建。目前，各組織缺損應以特異性療法治療，對於各者需要不同的發展。

然而所屬技術領域對於組織之重建及/或再生所使用的組織工程材料仍有需求，該等材料為完全地生物可相容的且對於所設計的應用提供合適的機械特徵，儘管可使用於廣範圍的組織。因此，本發明關於由經分化於具有明膠的多維度結構中的ASC所製成的移植物。

本發明關於具有多維度結構的生物材料，該生物材料包括脂肪幹細胞(ASC)、細胞外基質及明膠。

一具體例中，明膠為豬明膠。一具體例中，明膠呈粒子型。一具體例中，明膠具有平均直徑範圍由約50μm至約1000μm，較佳地由約75μm至約750μm，更佳地由約100μm至約500μm。

一具體例中，該生物材料為三維度。

某具體例中，該生物材料為可模塑的或可成形的。

一具體例中，該ASC分化為選自下述所成群組的細胞：成骨細胞、軟骨細胞、角質細胞、肌纖維母細胞、內皮細胞及脂肪細胞。

本發明亦關於包含上文所述之多維度生物材料的醫療裝置或醫藥組成物。

本發明之另一態樣係用於產生上文所述之多維度生物材料，包含步驟：

-脂肪幹細胞(ASC)增殖，

-ASC分化於第四繼代，以及

-多維度誘導，較佳為3D誘導。

本發明進一步關於藉由上文所述方法獲得之多維度生物材料。

本發明之另一目的係上文所述生物材料用於治療組織缺損的用途。一具體例中，該組織係選自下述所成群組：骨、軟骨、真皮、表皮、肌肉、內皮及脂肪組織。

第1A圖及第1B圖係顯示生物材材料的宏觀視角照相圖。第1A圖：於骨分化培養基培養2.5週之豬明膠(Cultispher G)及ASC形成的生物材料。第1B圖：於骨分化培養基培養7.5週之豬明膠(Cultispher G)及ASC形成的生物材料。

第2A圖及第2B圖係顯示於骨分化培養基培養7.5週之豬明膠(Cultispher G)及ASC形成的生物材料的蘇木素-伊紅染色照相圖。第2A圖：原始放大率x5。第2B圖：擴大x10。

第3A圖及第3B圖係顯示於骨分化培養基培養7.5週之豬明膠(Cultispher G)及ASC形成的生物材料的Von Kossa染色照相圖。第3A圖：原始放大率。第3B圖：擴大x10。

第4A圖及第4B圖係顯示於骨分化培養基培養7.5週之豬明膠(Cultispher G)及ASC形成的生物材料的骨鈣素表現照相圖。第4A圖：原始放大率。第4B圖：擴大x10。

第5A圖至第5L圖係顯示以ASC及Cultipher G形成的本發明的生物材料於骨分化培養基(生物材料)，相較於ASCc於MP(MP)的基因表現圖。第5A圖：ANG；第5B圖：ANGPT1；第5C圖：EPHB4；第5D圖：EDN1；第5E圖：THBS1；第5F圖：PTGS1；第5G圖：LEP；第5H圖：VEGFA；第5I圖：VEGFB；第5J圖：VEGFC；第5K圖：IDI；及第5L圖：TIMP1。*：p<0.05。

第6A圖至第6D圖係顯示以ASC及Cultipher G形成的本發明的生物材料於骨分化培養基於不同成熟程度圖。第6A圖：4週；第6B圖：8週；第6C圖：12週；及第6D圖：25週。礦化在透明顯示的3D矩陣中展示為黃色。

第7圖為以於骨分化培養基培養7.5週之豬明膠(Cultispher G或S)及ASC形成的生物材料於裸大鼠植入後第29日的「植入物位點」的放射照相圖。

第8圖為以於骨分化培養基培養7.5週之豬明膠(Cultispher G或S)及ASC形成的生物材料於Wistar大鼠植入後第29日的「植入物位點」的放射照相圖。

第9圖係顯示以於骨分化培養基培養7.5週之豬明膠(Cultispher G或S)及ASC形成的生物材料的Von Kossa染色照相圖。

第10圖係顯示以於骨分化培養基培養7.5週之豬明膠(Cultispher S)及ASC形成的生物材料的蘇木素-伊紅染色的照相圖。

第11圖係顯示以於骨分化培養基培養7.5週之豬明膠(Cultispher S)及ASC形成的生物材料於裸大鼠植入後第29日的Von Kossa染色照相圖。

第12A圖及第12B圖係顯示裸大鼠中「植入物位點」的放射照相圖。第12A圖：以於骨分化培養基培養7.5週豬明膠(Cultispher G或S)及ASC形成的生物材料植入後第29日。第12B圖：單以豬明膠(Cultispher G或S)形成的生物材料植入後第29日。

第13A圖至第13C圖係顯示大鼠於第0(D0)、15(D15)、23(D23)及34(D34)日的大鼠的腳的創傷癒合照相圖。第13A圖：無植入；第13B圖：Cultispher S粒子單獨植入後；及第13C圖：以於骨分化培養基培養8週之豬明膠(Cultispher S)及ASC形成的生物材料植入後(C)。左肢：缺血腳；右肢：非缺血腳。

第14圖係顯示於非缺血腳(黑色條)及缺血腳(白色條)之未處理(偽組)或經以Cultispher S粒子單獨(Cultispher)或以於骨分化培養基培養8週之豬明膠(Cultispher S)及ASC形成的生物材料(生物材料)處理的創傷尺寸的曲線下面積(AUC)柱狀圖，與固定為100%的偽組比較予以評估。

第15A圖及第15B圖係顯示以Cultispher S粒子單獨(正方形)或以於骨分化培養基培養8週之豬明膠(Cultispher S)及ASC形成的生物材料(圓形)處理，或 未處理(偽組，三角形)第0日至第34日後的創傷面積百分比圖。第15A圖：於非缺血腳；第15B圖：於缺血腳。

第16A圖及第16B圖係顯示未處理(偽組，左)、經以Cultispher S粒子單獨(中間)或本發明之生物材料(右)處理之完全創傷閉合的日數圖。第16A圖：非缺血腳；第16B圖：缺血腳。

第17A圖至第17C圖係顯示缺血腳處理後第0日至第34日的淋巴球CD3(黑線)及巨噬細胞CD68(灰線)的數目圖。第17A圖：未處理(偽組對照)。第17B圖：以Cultispher S粒子單獨處理。第17C圖：以於骨分化培養基培養8週之以豬明膠(Cultispher S)及ASC形成的生物材料處理。

第18A圖及第18B圖係顯示未處理(偽組對照)後、或Cultispher S粒子單獨植入後(Cultisphers)及以於骨分化培養基培養8週之豬明膠(Cultispher S)及ASC形成的生物材料植入後第15日及第34日的創傷厚度圖。第18A圖：於缺血模式中。第18B圖：於非缺血模式中。

第19A圖至第19D圖係顯示以Cultispher S粒子單獨(打點柱狀圖)或以於骨分化培養基培養8週之豬明膠(Cultispher S)及ASC形成的生物材料(黑色柱狀圖)處理後，或未處理(偽組，條文柱狀圖)後第1、5、15及34日之非缺血腳的表皮及真皮分數的處理後第1、5、15及34日之非缺血腳的表皮及真皮分數的柱狀圖。第19A圖：非缺血腳的芯的表皮給分。第19B圖：非缺血腳的周邊的表皮給分。第19C圖：非缺血腳的芯的真皮給分。第19D圖：非缺血腳的周邊的真皮給分。

第20A圖至第20D圖係顯示以ASC及粒子於不同培養基中所獲得的結構照相圖。第20A圖：成骨性培養基；第20B圖：軟骨性培養基；第20C圖：成肌 纖維性培養基；及第20D圖：角質性培養基。評估結構角蛋白原化(keratinogenic)培養基。結構型態(1.)、貼合性(2.)、蘇木素-伊紅染色(3.)及組織特異性染色(4.)，亦即對於成骨性培養基為骨鈣素(OC)，對於軟骨培養基為艾爾遜藍(alcian blue(AB))，對於成肌纖維性培養基為α-SMA，以及對角質培養基為CD34。

定義

本發明中，下述用語具有下述意義：

用語「約」於值之前意指該值的正或負10%的值。

用語「脂肪組織」指稱任何脂肪組織。脂肪組織可為棕色或白色脂肪組織，衍生自皮下、網膜/內臟、乳腺、性腺或其他脂肪組織位點。較佳地，脂肪組織為皮下白色脂肪組織。該等細胞可包括初代細胞培養物或不死化細胞株。脂肪組織可來自具有脂肪組織的任何有機體，無論存活或死亡。較佳地，脂肪組織為動物的，更佳為哺乳動物的，最佳地該脂肪組織為人類的。脂肪組織的傳統來源係來自抽脂手術，然而，脂肪組織的來源或脂肪組織單離的方法對本發明非關鍵性。

用語「脂肪幹細胞」當使用於本文時，指稱脂肪組織的「非脂肪細胞」部分。細胞可為新鮮的，或於培養物中。「脂肪幹細胞」(ASC)指稱起源於脂肪組織的基質細胞，其可作為各種不同細胞類型的前驅物，例如，但不限於脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞。

用語「再生」或「組織再生」包含，但不限於，來自本揭露的ASC之新細胞類型或組織生長、產出或重建。一具體例中，該等細胞類型或組織包含 但不限於成骨性細胞(例如，成骨細胞)、軟骨細胞、內皮細胞、心肌細胞、造血細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經元細胞及肌小管。特別的具體例中，用語「再生」或「組織再生」指稱來自本揭露之ASC的成骨性細胞(例如，成骨細胞)的產出或重建。

用語「生長因子」當使用於本文時，為促進組織生長、細胞增殖、血管化等的分子。特別的具體例中，用語「生長因子」包含促進骨組織的分子。

用語「經培養」當使用於本文係指稱一種或多種細胞其於試管內、活體內或離體環境中正進行細胞分裂或不進行細胞分裂。試管內環境可為使合用於試管內維持細胞之所屬技術領域中習之的任何培養基，例如，合適的液體培養基或瓊脂。對於細胞培養之合適的試管內環境的具體實例係揭示於Culture of Animal Cells：a manual of basic techniques(3rd edition),1994,R.1.Freshney(ed.),Wiley-Liss,Inc.；Cells：a laboratory manual(vol.1),1998,D.L.Spector,R.D.Goldman,L.A.Leinwand(eds.),Cold Spring Harbor Laboratory Press；以及Animal Cells：culture and media,1994,D.C.Darling,S.J.Morgan John Wiley and Sons,Ltd。

用語「匯合」指稱細胞培養表面(如培養皿或燒瓶)的貼附細胞數，意即，表面由細胞所覆蓋的比例。匯合100%意指表面完全由細胞所覆蓋。一具體例中，表現「細胞達匯合」或「細胞為匯合的」意指細胞覆蓋表面的80至100%。一具體例中，表現「細胞為次匯合的」意指細胞覆蓋表面的60至80%。一具體例中，表現「細胞為過匯合的」意指細胞覆蓋至少表面的100%及/或數小時或數日以來為100%匯合的。

用語「進行冷藏」或「冷藏」指稱將溫度帶至低於對象正常生理溫度的處理。例如，於選自範圍為約196℃至約+32℃的一個或多個溫度，持 續延伸時間期間，例如，至少約一小時、至少約一日、至少約一週、至少約四週、至少約6週等。一具體例中，「進行冷藏」或「冷藏」指稱將溫度帶至低於0℃的處理。進行冷藏可手動地實施，或較佳地使用能執行冷藏程式的臨時設備(ad hoc apparatus)實施。一具體例中，用語「冷藏」包含所屬技術領域習知的方法如「冷凍」及「冷凍保存」。所屬技術領中具有通常知識者將理解進行冷藏的方法可包含其他步驟，包含添加用於該目的的藥劑。

用語「非胚胎細胞」當使用於本文指稱不是從胚胎單離的細胞。非胚胎細胞可為分化的或未分化的。非胚胎細胞可指稱幾乎任何體細胞，如自前子宮動物單離的細胞。該等實例無限制意味。

用語「分化的細胞」當使用於本文指稱已由非特化表現型發展為特化表現型的前驅者。例如，脂肪幹細胞可分化為成骨細胞。

用語「分化培養基」當使用於本文指稱使用於本發明之培養系統的一組化合物以產生分化的細胞。沒有意圖限制化合物的作用模式。例如，可藉由誘導或有助於表現型改變、促進具有特別表現型的細胞生長或阻滯其他者的生長而可有助於分化過程的藥劑。其亦可作為對於其他因子的抑制劑，該等其他因子可藉由細胞族群於培養基中合成，否則將分化導向非所期望的細胞類型的途徑。

用語「處理」、「進行處理」或「緩和」指稱其中目的為預防或減緩(減少)骨缺損的醫治療處理。需要處理者包含已具有該等疾患者以及易罹患疾患者或與預防骨缺損者。個體係成功地「經處理」骨缺損，若在接受治療有效量之本發明的生物材料後，患者顯示可觀察的及/或可測量的下述之一者或多者的減低或不存在：減低骨缺損及/或在一定程度緩解與骨缺損相關的一種或多種 症狀；減低發病率及死亡率，以及改良生活品質問題。疾病中用於評估成功的處理及改良的上述參數可藉由醫師熟悉的常規程序容易地測量。

在所揭露的生物材料的治療用途的上下文中，於「同種異體」的療法中，捐贈者及接受者為相同物種的不同個體，而於「自體」的療法中，捐贈者及接受者為相同個體，以及於「異種」的療法中，捐贈者衍生自與接受者為不同物種的動物。

用語「有效量」指稱足以有效於有利的或所期望的結果的量，包含臨床結果。有效量投藥可一次或多次投藥。

用語「對象」指稱哺乳動物，較佳為人類。對象的實例包含人類、非人類靈長類、犬、貓、小鼠、大鼠、馬、牛及其基因轉殖物種。一具體例中，對象可為「患者」，亦即溫血動物，更佳地為人類，他/牠正等待接受，或正在接受醫學照護或曾經/正在/將要為醫學程序的目標，或正在監視疾病的發展。一具體例中，對象為成年者(例如年齡超過18的人類對象)。另一具體例中，對象為兒童(例如年齡低於18的人類對象)。一具體例中，對象為雄性。另一具體例中，對象為雌性。

用語「生物可相容的」指稱與生物系統，例如細胞、細胞培養物、組織或器官可相容的非毒性材料。

本發明關於具有多維度結構的生物材料，該生物材料包括脂肪幹細胞(ASC)、細胞外基質及明膠。

當使用於本文，用語「具有多維度結構的生物材料」可與本發明全文中的用語「多維度生物材料」交換。

一具體例中，細胞細單離自脂肪組織，且本文中係指稱脂肪幹細胞(ASC)。

一具體例中，ASC組織係源自動物，較佳地係源自哺乳動物，更佳地係源自人類。因此，一具體例中，ASC為動物ASC，較佳地為哺乳動物ASC，更佳地為人類ASC。較佳具體例中，ASC為人類ASC。

由脂肪組織單細幹細胞的方法為所屬技術領域所習知，且係揭露例如Zuk et al.(Tissue Engineering.2001,7：211-228)。一具體例中，ASC係藉由抽脂由脂肪組織單離。

作為說明，脂肪組織可藉由穿刺切片(needle biopsy)或抽脂抽吸(liposuction aspiration)收集。ASC可自脂肪組織單離藉由第一清洗組織樣本大量使用磷酸鹽-緩衝生理鹽水(PBS)，視需要地含有抗生素，例如1%青黴素/鏈黴素(P/S)。然後樣本可置於具有膠原蛋白酶的無菌組織培養盤中用以組織分解(例如，製備於含有2%P/S的PBS中的膠原蛋白酶I型)，且於37℃，5% CO₂培育30分鐘。膠原蛋白酶活性可藉由添加培養基(例如含有10%血清的DMEM)予以中和。崩解後，可轉移樣本至管。基質血管分液(SVF)，含有ASC，藉由離心樣本(例如於2000rpm離心5分鐘)獲得。為了完全自初代脂肪細胞分離基質細胞，樣本可激烈地振盪以徹底地破壞小粒及混合細胞。可重複離心步驟。旋轉及膠原蛋白酶溶液抽吸後，小粒可重新懸浮於裂解緩衝液，培育於冰(例如培育10分鐘)，清洗(例如以PBS/2% P/S)及離心(例如於2000rpm離心5分鐘)。然後可抽吸上清部分，細胞小粒重新懸浮於培養基(例如，基質培養基，亦即α-MEM，補充有20% FBS、1% L-麩胺醯胺及1% P/S)，然後過濾細胞懸浮液(例如，經過70μm細胞濾器)。含有細胞的樣本最終可平板培養於培養盤且於37℃、5% CO₂培育。

一具體例中，本發明的ASC係單離自脂肪組織的基質血管分液。一具體例中，脂質抽吸物於使用前可於室溫保持數小時，或於+4℃保持24小時，或長期保存於低於0℃，例如-18℃。

一具體例中，ASC可為新鮮的ASC或經冷藏的ASC。新鮮的ASC係經單離的ASC其未經進行冷藏處理。經冷藏的ASC係經單離的ASC其已經進行冷藏處理。一具體例中，冷藏處理意指低於0℃的任何處理。一具體例中，冷藏處理可實施於-18℃、於-80℃或於-180℃。特定具體例中，冷藏處理可為冷凍保存。

作為冷藏處理的說明，ASC可收獲於約80至90%匯合。清洗及自培養皿脫離後，細胞可以冷藏保存培養基作成小粒且置於小管。一具體例中，冷藏保存培養基包括80%胎牛血清或人類血清，10%的二甲基亞碸(DMSO)及10%的DMEM/Ham’s F-12。然後，小管可儲存於-80℃整夜。例如，小管可置於酒類冷凍容器其緩慢冷卻小管，於大約每分鐘1℃，直到達到-80℃。最終地，冷凍小管可轉移至液態氮容器用於長期儲存。

一具體例中，ASC係分化的ASC。一具體例中，ASC係分化為包括或由下述所成群組選擇的細胞：成骨細胞、軟骨細胞、角質細胞、內皮細胞、肌纖維母細胞及脂肪細胞。另一具體例中，ASC係分化為包括或由下述所成群組選擇的細胞：成骨細胞、軟骨細胞、角質細胞、內皮細胞及肌纖維母細胞。另一具體例中，ASC係分化為包括或由下述所成群組選擇的細胞：成骨細胞、軟骨細胞、角質細胞及肌纖維母細胞。另一具體例中，ASC係分化為包括或由下述所成群組選擇的細胞；成骨細胞、軟骨細胞、角質細胞及內皮細胞。另一具體例中，ASC係分化為包括或由下述所成群組選擇的細胞：成骨細胞、軟骨細胞及 角質細胞。另一具體例中，ASC係分化為包括或由下述所成群組選擇的細胞：成骨細胞及軟骨細胞。

一具體例中，ASC係成骨性分化的ACSs。換言之，較佳具體例中，ASC係分化為成骨性細胞。再換言之，較佳具體例中，ASC係於成骨性培養基中分化。特別的具體例中，ASC係分化為成骨細胞。

調控及評估成骨性分化的方法為所屬技術領域習知。例如，本發明的細胞或組織的骨-分化可藉由下述者予以評估：骨鈣素及/或磷酸鹽的染色(例如利用von Kossa)；藉由染色磷酸鈣(例如利用茜素紅)；藉由磁共振成像(MRI)；藉由礦化基體型成的測量；或藉由鹼性磷酸酶活性的測量。

一具體例中，ASC的成骨性分化係藉由於成骨性分化培養基(MD)培養ASC實施。

一具體例中，成骨性分化培養基包括人類血清。特別的具體例中，成骨性分化培養基包括人類血小板溶解物(hPL)。一具體例中，成骨性分化培養基不包括任何其他動物血清，較佳地其僅包括人類血清而無其他血清。

一具體例中，成骨性分化培養基包括補充有地塞米松(dexamethazone)、抗壞血酸及磷酸鈉的增殖培養基或由其所組成。一具體例中，成骨性分化培養基進一步包括抗生素，如青黴素、鏈黴素、健他黴素或兩性黴素B。一具體例中，所有培養基皆無動物蛋白質。

一具體例中，增殖培養基可為所屬技術領域中具有通常知識者習知之經設計用於支持細胞生長的任何培養基。當使用於本文，增殖培養基亦可稱為「生長培養基」。生長培養基的實例包含但不限於MEM、DMEM、IMDM、 RPMI 1640、FGM或FGM-2、199/109培養基、HamF10/HamF12或McCoy’s 5A。較佳具體例中，增殖培養基為DMEM。

一具體例中，成骨性分化培養基包括補充有L-丙胺醯基-L-麩胺醯胺((Ala-Gln，亦稱為「Glutamax®」或「Ultra麩胺醯胺®」)的DMEM、hPL、地塞米松、抗壞血酸及磷酸鈉或由其等所組成。一具體例中，成骨性分化培養基包括補充有L-丙胺醯基-L-麩胺醯胺的DMEM、hPL、地塞米松、抗壞血酸及磷酸鈉、青黴素、鏈黴素及兩性黴素B或由其等所組成。

一具體例中，成骨性分化培養基包括補充有L-丙胺醯基-L-麩胺醯胺、hPL(約5%，體積/體積)、地塞米松(約1μM)、抗壞血酸(約0.25mM)及磷酸鈉(約2.93mM)的DMEM或由其等所組成。一具體例中，成骨性分化培養基包括補充有L-丙胺醯基-L-麩胺醯胺、hPL(約5%，體積/體積)、地塞米松(約1μM)、抗壞血酸(約0.25mM)及磷酸鈉(約2.93mM)、青黴素(約100U/mL)及鏈黴素(約100μg/mL)的DMEM或由其等所組成。一具體例中，成骨性分化培養基進一步包括兩性黴素B(約0.1%)。

另一具體例中，ASC係成軟骨性分化ASC。換言之，較佳具體例中，ASC係分化為成軟骨性細胞。再換言之，較佳具體例中，ASC係於成軟骨性培養基中分化。特別的具體例中，ASC細分化為軟骨細胞。

調控及評估成軟骨性分化的方法為所屬技術領域習知。例如，本發明的細胞或組織的成軟骨性分化可藉由艾爾遜藍(Alcian Blue)染色予以評估。

一具體例中，成軟骨性分化係藉由於成軟骨性分化培養基培養ASC實施。

一具體例中，成軟骨性分化培養基包括DMEM、hPL、丙酮酸鈉、ITS、脯胺酸、TGF-β1及地塞米松或由其等所組成。一具體例中，分化培養基進一步包括抗生素，如青黴素、鏈黴素、健他黴素及/或兩性黴素B。

一具體例中，成軟骨性分化培養基包括DMEM、hPL(約5%，體積/體積)、地塞米松(約1μM)、丙酮酸鈉(約100μg/mL)、ITS(約1X)、脯胺酸(約40μg/mL)及TGF-β1(約10ng/mL)或由其等所組成。

另一具體例中，ASC為成角質性分化ASC。換言之，較佳具體例中，ASC係分化為成角質性細胞。再換言之，較佳具體例中，ASC於成角質性培養基中分化。特別的具體例中，ASC係分化為角質細胞。

調弄及評估成角質性分化的方法為所屬技術領域習知。例如，本發明的細胞或組織的角質分化可藉由Pankeratin或CD34的染色予以評估。

一具體例中，分化為角質細胞係藉由於成角質性分化培養基培養ASC實施。

一具體例中，成角質性分化培養基包括DMEM、hPL、胰島素、KGF、hEGF、氫化可體松及CaCl₂或由其等所組成。一具體例中，成角質性分化培養基進一步包括抗生素，如青黴素、鏈黴素、健他黴素及/或兩性黴素B。

一具體例中，成角質性分化培養基包括DMEM、hPL(約5%，體積/體積)、胰島素(約5μg/mL)、KGF(約10ng/mL)、hEGF(約10ng/mL)、氫化可體松(約0.5μg/mL)及CaCl₂(約1.5mM)或由其等所組成。

另一具體例中，ASC係成內皮性(endotheliogenic)分化的ASC。再換言之，較佳具體例中，ASC係於成內皮性培養基中分化。特別的具體例中，ASC係分化為內皮細胞。

調控及評估成內皮性分化的方法為所屬技術領域習知。例如，本發明的細胞或組織的成內皮性分化可藉由CD34染色予以評估。

一具體例中，分化為內皮細胞係藉由於成內皮性分化培養基培養ASC實施。

一具體例中，成內皮性分化培養基包括EBMTM-2培養基、hPL、hEGF、VEGF、R3-IGF-1、抗壞血酸、氫化可體松及hFGFb或由其等所組成。一具體例中，成內皮性分化培養基進一步包括抗生素，如青黴素、鏈黴素、健他黴素及/或兩性黴素B。

一具體例中，成內皮性分化培養基包括EBMTM-2培養基、hPL(約5%，體積/體積)、hEGF(約0.5mL)、VEGF(約0.5mL)、R3-IGF-1(約0.5mL)、抗壞血酸(約0.5mL)、氫化可體松(約0.2mL)及hFGFb(約2mL)、套組Clonetics^TM EGM^TM-2MV BulletKit^TM CC-3202(Lonza)的試劑或由其等所組成。

另一具體例中，ASC係成肌纖維性分化的ASC。換言之，較佳具體例中，ASC係分化為成肌纖維性細胞。再換言之，較佳具體例中，ASC係於成肌纖維性培養基中分化。特別的具體例中，ASC係分化為肌纖維母細胞。

調控及評估成肌纖維性分化的方法為所屬技術領域習知。例如，本發明的細胞或組織的成肌纖維性分化可藉由α-SMA染色予以評估。

一具體例中，分化為成肌纖維性細胞係藉由於經纖維性分化培養基培養ASC實施。

一具體例中，成肌纖維性分化培養基包括DMEM：F1、丙酮酸鈉、ITS、RPMI 1640維生素、TGF-β1、穀胱甘肽、MEM或由其等所組成。一具體 例中，成肌纖維性分化培養基進一步包括抗生素，如青黴素、鏈黴素、健他黴素及/或兩性黴素B。

一具體例中，成肌纖維性分化培養基包括DMEM：F12、丙酮酸鈉(約100μg/rnL)、ITS(約1X),RPMI 1640維生素(約1X)、TGF-β1(約1ng/mL)、穀胱甘肽(約1μg/mL)、MEM(約0.1mM)或由其等所組成。

另一具體例中，ASC係成脂肪性分化的ASC。換言之，較佳具體例中，ASC係分化為成脂肪性細胞。再換言之，較佳具體例中，ASC係於成脂肪性培養基中分化。特別的具體例中，ASC係分化為脂肪細胞。

調控及評估成脂肪性分化的方法為所屬技術領域習知。例如，本發明的細胞或組織的成知性分化可藉由Oil-Red染色予以評估。

一具體例中，分化為脂肪細胞係藉由於成脂肪性分化培養基培養ASC實施。

一具體例中，成脂肪性分化培養基包括DMEM、hPL、地塞米松、胰島素、吲哚美辛(indomethacin)及IBMX或由其等所組成。一具體例中，成脂肪性分化培養基進一步包括抗生素，如青黴素、鏈黴素、健他黴素及/或兩性黴素B。

一具體例中，成脂肪性分化培養基包括DMEM、hPL(約5%)、地塞米松(約1μM)、胰島素(約5μg/mL)、吲哚美辛(約50μM)及IBMX(約0.5mM)或由其等所組成。

一具體例中，ASC為後期繼代(late passaged)的脂肪幹細胞。當使用於本文，用語「後期繼代」意指脂肪幹細胞於至少繼代4後分化。當使用於本文，繼代4指稱第四繼代，亦即在將細胞重新懸浮於新鮮培養基之前藉由將細胞 由培養容器的表面脫離而分開細胞的第四次作用。一具體例中，後期繼代的脂肪幹細胞係於繼代4、繼代5、繼代6或更多繼代之後分化。較佳具體例中，ASC係於繼代4之後分化。

初代細胞的起始繼代係指稱為繼代0(P0)。根據本發明，繼代P0指稱由來自小粒狀基質血管分液(SVF)的細胞懸浮物於培養容器的接種。因此，繼代P4意指係自培養容器的表面脫離4次(於P1、P2、P3及P4)(例如藉由胰蛋白酶分解)且重新懸浮於新鮮培養基。

一具體例中，本發明的ASC係培養於增殖培養基直到第四繼代。一具體例中，本發明的ASC於第四繼代後係培養於分化培養基。因此，一具體例中，於繼代P1、P2及P3，ASC係自培養容器的表面脫離後於增殖培養基中稀釋至合適的細胞密度。再根據此具體例，於繼代P4，ASC係自培養容器的表面脫離後於分化培養基中稀釋至合適的細胞密度。因此，根據此具體例，於P4本發明的ASC未重新懸浮且於增殖培養基培養直到細胞於將分化前達到匯合(亦即，將於分化培養基培養之前)，但直接重新懸浮且於分化培養基培養。

一具體例中，細胞係維持於分化培養基至少直到細胞達到匯合，較佳地介於70%及100%匯合度，更佳地介於80%及95%匯合度。一具體例中，細胞係維持於分化培養基至少5日，較佳地至少10日，更佳地至少15日。一具體例中，細胞係維持於分化培養基5至30日，較佳地10至25日，更佳地15至20日。一具體例中，分化培養基係每2日更換。然而，如所屬技術領域習知，細胞生長率自一個捐贈者至另一個捐贈者可能稍微不同。因此，分化歷程及培養基改變數自一個捐贈者至另一個捐贈者可變化。

一具體例中，細胞係維持於分化培養基至少直到根據所使用的分化培養基的不同組織形成。

例如，細胞可維持於成骨性分化培養基至少直到類骨質形成，亦即未礦化，於骨組織成熟前的骨基質的有機部分。

培養參數，例如，溫度、pH、O₂含量、CO₂含量及鹽度可根據所屬技術領域可用的標準程序予以調整。

一具體例中，本發明的明膠為豬明膠。當使用於本文，用語「豬明膠(porcine gelatin)」可與「豬肉明膠(pork gelatin)」或「豬的明膠(pig gelatin)」交換。一具體例中，明膠為豬皮明膠。

一具體例中，本發明的明膠形式為粒子、珠粒、球粒、微球粒等。

一具體例中，本發明的明膠非結構為形成預先定義的3D形狀或支架，如例如立方體。一具體例中，本發明的明膠不具有預先定義的形狀或支架。一具體例中，本發明的明膠不具有立方體型。一具體例中，明膠，較佳地豬明膠，不為3D支架。一具體例中，本發明的生物材料無支架。

一具體例中，本發明的明膠為大孔微載體。

豬明膠粒子的實例包含，但不限於，Cultispher® G、Cultispher® S、Spongostan及Cutanplast。一具體例中，本發明的明膠為Cultispher® G或Cultispher® S。

一具體例中，本發明的明膠，較佳地豬明膠，具有平均直徑至少約50μm，較佳地至少約75μm，更佳地至少約100μm，更佳地至少約130μm。一具體例中，本發明的明膠，較佳地豬明膠，具有平均直徑至多約1000μm，較佳地至多約750μm，更佳地至多約500μm。另一具體例中，本發明的明膠，較 佳地豬明膠，具有平均直徑至多約450μm，較佳地至多約400μm，更佳地至少大部分約380μm。

一具體例中，本發明的明膠，較佳地豬明膠，具有平均直徑範圍由約50μm至約1000μm，較佳地由約75μm至約750μm，更佳地由約100μm至約500μm。另一具體例中，本發明的明膠，較佳地豬明膠，具有平均直徑範圍由約50μm至約500μm，較佳地由約75μm至約450μm，更佳地由約100μm至約400μm。另一具體例中，本發明的明膠，較佳地豬明膠，具有平均直徑範圍由約130μm至約380μm。

評估本發明的明膠粒子平均直徑的方法為所屬技術領域習知。該等方法的實例包含，但不限於，粒度測定法，特別地使用合適的篩；沉積測量法；離心技術；雷射繞射；及影像分析，特別地藉由具有遠心鏡頭的高效照相機等。一具體例中，明膠對於150cm²容器係添加於濃度範圍由約0.1cm³至約5cm³，較佳地由約0.5cm³至約4cm³，更佳地由約0.75cm³至約3cm³。一具體例中，明膠對於150cm²容器係添加於濃度範圍由約1cm³至約2cm³。一具體例中，g明膠對於150cm²容器係添加於濃度範圍約1cm³、1.5cm³或2cm³。

一具體例中，明膠對於150cm²容器係添加於濃度範圍由約0.1g至約5g，較佳地由約0.5g至約4g，更佳地由約0.75g至約3g。一具體例中，明膠對於150cm²容器係添加於濃度範圍由約1g至約2g。一具體例中，明膠對於150cm²容器係添加於濃度範圍約1g、1.5g或2g。

一具體例中，本發明的明膠係細胞分化後添加至培養基。一具體例中，本發明的明膠係當細胞為次匯合時添加至培養基。一具體例中，本發明的明膠係當細胞為過匯合時添加至培養基。一具體例中，本發明的明膠係當細胞分 化後達匯合時添加至培養基。換言之，一具體例中，本發明的明膠係當細胞於分化培養基達匯合時添加至培養基。一具體例中，本發明的明膠係於P4後至少5日添加至培養基，較佳地10至，更佳地15至。一具體例中，本發明的明膠係於P4後5至30日添加至培養基，較佳地10至25日，更佳地15至20日。

一具體例中，根據本發明的生物材料為二維度的。此具體例中，本發明的生物材料可形成小於1mm的薄膜。

本發明的範疇內，表示「小於1mm」涵括0.99mm、0.95mm、0.9mm、0.8mm、0.75mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm及更小。某些具體例中，表示「小於」可以表示「亞於」取代。

另一具體例中，根據本發明的生物材料為三維度的。此具體例中，本發明的生物材料可形成具有至少1mm厚度的後膜。生物材料的尺寸可配合用途。

本發明的範疇內，表示「至少1mm」涵括encompasses 1mm、1.2mm、1.3mm、1.5mm、1.6mm、1.75mm、1.8mm、1.9mm、2mm、2.25mm、2.5mm、2.75mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm及更多。某些具體例中，表示「至少1mm」可以表示「等於或多於1mm」取代。

一具體例中，本發明的生物材料不包括支架。當使用於本文，用語「支架」意指模擬天然哺乳動物組織的多孔性、孔徑及功能的結構，包含人類組織及動物組織，如天然哺乳動物骨或模擬天然細胞外基質結構的支架。該等支架的實例包含，但不限於，人工骨、膠原蛋白海綿、水凝膠，如蛋白質水凝膠、肽水凝膠、聚合物水凝膠及木系奈米纖維素水凝膠等。一具體例中，本發明的生物材料不包括人工骨。一具體例中，本發明的生物可相容材料不為人工骨。一具 體例中，本發明的生物材料不包括人工真皮及/或人工表皮。一具體例中，本發明的生物材料不為人工真皮及/或人工表皮。

一具體例中，本發明的生物材料的多維度不起因於模擬天然細胞外基質結構的支架。一具體例中，本發明的生物材料不包括模擬天然細胞外基質結構的支架。

一具體例中，本發明的生物材料的多維度係起因於藉由本發明的脂肪幹細胞的細胞外基質的合成。

一具體例中，本發明的生物材料包括細胞外基質。一具體例中，本發明的生物材料的細胞外基質衍生自ASC。

當使用於本文，用語「細胞外基質」意指非細胞的三維度巨分子網絡。ECM的基質組分彼此與細胞黏附受體結合，藉此於本發明的組織或生物材料中所存在的細胞中形成複合網絡。

一具體例中，本發明的細胞外基質包括膠原蛋白、蛋白多醣/醣胺聚醣、彈性蛋白、纖網蛋白、層連結蛋白、及/或其他糖蛋白。特別的具體例中，本發明的細胞外基質包括膠原蛋白。另一特別具體例中，本發明的細胞外基質包括蛋白多醣。另一特別具體例中，本發明的細胞外基質包括膠原蛋白及蛋白多醣。一具體例中，本發明的細胞外基質包括生長因子、蛋白多醣、分泌因子、細胞外基質調節劑及糖蛋白。

一具體例中，本發明的生物材料內的ASC形成組織，後文中稱為ASC組織。

一具體例中，ASC組織為細胞化互連組織。一具體例中，生物可相容材料，較佳地生物可相容粒子，係整合於細胞化互連組織中。一具體例中，生物可相容材料，較佳地生物可相容粒子，係分散於ASC組織內。

一具體例中，本發明的生物材料係特徵化於經由明膠所形成的互連組織。一具體例中，本發明的生物材料特徵化於環繞明膠的礦化。

一具體例中，當使用成骨性分化培養基，本發明的生物材料具有與真實骨所具有的骨鈣素表現及礦化性質為相同的性質。根據此具體例，本發明的生物材料包括骨性細胞。再根據此具體例，本發明的生物材料包括骨性細胞及細胞外基質。再根據此具體例，本發明的生物材料包括骨性細胞及膠原蛋白。再根據此具體例，本發明的生物材料包括骨性基質。

一具體例中，本發明的生物材料為該生物材料的細胞分化已達終點，且當植入時該生物材料的表現型將維持不改變。

一具體例中，本發明的生物材料包括生長因子。一具體例中，本發明的生物材料包括VEGF及/或SDF-1α。

一具體例中，根據本發明的生物材料係經礦化。當使用於本文，用語「礦化」或「骨組織礦密度」指稱由生物材料所形成的骨組織或「類骨」組織的每平方公分的礦物量，亦表示為百分比。因此，當使用於本文，用語「礦化」或「骨組織礦密度」指稱生物材料的每平方公分的礦物量，亦表示為百分比。

評估生物材料的礦化程度的方法為所屬技術領域所習知。該等方法的實例包含，但不限於，微米級電腦斷層掃描(micro-CT)分析、造影質譜術、鈣黃綠素(calcein)藍染色、骨礦密度分布(BMDD)分析等。

一具體例中，本發明的生物材料的礦化隨著生物材料的熟成而增加。當使用於本文，用語「生物材料的熟成」意指與明膠的培養歷程。換言之，生物材料的熟成回應於多維度誘導的時間。

一具體例中，本發明的生物材料的礦化程度係小於1%。一具體例中，小於1%的礦化程度係於成骨性分化培養基中熟成不及12週而獲得。一具體例中，小於1%的礦化程度係於成骨性分化培養基熟成不及或等於8週而獲得。

一具體例中，本發明的生物材料的礦化程度範圍由約1%至約20%，較佳地由約1%至約15%，更佳地由約1%至約10%，甚至更佳地由約1%至約5%。一具體例中，本發明的生物材料的礦化程度範圍由約1%至約4%或3%。本發明的範疇內，表示「約1%至約20%”」涵括約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%及約20%。

另一具體例中，本發明的生物材料的礦化程度係至少1%或1.24%。一具體例中，至少1%或1.24%的礦化程度係於成骨性分化培養基中熟成多於或等於12週而獲得。

另一具體例中，本發明的生物材料的礦化程度係至少2%、2.5%或2.77%。一具體例中，至少2%、2.5%或2.77%的礦化程度係於成骨性培養基中熟成多於或等於25週而獲得。

一特別具體例中，本發明的生物材料的礦化程度係約0.07%。另一特別具體例中，本發明的生物材料的礦化程度係約0.28%。另一特別具體例中，本發明的生物材料的礦化程度係約0.33%。另一特別具體例中，本發明的生 物材料的礦化程度係約1.24%。另一特別具體例中，本發明的生物材料的礦化程度係約2.77%。

本發明也關於用以生產包括分化的脂肪幹細胞(ASC)、細胞外基質及明膠的多維度結構的方法。

一具體例中，用以生產根據本發明的生物材料的方法包括下列步驟：

-細胞增殖，

-細胞分化，及

-多維度誘導。

一具體例中，用以生產根據本發明的生物材料的方法包括下列步驟：

-ASC增殖，

-ASC分化，及

-3-維度誘導。

一具體例中，用以生產根據本發明的生物材料的方法包括下列步驟：

-由個體單離細胞，較佳地ASC；

-增殖細胞，較佳地ASC，

-分化經增殖的細胞，較佳地ASC，及

-於明膠存在下培養分化的細胞，較佳地ASC。

一具體例中，用以生產本發明的生物材料的方法，進一步於實施細胞增殖步驟前，包括細胞單離的步驟，較佳地ASC。一具體例中，用以生產 本發明的生物材料的方法，進一步於實施細胞增殖步驟前，包括單離細胞的步驟，較佳地ASC。

一具體例中，增殖步驟係於增值培養基中實施。特別的具體例中，增殖培養基為DMEM。一具體例中，增殖培養基係補充有Ala-Gln及/或人類血小板裂解物(hPL)。一具體例中，增殖培養基進一步包括抗生素，如青黴素及/或鏈黴素。

一具體例中，增殖培養基包括補充有Ala-Gln及hPL(5%)的DMEM或由其等所組成。一具體例中，增殖培養基包括補充有Ala-Gln、hPL(5%)、青黴素(100U/mL)及鏈黴素(100μg/mL)的DMEM或由其等所組成。

一具體例中，增殖步驟係如本文前述實施。一具體例中，增殖步驟係實施多達P8。一具體例中，增殖步驟持續多達P4、P5、P6、P7或P8。因此，一具體例中，細胞增殖步驟包含至少3繼代。一具體例中，細胞增殖步驟包含至多7繼代。一具體例中，細胞增殖步驟包含3至7繼代。一特別具體例中，增殖步驟係實施多至P4。因此，一具體例中，細胞增殖步驟包含於繼代P1、P2及P3自培養容器表面脫離細胞然後於增殖培養基稀釋細胞。增殖多達P6的具體例中，細胞增殖步驟包含於繼代P1、P2、P3、P4及P53自培養容器表面脫離細胞然後於增殖培養基稀釋細胞。

一具體例中，有需要時持續增殖步驟將細胞繼代3、4、5、6或7次。特別的具體例中，有需要時增殖步驟持續將細胞繼代3次。一具體例中，增殖步驟持續直到最後繼代後細胞達匯合，較佳地介於70%及100%匯合度，更佳地介於80%及95%匯合度。一具體例中，the step of增殖步驟持續直到第三、第四、第五、第六或第七繼代後細胞達匯合。

優勢的具體例中，於添加明膠前，於分化培養基培養細胞，較佳地ASC，為本發明方法的關鍵步驟。該步驟為允許ASC成為成骨性細胞的分化所必要的。此外，此步驟為獲得多維度結構所必要的。

一具體例中，分化步驟係於P4、P5、P6、P7或P8後實施。一具體例中，分化步驟係當細胞不為匯合時實施。特別的具體例中，分化步驟係於P4、P5、P6、P7或P8後不培養細胞多至匯合而實施。

一具體例中，分化步驟係於P4、P5、P6、P7或P8實施。一具體例中，分化步驟係於細胞不為匯合時實施。特別的具體例中，分化步驟係於P4、P5、P6、P7或P8不培養細胞多至匯合而實施。

一具體例中，分化步驟係藉由於分化培養基培育細胞而實施。一具體例中，分化步驟係藉由於成骨性、成軟骨性基成基纖維性、或成角質性的分化培養基中，較佳地於成骨性、成軟骨性或成肌纖維性的分化培養基中，更佳地於成骨性或成軟骨性的分化培養基中培育而實施。一具體例中，分化步驟係藉由將自培養容器脫離的細胞重新懸浮於分化培養基中而實施。

一具體例中，ASC於分化培養基的培育係進行至少3日，較佳地至少5日，更佳地至少10日，更佳地至少15日。一具體例中，ASC於分化培養基的培育進行5至30日，較佳地10至25日，更佳地15至20日。一具體例中，分化培養基係每2日更換。本發明的範疇內，表示「至少3日」涵括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35日及更多日。

一具體例中，多維度誘導步驟，較佳地3D誘導，係藉由於如上文所定義的分化培養基添加明膠而實施。一具體例中，細胞於多維度誘導步驟中係維持於分化培養基，較佳地3D誘導。

一具體例中，多維度誘導步驟，較佳地3D誘導，係當細胞於分化培養中達匯合時實施，較佳地介於70%及100%匯合度，更佳地介於80%及95%匯合度。

另一具體例中，多維度誘導步驟，較佳地3D誘導，係當型態改變呈現時實施。一具體例中，多維度誘導步驟，較佳地3D誘導，根據所使用的分化培養基，係當至少一個可分別的組織發生時實施。例如，當使用成骨性分化培養基時，多維度誘導步驟，較佳地3D誘導，係當至少一個類骨結節形成時實施。當使用於本文，用語「類骨」意指形成於骨組織熟成前之未礦化的骨基質有機部分。

另一具體例中，多維度誘導步驟，較佳地3D誘導，係細胞達匯合時實施。

一具體例中，本發明的細胞及明膠係培育至少5日，較佳地至少10日，更佳地至少15日。一具體例中，本發明的細胞及明膠係培育10日至30日。本發明的範疇內，表示「至少5日」涵括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35日及更多日。

另一具體例中，本發明的細胞及明膠係培育至少1週、2週、3週、4週、8週、12週、25週或34週。

一具體例中，於多維度誘導步驟期間，較佳地3D誘導，培養基每2日更換。

本發明也關於藉由根據本發明的方法所獲得的多維度生物材料。一具體例中，多維度生物材料係藉由根據本發明的方法獲得。一具體例中，多維度生物材料係藉由根據本發明的方法產生。一具體例中，藉由本發明的方法可獲得或所獲得的生物材料係意圖植入至人體或動物體。一具體例中，植入的生物材料可為自體起源，或同體異種起源。一具體例中，本發明的生物材料可植入至骨、軟骨、真皮、肌肉、內皮或脂肪的組織區。一具體例中，此生物材料可植入至人體或動物體的不規則區。

一具體例中，本發明的生物材料為均質的，其意指生物材料的結構及/或構成於全組織中為類似的。一具體例中，生物材料具有用於天然疾病區植入所需的操作特性及機械特性。一具體例中，藉由本發明的方法可獲得或所獲得的生物材料可利用手術器械操作而不被撕毀。

本發明的另一目的為包括根據本發明的生物材料的醫療裝置。

又另一目的為包括根據本發明的生物材料及至少一醫藥可接受載劑的醫藥組成物。

本發明也關於根據本發明的生物材料或醫藥組成物使用作為醫藥。

本發明關於本發明的生物材料的任何用途，作為醫療裝置或包含於醫藥裝置中，或於醫藥組成物中。某具體例中，本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物為可於使用前調處或模塑的油灰狀材料。

本發明進一步關於具有多維度結構之包括分化的脂肪幹細胞(ASC)、細胞外基質及明膠的生物材料、包括該生物材料的醫療裝置或醫藥組成物，用以、或用於有需要的對象治療組織缺損。

本發明的另一態樣也關於使用具有多維度結構之包括分化的脂肪幹細胞(ASC)、細胞外基質及明膠的生物材料、包括該生物材料的醫療裝置或醫藥組成物，用以治療組織缺損的用途。本發明的在另一態樣，也關於具有多維度結構之包括分化的脂肪幹細胞(ASC)、細胞外基質及明膠的生物材料、包括該生物材料的醫療裝置或醫藥組成物用於製造或製備用以治療組織缺損的醫藥的用途。

本發明進一步關於在有需要的對象治療組織缺損的方法，包括對該對象投藥治療有效量之根據本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物。

本發明的一態樣係於有需要的對象組織重建的方法，包括對該對象投藥治療有效量之根據本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物。當使用於本文，用語「組織重建(tissue reconstruction)」可與「組織修復」或「組織再生」替換。

一具體例中，用語「組織」包括骨、軟骨、真皮、表皮、肌肉、內皮及脂肪的組織或由其等所組成。一具體例中，組織缺損包括骨、軟骨、真皮、表皮、肌肉、內皮及脂肪的組織缺損或由其等所組成。

一具體例中，組織重建係選自包括骨重建、軟骨重建、真皮重建、表皮重建、肌肉或肌原重建、內皮重建及脂肪原性重建的群組或由其等所組成的群組。

骨及真皮及/或表皮重建的實例包含，但不限於，真皮重建、創傷癒合、如糖尿病性足潰瘍之糖尿病性潰瘍處置、燒燙傷後損傷重建、放射後損傷重建、乳房癌症或乳房畸形後重建。

真皮及/或表皮重建的實例包含，但不限於，真皮重建、創傷癒合、如糖尿病性足潰瘍之糖尿病性潰瘍處置、燒燙傷後損傷重建、放射後損傷重建、乳房癌症或乳房畸形後重建。

軟骨重建的實例包含，但不限於，膝軟骨成形術、鼻或耳的重建、肋骨或胸骨的重建。

肌原重建的實例包含，但不限於，骨骼肌重建、腹壁破損後重建、下肢肌肉損傷後的重建、相關於腔室症候群(CS)的重建。

內皮重建的實例包含，但不限於，用於如靜脈動脈硬化分流之血管吻合的血管補片的再細胞化。

脂肪原性重建的實例包含，但不限於，美容手術、復原、充脂重建。

申請人已展示本發明的生物材料具有於植入物位點存在礦化組織的成骨性性質。

一特別態樣中，本發明關於本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物用於治療骨缺損。一特別態樣中，本發明關於本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物用於骨重建。一具體例中，本發明的生物材料用於填充人體或動物體填的骨腔。

一具體例中，本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物係用於治療軟骨缺損。一具體例中，本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物係用於 軟骨重建。一具體例中，本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物係用於膝軟骨成形術、鼻或耳的重建、肋骨或胸骨的重建。

申請人已展示本發明的生物材料具有優勢於較快的表皮及真皮重建、免疫回應啟發及彈性蛋白纖維數增加。再者，本發明的生物材料植入後的瘢痕不肥大的。

一具體例中，本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物係用於治療真皮缺損及/或表皮。一具體例中，本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物係用於真皮重建。一具體例中，本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物係用於皮膚重建。一具體例中，本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物係用於真皮重建、創傷癒合、如糖尿病性足潰瘍之糖尿病性潰瘍處置、燒燙傷後損傷重建、放射後損傷重建、乳房癌症或乳房畸形後重建。特別的具體例中，本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物係用以，或用於治療真皮創傷，較佳地糖尿病性真皮創傷。一具體例中，本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物係用於促進創傷閉合。一具體例中，本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物係用於減低創傷厚度，特別是於創傷癒合期間。

特別的具體例中，本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物係用以，或用於治療表皮溶解水皰症、先天性巨大黑色素痣及/或先天性皮膚發育不全。

再另一態樣中，本發明關於本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物用於重構手術或美容手術。

一具體例中，本發明的生物材料可使用作為同種異體的植入物或作為自體的植入物。一具體例中，本發明的生物材料可適用於組織移植。

一具體例中，對象已治療組織缺損。另一具體例中，對象尚未治療組織缺損。

一具體例中，對象對於至少另一其他組織缺損治療為無回應。

一具體例中，對象為糖尿病。一具體例中，對象罹患糖尿病創傷。

一具體例中，對象為成年人，亦即滿18歲或18歲以上。另一具體例中，對象為兒童，亦即未達18歲。

一具體例中，本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物係於組織重建過程期間投藥至有其需要的對象。

某些具體例中，本發明的生物材料、醫療裝置或醫藥組成物係藉由手術植入，例如經由夾子或套管；或藉由腹腔鏡途徑，投藥至有其需要的對象。

本發明也關於套組，包括根據本發明的生物材料、醫藥組成物或醫療裝置以及適合的固定手段。適合的固定手段的實例包含，但不限於，手術膠、組織膠、或為生物可相容、無毒性、及視需要為生物可吸收之用於手術用途的任何黏附組成物。

實施例

本發明藉由下述實施例進一步說明。

實施例1：本發明生物材料的產生

1.1. hASC的單離

人類皮下脂肪組織係在腹部區域藉由脂抽吸而接著Coleman技術且於知情同意及血清篩選後收集。

人類脂肪幹細胞(hASC)由收到的脂肪組織立即單離。脂抽吸物可於+4℃儲存24小時或於-80℃儲存較長時間。

首先，脂抽吸物的分液經單離用於品質管控目的且測量指抽吸物的殘餘體積。然後，指抽吸物藉由製備於HBSS(具最終濃度~8U/mL)的膠原蛋白酶溶液(NB 1,Serva Electrophoresis GmbH,Heidelberg,Germany)分解。使用於分解的酵素溶液的體積係雙倍於脂肪組織的體積。分解係於37℃±1℃於50至70分鐘期間實施。於15至25分鐘後實施第一間些振盪且於35至45分鐘後時實施第二振盪。藉由添加MP培養基(增殖培養基或生長培養基)中止分解。MP培養基包括DMEM培養基(4.5g/L葡萄糖及4mM Ala-Gln；Sartorius Stedim Biotech,Gottingen,Germany)補充有5%人類血小板裂解物(hPL)(體積/體積)。DMEM為標準培養基，其含有鹽類、胺基酸類、維生素類、丙酮酸及葡萄糖、以碳酸鹽緩衝液緩衝，且具有生理pH(7.2至7.4)。所使用DMEM含有Ala-Gln。人類血小板裂解物(hPL)為使用於活體外刺激間葉幹細胞(如hASC)生長的生長因子的富集來源。

經分解的脂肪組織經離心(500g，10分鐘，室溫)且移除上清物。小粒的基質血管分液(SVF)重新懸浮至MP培養基且通過200至500μm網眼過濾器。經過濾的細胞懸浮液二次離心(500g，10分鐘，20℃)。含有hASC的小粒重新懸浮於MP培養基。細胞懸浮物的小分液可保持用於細胞計數且殘餘細胞懸浮物全部使用於接種一個75cm² T-燒瓶(稱為繼代P0)。實施細胞計數(僅用於資訊)以估算接種的細胞數。

單離步驟後之日(第1日)，由75cm² T-燒瓶移除生長培養基。細胞以磷酸鹽緩衝液潤洗三次然後添加新鮮的MP培養基至燒瓶。

1.2.人類脂肪幹細胞的生長與擴增

於增殖相期間，hASC繼代4次(P1、P2、P3及P4)以獲得充足的細胞量用於過程的後續步驟。

在P0及第四繼代(P4)之間，細胞培養於T-燒瓶且饋料新鮮MP培養基。細胞係當達匯合度

70%且

100%(目標匯合度：80至90%)時予以繼代。來自1批次的所有細胞培養接受者係於相同時間繼代。於各繼代，細胞係以TrypLE(Select 1X；9mL對於75cm²燒瓶或12mL對於150cm²燒瓶)，重組無動物細胞解離酵素，由其培養容器脫離。TrypLe分解係於37℃±2℃實施5至15分鐘且藉由添加MP培養基中止。

然後將細胞離心(500g，5分鐘，室溫)，且重新懸浮於MP培養基。合併所收集的細胞以確保均質的細胞懸浮物。重新懸浮後，計數細胞。

於繼代P1、P2及P3，然後將殘餘細胞懸浮物於MP培養基中稀釋至合適的細胞密度且接踵於較大組織培養表面。該等步驟中，75cm²燒瓶接種細胞懸浮物體積15mL，而150cm²燒瓶接種細胞懸浮物體積30mL。於各繼代，細胞接種於0.5x10⁴及0.8x10⁴個細胞/cm²之間。不同繼代之間，培養基每3至4日交換。細胞行為及生長速率來自一個捐贈者與另一捐贈者可稍微不同。所以二繼代之間的期間及計代間的培養基交換數於一個捐贈者可能不同於另一捐贈者。

1.3.成骨性分化

於繼代P4(亦即第四繼代)，細胞離心二次，且重新懸浮於MD培養基(分化培養基)。重新懸浮後，第二次計數細胞後於MD培養基稀釋至合適的細胞密度，且細胞懸浮物體積70mL接種於150cm²燒瓶且饋料成骨性MD培養基。根據此 方法，細胞於第四繼代後直接培養於成骨性MD培養基。因此，成骨性MD培養基係添加而細胞尚未達匯合。

成骨性MD培養基的組成為增殖培養基(DMEM，Ala-Gln，hPL 5%)補充有地塞米松(1μM)、抗壞血酸(0.25mM)及磷酸鈉(2.93mM)。

細胞行為及生長速率於來自一個捐贈者與另一捐贈者可稍微不同。所以，成骨性分化步驟得期間以及繼代間的培養基交換數於一個捐贈者可能不同於另一捐贈者。

1.4.細胞的多維度誘導

當細胞達匯合度且呈現型態改變且於燒瓶中觀察到至少一個類骨結節(骨組織熟成前骨之未礦化的骨基質有機部分)則進行3D誘導。

暴露於成骨性MD培養基後，含有貼附成骨性細胞的匯合單層的容器係緩慢地且均質地撒上明膠粒子(Cultispher-G及Cultispher-S,Percell Biolytica,Astorp,Sweden)以濃度1、1.5及2cm³對於150cm²容器。

細胞維持於MD培養基。定期的培養基交換係於多維度誘導期間每3至4日實施。該等培養基交換藉由小心地避免明膠粒子及發展的結構的移除而實施。

實施例2：生物材料的特性

2.1.材料及方法

2.1.1.結構/組織學

測試由ASC及Cultispher G與S粒子所獲得的3D結構的形成。於繼代4由6個不同的捐贈者於匯合的ASC添加Cultispher粒子。測試不同體積：每容器150cm²為1、1.5、2cm³。細胞維持於分化培養基(DMEM 4.5g/L葡萄糖具有Ultra麩 胺醯胺+1%青黴素/鏈黴素+0.5%兩性黴素AB+地塞米松(1μM)、抗壞血酸(0.25mM)及磷酸鈉(2.93mM)每3至4日培養基。

為了比較於MP及MD的培養物，於粒子添加後5日、14日及8週採取MD的3D結構的生物切片。

為了評估細胞化，於Cultispher粒子添加後4週、8週及12週採取3D結構的生物切片。

將其固定於甲醛且至備用於蘇木素-伊紅染色、Masson’s Trichrome染色、骨鈣素染色及Von Kossa染色。

組織的骨分化及礦化係分別於骨鈣素染色及Von Kossa-染色玻片評估。組織的結構、細胞外基質的細胞化及存在係於蘇木素-伊紅染色及Masson’s Trichrome染色後評估。

2.1.2.生物活性

生物活性的活體外研究係藉由下述者評估：(i)最終產物中生長因子VEGF、IGF1、SDF-Iα的抽取及定量以及(ii)於缺氧及高血糖(糖尿病創傷癒合的條件)。此外，(iii)本發明的生物材料的生物活性性質於活體外係藉由qRT-PCR的分子層級予以特徵化。

生長因子含量

為了評估所形成組織的生物活性，明膠(1.5cm³)添加後於4週及8週採取生物切片用於蛋白質抽取及定量。總蛋白質含量及生長因子含量係藉由色度計(BCA Protein Assay Kit,ThermoFisher Scientific)定量以及以ELISA定量VEGF、SDF1α、IGF1(Human Quantikine ELISA kits,RD Systems)，根據供應商指示。

於缺氧及高血糖的培養

為了評估本發明的生物材料的生物活性以及缺氧及高血糖對於此3D結構的生物活性的影響，於8週來自3個捐贈者之利用Cultispher G(1.5cm³)及ASC所形成的組織切片以PBS潤洗二次且二重複置於6孔盤於10mL的MD at 4.5g/L(高血糖條件)或1g/L(正常血糖條件)葡萄糖而無HPL。將盤置於缺氧(1% O₂)或正常氧(21% O₂)、5% CO2、37℃持續72小時。然後收集上清物分別藉由色度計(BCA Protein Assay Kit,ThermoFisher Scientific)以及藉由ELISA(BMP2、BMP7、VEGF、SDF-1α、IGF1、FGFb(Human Quantikine ELISA kits,RD Systems)進行總蛋白質定量及生長因子定量。樣本經處理用於蛋白質抽取；純化及總蛋白質及生長因子的含量定量。

qRT-PCR

本發明的生物材料的前血管新生潛能係藉由分析涉及血管生成(vasculogenesis)及血管新生(angiogenesis)的基因表現予以研究。分析於不同狀態之藉由脂肪幹細胞的基因表現：脂肪幹細胞於增殖培養基(無表現型取向，MP)，脂肪組織幹細胞於典型成骨性培養基而無粒子(MD)及最終本發明的生物材料(脂肪組織幹細胞具有1.5cm³粒子就藉由細胞外基質之3維度無支架之結構形成的誘導而言)。

由

2000之培養於增殖培養基(MP)(n=4之人類脂肪組織的獨立來源)的ASC及來自本發明的生物材料(n=5)的約~1cm²的生物切片使用Qiazol裂解試劑(Qiagen,Hilden,Germany)及Precellys均質機(Bertin instruments,Montigny-le-Bretonneux,France)抽取粽RNA。RNA使用RNAs Rneasy mini kit(Qiagen,Hilden,Germany)以根據製造商指示的額外管柱DNase分解的添加予以純化。RNA的定量及定性計使用分光光度計(Spectramax 190,Molecular Devices, California,USA)測定。由0.5μg的總RNA使用RT² RNA first strand kit(Qiagen,Hilden,Germany)合成的cDNA經由市售可得PCR陣列(Human RT² Profiler Assay-Angiogenesis)用於成骨性及血管新生的基因表現。使用ABI Quantstudio 5系統(Applied Biosystems)及SYBR Green ROX Mastermix(Qiagen,Hilden,Germany)偵測擴增產物。根據△△CT方法獲得定量。各樣本的最終結果經正常化於三個管家基因(ACTB、B2M及GAPDH)的表現程度平均。

2.1.3.生物材料的熟成對於其性質的影響

生物材料(亦稱為「組織」)的熟成對於其性質的影響，係藉由礦化程度評價、組織學評價(細胞化測定)及生物活性評價(生長因子VEGF、IGF1、SDF-1α的抽取及定量)予以評估。生物材料的熟成本文中意指於分化培養基中ASC與Cultispher粒子的培養物的熟成。

於Cultispher粒子添加後於4週(一捐贈者)、8週(6捐贈者)、12週(3捐贈者)及25週(1捐贈者)採取3D結構生物切片且固定於甲醛用於微-CT掃描器分析。使用外周定量CT機械(Skyscan 1172G,Bruker micro-CTNV,Kontich,Belgium)評估3D結構礦化。

此外，組織(4週(n=3)、8週(n=8)、12週(n=3)及25週(n=1))的生物切片係固定於甲醛且製備用於蘇木素-伊紅染色、Masson’s Trichrome染色及Von Kossa染色。

2.2.結果

2.2.1.結構/組織學

當Cultispher粒子與hASC培養於增殖培養基時沒有獲得3D結構。由於沒有觀察到宏觀的3D結構，沒有形成微觀的結構。

相對於增殖培養基，Cultispher與ASC培養於成骨性分化培養基顯示類片狀3D結構的形成(第1A圖)。再者，此結構以鉗子捲纏(第1B圖)。

Cultispher與ASC培養於成骨性分化培養基的組織學檢測顯示粒子間細胞化互連組織的存在。再者，細胞外基質及細胞係可見於粒子的孔中(第2A圖及第2B圖)。Von Kossa染熱顯示經單離的礦化粒子的存在。相對地，細胞外基質未藉由Von Kossa染色(第3A圖及第3B圖)。最終地，骨鈣素表現可見於互連組織(第4A圖及第4B圖)。

2.2.2.生物學活性

生長因子含量及分泌

於Cultispher G及S單獨未觀察到蛋白質含量。僅偵測到微量的IGF-1但低於ELISA方法定量的下限。

於Cultispher與ASC培養於成骨性分化培養基的生物切片的上清物中偵測的IGF-1及BMP7程度係低於ELISA方法定量的下限而測得微量的BMP2及FGFb。相對地，觀察到VEGF及SDF-1α的顯著分泌。

觀察到培養條件對於生長因子分泌沒有顯著影響(表1)。

於來自Cultispher與ASC培養於成骨性分化培養基的生物切片的蛋白質抽取物中偵測的BMP2、BMP7及FGFb的程度係低於ELISA方法定量的下限。相對地，於IGF-1、VEGF及SDF-1α觀察到顯著含量。

觀察到培養條件對於VEGF含量沒有顯著影響。然而，相較於其他群，於正(21% O2)於4.5g/L葡萄糖中觀察到較低的IGF-1含量(p<0.05)。相對於缺氧(1及4.5g/L葡萄糖)於正常血氧及正常血糖觀察到較高的SDF-1α含量(p<0.05)(表2)。

qRT-PCR分析

藉由qRT-PCR分析進行84個前血管新生基因分析，於不同培養條件之間調變13個mRNA。相較於ASC於增殖培養基觀察到本發明的生物材料中十個基因上調(ANG、ANGPT1、EPHB4、EDN1、LEP、THBS1、PTGS1、VEGFA、VEGFB 及VEGFC)及相較於ASC於MP觀察到本發明的生物材料中二個基因下調(ID1、TIMP1)(第5圖)。

EPHB4(Ephrin受體B4)，一種穿膜蛋白質，於血管生成中扮演基礎角色、Endothelin(EDN1)，一種蛋白質血管收縮素(Wu MH,Nature,2013)、血小板反應蛋白(Thrombospondin)1(THBS1)、血管擴張素(vasodilatator)及環氧合酶1(PTGS1/COX-1)，調節內皮細胞，相較於ASC於MP於本發明的生物材料中係顯著地上調(分別為第5C圖、第5D圖、第5E圖及第5F圖)。

瘦素(LEP)mRNA(血管新生的重要增強劑及VEGF表現的誘導劑；Bouloumie A et al,Circ.Res.1998；Sierra-Honigmann MR et al,Science(New York,N.Y.)1998)的表現，相較於ASC於MP，於本發明的生物材料中亦為過度表現(第5G圖)。

最終地，血管內皮生長因子A、B及C的mRNA(VEGFA/B/C)的表現，相較於ASC於MP，於本發明的生物材料中對於ASC亦顯著地改良(分別為第5H圖、第5I圖及第5J圖)。VEGF為用於調節血管發展及血管新生的最重要生長因子之一。由於骨為高度血管化器官(血管新生為骨生成中的重要調節劑)，VEGF也正向地影響骨骼發展及出生後骨修復(Hu K et al,Bone 2016)。

相對地，DNA-結合蛋白質抑制劑(ID1)及金屬肽酶抑制劑1(TIMP1)，相關於活體內減低的血管新生(Reed MJ et al,Microvasc Res 2003)，相較於ASC於MP，於本發明的生物材料中為下調(分別地為第5K圖及第L圖)。

總結，該等分子分析顯示當細胞經包埋於本發明的生物材料中之其3D基質中時，ASC的前血管新生潛能為上調。

2.2.3.生物材料的熟成對於其性質的影響

礦化程度評價

3D移植物於4、8、12及25週的光宏觀圖(photomacrographs)顯示相同的宏觀結構(第6A圖及第6B圖)且於於micro*CT中分析。測定礦化體積的百分比：0.07%於4週，0.28% +/- 0.33%於8週，1.24% +/- 0.35%於12週及2.77%於25週(第6C圖及第6D圖)。

因此，越高的熟成程度，越高的礦化。

組織學評價

觀察到組織的礦化對於細胞化含量沒有影響，因為在分析的不同組織中定量類似的細胞化(數據未顯示)。

相對地，組織中ECM的比率隨著礦化程度增加，於4週為ECM顯著的較低比率及於25週為ECM較高比例(分別為28±7 vs 33±11/34±11 vs 56±8%之ECM於4、8/12及25週(p<0.05))(表3)。

於12週及25週的熟成觀察到較高的礦化度如更多標記的Von Kossa染色所示(數據未顯示)。

生物活性評價

生物材料於4、8、12及25週的熟成的生物活性係於蛋白質抽取、純化後研究及生長因子(VEGF、IGF1、SDF-1α)係藉由ELISA定量(表4)。

實施例3：血管新生及成骨性性質的活體內研究

3.1.材料及方法

3.1.1.使用裸大鼠的活體內試驗

於第0日，本發明的生物材料(ASC培養如實施例1所揭示，與1.5cm³的Cultispher G或S歷經熟成7.5週)的十個複製物係縫合於裸大鼠的經燒灼腰肌。植入29日後，收獲生物材料藉由成像及組織學予以分析。

3.1.2.使用Wistar大鼠的活體內試驗

第0日，本發明的生物材料(如實施例1所述之將ASC與1.5cm³的Cultispher G或S培養歷經7.5週的熟成)的十個複製物係縫合於Wistar大鼠的經燒灼腰肌。植入29日後，收獲生物材料藉由成像及組織學予以分析。

在試驗過程期間每日檢查動物的一般臨床狀態。

使用用於小動物成像SkyScan1076的高解析X-射線micro-CT系統實施30個試樣的礦化分析。礦化組織的掃描及分析的三維度重建係使用CTvol及CTan軟體(Skyscan)實施。

於肌肉樣本完成組織學分析以評價產物活體內血管新生及骨誘導性質(蘇木素-伊紅、Masson’s Trichrome、Von Kossa(以確定組織中礦化的位置)、人類組織標記Ku80(以確證動物組織中的細胞得人類起源)及CD3(以敘述組織中CD3+免疫細胞的重分區)染色。

3.2.結果

3.2.1.使用裸大鼠的活體內試驗

活體內試驗期間，未有受注意的痛苦信號或顯著損傷指示產物不誘導不良的動物效果。

裸大鼠中，於第29日實施的放射圖觀察到的不透射線結構的存在建議有礦化(第7圖)。

來自裸大鼠的樣本中的人類細胞的存在係經突出顯示。當存在時人類細胞代表二群中的平均一半的植入物位點的細胞，排除邊緣。來自大鼠及人類起源的細胞係均質地分布於植入物位點，除的邊緣，該處僅存在大鼠細胞。

3.2.2.使用Wistar大鼠的活體內試驗

Wistar大鼠中，於第29日實施的放射圖觀察到的不透明結構的存在建議有礦化(第8圖)。

礦化的分析建議各植入物位點中經礦化組織的存在。

Von Kossa染色指示礦化位於粒子(第9圖)。

實施例4：活體內生物活性研究

4.1.材料及方法

4.1.1.樣本製備

製備十個樣本的~0.5g生物材料(如實施例1所述之將ASC與1.5cm³的Cultispher S培養歷經8週的熟成)用於植入10之裸大鼠的脊椎旁的肌肉組織。此外，使用2樣本的~0.5g的Cultispher S粒子作為對照。

為了評估樣本的生長因子含量，製備生物材料的樣本用於蛋白抽取及定量(VEGF、IGF1、SDF-1α)。

為了評價生物材料的品質，一樣本固定於甲醛用於蘇木素-伊紅(HE)及Von Kossa(VK)染色。藉由於HE染色後技術組織中的細胞數評估去細胞化處理藥效評鑑。

4.1.2.動物設施中的畜舍

動物係安置於由獸醫服務核准的動物設施「Centre Préclinique Atlanthera」且所使用的所有試驗程序係符合目前存在的法規(2013年2月1日的Decree N 2013-118，針對使用於試驗目的的動物)。於研究開始前使動物適應至少7日，期間每日追蹤動物的一般狀態。動物係安置於空調動物畜舍中的標準維度的塑膠盒中。人工日/夜光循環係設定為12小時光照及12小時黑暗。所有動物自由攝取水且以商業糧食任食地餵食。各動物係藉由耳標(環)鑑定。

4.1.3.試驗方案

於第0日，生物材料的複製物係縫合於10隻裸大鼠的燒灼腰肌，而於實體化於裸大鼠1的腰肌中的肌肉經燒灼指套中單獨植入粒子。植入後29日，收獲含有生物材料的肌肉藉由成像及組織學予以分析。

植入至腰肌

動物係完全地麻醉以於最佳條件實施手術。麻醉過程係設定為手術前約30分鐘的丁基原啡因(Buprenorphine)注射接著於次日另一次注射。

手術：對於各動物，在腰椎水平方向沿脊柱製造縱向皮膚切口。對於大鼠1，肌肉套環係係達成於皮膚切口兩側(亦即，套環係實施至腰肌)。套環經燒灼。粒子單獨植入至該等套環。對於10隻大鼠，生物材料縫合於經燒灼腰肌。手術程序後，使用手術釘縫合皮膚創傷。

臨床追蹤

在試驗過程期間每日檢查動物的一般臨床狀態。每週二次，完成詳細的臨床追蹤，著重於：呼吸、眼、心血管、消化道的信號；運動活性及行為；癲癇痙攣的信號；皮膚的評估；於植入位點的發炎。

此外，於詳細的臨床追蹤的相同時間每週二次測定體重。

終止程序及解剖分析

於第29日，動物藉由放血犧牲且完成宏觀評價。於剖檢期間。觀察屍體的外觀及記錄任何的病理性流體的損失、內部損傷異常的可能信號。

寬廣地打開胸腔及腹腔以評估內部器官的任何損傷模式，著重於心、腎、脾、肝及肺。

於植入物位點的宏觀評估

暴露肌肉植入物位點且完成詳細的宏觀評估而著重於局部組織反應及植入物的存在與定位(放射圖分析)。

單獨移除肌肉植入物位點。外植體係於室溫固定於中性緩衝的福馬林溶液48小時。

3D組織形態計量分析

試樣的礦化分析係使用用於小動物成像SkyScan1076的高解析X-射線micro-CT予以實施。

使用下述參數於室溫掃描肌肉樣本：來源伏特：50kV；旋轉步驟：0.5°；像素尺寸：18μm；每位置1框架。

使用CTvol及CTan軟體(Skyscan)實施礦化組織的掃描及分析的三維度重建。

各樣本中，測定類似於骨礦化組織者(閾值40/225)的信號量(鑑定為骨體積：BV)。使用的「組織體積」值為所調配的植入物體積。

組織病理分析及2D組織形態計量分析

於肌肉樣本達成組織學分析以評估產物的活體內血管新生及骨誘導性質。

經福馬林固定的外植體係於EDTA 15%中脫鈣13日。然後，將樣本脫水且包埋於石蠟中。使用切片機切成4至5μm段且於玻片延伸。該等段係藉由150μm於二個不同水平距離實施。

於該等二段面積，實施蘇木素-伊紅(HE)、Masson’s trichrome(MT)及CD146的免疫組織化學(使用來自經包埋於石蠟或經冷凍的樣本的段)。

完全染色段的影像係使用數位玻片掃描機(Nanozoomer,Hamamatsu)獲得。藉由血管所佔面積的定量(Trichrome Masson,CD146)係使用NDPview2軟體予以實施：感興趣的面積係基於組織手動地劃定以特徵於該段定義「植入物位點」的面積。各血管係手動地劃定以定量感興趣區域中藉由血管所佔面積。回應於血管及血管數的表面係報導為「植入物位點」的總面積。

4.2.結果

4.2.1.組織學分析

組織中的細胞數係於HE染色後測定(第10圖)：146,5±50,4個細胞/mm²。

組織的Von Kossa染色顯示定位於粒子的弱礦化(第11圖)。

4.2.2.生物材料的生物活性的活體內研究

未有受注意的痛苦信號或顯著損傷指示產物不誘導不良的動物效果。於試驗全程中記錄動物體重，指示於第2日所有動物不存在體重獲得且然後顯示於第2日及第28日之間規律的體重獲得。通常觀察到在剛手術後的缺乏體重獲得且不考慮為測試產物的任何毒性信號。於第2日及第28日之間觀察到的規律的體重獲得證實開粒子不影響動物代謝。於活體內試驗的終點，剖檢未突出顯示任何宏觀的器官損傷。

於植入物位點的礦物質含量

於第29日實施的放射圖，於經植入生物材料所有位點觀察到的放射不透明結構的存在建議有礦化(第12圖)。

為了定量經礦化組織至肌肉中形成百分比，使用用於小動物成像SkyScan1076的高解析X-射線micro-CT實施「植入物位點」的礦化分析。結果呈示於表5。

分析建議於經植入生物材料的各位點的經礦化組織的可注意含量的存在，具有平均0.118的BV/TV。

植入物的新血管化

檢測纖維結締組織中微血管的存在以記檔(document)新血管化。

於Masson’s Trichome染色定量植入物中以及肌肉與植入物位點之間於接合處的血管/面積及血管密度的數。

藉由Masson’s Trichome染色觀察到具有生物材料的植入物的經血管化，具有40.8±18.5個血管/mm²的數。

實施例5：於高血糖/缺血異種大鼠模式中的活體內藥效研究

5.1.材料及方法

5.1.1動物

250至300g的56隻雌性Wistar大鼠腹腔內接受鏈脲佐菌素(streptozotocin)(50mg/kg)。於鏈脲佐菌素投藥後七至十日，藉由血糖測試紙測定來自位靜默血液的血糖程度。具有血糖程度>11.1mM的大鼠考慮為高血糖且包含於研究(n-42大鼠)。

如Levigné等人(Biomed Res Int 2013)所述於各大鼠的左肢誘導缺血。經由在腹股溝區域剃過的縱向切口，由總胯動脈至顯動脈解剖外胯動脈及股動脈。為了喚起缺血狀況，經解剖的動脈於左肢由總胯動脈切除而於右肢動脈保留且認為肢體為非缺血的。所有手術過程係於操作性顯微鏡(Carl Zeiss,Jena,Germany)下實施，且動物界由吸入異氟烷5%誘導麻醉及3%用於維持麻醉。

動物係隨機分為3群：

- 偽手術群(n=10隻雌性Wistar大鼠)；

- Cultispher群(n=10隻雌性Wistar大鼠)，亦即粒子單獨；

- 生物材料群(n=14隻雌性Wistar大鼠)，亦即ASC與明膠粒子形成組織。

5.1.2測試項目

製備~0.5g的Cultispher粒子的14個樣本，經γ-照射。

由植入製備~2cm²的生物材料(如實施例1所述之將ASC與1.5cm³的Cultispher S培育歷經8週的熟成)的14個樣本。

為了評價樣本的生長因子的含量，製備生物材料的一樣本用於蛋白質抽取及定量(VEGF、IGF1、SDF-1α)。

為了評估生物材料的定量，樣本係固定於甲醛用於蘇木素-伊紅(HE)著色。於HE染色後藉由計數組織中的細胞數評價去細胞化處理效果。

5.1.3創傷癒合的宏觀評價

於植入後第0、15、24及34日採取腳的照相圖。

為了定量創傷閉合，藉由二個獨立的操作者使用Image J軟體藉由影像分析測定創傷面積。於D0與D34之間於各時間點測定的創傷面積計算曲線下面積且表現為與偽手術群(固定為100%)比較。

5.1.4創傷癒合的微觀評估

解剖腳以移除創傷組織且此最新者導向於橫向地具有組織的完整厚度的組織學切片。製備5μm組織學切片且以HE染色用於表皮(op‘t Veld RC et al,Biomaterials 2018)及真皮給分(Yates C et al,Biomaterials 2007)：

創傷的三的代表性段中的給分表皮癒合(芯及外周)：

- 0：無上皮細胞的移動，

- 1：部分移動，

- 2：完全移動具有無/部分角質化，

- 3：完全移動具有完全角質化，

- 4：晚期肥大。

創傷的三的代表性段中的給分真皮癒合(芯及外周)：

- 0：無癒合，

- 1：發炎性浸潤，

- 2：粒子化組織存在-纖維增生及血管新生，

- 3：膠原蛋白沉積置換粒子化組織>50%，

- 4：肥大性纖維化回應。

此外，實施Masson’s Trichome著色藉由組織形態評估血管面積及CD3、CD68免疫染色用以評估免疫及發炎性回應。此外，實施KU80染色以鑑定植入後人類細胞的存在。

5.2.結果

於接受鏈脲佐菌素注射的56隻大鼠，42隻發展高血糖且選擇用於研究，而14隻表現低血糖且發展手術併發症而因此排除於研究外。

5.2.1.創傷癒合的宏觀評估

創傷的宏觀圖係呈示於第13圖。於生物材料群在手術後第15日(D15)觀察到較佳的創傷癒合(第13C圖)，相較於其他群(偽手術對照(第13A圖)及粒子單獨，第13B圖)。此差異可見於缺血性(左肢)及非缺血性(右肢)二者。

對於非缺血性創傷的曲線下面積係呈示於第14圖。Cultispher單獨的植入，相較於未經處理動物，分別顯示23%的創傷癒合減低。相對地，較佳的創傷癒合(25%)可於經本發明的生物材料處理的群觀察到。

對於D0及D34之間的非缺血性創傷及缺血性創傷的創傷面積評估係呈示於第15圖(分別為第15A圖及第15B圖)。注意到經以本發明的生物材料處理的創傷於D21至D34，相較於其他群，呈現較低的未癒合組織。當以本發明的生物材料處理時，於非缺血性及缺血性的狀況，創傷的完全閉合顯著地為較快(分別為第16A圖及第16B圖)。

用於評估發炎性反應的組織形態學的結果係呈示於第17圖。該等結果顯示，經以本發明的生物材料(第17C圖)處理的邊界、芯及總缺血性創傷 顯示較高的淋巴球CD3(黑線)，相較於偽手術對照(第17A圖)及Cultispher S單獨(第17B圖)。CD3正常功能係破壞感染物及不起作用的細胞。

此外，巨噬細胞CD68(灰線)於D10達峰(第17C圖)，如同偽手術對照(第17A圖)及Cultispher S單獨(第17B圖)。CD68係巨噬細胞的特徵，可見於感染組織位點及移除細胞殘質及感染物。

該等二個觀察證實本發明生物材料的植入藉由免疫啟發而導致創傷閉合動力學的增加。

也評估創傷厚度(第18圖)。於缺血性模式中(第18A圖)，創傷厚度於植入後D15至D34減少，顯示退縮。於非缺血性模式中(第18B圖)，創傷厚度於植入後D15至D34稍微減少，但於更重要的係於偽手術對照及Cultisphers單獨的情況不增加。此結果突出顯示當植入本發明的生物材料無肥大。

5.2.2.創傷癒合的微觀評估

於各時間點於缺血性創傷的表皮及真皮給分，係呈示於第19A圖、第19B圖、第19C圖及第19D圖。相較於其他群，本發明的生物材料可觀察到較快的真皮及表皮。

實施例6：不同的分化培養基測試

6.1.材料及方法

研究分化培養基對於所形成的3D結構的影響。ASC與1.5cm³的Cultispher S於不同的分化培養基培養4週：成骨性(如同實施例1)、成軟骨性(DMEM、5% HPL、100μg/mL丙酮酸鈉、ITS 1X、40μg/mL脯胺酸、10ng/mL TGF-β1、1μM地塞米松)、成角質性(DMEM、5% HPL、5μg/mL胰島素、10ng/mL KGF、10ng/mL hEGF、0.5μg/mL氫化可體松、1.5mM CaCl2)及成肌纖維性(DMEM：F12、 100μg/mL丙酮酸鈉、1X ITS、1X RPMI 1640維生素、1ng/mL TGF-β1、1μg/mL穀胱甘肽、0.1mM MEM)。培養維持4週且分化培養基更換為每3至4日。

於4週的組織活檢體係固定於甲醛用於蘇木素-伊紅染色、Masson’S Trichrome染色及Von Kossa染色。此外，實施組織特異性染色(骨鈣素、艾爾遜藍、Pankeratin、CD34、α-SMA)。

為了評估所形成組織的生物可利用性，於Cultispher的添加後4週採取活檢體用於蛋白質抽取及定量。藉由色度計(BCA Protein Assay Kit,ThermoFisher Scientific)定量總蛋白質含量及生長因子含量(VEGF及SDF-1α)。

6.2.結果

ASC及Cultispher S於成骨性培養基中作為成骨性分化的陽性對照。觀察到大的可抓握3D結構的形成。組織分析顯示細胞化互連組織中的粒子整合及基質的骨鈣素陽性染色(第20A圖)。

於成軟骨性培養基中培養快速地(僅於數日後)展示強力及厚的3D結構的形成，容易地可抓握且耐機械力。組織分析顯示細胞化互連組織中的粒子整合及基質艾爾遜藍著色為陽性(第20B圖)。

成基纖維性分化培養基允許3D結構的形成。所形成的結構為可抓握，但易碎。再次，組織分析解顯示細胞化互連組織中的粒子整合及基質的α-SMA陽性染色(第20C圖)。

ASC及粒子於成角質性培養基中形成大的、平的及薄的3D結構。此最後者為非常易碎且難以操作(第20D圖)。

所以，於測試的所有分化培養基，以ASC及明膠所形成的生物材料的所有樣本中皆觀察到3D結構。

Claims (15)

1. 一種具有多維度結構的生物材料，包括分化的脂肪幹細胞(ASC)、細胞外基質及明膠。
2. 如申請專利範圍第1項所述的生物材料，其中，該明膠為豬明膠。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述的生物材料，其中，該明膠係呈粒子型。
4. 如申請專利範圍第3項所述的生物材料，其中，該粒子具有平均直徑範圍由約50μm至約1000μm，較佳地由約75μm至約750μm，更佳地由約100μm至約500μm。
5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的生物材料，其中，該生物材料係三維度。
6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的生物材料，其中，該ASC係分化為由下述所成群組選擇的細胞：成骨細胞、軟骨細胞、角質細胞、肌纖維母細胞、內皮細胞及脂肪細胞。
7. 一種醫療裝置，包括申請專利範圍第1至6項中任一項所述的多維度生物材料。
8. 一種用於產生申請專利範圍第1至6項中任一項所述的多維度生物材料的方法，包括下列步驟：

   - 脂肪幹細胞(ASC)增殖，

   - ASC分化於第四繼代，以及

   - 多維度誘導，較佳地3D誘導。
9. 一種多維度生物材料，其係由申請專利範圍第8項所述的方法獲得。
10. 一種申請專利範圍第1至6項中任一項所述的生物材料的用途，用於治療組織缺損。
11. 如申請專利範圍第10項所述的生物材料的用途，其中，該組織係選擇由下述所成群組：骨、軟骨、真皮、表皮、肌肉、內皮及脂肪組織。
12. 如申請專利範圍第10或11項所述的生物材料的用途，其中，該組織缺損係真皮缺損及/或表皮缺損。
13. 如申請專利範圍第10至12項中任一項所述的生物材料的用途，其中，該生物材料的用途係真皮重建。
14. 如申請專利範圍第10至13項中任一項所述的生物材料的用途，其中，該生物材料的用途係用於治療真皮創傷，較佳地糖尿病性真皮創傷。
15. 如申請專利範圍第10至14項中任一項所述的生物材料的用途，其中，該生物材料的用途係用於治療表皮溶解水皰症、先天性巨大黑色素痣及域先天性皮膚發育不全。

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