KR102339700B1

KR102339700B1 - 입자상 탈세포화 조직을 포함하는 하이브리드 겔

Info

Publication number: KR102339700B1
Application number: KR1020157033527A
Authority: KR
Inventors: 주니치 마츠다; 수미카 미야바시라; 사토미 하라노; 아키오 키시다; 츠요시 키무라; 준 네기시; 테츠야 히가미; 세이이치 후나모토; 켄-이치로 히와타리; 아키코 타사키
Original assignee: 케이엠 바이올로직스 가부시키가이샤; 고쿠리츠 다이가쿠호우징 도쿄이카시카다이가쿠; 훗카이도 코리츠 다이가쿠 호진 삿포르 이카 다이가쿠; 가부시키가이샤 아데카
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2014-05-02
Publication date: 2021-12-14
Also published as: JPWO2014181886A1; EP2995326A4; EP2995326B1; EP2995326A1; HK1222137A1; CN105658250B; JP6553507B2; CN105658250A; WO2014181886A1; KR20160025502A; CA2911592A1; US20160051731A1; CA2911592C

Abstract

입자상 탈세포화 조직(동물유래의 생체조직을 탈세포화 처리해서 수득된 탈세포화 생체조직이 분쇄한 것), 피브리노겐, 및 트롬빈을 포함하는 하이브리드 겔, 해당 하이브리드 겔을 포함하는 세포배양 기재, 해당 하이브리드 겔의 제작방법, 및 입자상 탈세포화 조직 및 생체조직 접착제를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 하이브리드 겔은 줄기세포의 분화나 기능획득을 촉진하는 효과, 각종질병에 대한 치료효과를 갖는다.

Description

입자상 탈세포화 조직을 포함하는 하이브리드 겔{HYBRID GEL CONTAINING PARTICULATE DECELLULARIZED TISSUE}

본 발명은 재생의료의 기술분야에 관한 것으로서, 구체적으로는 동물유래의 생체조직을 탈세포화시킨 조직(탈세포화 생체조직)을 분쇄한 입자상 탈세포화 조직, 피브리노겐, 및 트롬빈을 포함하는 하이브리드 겔, 및 그 이용방법에 관한 것이다.

타인의 생체조직 유래의 이식편을 이식하는 경우, 피이식자측 조직에 의한 이식편의 거절반응이 문제가 된다. 이러한 문제의 해결방법으로서 인공조직의 개발이 기대되고 있다. 소재로서 여러 고분자가 시험되고 있지만, 이것들 소재와 생체조직과의 적합성이 낮기 때문에 이식편과 생체조직과의 접합부위에서의 탈락이나 감염증이 발생하는 경우가 있다.

따라서, 생체조직과의 적합성을 향상하기 위해, 생체조직으로부터 세포를 제거해서 잔존하는 지지 조직인 탈세포화 생체조직을 이식편으로서 사용하고, 이러한 탈세포화 생체조직을 분쇄해서 수득된 것(입자상 탈세포화 조직)을 사용하는 기술이 개발되어 왔다.

그러한 가운데서, CryoLife사는 처음으로 상업적으로 사용 가능한 탈세포화된 인간 유래 심장 판막을 개발하고 있으며, AutoTissue사는 인간의 심장질병을 치료할 목적으로 탈세포화된 돼지 유래의 심장 판막을 개발하고 있다.

탈세포화 조직이나 입자상 탈세포화 조직에 대해서는 하기의 보고가 있다. 비특허문헌 1(Sasaki S., et al., Mol. Vis., 2009, 15, 2022-2028), 비특허문헌 2(Hashimoto Y., et al., Biomaterials, 2010, 31, 3941-3948)는 돼지의 각막을 고정수압으로 처리해서 탈세포화한 것을 토끼의 눈에 이식했을 경우에 기능적인 것을 보고하고 있다. 특허문헌 1(일본 공개특허공보 제2013-42677호)는 각막의 탈세포화 처리에 적합한 처리액을 개시하고 있다. 비특허문헌 3(Funamoto S., et al., Biomaterials, 2010, 31, 3590-3595)는 돼지 유래의 대동맥을 고정수압 처리에 의해 탈세포화하고, 역학적특성이나 in vivo에서의 능력에 대해서 평가한 결과, 역학적 특성은 고정수압 처리에 의해 악영향을 받지 않고, 염증반응은 억제되고, 동맥의 혈압에 견딜 수 있고, 관강측에 혈전이 형성되지 않는 점을 보고하고 있으며, 또, 혈관벽으로의 세포침윤이 해당 혈관을 이식해서 4주간에 발생하는 것을 보고하고 있다. 비특허문헌 4(Negishi J., et al., J. Artif. Organs, 2011, 14, 223-231)는 콜라겐의 변성이 억제된 조건에서 랫트 유래의 경동맥을 탈세포화하고, 랫트에 이식했을 경우, 동맥폐색이 억제되는 것을 보고하고 있다.

비특허문헌 5(Singelyn J. M., et al., Biomaterials, 2009, 30, 5409-5416)는 돼지의 심근을 계면활성제로 탈세포화한 후, 동결건조, 분쇄, 및 펩신소화를 거쳐서 수득된 심근 매트릭스가 자기회합하고, 다공성으로 섬유상의 하이드로겔을 형성하는 것, 및, 해당 하이드로겔에 대해서 내피세포나 평활근 세포가 침윤하고, 소혈관의 형성을 증가시키는 것을 보고하고 있다. 비특허문헌 6(Seif-Naraghi S., et al., J. Vis. Exp., 2010, 46, e2109)은 해당 하이드로겔을 좌실 자유벽에 적용해서 숙주반응을 검토하고 있다. 비특허문헌 7(Singelyn J. M., et al., J. Am. Coll. Cardiol., 2012, 59, 751-763)은 해당 하이드로겔을 심근경색 모델 랫트에 적용했을 경우, 내재성의 심근세포를 증가시키고, 부정맥을 일으키는 않아 심장기능이 유지되고 있는 것을 보고하고 있다. 비특허문헌 8(SonyaB.,etal.,Sci.Transl.Med.,2013,5,173ra25) 은 해당 하이드로겔을 돼지의 심근경색 모델에 적용했을 경우, 심장의 기능, 심실의 용적, 전체적인 심장벽의 움직임이 개선하고 있음을 보고하고 있고, 또, 해당 하이드로겔이 랫트에 대해서 생체 적합성인 점을 보고하고 있다. 비특허문헌 9(Wolf M. T., et al., Biomaterials, 2012, 33, 7028-7038)는 돼지 유래 진피 또는 돼지 유래 방광을 탈세포화, 동결건조, 및 펩신 처리를 거쳐서 수득된 세포외 매트릭스 하이드로겔을 랫트 복벽 결손부에 적용했을 경우, 방광유래 겔은 진피유래 겔보다 신속하게 분해되고, 근육 형성량이 많은 점을 개시하고 있다.

그렇지만, 해당 하이드로겔은 임상에 있어서 표적부위에 적용하는 방법이 불충분하고, 적용부위에서 벗겨져 떨어지는 혹은 첨가한 매트릭스가 흐르게 되어 목적으로 하는 부위로부터 소실되어버리는 것이 상정된다. 입자상 탈세포화 조직의 종류에 따라서는 자기 겔화에 의해 적용부위에서의 유치가 기대되지만, 겔화는 즉시로는 완료할 수 없고, 또 표적부위와의 친화성도 불충분하다. 특히 심장과 같은 동적인 조직에서는 적용부에 유치시키는 것이 곤란하고, 그 결과, 충분한 효과가 수득되지 않는 것이 시사된다.

특허문헌 2(일본 공개특허공보 제2002-518319호)는 인간 피부의 탈세포화 조직 매트릭스인 AlloDerm(Life Cell사)의 저온 파괴한 입상 무세포조직 매트릭스가 랫트나 돼지에 적용했을 경우에 치명적인 급성 염증성 응답의 징후가 관찰되는 않는 것을 보고하고 있다.

일본 공개특허공보 제2013-42677호 일본 공개특허공보 제2002-518319호 일본특허 제4092397호 일본 재공개특허공보 제WO2008-111530호 일본 공개특허공보 제2009-50297호 일본 공개특허공보 제2010-227246호 일본특허 제4189484호

Sasaki S., et al., Mol. Vis., 2009, 15, 2022-2028 Hashimoto Y., et al., Biomaterials, 2010, 31, 3941-3948 Funamoto S., et al., Biomaterials, 2010, 31, 3590-3595 Negishi J., et al., J. Artif. Organs, 2011, 14, 223-231 Singelyn J. M., et al., Biomaterials, 2009, 30, 5409-5416 Seif-Naraghi S., et al., J. Vis. Exp., 2010, 46, e2109 Singelyn J. M., et al., J. Am. Coll. Cardiol., 2012, 59, 751-763 Sonya B., et al., Sci. Transl. Med., 2013, 5, 173ra25 Wolf M. T., et al., Biomaterials, 2012, 33, 7028-7038 Ott H. C., et al., Nature Medicine, 2008, 14, 213-221 Barakat O., et al., J. Surg. Res., 2012, 173, e11-e25 Park K. M., et al., Transplant. Proc., 2012, 44, 1151-1154 Ott H. C., et al., Nature Medicine, 2010, 16, 927-933 Yang B., et al., Tissue Eng. Part C Methods, 2010, 16, 1201-1211 De Quach J. A., et al., Tissue Eng. Part A, 2011, 17, 2583-2592

이렇게 입자상 탈세포화 조직은 이식편의 거절반응도 없고, 질병부위의 재생ㆍ치유에 유용한 것이 나타나 있지만, 더욱 완전한 것으로 하기 위해서는 이하의 점이 소망된다. 즉, 재생ㆍ치유에 관계되는 환자유래 또는 도입한 세포가 표적부위에 모이고, 또는 표적부위의 성숙세포가 탈분화하고, 이것들의 세포가 증식하고, 분화ㆍ재분화하는 행정이 신속하게 수행되는 비계인 점; 또는 입자상 탈세포화 조직으로 재구축된 조직ㆍ기관이 신속하게 숙주에 적합해 기능하는 점; 표적부위에 용이하게 적용되고, 그 부위에서 신속하게 겔화하고, 확실하게 유치하는 것; 부가해서 집적한 세포로의 영양공급을 실시하기 위한 미세혈관을 조기에 유도하고, 전술한 효과를 촉진시켜서 보다 효과적인 조직 재생을 촉진하는 점.

이들 과제를 해결하기 위해서 본 발명자들은 예의 검토를 실시한 결과, 탈세포화 생체조직에 유래하는 입자와 피브린 풀(glue)을 조합시켜서 세포나 질병 모델 동물에 적용했을 경우, (1) 심장유래 세포에서는 심근세포로의 분화 및 박동 등의 기능획득이 발견되고, (2) 심근경색 모델에서는 심장의 벽 두께가 얇아지는 것을 억제하는 효과나 혈관신생 효과가 확인되고, (3) 신경 전구세포에서는 수상돌기의 형성 유도/신경돌기의 신장작용이 발견되고, (4) 피부동상 모델에서는 동상부위의 구축발생을 억제하면서 조직재생을 촉진하는 효과가 확인되고, 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명에는 이하의 발명이 포함된다.

ㆍ 동물유래의 생체조직을 탈세포화시킨 조직(탈세포화 생체조직)을 분쇄한 입자상 탈세포화 조직, 피브리노겐, 및 트롬빈을 포함하는 하이브리드 겔;

ㆍ 해당 하이브리드 겔을 포함하는 것을 특징으로 하는 질병 치료제, 세포이식 보조제, 또는 세포배양 기재;

ㆍ 동물유래의 생체조직을 탈세포화해서 탈세포화 생체조직을 얻는 공정, 그 탈세포화 생체조직을 분쇄해서 입자상 탈세포화 조직을 얻는 공정, 및 그 입자상 탈세포화 조직, 피브리노겐, 및 트롬빈을 혼합하는 공정, 을 포함하는 하이브리드 겔의 제작방법;

ㆍ 해당 입자상 탈세포화 조직, 및 피브린 풀을 동물조직에 적용하는 것을 포함하는 조직재생 요법;

ㆍ 해당 하이브리드 겔을 동물조직에 적용하는 것을 포함하는 조직재생 요법;

ㆍ 해당입자상 탈세포화 조직, 피브린 풀, 및 세포를 동물조직에 적용하는 것을 포함하는 세포이식 방법;

ㆍ 해당 하이브리드 겔과 함께 세포를 동물조직에 적용하는 것을 포함하는 세포이식 방법;

ㆍ 해당 하이브리드 겔과 함께 세포를 배양하는 것을 포함하는 세포배양 방법;

ㆍ 동물유래의 생체조직을 탈세포화시킨 조직(탈세포화 생체조직)을 분쇄한 입자상 탈세포화 조직, 및 피브린 풀을 포함하는 키트.

추가로 구체적으로는, 본 발명에는 이하의 발명이 포함된다.

[1] 동물유래의 생체조직을 탈세포화시킨 조직(탈세포화 생체조직)을 분쇄한 입자상 탈세포화 조직, 피브리노겐, 및 트롬빈을 포함하는 하이브리드 겔.

[2] 상기 [1]에서, 동물이 인간 이외의 동물인 하이브리드 겔.

[3] 상기 [1] 또는 [2]에서, 탈세포화되는 생체조직이 매트릭스 구조를 가지는 생체조직인 하이브리드 겔.

[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에서, 탈세포화되는 생체조직이 심장, 간장, 신장, 폐, 뇌, 및 척수로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1 이상의 생체조직인 하이브리드 겔.

[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에서, 탈세포화 생체조직이 생체조직에 고정수압 처리를 실시해서 수득된 탈세포화 생체조직인 하이브리드 겔.

[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에서, 트롬빈이 0.8U/㎖ 이상의 농도인 하이브리드 겔.

[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 하이브리드 겔을 포함하는 질병 치료제.

[8] 상기 [7]에서, 질병 치료제가 심근경색 치료제, 신경손상 질병 치료제, 및 피부동상 치료제로 이루어지는 그룹에서 선택되는 치료제인 치료제.

[9] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 하이브리드 겔을 포함하는 세포이식 보조제.

[10] 상기 [9]에서, 세포가 심장유래 세포, 신경 전구세포, 또는 조직 줄기세포 유래인 세포이식 보조제.

[11] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 하이브리드 겔을 포함하는 세포배양 기재.

[12] 상기 [11]에서, 세포가 심장유래 세포, 신경 전구세포, 또는 조직 줄기세포 유래인 세포배양 기재.

[13] 동물유래의 생체조직을 탈세포화해서 탈세포화 생체조직을 얻는 공정, 그 탈세포화 생체조직을 분쇄해서 입자상 탈세포화 조직을 얻는 공정, 및 그 입자상 탈세포화 조직, 피브리노겐, 및 트롬빈을 혼합하는 공정을 포함하는 하이브리드 겔의 제작방법.

[14] 상기 [13]에서, 동물이 인간 이외의 동물인 제작방법.

[15] 상기 [13] 또는 [14]에서, 탈세포화되는 생체조직이 매트릭스 구조를 가지는 생체조직인 제작방법.

[16] 상기 [13] 내지 [15] 중 어느 하나에서, 탈세포화되는 생체조직이 심장, 간장, 신장, 폐, 뇌, 및 척수로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1 이상의 생체조직인 제작방법.

[17] 상기 [13] 내지 [16] 중 어느 하나에서, 탈세포화 생체조직을 얻는 공정이, 동물유래의 생체조직을 탈세포화하는 공정, 및 마이크로파 조사해서 세정하는 공정을 포함하는 제작방법.

[18] 상기 [13] 내지 [17] 중 어느 하나에서, 탈세포화가 생체조직에 고정수압 처리해서 이루어지는 제작방법.

[19] 상기 [13] 내지 [18] 중 어느 하나에서, 탈세포화 생체조직을 분쇄하는 공정이,

탈세포화 생체조직을 세단하는 공정, 세단된 탈세포화 생체조직을 동결건조 또는 동결하는 공정, 및 동결건조 또는 동결된 탈세포화 생체조직을 분쇄하는 공정을 포함하는 제작방법.

[20] 상기 [19]에서, 분쇄된 탈세포화 생체조직을 입자 사이즈로 체질하는 공정을 추가로 포함하는 제작방법.

[21] 상기 [13] 내지 [20] 중 어느 하나에서, 트롬빈이 0.8U/㎖ 이상의 농도인 제작방법.

[22] 동물유래의 생체조직을 탈세포화시킨 조직(탈세포화 생체조직)을 분쇄한 입자상 탈세포화 조직, 및 피브린 풀을 동물조직에 적용하는 것을 포함하는 조직재생 요법.

[23] 상기 [22]에서, 탈세포화 생체조직의 유래가 되는 동물이 인간 이외의 동물인 조직재생 요법.

[24] 상기 [22] 또는 [23]에서, 탈세포화되는 생체조직이 매트릭스 구조를 가지는 생체조직인 조직재생 요법.

[25] 상기 [22] 내지 [24] 중 어느 하나에서, 탈세포화되는 생체조직이 심장, 간장, 신장, 폐, 뇌, 및 척수로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1 이상의 생체조직인 조직재생 요법.

[26] 상기 [22] 내지 [25] 중 어느 하나에서, 탈세포화 생체조직이 생체조직에 고정수압 처리를 실시해서 수득된 탈세포화 생체조직인 조직재생 요법.

[27] 상기 [22] 내지 [26] 중 어느 하나에서, 적용하는 동물이 인간 이외의 동물인 조직재생 요법.

[28] 상기 [22] 내지 [27] 중 어느 하나에서, 적용하는 조직이 심장, 신경, 또는 피부인 조직재생 요법.

[29] 상기 [1] 내지 [6]에 기재된 하이브리드 겔을 동물조직에 적용하는 것을 포함하는 조직재생 요법.

[30] 상기 [29]에서, 적용하는 동물이 인간 이외의 동물인 조직재생 요법.

[31] 상기 [29] 또는 [30]에서, 적용하는 조직이 심장, 신경, 또는 피부인 조직재생 요법.

[32] 동물유래의 생체조직을 탈세포화시킨 조직(탈세포화 생체조직)을 분쇄한 입자상 탈세포화 조직, 피브린 풀, 및 세포를 동물조직에 적용하는 것을 포함하는 세포이식 방법.

[33] 상기 [1] 내지 [6]에 기재된 하이브리드 겔과 함께 세포를 동물조직에 적용하는 것을 포함하는 세포이식 방법.

[34] 상기 [32] 또는 [33]에서, 세포가 심장유래 세포, 신경 전구세포, 또는 조직 줄기세포 유래의 세포이식 방법.

[35] 상기 [32] 내지 [34] 중 어느 하나에서, 적용하는 동물이 인간 이외의 동물인 세포이식 방법.

[36] 상기 [32] 내지 [35] 중 어느 하나에서, 적용하는 조직이 심장, 신경, 또는 피부인 세포이식 방법.

[37] 상기 [1] 내지 [6]에 기재된 하이브리드 겔과 함께 세포를 배양하는 것을 포함하는 세포배양 방법.

[38] 상기 [37]에서, 세포가 심장유래 세포, 신경 전구세포, 또는 조직 줄기세포 유래의 것인 세포배양 방법.

[39] 동물유래의 생체조직을 탈세포화시킨 조직(탈세포화 생체조직)을 분쇄한 입자상 탈세포화 조직, 및 피브린 풀을 포함하는 키트.

[40] 상기 [39]에서, 탈세포화 생체조직의 유래가 되는 동물이 인간 이외의 동물인 키트.

[41] 상기 [39] 또는 [40]에서, 탈세포화되는 생체조직이 매트릭스 구조를 가지는 생체조직인 키트.

[42] 상기 [39] 내지 [41] 중 어느 하나에서, 탈세포화되는 생체조직이 심장, 간장, 신장, 폐, 뇌, 및 척수로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1 이상의 생체조직인 키트.

[43] 상기 [39] 내지 [42] 중 어느 하나에서, 탈세포화 생체조직이 생체조직에 고정수압 처리를 실시해서 수득된 탈세포화 생체조직인 키트.

[44] 상기 [39] 내지 [43] 중 어느 하나에서, 키트가 질병치료 키트인 키트.

[45] 상기 [44]에서, 질병치료 키트가 심근경색치료 키트, 신경손상 질병치료 키트, 및 피부동상치료 키트로 이루어지는 그룹에서 선택되는 키트인 키트.

[46] 상기 [39] 내지 [43] 중 어느 하나에서, 키트가 세포이식용 키트인 키트.

[47] 상기 [46]에서, 세포가 심장유래 세포, 신경 전구세포, 또는 조직 줄기세포 유래의 것인 키트.

[48] 상기 [39] 내지 [43] 중 어느 하나에서, 키트가 세포배양용 키트인 키트.

[49] 상기 [48]에서, 세포가 심장유래 세포, 신경 전구세포, 또는 조직 줄기세포 유래의 것인 키트.

본 발명의 하이브리드 겔은 줄기세포의 분화나 기능획득을 촉진하는 효과, 각종질병에 대한 치료효과를 갖는다. 더 구체적으로는, (1) 심장유래 세포가 심근세포로의 분화 및 박동 등의 기능을 획득하는 효과, (2) 심근경색 후에 심장벽이 얇아지는 것을 억제하는 효과나 혈관신생 효과, (3) 신경 전구세포가 수상돌기의 형성능 또는 신경돌기의 신장 능을 획득하는 효과, (4) 피부동상 후에 동상부위의 구축발생을 억제해서 조직재생을 촉진하는 효과가 예시된다.

도 1은 심근경색 모델 랫트의 미처리의 결과를 나타낸다.
도 2는 피브린 풀을 심근경색 모델 랫트에 적용한 결과를 나타낸다.
도 3은 피브린 풀을 심근경색 모델 랫트에 적용한 결과를 나타낸다.
도 4는 하이브리드 겔을 심근경색 모델 랫트에 적용한 결과를 나타낸다.
도 5는 하이브리드 겔을 심근경색 모델 랫트에 적용한 결과를 나타낸다.
도 6은 경색부의 신생 혈관수의 계측 결과를 나타낸다.
도 7은 신경 전구세포에 대한 수상돌기의 형성유도 작용을 평가한 결과를 나타낸다.
도 8은 신경 전구세포의 신경 세포로의 분화를 평가한 결과를 나타낸다.
도 9는 피하에서의 혈관신생 유도능을 평가한 결과를 나타낸다.
도 10은 동상부위에서의 피부조직 재생을 평가한 결과를 나타낸다.

1. 하이브리드 겔의 제작방법

본 발명에는 동물유래의 생체조직을 탈세포화해서 탈세포화 생체조직을 얻는 공정, 그 탈세포화 생체조직을 분쇄해서 입자상 탈세포화 조직을 얻는 공정, 및 그 입자상 탈세포화 조직, 피브리노겐, 및 트롬빈을 혼합하는 공정을 포함하는 하이브리드 겔의 제작방법이 포함된다.

본 발명의 제작방법에서는 처음에 동물로부터 생체조직을 회수한다. 생체조직은 탈세포화 처리가 이루어지는 것에 의해서, 동물유래 세포나 바이러스 및 박테리아가 제거된다. 그 때문에 생체조직은 그 유래로 하는 동물과 다른 종류의 동물에 이식했을 경우라도 이종면역반응이 억제된다. 따라서 생체조직을 회수하는 동물의 종류는 특별하게 한정되지 않는다. 한편, 생체조직은 용이하게 입수할 수 있음이 바람직하기 때문에 인간 이외의 동물인 것이 바람직하고, 특히 포유류의 가축, 조류의 가축이 바람직하다. 포유류의 가축으로서는 소, 말, 낙타, 라마, 당나귀, 야크, 양, 돼지, 염소, 사슴, 알파카, 개, 너구리, 족제비, 여우, 고양이, 토끼, 햄스터, 모르모트, 랫트, 다람쥐, 미국너구리 등을 들 수 있다. 또, 조류의 가축으로서는 잉꼬, 앵무새, 닭, 집오리, 칠면조, 거위, 뿔닭, 꿩, 타조, 메추리 등을 들 수 있다. 이 중에서도 입수의 안정성으로부터 돼지, 또는 토끼가 바람직하다.

생체조직은 세포 외에 매트릭스 구조를 가진 탈세포화 처리가 가능한 조직이 예시된다. 그러한 조직은 간장, 신장, 뇨관, 방광, 요도, 혀, 편도, 식도, 위, 소장, 대장, 항문, 췌장, 심장, 혈관, 비장, 폐, 뇌, 뼈, 척수, 연골, 정소, 자궁, 난관, 난소, 태반, 각막, 골격근, 근육, 신경, 피부 등으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 조직이다. 특히 바람직하게는 심장, 간장, 신장, 폐, 뇌, 척수, 정소, 비장, 방광, 혈관, 및 피부 등으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 조직이다. 생체조직으로서 특히 바람직하게는, 심장, 간장, 신장, 폐, 뇌, 및 척수이다. 동물로부터 생체조직을 회수하는 방법은 당업자에게 있어서 공지이다.

다음에, 본 발명의 제작방법에서는 동물유래의 생체조직에 대해서 탈세포화 처리를 실시한다. 탈세포화 처리는 동물유래의 세포나 바이러스 및 박테리아를 제거하는 방법이라면 특별하게 한정되지 않는다. 그러한 방법으로서는 계면활성제 처리(비특허문헌 5, 비특허문헌 7, 비특허문헌 8), 효소처리, 삼투압 처리, 동결융해 처리, 고정수압 처리(비특허문헌 1, 2, 3, 4, 특허문헌 3: 일본특허 제4092397호, 특허문헌 4: 일본 재공개특허공보 제WO2008-111530 호, 특허문헌 5: 일본 공개특허공보 제09-50297호)이 예시되고, 동물이나 생체조직의 종류에 따라 적당하게 선택할 수 있다. 고정수압 처리는 계면활성제 등의 인체에 악영향을 미칠 가능성이 있는 약제가 사용되지 않기 때문에, 특히 바람직하다. 정수압 처리에서 인가하는 압력은 2에서 1500MPa, 바람직하게는 10에서 1000MPa, 더욱 바람직하게는 80에서 500MPa이다.

탈세포화 처리의 조건은 동물이나 생체조직의 종류에 따라 적당하게 선택할 수 있다. 탈세포화 처리의 조건은 당업자에게 있어서 공지이며, 심장은 비특허문헌 10(Ott H. C., et al., Nature Medicine, 2008, 14, 213-221), 간장은 비특허문헌 11(Barakat O., et al., J. Surg. Res., 2012, 173, e11-e25), 위ㆍ장ㆍ비장ㆍ신장은 비특허문헌 12(Park K. M., et al., Transplant. Proc., 2012, 44, 1151-1154), 폐는 비특허문헌 13(Ott H. C., et al., Nature Medicine, 2010, 16, 927-933), 방광은 비특허문헌 14(Yang B., et al., Tissue Eng. Part C Methods, 2010, 16, 1201-1211), 혈관은 비특허문헌 3이나 비특허문헌 4, 뇌는 비특허문헌 15(De Quach J. A., et al., Tissue Eng. Part A, 2011, 17, 2583-2592), 피부는 비특허문헌 9에 개시되어 있다.

탈세포화 처리는 탈세포화 생체조직을 세정하는 공정을 포함할 수도 있다. 탈세포화 생체조직을 세정하는 방법은 탈세포화 처리의 종류에 따라 적당하게 선택할 수도 있다. 방법으로서는 세정액에 침지시키게 하는 방법(특허문헌 6: 일본 공개특허공보 제2010-227246호), 마이크로파를 조사하는 방법(특허문헌 7: 일본특허 제4189484호)이 예시된다.

다음에, 본 발명의 제작방법에서는 탈세포화 처리된 생체조직에 대해서 분쇄처리를 실시한다. 분쇄공정은 탈세포화 생체조직을 세단하는 공정, 세단된 탈세포화 생체조직을 동결건조 또는 동결하는 공정, 및 동결건조 또는 동결된 탈세포화 생체조직을 분쇄하는 공정을 포함할 수 있다. 입자상 탈세포화 조직을 제작하는 방법은 비특허문헌 5, 6, 7, 8, 및 특허문헌 2에 개시되어 있다.

조직을 분쇄하는 방법으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 생체조직을 상온에서 분쇄하는 방법, 생체조직을 냉동하고, 동결상태에서 분쇄하는 방법 등이 예시된다. 상온에서의 분쇄가 곤란한 생체조직 예를 들면, 신장 등의 경우에는, 동결상태에서 분쇄하는 것이 바람직하다. 동결상태에서 분쇄하는 경우, 0℃ 부근의 온도에서는 얼음 결정의 성장에 의해 조직에 대미지가 남는 경우가 있다. 이 때문에, 동결상태에서 분쇄하는 경우의 분쇄의 조건은 -80℃에서 -5℃, 바람직하게는 -50℃에서 -10℃, 더욱 바람직하게는 -40℃에서 -15℃ 이다.

분쇄방법으로서는 볼밀, 비드밀, 콜로이드밀, 코니커밀, 디스크밀, 에지밀, 제분밀, 해머밀, 펠릿밀, 커팅밀, 롤러밀, 제트밀 등이 예시된다. 커팅밀이 바람직하다.

또, 분쇄된 탈세포화 생체조직을 입자 사이즈로 체질하는 공정을 추가로 포함할 수도 있다.

입자상 탈세포화 조직의 입경은 특별하게 한정되지 않지만, 너무나 작은 경우에는 조직 재생의 효과가 낮고, 또 너무나 큰 경우에는 이식이나 치료의 기재로서 사용하기 어렵기 때문에, 0.1에서 1000㎛, 바람직하게는 0.5에서 500㎛, 더욱 바람직하게는 1에서 100㎛이다.

본 발명에 있어서의 입자상 탈세포화 조직의 제작방법에서는 생체조직을 채취하고, 생체조직에 탈세포화 처리를 실시하고, 파괴된 세포를 세정 제거하고, 입자상의 탈세포화 조직을 얻기까지 사이의 어느 단계에서 탈세포화 조직(또는 생체조직)을 분쇄해서 입자상으로 할 수도 있다. 즉, 분쇄 공정이 탈세포화 처리 전후 어느 경우라 해도, 수득되는 입자상 탈세포화 조직에 차이는 인정되지 않고, 다음 하이브리드 겔의 제작에 동등하게 사용할 수 있다.

본 발명의 하이브리드 겔의 제작방법에서는 입자상 탈세포화 조직, 피브리노겐, 및 트롬빈을 혼합하고, 하이브리드 겔을 제작한다. 혼합하는 방법은 피브리노겐 용액과 입자상 탈세포화 조직을 혼합한 것에 대해서 트롬빈 용액(또는 트롬빈 분말)을 혼합하는 방법, 트롬빈 용액과 입자상 탈세포화 조직을 혼합한 것에 대해서 피브리노겐 용액(또는 피브리노겐 분말)을 혼합하는 방법이 예시된다.

하이브리드 겔에 포함되는 피브리노겐 농도는 겔을 형성하는 농도라면 특별하게 한정되지 않고, 하이브리드 겔의 적용부위나 용도에 따라 적당하게 변경할 수 있다. 30㎎/㎖에서 40㎎/㎖가 예시된다.

하이브리드 겔에 포함되는 트롬빈 농도는 겔을 형성하는 농도라면 특별하게 한정되지 않고, 하이브리드 겔의 적용부위나 용도에 따라 적당하게 변경할 수도 있다. 트롬빈 농도가 0.8U/㎖ 이상인 경우 하이브리드 겔이 용이하게 형성된다. 그 때문에 트롬빈 농도로서는 0.8U/㎖에서 250U/㎖가 예시된다. 또, 겔 중의 트롬빈 농도가 낮을 경우, 세포의 접착성이 우수했다. 그 때문에 바람직한 트롬빈 농도로서는 0.8U/㎖에서 125U/㎖, 더욱 바람직하게는 0.8U/㎖에서 12.5U/㎖가 예시된다. 그러나, 0.8U/㎖ 미만의 트롬빈 농도라고 하여도 겔로 응고하는 시간이나 온도를 조정함으로써 하이브리드 겔을 제작하는 것이 가능하다고 생각되기 때문에 0.8U/㎖ 미만의 농도 또한 사용 가능하다.

하이브리드 겔에 포함되는 입자상 탈세포화 조직의 농도는 입자의 종류나 하이브리드 겔의 적용부위나 용도에 따라 적당하게 변경할 수도 있다. 16㎍/㎖에서 64㎍/㎖가 예시된다.

2. 하이브리드 겔

본 발명에는 동물유래의 생체조직을 탈세포화시킨 조직(탈세포화 생체조직)을 분쇄한 입자상 탈세포화 조직, 피브리노겐, 및 트롬빈을 포함하는 하이브리드 겔이 포함된다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 하이브리드 겔에 있어서, 생체조직을 회수하는 동물의 종류는 특별하게 한정되지 않는다. 바람직하게는 인간 이외의 동물이고, 포유류의 가축, 조류의 가축이 바람직하다. 포유류의 가축으로서는 소, 말, 낙타, 라마, 당나귀, 야크, 양, 돼지, 염소, 사슴, 알파카, 개, 너구리, 족제비, 여우, 고양이, 토끼, 햄스터, 모르모트, 랫트, 다람쥐, 미국너구리 등을 들 수 있다. 또, 조류의 가축으로서는 잉꼬, 앵무새, 닭, 집오리, 칠면조, 거위, 뿔닭, 꿩, 타조, 메추리 등을 들 수 있다. 이 중에서도 입수의 안정성으로부터 돼지, 또는 토끼가 바람직하다.

생체조직은 세포 외에 매트릭스 구조를 가진 탈세포화 처리가 가능한 조직이 예시된다. 그러한 조직은 간장, 신장, 뇨관, 방광, 요도, 혀, 편도, 식도, 위, 소장, 대장, 항문, 췌장, 심장, 혈관, 비장, 폐, 뇌, 뼈, 척수, 연골, 정소, 자궁, 난관, 난소, 태반, 각막, 골격근, 근육, 신경, 피부 등으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 조직이다. 특히 바람직하게는 심장, 간장, 신장, 폐, 뇌, 척수, 정소, 비장, 방광, 혈관, 및 피부 등으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 조직이다. 생체조직으로서 특히 바람직하게는 심장, 간장, 신장, 폐, 뇌, 및 척수이다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 하이브리드 겔에 있어서, 탈세포화 처리하는 방법은 특별하게 한정되지 않는다. 바람직하게는 고정수압 처리이다.

상기한 바와 같이, 하이브리드 겔중의 피브리노겐 농도는 겔을 형성하는 농도라면 특별하게 한정되지 않는다. 30㎎/㎖에서 40㎎/㎖가 예시된다.

상기한 바와 같이, 하이브리드 겔중의 트롬빈 농도는 겔을 형성하는 농도라면 특별하게 한정되지 않는다. 0.8U/㎖에서 250U/㎖가 예시된다. 바람직한 농도로서는 0.8U/㎖에서 125U/㎖, 더욱 바람직하게는 0.8U/㎖에서 12.5U/㎖가 예시된다. 한편으로는 0.8U/㎖ 미만의 농도도 사용 가능하다.

상기한 바와 같이, 하이브리드 겔중의 입자농도는 특별하게 한정되지 않지만, 16㎍/㎖에서 64㎍/㎖가 예시된다. 입자상 탈세포화 조직의 입경은 특별하게 한정되지 않지만, 0.1에서 1000㎛, 바람직하게는 0.5에서 500㎛, 더욱 바람직하게는1에서 100㎛이다.

3. 질병 치료제

본 발명에서는 상기 하이브리드 겔에, 심장유래 세포를 분화 유도하는 효과, 심근경색의 예후를 개선하는 효과, 신경 전구세포를 분화 유도하는 효과, 및 피부동상부위에 있어서 구축의 발생을 억제해서 환부를 치유하는 효과가 확인되고 있다. 그 때문에 본 발명에는 상기 하이브리드 겔을 포함하는 질병 치료제가 포함된다. 하이브리드 겔은 겔 상태, 동결상태, 동결건조상태의 어느 것일 수도 있다. 동결상태의 경우에는 적용 전에 융해할 수 있고, 동결건조상태의 경우에는 적용 전에 수화시킬 수 있다. 또, 하이브리드 겔은 직접 환부에 적용할 수 있다. 본 발명의 질병 치료제로서는 심근경색 치료제, 신경손상 질병 치료제, 및 피부동상 치료제가 예시된다.

4. 세포이식 보조제ㆍ세포배양 기재

본 발명의 하이브리드 겔은 심장유래 세포에 대한 분화 유도 효과나 박동기능을 획득시키는 효과, 및 신경 전구세포에 대한 분화 유도 효과가 확인되고 있다. 그 때문에 본 발명에는 상기 하이브리드 겔을 포함하는 세포이식 보조제나 세포배양 기재가 포함된다. 세포이식 보조제는 주로 하이브리드 겔과 이식세포로 구성되는 경우와, 주로 하이브리드 겔로 구성되는 경우가 예시된다. 전자의 경우, 하이브리드 겔내 또는 표면상에 이식세포를 존재시킨 상태에서 동물조직에 적용할 수 있다. 후자의 경우, 하이브리드 겔을 동물조직에 적용하는 전후에서 이식세포를 조합시켜서 적용할 수 있다.

세포배양 기재는 주로 하이브리드 겔로 구성되어 있으며, 배지 중에서 세포와 공존시켜서 사용한다. 세포와 공존시키는 경우에는 하이브리드 겔 상에 직접 세포를 파종해서 사용할 수도 있고, 하이브리드 겔과 세포 사이에 세포배양 삽입을 설치해서 사용할 수도 있다.

세포이식 보조제나 세포배양 기재에서 사용되는 세포는 특별하게 제한되지 않는다. 바람직하게는 심장유래 세포, 신경 전구세포 또는 조직 줄기세포 유래의 것이다.

5. 조직재생 요법

본 발명에는 동물유래의 생체조직을 탈세포화시킨 조직(탈세포화 생체조직)을 분쇄한 입자상 탈세포화 조직, 및 피브린 풀을 동물조직에 적용하는 것을 포함하는 조직재생 요법이 포함된다. 상기의 조직재생 요법에서는 입자상 탈세포화 조직, 피브린 풀을 동물조직에 적용하는 것에 의해서, 동물조직 상에서 하이브리드 겔을 형성시킨다. 그때에 입자상 탈세포화 조직이나 피브린 풀을 적용하는 순서는 특별하게 한정되지 않는다. 또, 본 발명에는 상기의 하이브리드 겔을 동물조직에 적용하는 것을 포함하는 조직재생 요법이 포함된다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 조직재생 요법에 있어서, 생체조직을 회수하는 동물의 종류는 특별하게 한정되지 않는다. 바람직하게는 인간 이외의 동물이고, 포유류의 가축, 조류의 가축이 바람직하다. 포유류의 가축으로서는 소, 말, 낙타, 라마, 당나귀, 야크, 양, 돼지, 염소, 사슴, 알파카, 개, 너구리, 족제비, 여우, 고양이, 토끼, 햄스터, 모르모트, 랫트, 다람쥐, 미국너구리 등을 들 수 있다. 또, 조류의 가축으로서는, 잉꼬, 앵무새, 닭, 집오리, 칠면조, 거위, 뿔닭, 꿩, 타조, 메추리 등을 들 수 있다. 이 중에서도 입수의 안정성으로부터 돼지, 또는 토끼가 바람직하다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 조직재생 요법에 있어서 탈세포화 처리하는 방법은 특별하게 한정되지 않는다. 바람직하게는 고정수압 처리하는 방법이다.

본 발명의 조직재생 요법을 적용하는 조직은 특별하게 한정되지 않는다. 바람직하게는 심장, 신경, 또는 피부이다.

본 발명의 피브린 풀의 종류는 특별하게 한정되지 않는다. 바람직하게는 Bolheal(THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE)이 예시된다.

상기한 바와 같이, 하이브리드 겔 중의 피브리노겐 농도는 겔을 형성하는 농도라면 특별하게 한정되지 않는다. 30㎎/㎖에서 40㎎/㎖가 예시된다.

상기한 바와 같이, 하이브리드 겔중의 입자농도는 특별하게 한정되지 않지만, 16㎍/㎖에서 64㎍/㎖가 예시된다. 입자상 탈세포화 조직의 입경은 특별하게 한정되지 않지만, 0.1에서 1000㎛, 바람직하게는 0.5에서 500㎛, 더욱 바람직하게는 1에서 100㎛이다.

6. 세포이식 방법

본 발명에는 해당 입자상 탈세포화 조직, 피브린 풀, 및 세포를 동물조직에 적용하는 것을 포함하는 세포이식 방법이 포함된다. 상기의 이식방법에서는 입자상 탈세포화 조직과 피브린 풀에 의해 하이브리드 겔이 형성되고, 세포는 하이브리드 겔 내나 표면상에 존재시킨다. 입자상 탈세포화 조직, 피브린 풀, 및 세포를 동물조직에 적용하는 순서는 특별하게 한정되지 않는다. 또, 각 성분은 각각 적용할 수도 있고, 동시에 적용할 수도 있다.

또, 본 발명에는 상기의 하이브리드 겔과 함께 세포를 동물조직에 적용하는 것을 포함하는 세포이식 방법이 포함된다. 세포는 하이브리드 겔 내 또는 표면상에 존재시킬 수 있다. 하이브리드 겔 내 또는 표면 상에 세포를 존재시킨 상태에서 동물조직에 적용할 수도 있고, 하이브리드 겔 또는 세포를 동물조직에 적용 후에 다른 한쪽을 적용할 수도 있다. 후자의 경우에 하이브리드 겔과 세포를 적용하는 순서는 특별하게 한정되지 않는다.

세포이식에 사용하는 세포의 종류는 특별하게 한정되지 않는다. 심장유래 세포, 신경 전구세포, 또는 조직 줄기세포 유래의 것이 예시된다. 세포이식 방법을 적용하는 조직으로서는 특별하게 한정되지 않는다. 심장, 신경, 또는 피부가 예시된다.

7. 세포배양 방법

본 발명에는 상기 하이브리드 겔과 함께 세포를 배양하는 세포배양 방법이 포함된다. 본 발명의 세포배양 방법에서는 배지 중에 하이브리드 겔과 세포를 공존시키는 경우에 있어서, 하이브리드 겔 상에 직접 세포를 파종해서 배양할 수도 있고, 하이브리드 겔과 세포 사이에 세포배양 삽입을 설치해서 배양할 수도 있다. 배양하는 세포는 특별하게 한정되지 않는다. 심장유래 세포, 신경 전구세포, 또는 조직 줄기세포 유래의 것이 예시된다.

8. 키트

본 발명에는 동물유래의 생체조직을 탈세포화시킨 조직(탈세포화 생체조직)을 입자화한 입자상 탈세포화 조직, 및 피브린 풀을 포함하는 키트가 포함된다. 해당 키트는 입자상 탈세포화 조직 및 피브린 풀을 동물조직에 적용했을 경우에, 적용부위에 있어서 하이브리드 겔이 형성된다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 키트에 있어서 생체조직을 회수하는 동물의 종류는 특별하게 한정되지 않는다. 바람직하게는 인간 이외의 동물이고, 포유류의 가축, 조류의 가축이 바람직하다. 포유류의 가축으로서는 소, 말, 낙타, 라마, 당나귀, 야크, 양, 돼지, 염소, 사슴, 알파카, 개, 너구리, 족제비, 여우, 고양이, 토끼, 햄스터, 모르모트, 랫트, 다람쥐, 미국너구리 등을 들 수 있다. 또, 조류의 가축으로서는 잉꼬, 앵무새, 닭, 집오리, 칠면조, 거위, 뿔닭, 꿩, 타조, 메추리 등을 들 수 있다. 이 중에서도 입수의 안정성으로부터 돼지, 또는 토끼가 바람직하다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 하이브리드 겔에 있어서 탈세포화 처리하는 방법은 특별하게 한정되지 않는다. 바람직하게는 고정수압 처리이다. 탈세포화 입자의 입경은 특별하게 한정되지 않지만, 0.1에서 1000㎛, 바람직하게는 0.5에서 500㎛, 더욱 바람직하게는 1에서 100㎛이다.

본 발명에서는 상기 하이브리드 겔이 질병 모델(심근경색 모델이나 피부동상 모델)이나 세포(심장유래 세포나 신경 전구세포)에 대해서 뛰어난 효과를 발휘하고 있었기 때문에 본 발명의 키트에는 질병치료 키트가 포함된다. 그러한 질병치료 키트로서는 심근경색치료 키트, 신경손상 치료 키트, 피부동상치료 키트가 예시된다. 또, 본 발명의 키트로서는 세포이식용 키트나 세포배양 키트와 같은 것이 예시된다. 세포의 종류는 특별하게 한정되지 않지만, 심장유래 세포, 신경 전구세포, 또는 조직 줄기세포 유래의 것이 예시된다.

실시예

이하, 실시예에 따라, 본원발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 하기의 실시예에 전혀 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

성체 토끼 심장유래의 입자상 탈세포화 조직이 토끼 태아심장유래 세포의 배양에 미치는 효과의 검토

1. 토끼 태아심장유래 세포의 조제

약 6개월령의 일본 백색종 암컷 토끼(Oriental Yeast Co., Ltd.)에 FSH(전엽성 난포자극 호르몬: Antolin Rㆍ10, Kyoritsu Seiyaku Corporation)을 0.5U/개체로 피하에 12시간 간격으로 6회 투여하고, 최종 FSH 투여 약 5시간 후에 hCG(태반성 성선자극 호르몬: Puberogen, Novartis)를 50U/개체로 정맥 내에 투여하고, 수컷 토끼와 교배시켜 임신 토끼를 제작했다. 교배 후 16.5∼18.5일째에 임신 토끼의 정맥 내에 펜토바르비탈 주사액(Somnopentyl, Kyoritsu Seiyaku Corporation)을 약 200mg 투여해서 안락사시키고, 개복 후 자궁에서 태아를 채취하고, 생리식염수(Otsuka normal saline, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) 중에 부유시켰다. 태아로부터 심장을 채취하고, 약 1.25%의 트립신액(Difco)에 분산함으로써 세포를 조제했다.

2. 입자상 탈세포화 조직의 조제

약 6∼12개월령의 일본 백색종 토끼(Oriental Yeast Co., Ltd.)에서 심장을 채취하고, 생리식염수로 세정했다. 세정 후, 조직을 생리식염수와 함께, 폴리에틸렌 백에 넣어 밀폐했다. Dr. Chef(Kobe Steel, Ltd.)를 사용해서 3,000∼10,000atm으로 고정수압 처리를 실시했다. 고정수압 처리 후의 조직을 핵산분해 효소 함유 세정액, 알코올 함유 세정액에 의해 세정했다. 세정 종료 후, 각 탈세포화 조직을 동결건조기(Eyela Corporation.)를 사용해서 동결건조 했다. 동결건조한 탈세포화 조직을 밀, 푸드프로세서, 마노 분쇄기(AS ONE Corporation.) 등을 사용해서 분쇄했다. 입자상 탈세포화 조직을 체에 의해 처리를 실시하고, 직경 500㎛ 이하의 입자상 탈세포화 조직을 제작했다. 입자상 탈세포화 조직은 사용시까지 4℃로 보존하고, 생리식염수로 2㎎/㎖로 조제해서 사용했다.

3. 배양

0.1% 젤라틴액(Sigma)으로 코팅한 TERASAKI plate(Sumiron Co., Ltd.)의 1구멍당 약 10 만개의 토끼 태아심장유래 세포와 성체 토끼 심장유래의 입자상 탈세포화 조직을 첨가한 Bolheal A액(첨부서에 따라 조제하고, G-CSF(Diaclone)를 최종농도(Bolheal 중) 100ng/㎖, bFGF(PROGEN) 10ng/㎖ 및 셀레노프로테인 P 프래그먼트(자가조제) 7㎍/㎖ 함유) 10㎕를 첨가하고, 계속해서 Bolheal B액(첨부서에 따라 조제하고, 생리식염액으로 1/10 농도로 했다) 10㎕ 첨가하고 응고(피브린화)시켰다. 응고 후, 배지(10% FBS(Funakoshi Co., Ltd.) DMEM(Sigma))를 중층하고, 탄산가스(5%, 37℃) 항온기 내에서 배양했다.

4. 그룹구성 및 관찰

성체 토끼심장16(성체 토끼 심장유래의 입자상 탈세포화 조직을 최종농도 16㎍/㎖로 첨가), 성체 토끼심장64(성체 토끼 심장유래의 입자상 탈세포화 조직을 최종농도 64㎍/㎖로 첨가) 및 무첨가(입자상 탈세포화 조직을 무첨가(0㎍/㎖))의 3그룹에 대해서 배양 6일째에 증식[사멸 또는 무증식: -, 1∼2배 정도 증식: ±, 2∼5배 정도: +, 5배 이상: ++를 기준으로 해서 정성적으로 판단], 분화[파종시의 형상(구형)으로부터 형상의 변화를 지표에로 평가(세포의 변화는 분화되는 세포로의 성숙 또는 성숙 행정이다), 없음: -, 적어도 구형으로부터 형상 변화가 관찰됨: ±, 분명한 형상변화(봉상화, 편평화, 세포돌기 형성 등)이 관찰됨: +, 분명한 분화(심근화, 섬유아 세포화, 세포돌기의 복잡화 등 특정한 세포종으로의 분화가 추측되는 레벨)가 관찰됨: ++] 및 박동[심박, 관찰되지 않음: -, 적어도 1예는 관찰할 수 있음: ±, 3예 이상은 관찰할 수 있음: +, 다수(6예∼) 관찰할 수 있음: ++]에 대해서 평가를 실시했다.

5. 결과

결과를 표 1에 나타낸다. 입자상 탈세포화 조직 무첨가 그룹에서 배양한 토끼 태아심장 유래 세포의 증식은 관찰되었지만 분화는 그다지 관찰되지 않고, 동일하게 박동하는 세포는 거의 인정되지 않았다. 입자상 탈세포화 조직을 첨가한 경우에는 증식 및 분화가 인정되고, 또 세포의 박동이 인정되었다. 또 입자상 탈세포화 조직을 64㎍/㎖의 농도로 첨가했을 경우가 분화, 박동 모두 현저했다. 이상의 결과로부터 성체 토끼 심장유래의 입자상 탈세포화 조직은 토끼 태아심장유래 세포의 심근세포로의 분화 및 박동 등의 기능획득에 기여하고 있는 것임이 분명하게 되었다.

실시예 2

각종 입자상 탈세포화 조직의 배양 토끼 태아심장유래 세포에 미치는 효과의 검토

1. 토끼 태아심장유래 세포의 조제

실시예 1과 동일한 수법으로 얻었다.

2. 입자상 탈세포화 조직의 조제

실시예 1과 동일한 수법으로 채취한 토끼 태아심장 및 약 6∼12개월령의 일본 백색종 토끼(Oriental Yeast Co., Ltd.)에서 채취한 심장, 신장, 폐, 간장 및 성체 돼지에서 채취한 간장에 대해서, 조직을 생리식염수와 함께, 폴리에틸렌 백에 넣어 밀폐했다. Dr. Chef(Kobe Steel, Ltd.)를 사용해서 3,000∼10,000atm로 고정수압 처리를 실시했다. 고정수압 처리 후의 조직을 핵산분해 효소 함유 세정액, 알코올 함유 세정액에 의해 세정했다. 세정 종료 후, 각 탈세포화 조직을 동결건조기(Eyela Corporation.)를 사용해서 동결건조했다. 동결건조한 탈세포화 조직을 밀, 푸드프로세서, 마노 분쇄기(AS ONE Corporation.) 등을 사용해서 분쇄했다. 입자상 탈세포화 조직을 체에 의해 처리를 실시하고, 직경 500㎛ 이하의 입자상 탈세포화 조직을 제작했다. 입자상 탈세포화 조직은 사용시까지 4℃로 보존하고, 생리식염수로 2㎎/㎖로 조제해서 사용했다.

3. 배양

0.1% 젤라틴액(Sigma)으로 코팅한 멀티 dish 4-웰(Nunc)의 1구멍당 약 40 만개의 토끼 태아심장유래 세포와 상기의 입자상 탈세포화 조직을 각각 첨가한 Bolheal A액(첨부서에 따라 조제하고, 생리식염액으로 1/2 농도로 했다) 10㎕를 첨가하고, 계속해서 Bolheal B액(첨부서에 따라 조제하고, 생리식염액으로 1/10 농도로 했다) 10㎕ 첨가하고 응고(피브린화)시켰다. 응고 후, 배지(10% FBS(Funakoshi Co., Ltd.) DMEM(Sigma))를 중층하고, 탄산가스(5%, 37℃) 항온기 내에서 배양했다.

4. 그룹구성 및 관찰

토끼 태아심장, 성체 토끼 심장, 성체 토끼 신장, 성체 토끼 폐, 성체 토끼 간장, 성체 돼지간장 유래의 입자상 탈세포화 조직을 각각 500㎍/㎖의 농도로 첨가한 시험그룹, 무첨가(입자상 탈세포화 조직을 무첨가(0㎍/㎖)), 및 컨트롤(입자상 탈세포화 조직을 무첨가(0㎍/㎖)/Bolheal(함유물을 포함)을 무첨가)의 시험그룹에 대해서 검토했다. 각각 배양 7일째에 실시예 1과 마찬가지로 증식, 분화 및 박동에 대해서 평가를 실시했다.

5. 결과

결과를 표 2에 나타낸다. 컨트롤에서는 증식은 그다지 인정되지 않고, 팽화한 세포로의 분화 경향이 인정되었다. 박동하는 세포는 인정되지 않았다. 무첨가 그룹은 증식/분화는 인정되었지만 박동하는 세포는 그다지 인정되지 않았다. 이것들에 대해서 입자상 탈세포화 조직을 첨가한 그룹은 동물종, 장기의 유래에 구별없이 증식/분화가 인정되고, 또 박동하는 세포가 인정되었다. 이상의 결과로부터, 입자상 탈세포화 조직은 그 유래에 관계없이 토끼 태아심장유래 세포의 심근세포로의 분화 및 박동 등의 기능획득에 기여하고 있는 것임이 분명하게 되었다.

실시예 3

입자상 탈세포화 조직의 하이브리드 겔의 랫트 심근경색 모델에서의 효과의 검토

1. 입자상 탈세포화 조직의 조제

Wistar 랫트의 간장의 조직을 채취하고, 생리식염수로 세정했다. 세정 후, 각 조직을 생리식염수와 함께, 폴리에틸렌 백에 넣어 밀폐했다. Dr. Chef(Kobe Steel, Ltd.)를 사용해서 3,000∼10,000atm으로 고정수압 처리를 실시했다. 고정수압 처리 후의 조직을 핵산분해 효소 함유 세정액, 알코올 함유 세정액에 의해 세정했다. 세정 종료 후, 각 탈세포화 조직을 동결건조기(Eyela Corporation.)를 사용해서 동결건조 했다. 동결건조한 탈세포화 조직을 밀, 푸드프로세서, 마노 분쇄기(AS ONE Corporation.) 등을 사용해서 분쇄했다. 입자상 탈세포화 조직을 체에 의해 처리를 실시하고, 직경 500㎛ 이하의 것을 입자상 탈세포화 조직으로 사용했다.

2. 이식실험

Wistar 랫트(수컷, 10-12 주령)을, 0.1㎖ Somnopentyl 근육주사를 사용해서 마취 처리했다. 측흉부를 제모하고, 이소딘으로 소독했다. 마취 하의 랫트 기관에 삽관하고, 벤틸레이터에 접속했다. 랫트를 횡와위로 하고, 측흉부로부터 절개하고, 근육층, 심막을 제거해서 심장에 어프로치 했다. 좌관상 동맥을 봉합사로 결찰하고, 경색부를 제작했다. 제작한 경색부에 간장유래의 입자상 탈세포화 조직을 10% 함유하는 피브리노겐 용액(x1; 80㎎/㎖) 100㎕을 적하하고, 그 후 트롬빈 용액(x1; 250U/㎖, x1/150; 1.6U/㎖)을 100㎕ 적하했다. 컨트롤로서 Bolheal만 적하그룹, 미처치 그룹을 사용했다. 경색제작, 각 처치를 실시한 랫트의 절개부를 봉합하고, 자발호흡이 안정하고나서 발관했다.

3. 그룹구성 및 관찰

하이브리드 겔 중의 피브리노겐 농도는 40㎎/㎖로 하고, 하이브리드 겔 중의 트롬빈 농도는 0.8U/㎖ 및 125U/㎖로 하고, 각각의 농도에 대해서 겔의 10% 농도가 되도록 입자상 탈세포화 조직을 첨가했다. 비교 대상으로서 입자상 탈세포화 조직을 첨가하지 않는 그룹도 설정하고, 4주간 후에 랫트를 안락사시키고, 심장경색부위를 관찰하고, 샘플을 채취했다. 채취한 샘플은 HE염색에 의해 조직학적으로 평가하고, 각각의 시험그룹에 대해서 검토했다.

4. 결과

결과를 도 1에서 도 5에 나타낸다. 입자상 탈세포화 조직을 첨가하지 않는 피브린 겔에도 육안적으로는 신생 혈관의 침윤을 인정되었다. 또, 트롬빈 농도가 125U/㎖이고, 혈관신생은 적은 경향에 있었다. 한편, 입자상 탈세포화 조직을 첨가한 하이브리드 겔은 육안적 소견으로 주위에 풍부한 혈관신생을 인정되고, 경색심근 내에 많은 혈관신생을 인정되었다. 부가해서, 그 정도에 대해서는 트롬빈 농도에서 차이가 있고, 트롬빈 농도가 0.8U/㎖의 쪽이 혈관신생이 보다 강하게 인정되었다.

실시예 4

각종 입자상 탈세포화 조직의 배양 토끼 태아심장 유래 세포에 미치는 효과의 검토

1. 토끼 태아심장 유래 세포의 조제

실시예 1과 동일한 수법으로 얻었다.

2. 입자상 탈세포화 조직의 조제

식용 돼지의 심장, 비장, 뇌, 척수, 신장 및 방광의 조직을 채취하고, 생리식염수로 세정했다. 세정 후, 각 조직을 생리식염수와 함께, 폴리에틸렌 백에 넣어 밀폐했다. Dr. Chef(Kobe Steel, Ltd.)를 사용해서 3,000∼10,000atm으로 고정수압 처리를 실시했다. 고정수압 처리 후의 조직을 핵산분해 효소 함유 세정액, 알코올 함유 세정액에 의해 세정했다. 세정 종료 후, 각 탈세포화 조직을 동결건조기(Eyela Corporation.)를 사용해서 동결건조했다. 동결건조한 탈세포화 조직을 밀, 푸드프로세서, 마노 분쇄기(AS ONE Corporation.) 등을 사용해서 분말상으로 했다. 탈세포화 분말을 체의 의해 처리를 실시하고, 직경 500㎛ 이하의 것을 입자상 탈세포화 조직으로 사용했다. 입자상 탈세포화 조직은 사용시까지 4℃로 보존하고, 생리식염수로 2㎎/㎖로 조제해서 사용했다.

3. 배양

실시예 1과 동일한 수법으로 실시했다.

4. 그룹 구성 및 관찰

각종 입자상 탈세포화 조직을 각각 100㎍/㎖의 농도로 첨가한 시험그룹, 무첨가 그룹(입자상 탈세포화 조직을 무첨가(0㎍/㎖)), 양성 컨트롤 그룹(토끼 성체심장유래 입자상 탈세포화 조직 첨가(100㎍/㎖)), 및 컨트롤(입자상 탈세포화 조직을 무첨가(0㎍/㎖)/Bolheal을 무첨가(함유물을 포함한다))의 시험그룹에 대해서 검토했다. 각각 배양 7일째에 실시예 1과 마찬가지로 박동에 대해서 평가를 실시했다.

5. 결과

결과를 표 3에 나타낸다. 컨트롤에서는 박동은 인정되지 않았다. 무첨가 그룹은 박동하는 세포는 그다지 인정되지 않았다. 또 토끼 심장유래 입자상 탈세포화 조직을 첨가한 그룹은 많은 세포에서 박동이 인정되었다. 이것들에 대해서 돼지 유래 각종 입자상 탈세포화 조직을 첨가한 그룹은 특히 장기의 유래에 구별없이 박동하는 세포가 인정되었다. 이상의 결과로부터, 입자상 탈세포화 조직은 그 이종 유래라고 하여도 태아심장 유래 세포의 심근세포로의 분화 및 박동 등의 기능획득에 기여하고 있는 것임이 분명하게 되었다.

실시예 5

입자상 탈세포화 조직의 하이브리드 겔의 토끼 심근경색 모델에서의 효과의 검토

1. 입자상 탈세포화 조직의 조제

실시예 2와 동일한 수법으로 얻었다.

2. 이식실험

일본 백색종 토끼(수컷, 입하 시 14-15주령, Biotek. Co.,Ltd.)를 인공호흡관리로 케타민 및 이소플루란의 전신마취 하에서 개흉하고, 좌관상동맥전하행지를 봉합사로 결찰하고, 경색부를 제작했다. 하이브리드 겔 그룹에서는 제작한 경색부에 피브리노겐액을 약 40㎕ 문지르고, 토끼 태아심장유래의 입자상 탈세포화 조직 분체 0.01mg을 생리식염액에 현탁한 액 5㎕과 피브리노겐액 5㎕를 혼합한 액을 적하 후, 트롬빈액(×1/10: 25U/㎖)을 10㎕ 적하하고, 1분 방치후에 피브리노겐액 100㎕과 트롬빈액 100㎕의 혼합 스프레이 분무를 실시하고, 추가로 1분간 스탠딩했다. 컨트롤로서 경색제작만을 실시한 비이식 그룹을 설정했다. 모든 이식조작을 실시한 후, 가슴을 닫았다.

3. 결과

결과를 도 6에 나타낸다. 수술 후 2개월에서의 병리조직 평가(헤마톡실린 에오진 염색 표본)에 있어서, 본 발명의 입자상 탈세포화 조직의 하이브리드 겔 그룹에서는 비이식 그룹과 비교해서 경색부의 혈관신생이 많이 인정되었다.

실시예 6

각종 입자상 탈세포화 조직의 하이브리드 겔의 신경 전구세포로의 효과의 검토

1. 각종 입자상 탈세포화 조직의 조제

Wistar 랫트의 뇌, 척수, 간장의 조직을 채취하고, 생리식염수로 세정했다. 세정 후, 각 조직을 생리식염수와 함께, 폴리에틸렌 백에 넣어 밀폐했다. Dr. Chef(Kobe Steel, Ltd.)를 사용해서 3,000∼10,000atm으로 고정수압 처리를 실시했다. 고정수압 처리 후의 조직을 핵산분해 효소 함유 세정액, 알코올 함유 세정액에 의해 세정했다. 세정 종료 후, 각 탈세포화 조직을 동결건조기(Eyela Corporation.)를 사용해서 동결건조했다. 동결건조한 탈세포화 조직을 밀, 푸드프로세서, 마노 분쇄기(AS ONE Corporation.) 등을 사용해서 분말상으로 했다. 탈세포화 분말을 체에 의해 처리를 실시하고, 직경 500㎛ 이하의 것을 입자상 탈세포화 조직으로 사용했다.

2. 배양과 그룹구성

뇌, 척수, 간장유래의 각각의 입자상 탈세포화 조직에 있어서, 입자상 탈세포화 조직 함유 Bolheal 상 배양그룹(on) 및 입자상 탈세포화 조직 함유 Bolheal 인서트 그룹(insert; cell culture insert 상에 입자상 탈세포화 조직 함유 Bolheal 겔을 첨가)에서 각각의 그룹의 비교검토를 실시했다.

입자상 탈세포화 조직 함유 Bolheal 상 배양그룹(on)에 있어서는, 24-well plate dish에 10% 입자상 탈세포화 조직 함유 피브리노겐 용액 150㎕ 적하, 각 희석배율(x1; 250U/㎖, x1/10; 25U/㎖, x1/100; 2.5U/㎖)의 트롬빈 용액 150㎕을 적하 혼합했다. PC12 세포(랫트 부신갈색종 유래 세포)를 겔 상에 파종하고(1.0×10⁴ cells/well, 0.1% horse serum in RPMI), 24시간 배양했다.

입자상 탈세포화 조직 함유 Bolheal 인서트 그룹(insert)에 있어서는, 콜라겐 코팅24-well plate dish에, PC12세포(1.0x10⁴ cells/well, 10% horse serumㆍ5% FBS in RPMI)을 파종하고, 24시간 배양했다. cell culture insert(포어직경 8㎛)에, 10% 입자상 탈세포화 조직 함유 피브리노겐 용액 150㎕ 적하, 각 희석배율(x1; 250U/㎖, x1/10; 25U/㎖, x1/100; 2.5U/㎖)의 트롬빈 용액을 150㎕ 적하 혼합하고, 입자상 탈세포화 조직 함유 겔을 조제했다. 배양액을 0.1% horse serum in RPMI으로 교환하고, 겔이 조제된 cell culture insert를 각 well에 세팅하고, 24 시간 배양했다.

어느 쪽의 검토에 있어서도, 입자상 탈세포화 조직을 첨가하지 않는 음성 컨트롤 그룹과 입자상 탈세포화 조직 대신에 NGF를 50ng 첨가한 양성 컨트롤 그룹을 설치하고, 평가계가 기능하고 있는 것임을 확인했다.

3. 결과

결과를 도 7에 나타낸다. 간장유래의 입자상 탈세포화 조직 첨가 그룹에 비해서 뇌유래의 입자상 탈세포화 조직 첨가 그룹이나 척수유래의 입자상 탈세포화 조직 첨가 그룹 쪽이 수상돌기의 형성을 유도하는 작용이 뛰어나며, 그 효과는 NGF에 필적하는 것이었다. 부가해서, 저농도의 트롬빈 쪽이 수상돌기의 형성작용이 보다 강하게 인정되었다.

실시예 7

이종 입자상 탈세포화 조직의 하이브리드 겔의 신경 전구세포로의 효과의 검토

1. 입자상 탈세포화 조직의 조제

식용 돼지의 뇌 조직을 채취하고, 생리식염수로 세정했다. 세정 후, 각 조직을 생리식염수와 함께, 폴리에틸렌 백에 넣어 밀폐했다. Dr. Chef(Kobe Steel, Ltd.)를 사용해서 3,000∼10,000atm으로 고정수압 처리를 실시했다. 고정수압 처리후의 조직을 핵산분해 효소 함유 세정액, 알코올 함유 세정액에 의해 세정했다. 세정 종료 후, 각 탈세포화 조직을 동결건조기(Eyela Corporation.)를 사용해서 동결건조했다. 동결건조한 탈세포화 조직을 밀, 푸드프로세서, 마노 분쇄기(AS ONE Corporation.) 등을 사용해서 분말상으로 했다. 탈세포화 분말을 체질하여 직경 500㎛ 이하의 것을 입자상 탈세포화 조직으로 사용하였다.

2. 배양과 그룹구성

돼지 뇌입자상 탈세포화 조직에 있어서, Bolheal 겔 내 분말봉입체 첨가그룹 및 Bolheal 겔 첨가그룹에서 각각의 그룹의 비교검토를 실시했다. PC12 세포를 콜라겐IV로 코팅한 96-well 플레이트에 1×10⁴개/100㎕(10% horse serum-5% FBS-RPMI1640)/well로 파종하고, 24시간 후에 배지를 0.1% horse serum-RPMI1640(100㎕/well) 로 교환하고, 그룹구성에 따라 입자상 탈세포화 조직, Bolheal, 시약의 첨가를 실시했다. Bolheal 겔 내 분말봉입체 첨가그룹은 TERASAKI plate(Sumiron Co., Ltd.)를 사용해서 2.5U/㎖트롬빈 용액 10㎕에 돼지 뇌입자상 탈세포화 조직 0.3㎎/5㎕를 첨가, 추가로 5㎕의 피브리노겐 용액을 첨가하고, 피펫팅에 의해 혼합 후 겔화(37℃, 2시간 이상)하고, well에 첨가했다. Bolheal 겔 첨가그룹은 TERASAKI plate를 사용해서 2.5U/㎖ 트롬빈 용액 10㎕, 생리식염액(Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) 5㎕, 피브리노겐 용액 5㎕을 차례로 첨가하고, 피펫팅에 의해 혼합후 겔화(37℃, 2시간 이상) 하고, well에 첨가했다. 추가로 양성 컨트롤로서 NGF를 50ng/㎖가 되도록 첨가한 그룹 및 음성 컨트롤로서 무처리 그룹을 첨가했다. 처리 후 2∼3일째에 신경 세포화 유도의 유무에 대해서 신경돌기의 신장 및 신경 세포특이항원의 검출을 지표로 해석을 실시했다. 신경 세포특이항원의 검출은 면역조직화학적 염색을 수행함으로써 실시했다. 면역조직화학적 염색에는 항원검출용의 항체로서 Anti-βIII Tubulin(Promega), 시각화의 항체로서 Alexa Fluor 594 anti-mouse(Invitrogen)를 사용하고, 핵염색에는 Hoechst 33342(DOJINDO)을 사용했다. 상기의 염색조건에 의해 세포핵은 청색으로, βIII Tubulin은 적색으로 염색되었다.

3. 결과

배양 2일째의 신경돌기신장의 관찰결과를 표 4에 나타낸다. Bolheal 겔 내 분말봉입체 첨가그룹 및 양성 컨트롤(NGF첨가)에서 신경돌기의 신장이 인정되었다. 배양 3일째의 각 그룹의 면역 조직학관찰 결과를 도 8 및 표 5에 나타낸다. 면역조직화학적 염색에 있어서도 Bolheal 겔 내 분말봉입체 첨가그룹과 양성 컨트롤(NGF첨가)에서 βIII Tubulin 항원이 인정되었다. 이상의 결과로부터 Bolheal 겔 내 분말봉입체 첨가그룹에서 신경에의 분화가 확인되고, 이종동물의 입자상 탈세포화 조직을 사용한 하이브리드 겔에 있어서도 신경 세포유도능이 있는 것이 나타났다.

실시예 8

입자상 탈세포화 조직의 하이브리드 겔의 랫트 등부위 피하에서의 효과의 검토

1. 입자상 탈세포화 조직의 조제

Wistar 랫트의 간장을 채취하고, 생리식염수에서 세정했다. 세정 후, 각 조직을 생리식염수와 함께, 폴리에틸렌 백에 넣어 밀폐했다. Dr.Chef(Kobe Steel, Ltd.)를 사용해서 3,000∼10,000atm으로 고정수압 처리를 실시했다. 고정수압 처리 후의 조직을, 핵산분해 효소 함유 세정액, 알코올 함유 세정액에 의해 세정했다. 세정 종료 후, 각 탈세포화 조직을 동결건조기(Eyela Corporation.)를 사용해서 동결건조 했다. 동결건조한 탈세포화 조직을 밀, 푸드프로세서, 마노 분쇄기(AS ONE Corporation.) 등을 사용해서 분체상으로 했다. 탈세포화 분체를 체에 의해 처리를 실시하고, 직경 500㎛ 이하의 것을 입자상 탈세포화 조직으로 사용했다.

2. 이식실험

Wistar 랫트(수컷, 8-12 주령)을 0.1㎖ Somnopentyl 근육주사를 사용해서 마취 처리했다. 등부위를 제모하고, 이소딘으로 소독했다. 소독한 등부위에 1cm의 절개를 제작하고, 절개층으로부터 피부와 근육층 사이에 하이브리드 겔을 삽입하는 포켓을 제작했다. 제작한 포켓에 피브린 겔로 이루어지는 하이브리드 겔을 이식하고, 절개층을 5-0 봉합사로 봉합했다. 소정의 기간경과 후, 랫트를 안락사시키고 창상부를 관찰하고, 샘플을 회수했다. 회수한 샘플은 HE 염색에 의해 조직학적으로 평가했다.

3. 그룹구성 및 관찰

하이브리드 겔중의 피브리노겐 농도는 40㎎/㎖로 하고, 하이브리드 겔 중의 트롬빈 농도는 0.8U/㎖ 및 125U/㎖로 하고, 각각의 농도에 대해서 겔의 5% 농도가 되도록 입자상 탈세포화 조직을 첨가했다. 비교대상으로 입자상 탈세포화 조직을 첨가하지 않는 그룹도 설정하고, 각각의 시험그룹에 대해서 검토했다.

4. 결과

결과를 도 9에 나타낸다. 입자상 탈세포화 조직을 첨가하지 않은 피브린 겔에도 육안적으로는 신생 혈관의 침윤을 인정되었다. 또, 트롬빈 농도에 관계없이 세포침윤은 거의 인정되지 않았다. 이식 3일째와 7일째에서도 큰 차이는 인정되지 않았다. 한편, 입자상 탈세포화 조직을 첨가한 하이브리드 겔은 육안적 소견으로 주위에 풍부한 혈관신생이 인정되고, 겔 내부로의 세포침윤이나 혈관신생이 인정되었다. 부가해서, 그 정도에 대해서는 트롬빈 농도에서 차이가 있고, 트롬빈 농도가 0.8U/㎖의 쪽이 세포침윤이나 혈관신생이 보다 강하게 인정되었다.

실시예 9

입자상 탈세포화 조직의 하이브리드 겔의 랫트 피부동상 모델에서의 효과의 검토

1. 입자상 탈세포화 조직의 조제

Wistar 랫트의 간장의 조직을 채취하고, 생리식염수로 세정했다. 세정 후, 각 조직을 생리식염수와 함께, 폴리에틸렌 백에 넣어 밀폐했다. Dr. Chef(Kobe Steel, Ltd.)를 사용해서 3,000∼10,000atm으로 고정수압 처리를 실시했다. 고정수압 처리 후의 조직을 핵산분해 효소 함유 세정액, 알코올 함유 세정액에 의해 세정했다. 세정 종료 후, 각 탈세포화 조직을 동결건조기(Eyela Corporation.)를 사용해서 동결건조했다. 동결건조한 탈세포화 조직을 밀, 푸드프로세서, 마노 분쇄기(AS ONE Corporation.) 등을 사용해서 분체상으로 했다. 탈세포화 분체를 체에 의해 처리를 실시하고, 직경 500㎛ 이하의 것을 입자상 탈세포화 조직으로 사용했다.

2. 이식실험

Wistar 랫트(수컷, 8-12 주령)를 0.1㎖ Somnopentyl 근육주사를 사용해서 마취 처리했다. 등부위를 제모하고, 이소딘으로 소독했다. 소독한 등부위에, 진피중층까지의 결손(직경 15mm)을 제작했다. 동상된 창상에 액체질소로 냉각한 금속체를 창상부에 60초 눌렀다. 동상의 창상에, 입자상 탈세포화 조직(간장)을 첨가하고 피브리노겐 용액 80㎎/㎖를 적하하고, 트롬빈 용액 250U/㎖를 적하했다. 컨트롤로서 Bolheal만 적하그룹, 미처치 그룹을 설정했다. 그 후에 창상부를 반창고로 피복, 또한 랫트 동체 전체 주위를 거즈를 사용해서 피복했다.

3. 그룹구성 및 관찰

하이브리드 겔 중의 피브리노겐 농도는 40㎎/㎖로 하고, 하이브리드 겔 중의 트롬빈 농도는 125U/㎖로 하고, 각각의 농도에 대해서 겔의 10% 농도가 되도록 입자상 탈세포화 조직을 첨가했다. 비교대상으로 입자상 탈세포화 조직을 첨가하지 않는 그룹도 설정하고, 소정의 기간경과 후의 손상부위를 관찰했다.

4. 결과

결과를 도 10에 나타낸다. 미처치 그룹에서는 동상부위에 피부조직 치유과정 특유의 피부의 구축이 관찰되었다. 이에 대해서 입자상 탈세포화 조직 미첨가 겔 그룹에서는 피부의 구축은 관찰되지 않았다. 그러나 동상에 의한 피부결손의 보충까지는 이르지 않고, 취약한 조직으로 덮어져 있는 상태이었다. 입자상 탈세포화 조직 첨가 겔 그룹에서는 피부구축도 관찰되지 않고, 부가해서, 육안적으로는 피부결손부위의 조직 재생이 조기에 이루어지고 있는 소견이 인정되었다. 이것으로, 탈세포화 분체는 피부재생을 촉진하는 세포의 집적 및 비계의 보충을 재촉하는 재료라고 생각되었다.

(산업상의 이용 가능성)

본 발명은 재생의료의 분야에서 이용 가능한 기술이다.

Claims

인간 이외의 동물유래의 생체조직을 탈세포화시킨 조직(탈세포화 생체조직)을 분쇄한 입자상 탈세포화 조직, 30㎎/㎖ 내지 40㎎/㎖ 농도의 피브리노겐, 및 0.8U/㎖ 내지 125U/㎖ 농도의 트롬빈을 포함하는, 심근경색치료, 신경손상질병치료, 피부동상치료 및 조직재생 중 하나 이상의 용도로 사용하기 위한 하이브리드 겔.
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제 1 항에 있어서, 탈세포화되는 생체조직이 매트릭스 구조를 가지는 생체조직인 하이브리드 겔.
제 1 항에 있어서, 탈세포화되는 생체조직이 심장, 간장, 신장, 폐, 뇌, 및 척수로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1 이상의 생체조직인 하이브리드 겔.
제 1 항에 있어서, 탈세포화 생체조직이 생체조직에 고정수압 처리를 실시해서 수득된 탈세포화 생체조직인 하이브리드 겔.
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제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 하이브리드 겔을 포함하는,
심근경색, 신경손상 질병 및 피부동상으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 질병의 치료제.
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제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 하이브리드 겔의 제작방법으로서,
인간 이외의 동물유래의 생체조직을 탈세포화해서 탈세포화 생체조직을 얻는 공정, 그 탈세포화 생체조직을 분쇄해서 입자상 탈세포화 조직을 얻는 공정, 및 그 입자상 탈세포화 조직, 30㎎/㎖ 내지 40㎎/㎖ 농도의 피브리노겐, 및 0.8U/㎖ 내지 125U/㎖ 농도의 트롬빈을 혼합하는 공정을 포함하는 제작방법.
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제 13 항에 있어서, 탈세포화되는 생체조직이 매트릭스 구조를 가지는 생체조직인 제작방법.
제 13 항에 있어서, 탈세포화되는 생체조직이 심장, 간장, 신장, 폐, 뇌, 및 척수로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1 이상의 생체조직인 제작방법.
제 13 항에 있어서, 탈세포화 생체조직을 얻는 공정이 동물유래의 생체조직을 탈세포화하는 공정, 및 마이크로파 조사해서 세정하는 공정을 포함하는 제작방법.
제 13 항에 있어서, 탈세포화가 생체조직에 고정수압 처리해서 이루어지는 제작방법.
제 13 항에 있어서, 탈세포화 생체조직을 분쇄하는 공정이,
탈세포화 생체조직을 세단하는 공정, 세단된 탈세포화 생체조직을 동결건조 또는 동결하는 공정, 및 동결건조 또는 동결된 탈세포화 생체조직을 분쇄하는 공정을 포함하는 제작방법.
제 19 항에 있어서, 분쇄된 탈세포화 생체조직을 입자 사이즈로 체질하는 공정을 추가로 포함하는 제작방법.
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제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 하이브리드 겔을 인간 이외의 동물조직에 적용하는 것을 포함하는 조직재생 방법.
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제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 하이브리드 겔과 함께 세포를 배양하는 것을 포함하는 세포배양 방법.
제 28 항에 있어서, 세포가 심장유래 세포, 신경 전구세포, 또는 조직 줄기세포 유래의 것인 세포배양 방법.
인간 이외의 동물유래의 생체조직을 탈세포화시킨 조직(탈세포화 생체조직)을 분쇄한 입자상 탈세포화 조직, 30㎎/㎖ 내지 40㎎/㎖ 농도의 피브리노겐, 및 0.8U/㎖ 내지 125U/㎖ 농도의 트롬빈을 포함하는,
심근경색치료 키트, 신경손상 질병치료 키트 및 피부동상치료 키트로 이루어지는 그룹에서 선택되는 키트.
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