CN112384200A - 低氧条件下培养的细胞衍生的胞外囊泡及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从条件培养基(CCM)组合物中产生胞外囊泡组合物的方法。所述方法包括在低氧条件下于体外生物相容性表面上培养细胞。所述培养方法同时产生了可溶性(CCM)和不可溶性组分。胞外囊泡来源于低氧条件下培养的细胞所产生的可溶性组分(CCM)，并可以用于多种医学和治疗应用。

Description

低氧条件下培养的细胞衍生的胞外囊泡及其用途

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年1月30日提交的美国临时申请第62/623,851号的优先权权益，其全部内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明通常涉及胞外囊泡组合物的产生及用途，更具体地，涉及通过在低氧条件下于适当生长培养基中培养细胞获得的胞外囊泡组合物。

背景技术

胞外基质(ECM)是在哺乳动物组织内体内发现的包围和支持细胞的复杂结构实体。ECM通常被称为结缔组织。ECM主要由三大类生物分子构成，所述生物分子包括结构蛋白(如胶原蛋白和弹性蛋白)、特化蛋白(如原纤维蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白)和蛋白聚糖。

ECM组合物的体外生长及其在各种治疗和医学应用中的用途已在本领域进行了描述。这类ECM组合物的一种治疗应用包括治疗和修复软组织和皮肤缺损，如皱纹和瘢痕。

由缺损(如痤疮、手术瘢痕或老化)引起的软组织缺损的修复或增强已被证明非常困难。许多材料已被用于矫正软组织缺损，并取得了不同程度的成功，然而，还没有一种材料是完全安全有效的。例如，硅会引起各种生理和临床问题，包括长期副作用，如结节、复发性蜂窝织炎和皮肤溃疡。

胶原蛋白组合物也被用作软组织增强的可注射材料。胶原蛋白是结缔组织的主要蛋白和哺乳动物体内含量最丰富的蛋白，约占总蛋白含量的25％。目前文献中描述了28种胶原蛋白(例如，详细列表参见下表1和表2)。然而，体内超过90％的胶原蛋白是胶原蛋白I、II、III和IV。

不同的胶原蛋白材料已被用于治疗软组织缺损，如重组可注射牛胶原蛋白、交联胶原蛋白或其他异种胶原蛋白。然而，这类胶原蛋白存在几个问题。一个常见问题包括生产植入物材料以去除潜在免疫原性物质从而避免受试者过敏反应非常复杂且成本较高。此外，使用这类胶原蛋白的治疗尚未被证明具有长期持久性。

还描述了可以用于软组织修复或增强的其他材料，如水凝胶中的生物相容性陶瓷颗粒(美国专利第5,204,382号)、热塑性和/或热固性材料(美国专利第5,278,202号)和乳酸基聚合物混合物(美国专利第4,235,312号)。此外，还描述了天然分泌ECM组合物的用途(美国专利第6,284,284号)。然而，这类材料都被证明有局限性。

因此，软组织修复和增强需要新的材料，以克服之前材料的缺陷。需要提供一种安全、可注射、持久、生物可吸收的软组织修复和增强材料。

体外培养的ECM组合物可以附加地用于治疗受损组织，如受损心肌和相关组织。所述组合物可以用作植入式器械(如支架)上的植入物或生物涂层；用于促进器官(如心脏和相关组织)血管化的人工血管；以及用于疝修补、盆底修补、伤口修补和肩袖修补(如补片等)的器械。

冠心病(CHD)，也称为冠状动脉疾病(CAD)、缺血性心脏病和动脉粥样硬化性心脏病，特征为供应心脏血液和氧气的小血管狭窄。冠心病通常是由称为动脉粥样硬化的病况引起的，当脂肪物质和斑块聚集在动脉壁上导致动脉狭窄时，就会发生动脉粥样硬化。由于冠状动脉狭窄，流向心脏的血流可能减慢或停止，引起胸痛(稳定型心绞痛)、气短、心脏病发作等症状。

在美国，冠心病(CHD)是男性和女性死亡的主要原因。根据美国心脏协会的数据，超过1500万人患有一些形式的病况。虽然冠心病的症状和征象在疾病晚期很明显，但随着疾病进展，在心脏病突然发作之前，大多数冠心病患者几十年来并没有疾病征兆。所述疾病是猝死的最常见原因，也是20岁以上男女最常见的死亡原因。根据美国目前的趋势，40岁健康男性中有一半在未来会得CHD，而40岁健康女性中也有三分之一在未来会得CHD。

目前改善患病或其他受损心脏血流的方法涉及侵入性手术技术，如冠状动脉旁路移植术、血管成形术和动脉内膜切除术。这类手术自然涉及术中和术后的高度固有风险，并通常仅为心肌缺血提供临时补救措施。因此，需要新的治疗选择来增加目前可用的治疗CHD和相关症状技术的成功率。

体外培养的ECM组合物还可以用于修复和/或再生受损的细胞或组织，如软骨或骨软骨细胞。骨软骨组织是与骨或软骨相关或含有骨或软骨的任何组织。本发明的组合物可以用于治疗骨软骨缺损，如退行性结缔组织疾病，如类风湿和/或骨关节炎，以及由于创伤导致软骨缺损的患者的缺损。

目前修复骨软骨缺损的尝试包括将人软骨细胞植入生物相容性和生物可降解的水凝胶移植物中，以试图提高恢复关节软骨病变的可能性。此外，已描述了在藻酸盐珠或含多硫酸化盐藻酸盐的基质中培养软骨细胞的技术可以生成透明样软骨组织。然而，通过植入人自体软骨细胞修复关节软骨的软骨内损伤的尝试收效甚微。因此，需要新的治疗选择来增加目前可用的治疗骨软骨缺损技术的成功率。

体外培养的ECM组合物在组织培养系统中也可以用于产生工程组织植入物。组织工程领域涉及利用细胞培养技术生成新的生物组织或修复受损组织。部分由干细胞革命推动的组织工程技术为创伤或退行性疾病治疗后的组织再生和替代提供了希望。其也可以用于整容手术。

组织工程技术可以使用多种细胞类型和培养技术，以用于同时生成自体和异体组织或细胞。在创建自体植入物时，可以采集供体组织并分离成单个细胞，随后在基质上贴壁和培养，以在所述功能组织的预期部位进行植入。许多分离的细胞类型可以使用细胞培养技术在体外扩增，然而，锚定依赖细胞需要特定的环境，通常包括三维支架的存在，以作为生长的模板。

目前的组织工程技术一般提供人工植入物。成功的细胞移植治疗取决于为体外和体内组织培养开发提供合适的基质。因此，仅含有天然材料并适用于植入的ECM的发展将具有更多内源性组织的特征。因此，天然ECM材料的产生是组织工程领域的一个持续挑战。

长期以来，已知细胞在凋亡过程中会将囊泡释放到胞外环境中。然而，直到最近才意识到健康细胞也将囊泡释放到胞外环境。胞外囊泡(ECV)或外泌体是40-100nm细胞来源的膜囊泡，存在于许多和几乎所有的真核液体中，包括血液、尿液和细胞培养物的培养基。ECV含有其起源细胞的各种分子成分，包括蛋白和RNA。ECV可以在细胞间信号传导中发挥作用，具体来说，因为ECV可以以与远离其起源细胞的细胞结合并将其内容物释放到细胞中，所以它们可能影响受体细胞中的过程。ECV的分离和检测已被证明是复杂的。由于体液的复杂性，ECV与细胞和相似大小颗粒的物理分离具有挑战性。

发明内容

本发明的部分基于开创性的发现，即在刺激早期胚胎环境(例如，低氧和重力降低)的条件下在表面(例如，二维或三维)上培养的细胞产生具有胎儿特性的ECM组合物和条件培养基(CCM)组合物。在低氧条件下在含有一种或多种胚胎蛋白的表面上培养细胞产生的ECM组合物具有多种有益的应用。研究还发现，在低氧条件下从生长的细胞来源的条件培养基(CCM)组合物中分离的胞外囊泡(ECV)含有具有有益应用的蛋白。最近研究表明，这类ECV可以用于多种医疗和治疗应用。具体来说，这些胞外囊泡组合物可以用于刺激毛发生长、刺激和/或再生组织以及皮肤更新。

在一个实施方案中，本发明提供了一种制备含有一种或多种胚胎蛋白的ECM组合物的方法。所述方法包括：在低氧条件下，于合适生长培养基中在表面(如二维或三维)上培养细胞，以产生可溶性和不可溶性组分。在各个方面，所述组合物包括单独的可溶性或不可溶性组分，以及与可溶性和不可溶性组分的组合。在各个方面，产生的组合物包括基因表达上调和层粘连蛋白、胶原蛋白和Wnt因子的产生。在其他方面，产生的组合物包括层粘连蛋白、胶原蛋白和Wnt因子基因表达的下调。在其他方面，所述组合物具有种属特异性和包括单一动物种属的细胞和/或生物材料。虽然体外培养的ECM组合物可以用于人类治疗，但这类组合物可以应用于其他种属的动物。因此，这类组合物非常适合兽医的应用。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种产生Wnt蛋白和血管内皮生长因子(VEGF)的方法。所述方法包括：在低氧条件下，于合适生长培养基中在表面(例如，二维或三维)上培养细胞，从而产生Wnt蛋白和VEGF。在各个方面，所述生长培养基无血清，且低氧条件为1-5％的氧气。在相关方面，与在约15-20％的氧气条件下产生的培养基相比，Wnt种属得到了上调。在示例性方面，Wnt种属是Wnt3a、7a、7b和Wnt11。在其他实施方案中，将所述条件培养基分离为含有本文所述各种蛋白的组合物。

在另一个实施方案中，本发明包括通过接触本文所述ECM组合物修复或再生的细胞来修复和/或再生细胞的方法。在一方面，所述细胞是骨软骨细胞。因此，所述方法考虑了修复骨软骨缺损。

在另一个实施方案中，ECM组合物可以用作植入式器械上的植入物或生物涂层。在各个方面，本发明的组合物包括在植入体中或用作植入式器械(如支架)的生物涂层；以及用于促进器官(如心脏和相关组织)血管化的人工血管。在相关方面，所述组合物包括在组织再生补片或植入物中，用于疝修补、盆底修补、伤口修补、肩袖修补等。

在又一个实施方案中，本发明包括一种改善受试者皮肤表面的方法，所述方法包括在皱纹部位将本文所述的ECM组合物施用于受试者。在又一个实施方案中，本发明包括一种在受试者中进行软组织修复或增强的方法，所述方法包括在皱纹部位将本文所述的ECM组合物或条件培养基施用于受试者。

在另一个实施方案中，本发明包括一种组织培养系统。在各个方面，所述培养系统由本文所述的ECM组合物或培养基构成，如包含在二维或三维支持材料中。在另一个方面，本文所述的ECM组合物作为各种细胞类型生长的支持或二维或三维支持。例如，所述培养系统可以用来支持干细胞的生长。在一个方面，所述干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞。

在另一个实施方案中，本发明包括培养细胞(例如，成纤维细胞，在低氧条件下)来产生干细胞，从而以至少比在常氧条件下生长时大3倍的水平产生表达干细胞基因特征的细胞。这类基因可以包括例如，Oct4、Sox2、KLF4、NANOG和cMyc。

通过本发明方法产生的干细胞优选为多能干细胞。任何基质或非干细胞均可以作为起始细胞类型。

在另一个实施方案中，本发明的组合物可以用于提供治疗受损组织的方法。所述方法包括：在允许治疗受损组织的条件下，使受损组织与在低氧条件下在含有一种或多种胚胎蛋白的二维或三维表面上培养细胞所产生的组合物接触。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种刺激或促进毛发生长的方法。所述方法包括使细胞与本文所述ECM组合物或条件培养基接触。在示例性方面，所述细胞是毛囊细胞。在各个方面，所述细胞可以在体内或离体接触。

在一个实施方案中，本发明提供了包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9阳性胞外囊泡(ECV)。在一个方面，所述ECV通过以下产生：在1-5％氧气的低氧条件下，于合适生长培养基中在微载体珠或三维表面上培养成纤维细胞至少2周，从而产生多能干细胞(其产生并分泌ECV到培养基中)；并收集ECV。在另一个方面，Wnt蛋白是Wnt3a、Wnt7a和/或Wnt7b。

在附加的实施方案中，本发明提供了一种产生至少包含Wnt和卵泡抑素蛋白的ECV的方法，所述方法包含：在1-5％氧气的低氧条件下，于合适生长培养基中在微载体珠或三维表面上培养成纤维细胞至少2周，从而产生多能干细胞，其中所述多能干细胞在培养基中产生并分泌ECV。

在进一步的实施方案中，本发明提供了一种包含CD9、CD63和/或CD81阳性ECV(包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段)和载体的组合物。在一个方面，所述载体是药学上可接受的载体。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种刺激毛发生长的方法，所述方法包括将包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9阳性ECV施用于有此需要的受试者，从而刺激毛发生长。

在附加的实施方案中，本发明提供了一种刺激皮肤更新和/或再生的方法，所述方法包括将包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9阳性ECV施用于有此需要的受试者，从而刺激皮肤更新和/或再生。

在进一步的实施方案中，本发明提供了包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9阳性ECV在制备刺激毛发生长药物中的用途。

在一个实施方案中，本发明提供了包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9阳性ECV在制备刺激皮肤更新和/或再生药物中的用途。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗需要修复组织的方法，所述方法包括将包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9阳性ECV施用于有此需要的受试者，从而修复所述组织。

在附加的实施方案中，本发明提供了一种包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9阳性ECV，其中所述ECV是外泌体。

附图说明

图1是用于分离本发明ECV的示例性步骤的图示。

图2是通过蛋白免疫印迹获得的ECV组合物中CD9蛋白表达谱的图示。M：蛋白标准品；A：工程批次(10X)；B：临床批4.20.11(10X)；C：生产(SV)批(10X)；D：工程+BCS 4.10.12(1X)。

图3A-3B是纳米颗粒数据的图示。A)在两份样品中分析的ECV参数的描述。B)两个CCM样品中ECV浓度的图示。

图4是四份ECV样品中提取的蛋白含量的图示。

图5A-5C是ECV组合物中Wnt蛋白表达谱的图示。A)Wnt-7a蛋白的表达谱。B)Wnt-7b蛋白的表达谱。C)Wnt-3a蛋白的表达谱。M：预染色蛋白标准品；7a：Wnt7a阳性细胞裂解物；7b：Wnt 7b阳性细胞裂解物；E：ECV样品。

图6是如FST生物试验中测定的ECV组合物中FST生物活性的图示。

具体实施方式

本发明涉及一种制备包括一种或多种胚胎蛋白的ECM、条件培养基和胞外囊泡(ECV)组合物的方法。特别地，所述组合物是通过在低氧条件下于合适生长培养基中在表面(例如，二维或三维)上培养细胞生成。所述培养方法可以产生可溶性和不可溶性组分，其可以单独或结合使用，以获得具有多种应用的生理学上可接受的组合物。此外，源于可溶性组分的ECV含有可用于各种医学和治疗应用的蛋白。

干细胞和多能祖细胞的分裂、分化和功能受到微环境中复杂信号的影响，包括氧的可用性。例如，由于快速细胞分裂和异常血管形成，肿瘤中出现了重度氧气缺乏(低氧)区域。低氧诱导因子(HIF)介导正常组织和癌症中对局部低氧的转录反应，并可以通过改变细胞代谢和刺激血管生成促进肿瘤进展。最近，HIF被证明可以激活特定的信号传导通路(如Notch)和转录因子(如Oct4)的表达，这类转录因子控制干细胞自我更新和多潜能性。由于许多癌症被认为是由少量转化、自我更新和多能的“肿瘤干细胞”发展而来，因此这些结果表明了HIF在肿瘤进展中的新作用。例如，本示例中显示的数据表明，在低氧条件下培养的细胞表达通常与多能细胞相关的基因，如Oct4、NANOG、Sox2、KLF4和cMyc。

本发明的组合物具有多种应用，包括但不限于促进受损细胞或组织的修复和/或再生；用于补片和植入物以促进组织再生(例如，疝修补、盆底修补、肩袖修补和伤口修补)；用于组织培养系统以培养细胞，如干细胞；用于与植入式器械(例如，起搏器、支架、支架移植物、血管假体、心脏瓣膜、分流器、药物递送端口或导管、疝和盆底修补补片)联合使用的表面涂层；促进软组织修复、增强和/或改善皮肤表面(如皱纹)，创伤后皮肤应用(例如，激光后)、皮肤更新、毛发生长；用作生物防粘连剂或在递送部位作为细胞递送或维持的生物赋形剂。

本发明的部分依据是发现在血管生成前，在刺激早期胚胎环境(低氧和重力降低)的条件下，在珠或三维表面上培养的细胞产生具有胎儿特性的ECM组合物，包括生成胚胎蛋白。低氧条件下细胞的生长证明了一种独特的ECM和具有胎儿特性和生长因子表达的条件培养基。与在传统培养条件下培养ECM不同，超过5000个基因在低氧条件下培养的ECM中差异表达。这导致培养的ECM具有不同的性质和不同的生物组合物。例如，低氧条件下产生的ECM与胎儿间充质组织相似，因为它相对富含Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白和糖蛋白(如纤连蛋白、SPARC、血小板反应蛋白、透明质酸)。

低氧还可以增强调节伤口愈合和器官形成的因子(如VEGF、FGF-7和TGF-β)以及多种Wnt因子(包括wnt 2b、4、7a、10a和11)的表达。培养的胚胎人ECM也刺激体外人成纤维细胞代谢活性增加，如通过酶活性的增加进行测定。此外，培养的胚胎ECM导致细胞数量增加。

在描述本组合物和方法之前，应理解的是本发明不限于所描述的特定组合物、方法和实验条件，因为这类组合物、方法和条件可以发生变化。还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案，并不意在限制，因为本发明的范围将仅限于所附权利要求中。

除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用。因此，例如，“方法”的引用包括本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤，本领域技术人员在阅读本公开等内容后，其将变得显而易见。

在各种实施方案中，本发明涉及一种制备包括一种或多种胚胎蛋白的ECM组合物的方法及其应用。特别地，通过在低氧条件下于合适生长培养基中在二维或三维表面上培养细胞来生成所述组合物。通过在三维框架上生长细胞得到多层细胞培养系统，衍生得到所述组合物。根据本发明，在三维框架支架上生长的细胞在多层中生长，以形成细胞基质。在ECM和条件培养基中，低氧培养条件与传统培养的比较结果是低氧条件下培养的细胞的生长导致差异基因表达。

ECM是一种蛋白和生物聚合物的组合物，所述生物聚合物主要包含通过培养细胞产生的组织。基质细胞，如成纤维细胞，是一种锚定依赖细胞类型，其附着在合适细胞培养的材料和表面的同时需要生长。通过培养的细胞产生的ECM材料以三维排列沉积，从而为组织样结构的形成提供空间。

提供三维结构的培养材料被称为支架。ECM沉积的空间以开口的形式存在于，例如，在球形珠(称为微载体)的紧密构造中创建的编织网或组织间隙中。

如本文所用，“胞外基质组合物”包括可溶性和不可溶性组分或其任何部分。所述不可溶性组分包括沉积在支持或支架上的分泌ECM蛋白和生物成分的那些。所述可溶性组分包括指培养基或条件培养基，其中细胞已被培养并且细胞已经分泌活性剂到其中，并且包括未沉积在支架上的蛋白和生物成分。可以收集两种组分，并任选地进一步处理，并单独或结合用于本文所述的各种应用。

用于培养基质细胞的三维支持或支架可以是任何材料和/或形状：(a)允许细胞附着在其上(或可以进行修饰以使细胞附着在其上)；和(b)允许细胞多于一层地生长(即形成三维组织)。在其他实施方案中，可以使用大体上二维的片材或膜或珠来培养形式上足够三维的细胞。

生物相容性材料形成三维结构或支架，其中所述结构具有用于细胞附着和生长成三维组织的组织间隙。在一些实施方案中，框架的开口和/或组织间隙具有合适的尺寸，以允许细胞伸展跨越所述开口或间隙。维持伸展跨越框架的活跃生长细胞似乎可以增强负责本文所述活动的生长因子库的产生。如果开口太小，细胞可以迅速达到汇合，但不容易从网中出来。这些捕获的细胞可以表现出接触抑制，并停止产生支持增殖和维持长期培养物所需的合适因子。如果开口太大，细胞可以无法伸展跨越开口，这可以导致基质细胞产生支持增殖和维持长期培养物所必需的合适因子的减少。通常，组织间隙为至少约100um、至少140um、至少约150um、至少约180um、至少约200um或至少约220um。当使用网型基质时，如本文所示例的，发现约100μm到约220μm的开口将令人满意地工作。然而，根据框架的三维结构和复杂性，其他尺寸也是允许的。根据本文的方法，任何允许细胞伸展并继续复制并生长较长时间的形状或结构都可以起到完善细胞因子的作用。

在一些方面，三维框架由聚合物或线形成，所述聚合物或线经针织、机织、编织或以其他方式排列形成框架，如网或织物。通过铸造材料或制成泡沫、基质或海绵样支架，也可以形成所述材料。在其他方面，三维框架是由聚合物或其他纤维压在一起生成具有组织间隙的材料制成的无光泽纤维的形式。三维框架可以采取任何形式或几何形状，用于培养中细胞的生长。因此，如以下进一步描述，框架的其他形式可以足以生成合适的条件培养基。

可以使用多种不同材料形成支架或框架。这些材料包括非聚合物和聚合物材料。当使用时，聚合物可以是任何类型的聚合物，如均聚物、无规聚合物、共聚物、嵌段聚合物、共嵌段聚合物(例如，二、三等)、线性或支化聚合物，以及交联或非交联聚合物。用作支架或框架的材料的非限制性示例包括玻璃纤维、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺(例如，尼龙)、聚酯(例如，涤纶)、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯化合物(例如，聚氯乙烯；PVC)、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE；TEFLON)、Thermanox(TPX)、硝酸纤维素、多糖(例如，纤维素、壳聚糖、琼脂糖)、多肽(例如，蚕丝、明胶、胶原蛋白)、聚乙醇酸(PGA)和葡聚糖。

在一些方面，框架或珠可以由在使用条件下随时间降解的材料制成。生物可降解也指化合物或组合物在体内或体外条件施用时的可吸收性或降解性。生物降解可以通过生物制剂的作用直接或间接发生。生物可降解材料的非限制性示例包括聚乳酸、聚乙交酯、聚(三亚甲基碳酸酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(即PLGA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚己内酯、肠线缝合材料、胶原蛋白(例如，马胶原蛋白泡沫)、聚乳酸或透明质酸。例如，这些材料可以编织成三维框架，如胶原蛋白海绵或胶原蛋白凝胶。

在其他方面，如果培养物需要长期保存、冷冻保存和/或需要附加的结构完整性，三维框架可以由非生物可降解材料构成。如本文所用，非生物可降解材料是指在培养基中的条件下不会显著降解或分解的材料。不可降解材料示例包括，作为非限制性示例，尼龙、涤纶、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、膨体PTFE(ePTFE)和纤维素。示例性的非降解三维框架包含尼龙网(商品名为

)、尼龙过滤网(平均孔径为140μm，平均尼龙纤维直径为90μm)(#3-210/36,Tetko公司，纽约)。

在其他方面，珠、支架或框架是生物可降解和非生物可降解材料的组合。非生物可降解材料在培养过程中为三维支架提供稳定性，而生物可降解材料允许形成足以产生细胞网络的组织间隙，所述细胞网络产生足以用于治疗应用的细胞因子。生物可降解材料可以涂在非生物可降解材料上，或编织、针织或形成网。可以使用生物可降解和非生物可降解材料的各种组合。示例性的组合是涂有生物可降解聚合物薄膜(聚[D-L-乳酸-羟基乙酸共聚物)的聚(乙二醇酯)(PET)织物，以获得极性结构。

在各个方面，支架或框架材料可以在接种细胞之前进行预处理，以增强细胞附着。例如，在接种细胞之前，用0.1M的乙酸处理一些实施方案中的尼龙网，并在多聚赖氨酸、胎牛血清和/或胶原蛋白中孵育以涂覆尼龙。可以使用硫酸类似地处理聚苯乙烯。在其他实施方案中，通过在框架上添加或用蛋白(例如，胶原蛋白、弹性蛋白纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，硫酸乙酰肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素等)、纤连蛋白和/或共聚物(聚[N-对乙烯基苄基-D-内酰胺]，PVLA)涂覆，可以进一步增强细胞在三维支持框架存在下的生长，以改善细胞附着。当材料是细胞附着的不良基质时，支架或框架的处理是有用的。

在一个方面，网用于产生ECM。网是一种编织尼龙6材料，平织形式，开口约为100μm，厚度约为125μm。在培养中，成纤维细胞通过带电蛋白相互作用附着在尼龙上，并在产生并沉积ECM蛋白的同时生长进入网的空隙中。过大或过小的网开口可能无效，但可以与上述不同，而不会显著改变产生或沉积ECM的能力。在另一个方面，其他编织材料用于ECM产生，如聚烯烃，以编织结构为细胞生长和ECM沉积提供足够的几何形状。

例如，通过切割至所需尺寸，用0.1-0.5M乙酸清洗，然后用高纯水冲洗，然后蒸汽灭菌，在本发明的任何步骤中制备用于培养的尼龙网。用作ECM产生的三维支架时，将网制成约10cm×10cm的正方形。然而，网的尺寸可以与预期应用相适应，以用于本发明的任何方法，包括接种、细胞生长和ECM产生的培养方法以及最终形式的制备。

在其他方面，生成培养组织的支架由微载体构成，所述微载体是珠或颗粒。珠可以是微观或宏观的，并且其尺寸可以进一步定制以允许渗入组织或压实形成特定的几何形状。在一些组织穿透的实施方案中，用于细胞培养物的框架包含与细胞结合形成三维组织的颗粒。细胞附着在颗粒上，并相互附着形成三维组织。颗粒和细胞的复合物具有足够的大小，以通过注射或导管施用于组织或器官。珠或微载体通常被认为是二维系统或支架。

如本文所用，“微载体”是指粒径为纳米至微米的颗粒，其中所述颗粒可以是任何形状或几何形状，为不规则、非球形、球形或椭圆体。

适用于本文目的的微载体尺寸可以是适用于特定应用的任何尺寸。在一些实施方案中，适合三维组织的微载体的尺寸可以是可通过注射施用的那些。在一些实施方案中，微载体的粒径范围是至少约1μm、至少约10μm、至少约25μm、至少约50μm、至少约100μm、至少约200μm、至少约300μm、至少约400μm、至少约500μm、至少约600μm、至少约700μm、至少约800μm、至少约900μm、至少约1000μm。

在一些方面，其中微载体由生物可降解材料制成。在一些方面，可以使用包含两层或多层不同生物可降解聚合物的微载体。在一些实施方案中，至少外部第一层具有生物可降解特性，以在培养物中形成三维组织，而当施用于组织或器官时，至少使特性不同于第一层的生物可降解内部第二层发生侵蚀。

在一些方面，微载体是多孔微载体。多孔微载体是指具有间隙的微载体，分子可以通过所述间隙进出微粒。在其他实施方案中，微载体是无孔微载体。无孔微粒是指选择尺寸的分子不会扩散到微粒内或微粒外的微粒。

组合物中使用的微载体具有生物相容性，并对细胞的毒性较低或无毒性。可以根据待治疗的组织、待治疗的损伤类型、所需的治疗时间、体内细胞培养物的寿命和形成三维组织所需的时间，选择合适的微载体。微载体可以包含各种天然或合成、带电(即阴离子或阳离子)或不带电、可生物降解或非可生物降解的聚合物。聚合物可以是均聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物和支化聚合物。

在一些方面，微载体包含非可生物降解的微载体。非可生物降解的微囊和微载体包括但不限于由聚砜、聚(丙烯腈-共-氯乙烯)、乙烯-醋酸乙烯酯、甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物制成的那些。这些有助于提供组织膨胀特性或用于微载体被体内消除的实施方案。

在一些方面，微载体包含可降解支架。这些包括由天然聚合物制成的微载体，其非限制性示例包括纤维蛋白、酪蛋白、血清白蛋白、胶原蛋白、明胶、卵磷脂、壳聚糖、藻酸盐或多聚氨基酸(如多聚赖氨酸)。在其他方面，可降解微载体由合成聚合物制成，非限制性示例包括聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚己内酯、聚对二氧环己酮三亚甲基碳酸酯、聚羟基脂肪酸酯(例如聚(羟基丁酸酯)、聚(谷氨酸乙酯)、聚(DTH亚氨基碳)(双酚A亚氨基碳酸酯)、聚(邻酯)和聚氰基丙烯酸酯。

在一些方面，微载体包含水凝胶，所述水凝胶通常是充满水的亲水性聚合物网络。水凝胶具有选择性触发聚合物溶胀的优点。根据聚合物网络的组合物，微粒的溶胀可以由多种刺激触发，包括pH值、离子强度、热、电、超声和酶活性。可用于水凝胶组合物的聚合物的非限制性示例包括由聚(丙交酯-共-乙交酯)；聚(N-异丙基丙烯酰胺)；聚(甲基丙烯酸-g-聚乙二醇)；聚丙烯酸和聚(氧丙烯-共-氧乙烯)乙二醇的聚合物形成的那些；以及天然化合物，如硫酸软骨素、壳聚糖、明胶、纤维蛋白原或合成和天然聚合物的混合物，例如壳聚糖-聚(环氧乙烷)。聚合物可逆或不可逆交联，以形成适用于形成三维组织的凝胶。

在示例性的方面，本发明中使用的微载体或珠完全或部分地由葡聚糖构成。

根据本发明，培养方法适用于包括基质细胞，如成纤维细胞，尤其是原代人新生包皮成纤维细胞等的不同类型细胞的增殖。在各个方面，接种到支架或框架上的细胞可以是包含成纤维细胞的基质细胞，有或没有如以下进一步所述的其他细胞。在一些实施方案中，细胞是通常来源于结缔组织的基质细胞，包括但不限于：(1)骨；(2)疏松结缔组织，包括胶原蛋白和弹性蛋白；(3)形成韧带和肌腱的纤维结缔组织，(4)软骨；(5)血液的ECM；(6)脂肪组织，包含脂肪细胞；以及(7)成纤维细胞。

基质细胞可以源于各种组织或器官，如皮肤、心脏、血管、骨髓、骨骼肌、肝脏、胰腺、脑、包皮，其可以通过活检(如适用)或尸检获得。在一个方面，胎儿成纤维细胞可以从包皮，如新生儿包皮中大量获得。

在一些方面，细胞包含成纤维细胞，其可以来自胎儿、新生儿、成人或其组合。在一些方面，基质细胞包含胎儿成纤维细胞，其可以支持各种不同细胞和/或组织的生长。如本文所用，胎儿成纤维细胞是指来源于胎儿的成纤维细胞。如本文所用，新生儿成纤维细胞是指来源于新生儿的成纤维细胞。在合适条件下，成纤维细胞可以产生其他细胞，如骨细胞、脂肪细胞和平滑肌细胞以及其他中胚层来源的细胞。在一些实施方案中，成纤维细胞包含皮肤成纤维细胞，即来源于皮肤的成纤维细胞。从新生儿包皮中可以分离出正常人真皮成纤维细胞。这些细胞通常在原代培养结束时冷冻保存。

在其他方面，三维组织可以使用干细胞或祖细胞，单独或与本文所讨论的任何细胞类型结合。干细胞和祖细胞包括，例如，但不限于，胚胎干细胞、造血干细胞、神经元干细胞、表皮干细胞和间充质干细胞。

在一些实施方案中，可以通过用特定器官(即皮肤、心脏和/或之后按照本文所述方法接受在培养物中生长的细胞和/或组织的特定个体)的细胞接种三维支架来制备“特定”三维组织。

对于体内的某些用途，优选从患者自身组织中获得基质细胞。在三维基质支持框架存在的情况下，细胞的生长可以通过将以下物质添加到框架中，或用其涂覆框架支持来进一步增强：蛋白，例如胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性纤维、网状纤维、糖蛋白；糖胺聚糖，例如硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素等；细胞基质和/或其他材料。

因此，由于本文所述的二维或三维培养系统适用于不同细胞类型和组织的生长，并且根据待培养的组织和所需的胶原蛋白类型，可以选择合适的基质细胞来接种框架。

虽然本发明的方法和应用适用于不同的细胞类型，如本文所讨论的组织特异性细胞或不同类型的基质细胞，但是用于本发明的细胞的衍生也可以具有种属特异性。因此，可以产生具有种属特异性的ECM组合物。例如，本发明中使用的细胞可以包括人细胞。例如，细胞可以是人成纤维细胞。同样，细胞也来自另一种属的动物，如马科(马)、犬科(犬)或猫科(猫)细胞。此外，一个种属或种属菌株的细胞可以用于产生ECM组合物，以用于其他种属或相关菌株(例如，同种异体、同基因和异种)。还应该注意，来源于不同种属的细胞可以结合产生多种属ECM组合物。

因此，本发明的方法和组合物适用于涉及非人动物的应用。如本文所用，“兽医”是指与动物，特别是家畜的医疗或手术治疗有关或相关的医学科学。常见的兽用动物可以包括哺乳动物、两栖动物、鸟类、爬行动物和鱼类。例如，典型的哺乳动物可以包括犬、猫、马、兔、灵长类、啮齿类动物和农场动物，如牛、马、山羊、绵羊和猪。

如上所讨论，与基质细胞共同培养时可以有附加的细胞。这些附加的细胞可以具有许多有益的作用，包括支持培养物的长期生长、增强生长因子的合成和促进细胞附着在支架上。附加的细胞类型包括，作为非限制性示例，平滑肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、周细胞、巨噬细胞、单核细胞和脂肪细胞。这类细胞可以与成纤维细胞一起接种到框架上，或者在一些方面，在没有成纤维细胞的情况下接种到框架上。这些基质细胞可以源于合适的组织或器官，包括但不限于皮肤、心脏、血管、骨髓、骨骼肌、肝脏、胰腺和脑。在其他方面，将一种或多种其他细胞类型(不包括成纤维细胞)接种到支架上。在其他方面，支架只接种成纤维细胞。

通过分解作为成纤维细胞源的合适器官或组织，可以很容易地分离成纤维细胞。例如，组织或器官可以机械分解和/或用消化酶和/或螯合剂处理，这些酶和/或螯合剂削弱相邻细胞之间的连接，使组织分散成单个细胞悬浮液而不发生明显的细胞断裂。酶解离可以通过切碎组织并用多种消化酶中的任何一种单独或结合处理切碎的组织来完成。这些包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、链霉蛋白酶和/或分散酶等。机械破坏也可以通过许多方法来完成，所述方法包括但不限于使用研磨机、搅拌机、筛网、匀浆器、压力受感装置或声波发生器，这只是列举的几种。在一个方面，使用消化酶(通常是胶原蛋白酶和/或胰蛋白酶)处理切除的包皮组织，使细胞与包囊结构分离。

例如，成纤维细胞的分离可以如下进行操作：彻底清洗新鲜组织样品，并在Hanks平衡盐溶液(HBSS)中切碎，以除去血清。将切碎的组织在新鲜制备的解离酶(如胰蛋白酶)溶液中孵育1-12小时。这类孵育后，混悬解离的细胞，离心沉淀并铺板于培养皿上。所有的成纤维细胞都会在其他细胞之前附着，因此，可以选择性地分离和生长合适的基质细胞。然后，分离的成纤维细胞可以生长至融合，从融合培养物中取出并接种到三维框架上，参见Naughton等人，1987,J.Med.18(3&4):219-250。用高浓度的基质细胞接种三维框架，例如，约10⁶至5×10⁷个细胞/ml，将导致在较短的时间内建立三维基质支持。

一旦组织减少为单个细胞的混悬液，则所述混悬液可以分为亚群，可以从其中获得成纤维细胞和/或其他基质细胞和/或成分。这也可以使用细胞分离的标准技术来完成，包括但不限于特定细胞类型的克隆和选择、不需要细胞的选择性破坏(阴性选择)、基于混合细胞群中的差异细胞凝集能力的分离、冻融程序、混合细胞群中细胞的差异粘附特性、过滤、常规和分区离心、离心淘洗(逆流离心)、单位重力分离、逆流分布、电泳和荧光激活细胞分选。有关克隆选择和细胞分离技术的综述，请参见Freshney,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniques,2d Ed.,A.R.Liss,Inc.,New York,1987,Ch.11and 12,pp.137-168。

在一个方面，分离的成纤维细胞可以生长以产生细胞库。创建细胞库以开始不同数量和时间的培养批次，并允许先行检测细胞的污染物和特定细胞特性。随后，来自细胞库的成纤维细胞生长，以将细胞数量增加到接种支架的合适水平。通过无菌操作进行涉及细胞和细胞接触材料环境暴露的操作，以降低异物或不良微生物污染的可能性。

在本发明的另一个方面，分离后，细胞可以通过几次传代生长至适合构建主细胞库的数量。然后，可以收获细胞库并灌装到合适的容器中，并在低温条件下保存。来自主细胞库的冷冻小瓶中的细胞可以解冻并通过附加的传代(通常为两次或更多次)生长。然后，细胞可以用于制备低温保存的工作细胞库。

细胞扩增步骤使用工作细胞库阶段的细胞小瓶，以进一步增加用于接种三维支架或支持(如网或微载体)的细胞数量。每次传代是包括接种细胞生长表面、孵育、细胞补料和收获的一系列传代培养步骤。

细胞库的培养和细胞扩增可以通过接种培养容器(如培养瓶、转瓶或微载体)来进行。基质细胞，如成纤维细胞，附着在预期的生长表面，并在存在培养基的情况下生长。培养容器，如培养瓶、转瓶和微载体，是专门为细胞培养配置的，并且通常由适合预期应用的各种塑料材料制成。微载体通常为微观或宏观珠，通常由各种塑料材料制成。然而，它们可以由其他材料制成，如玻璃或固体/半固体生物基的材料，如胶原蛋白或其他材料，如葡聚糖、改良糖复合物，如上所讨论。

培养期间，在细胞生长过程中，定期用新鲜培养基替换耗尽的培养基，以保持营养物质的充分可用性并去除培养的抑制产物。培养瓶和滚瓶为细胞提供了生长表面，并且通常用于培养锚定依赖细胞。

在一个方面，在37℃加热腔室中进行孵育。需要培养基和腔室环境交换的培养拓扑结构使用5％的CO₂ v/v和腔室气体空间中的空气，以帮助调节pH值。或者，可以使用配备维持培养温度和pH值的容器进行细胞扩增和ECM产生操作。温度低于35℃或高于38℃以及CO₂浓度低于3％或高于12％可能是不合适的。

从附着表面收获细胞可以通过去除生长培养基并用缓冲盐溶液冲洗细胞以减少酶竞争蛋白、应用分离酶然后在细胞分离后中和酶来进行。收集收获的细胞悬液，并通过离心分离收获液。可以对传代培养收获物的细胞混悬液进行取样，以评估回收的细胞数量和其他细胞属性，随后与新鲜培养基合并，并作为接种物应用。用于制备细胞库和支架接种物的传代次数对于达到可接受的ECM特性至关重要。

制备合适的三维支架后，接种所制备的基质细胞来进行接种。支架的接种可以通过多种方式(如沉降)来完成。在有氧条件下制备用于培养ECM网的制备方式与低氧生长网相同，只是不使用厌氧腔室创建低氧条件。

例如，对于在有氧和低氧条件下制备用于培养ECM的两种网，将制备和灭菌的网置于无菌150mm直径×15mm深的培养皿中，并堆叠至约10片厚度。然后通过沉降接种网堆层。将细胞加入新鲜培养基中，以获得合适浓度的细胞接种物。将接种物添加到网堆层中，细胞沉降到尼龙纤维上，并在孵育条件下附着。经过足够的时间后，可以将单独接种的网片从堆层中无菌分离，并单独置于含有约50ml生长培养基的单独150mm×15mm培养皿中。

在低氧条件下进行接种培养物的孵育，发现与正常培养条件下生成的ECM相比，其可以产生具有独特性质的ECM和周围培养基。如本文所用，与环境空气中的氧气浓度(约15％-20％的氧气)相比，低氧条件的特征是氧气浓度较低。在一个方面，低氧条件的特征是氧浓度小于约10％。在另一个方面，低氧条件的特征是氧浓度约为1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％或1％至2％。在特定方面，系统在培养容器内维持约1-3％的氧气。通过使用允许控制环境气体浓度的培养装置，例如厌氧培养腔室，可以创建和维持低氧条件。

细胞培养物的培养通常在15-20％的氧气和5％的CO₂的正常大气环境下进行，用于扩增和接种，此时将低氧培养物分流至充满95％的氮气/5％的CO₂的密闭腔室中，以便在培养基内形成低氧环境。

例如，在低氧条件下培养产生ECM的有网的皮氏培养皿在37℃和95％的空气/5％的CO₂孵育2-3周来开始生长。近大气培养期后，在设计用于厌氧培养的腔室中孵育网的皮氏培养皿，所述腔室用约95％的氮气和5％的CO₂的气体混合物吹扫。在整个培养期间，用处于大气氧气水平的新鲜培养基替换膨胀的生长培养基，在更换培养基后，将装满筛网的皮氏培养皿置于厌氧培养腔室中，用95％的氮气/5％的CO₂吹扫培养腔室，然后在37℃下孵育。当其达到所需尺寸或含有所需的生物成分时，收获培养的网。

在孵育期间，基质细胞将沿着三维框架线性生长并包裹，然后开始生长到框架的开口中。生长中的细胞产生无数的生长因子、调节因子和蛋白，其中一些分泌在周围培养基中，另一些则沉积在支持上，以制备如下更充分讨论的ECM。可以在培养物中加入生长和调节因子，但不是必需的。基质细胞的培养产生不溶性和可溶性组分。细胞生长至合适程度，使ECM蛋白充分沉积。

在三维组织的培养过程中，增殖细胞可以从框架中释放出来，并粘附在培养容器壁上，其中它们可以继续增殖并形成融汇的单层细胞。为了尽量减少发生这类可能影响细胞生长的情况，可以在补料期间或通过将三维细胞培养物转移至新的培养容器中去除释放的细胞。去除融汇的单层细胞或将培养的组织转移到新容器中的新鲜培养基中，保持或恢复三维培养物的增殖活性。在一些方面，可以在培养细胞单层超过25％融汇的培养容器中进行移除或转移。或者，一些实施方案中，搅拌培养物以防止释放的细胞粘附；在其他实施方案中，通过系统连续输注新鲜培养基。在一些方面，两种或更多种的细胞类型可以同时培养，也可以先培养第一种后培养第二种(如成纤维细胞和平滑肌细胞或内皮细胞)。

接种三维支架后，细胞培养物在合适的营养培养基和孵育条件下孵育，支持细胞生长到三维组织中。许多市售培养基，如Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、RPMI1640、Fisher、Iscove和McCoy可以适用于支持细胞培养物的生长。培养基可以补充附加的盐、碳源、氨基酸、血清和血清成分、维生素、矿物质、还原剂、缓冲液、脂质、核苷、抗生素、附着因子和生长因子。不同类型培养基的配方在本领域技术人员可获得的各种参考资料中进行了描述(Methods for Preparation of Media,Supplements and Substrates for SerumFree Animal Cell Cultures,Alan R.Liss,New York(1984)；Tissue Culture:Laboratory Procedures,John Wiley&Sons,Chichester,England(1996)；Culture ofAnimal Cells,A Manual of Basic Techniques,4th Ed.,Wiley-Liss(2000))。

在需氧或低氧条件下，本发明的任何培养步骤中使用的生长或培养基可以包括血清或不含血清。在一个方面，培养基为具有4.5g/L的葡萄糖、丙氨酰-L-谷氨酰胺、Eq 2mM和标称补充10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基。在另一个方面，培养基为无血清培养基，即Dulbecco改良Eagle培养基，其具有4.5g/L的

葡萄糖，补充0.5％血清白蛋白、2μg/mL的肝素、1μg/mL的重组碱性FGF、1μg/mL的大豆胰蛋白酶抑制剂、1X ITS补充剂(胰岛素-转铁蛋白-硒，Sigma目录编号I3146)，1:1000稀释的脂肪酸补充剂(Sigma目录编号7050)和1:1000稀释的胆固醇。此外，相同的培养基可以用于低氧和有氧培养。在一个方面，在接种和生长第一周后，将生长培养基从基于血清的培养基变更为无血清培养基。

孵育条件将在合适的pH、温度和气体(例如O₂、CO₂等)条件下进行，以维持低氧生长条件。在一些实施方案中，三维细胞培养物可以在孵育期间悬浮在培养基中，以使增殖活性最大化，并产生有利于组分所需生物活性的因子。此外，培养物可以定期“补料”，以除去用过的培养基，去除释放的细胞，并添加新的营养来源。在孵育期间，培养的细胞沿着三维支架的细丝线性生长并包裹，然后开始生长到支架的开口中。

在低氧条件的孵育期间，与在正常大气氧浓度约15-20％下孵育相比，数千个基因差异表达。一些基因被发现在这些组合物中上调或下调，最显著的是某些层粘连蛋白种属、胶原蛋白种属和Wnt因子。在各个方面，与正常条件下的生长相比，三维ECM可以通过细胞在低氧条件下生长产生的特征性指纹或一组细胞产物来定义。在本文特别示例性的ECM组合物中，三维组织和周围介质的特征是表达和/或分泌各种因子。

本文所述的三维组织和组合物具有存在于支架或框架上的ECM。在一些方面，由于在低氧条件下生长和选择在支架上生长的细胞，所述ECM包括各种层粘连蛋白和胶原蛋白类型。ECM蛋白沉积的比例可以通过选择阐述了合适的胶原蛋白类型的成纤维细胞，并在其中特定层粘连蛋白和胶原蛋白类的表达上调或下调的低氧条件下生长细胞来操纵或增强。

在一些方面，成纤维细胞的选择可以使用定义特定胶原蛋白类型的合适同种型或亚类的单克隆抗体完成。在其他方面，固体底物，如磁珠，可以用于选择或消除已结合抗体的细胞。这些抗体的组合可以用于选择(阳性或阴性)表达所需胶原蛋白类型的成纤维细胞。或者，用于接种框架的基质可以是合成所需胶原类型的细胞混合物。示例性胶原蛋白类型的分布和来源见表1。

表1.各类型胶原蛋白的分布和来源

ECM组合物中可以存在的其他类型的胶原蛋白如表2所示。

表2.胶原蛋白类型和相应基因

如上所讨论，本文所述的ECM组合物包括各种胶原蛋白。如实施例1的表3所示，在低氧培养的ECM组合物中发现几种胶原蛋白的表达上调。因此，在本发明的一个方面，与在约15-20％氧气的氧气条件下产生的相比，包括一个或多个胚胎蛋白的ECM组合物包括胶原蛋白种属的上调。在另一个方面，上调的胶原种属是V型α1；IX型α1；IX型α2；VI型α2；VIII型α1；IV型α5；VII型α1；XVIII型α1；以及XIIα1。

除了各种胶原蛋白，本文所述的ECM组合物包括各种层粘连蛋白。层粘连蛋白属于糖蛋白异三聚体家族，由α、β和γ链亚基通过卷曲螺旋结构域连接在一起构成。迄今为止，已发现5条α、4条β和3条γ层粘连蛋白链可以结合形成15种不同的亚型。在这一结构中，是对其他层粘连蛋白和基膜分子以及膜结合受体具有结合活性的可识别的结构域。结构域VI、IVb和IVa形成球状结构，而结构域V、IIIb和IIIa(含有富含半胱氨酸的EGF样成分)形成棒状结构。三条链的结构域I和II参与形成三链卷曲螺旋结构(长臂)。

层粘连蛋白链具有共同和独特的功能，并以特定的时间(发育)和空间(组织部位特异性)模式表达。层粘连蛋白α链被认为是异三聚体的功能重要部分，因为它们表现出组织特异性分布模式，并含有主要的细胞相互作用位点。已知血管内皮表达两种层粘连蛋白亚型，其表达因发育阶段、血管类型和内皮的活化状态而不同。

因此，在本发明的一个方面，与在约15-20％氧气的氧气条件下产生的相比，包括一个或多个胚胎蛋白的ECM组合物包括各种层粘连蛋白种属的上调或下调。

层粘连蛋白8由α-4、β-1和γ-1层粘连蛋白链构成。层粘连蛋白α-4链广泛分布于成人和发育过程中。在成人中，其可以在心、骨骼肌和平滑肌纤维周围的基底膜以及肺泡间隔中被识别出来。也已知它存在于毛细血管和较大血管的内皮基底膜中，周围神经的神经束膜基底膜中，以及骨髓的窦间隙、大动脉和较小小动脉中。层粘连蛋白8是血管内皮中的一种主要层粘连蛋白亚型，由血小板表达和粘附，并且在3T3-L1脂肪细胞中合成，细胞脂肪转化后其合成水平增加。层粘连蛋白8被认为是层粘连蛋白亚型，通常在间充质细胞谱系中表达，以诱导结缔组织中的微血管。层粘连蛋白8也在小鼠骨髓原代细胞培养物、小动脉壁和窦间隙中被识别出来，它是发育中骨髓的主要层粘连蛋白亚型。由于位于邻近造血细胞的成人骨髓中，含有α-4链的层粘连蛋白亚型很可能与发育中的造血细胞发生生物学相关的相互作用。

因此，在本发明的另一个方面，ECM包括层粘连蛋白种属的上调，如层粘连蛋白8。在另一个方面，由本发明的三维组织产生的层粘连蛋白至少包括层粘连蛋白8，其定义了存在于组合物中的层粘连蛋白的特点或特征。

本文所述的ECM组合物可以包括不同的Wnt因子。Wnt家族因子是信号传导分子，在多种细胞通路和细胞间相互作用过程中发挥作用。Wnt信号传导与肿瘤发生、胚胎早期中胚层模式、脑和肾的形态发生、乳腺增殖调节和阿尔茨海默病有关。如实施例1的表4所示，在低氧培养的ECM组合物中发现了几个Wnt蛋白种属的表达上调。因此，在本发明的一个方面，与在约15-20％氧气的氧气条件下产生的Wnt种属相比，包括一个或多个胚胎蛋白的ECM组合物包括Wnt种属的上调。在另一个方面，上调的Wnt种属是Wnt7a和Wnt11。在另一个方面，本发明的三维组织产生的Wnt因子至少包括wnt7a和wnt11，其定义了所述组合物中存在的Wnt蛋白的特点或特征。

本文所述的培养方法，包括在低氧条件下的培养，也显示上调各种生长因子的表达。因此，本文所述的ECM组合物可以包括各种生长因子，如血管内皮生长因子(VEGF)。如本文所用，VEGF旨在包括所有已知的VEGF家族成员。VEGF是生长因子的一个亚家族，更具体地说是胱氨酸结生长因子的血小板衍生生长因子家族。VEGF在血管新生和血管生成中具有已知的作用。已知有几种VEGF，包括VEGF-A，在发现其他VEGF种属之前，VEGF-A被称为VEGF。其他VEGF种类包括胎盘生长因子(PlGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。此外，人VEGF的几种亚型是已知的。

根据本文所述的在低氧条件下培养增加Wnt蛋白和生长因子的产生，本发明进一步提供了一种产生Wnt蛋白和血管内皮生长因子(VEGF)的方法。所述方法可以包括在如本文所述低氧条件下，于合适生长培养基中在三维表面上培养细胞，产生Wnt蛋白和VEGF。在示例性方面，Wnt种属是Wnt7a和Wnt11，而VEGF是VEGF-A。可以按照本文的进一步描述或本领域已知的方法对蛋白进行进一步处理或收获。

在整个讨论中，本发明的ECM组合物包括可溶和不可溶组分或其任何部分。应当理解的是，本发明的组合物可以包括其中一种或两种组分，以及其任何组合。此外，可以从单独使用或与其他分离株或已知组合物结合使用的组分中分离单个成分。

因此，在各个方面，使用本发明方法产生的ECM组合物可以直接使用或以各种方式处理，其方法可以适用于不溶性和可溶性组分。可溶性组分，包括无细胞的上清液和培养基，可以进行冻干以保存和/或浓缩因子。必要时，可以使用各种生物相容性防腐剂、冷冻保护剂和稳定剂来保存活性。生物相容性试剂的示例包括甘油、二甲基亚砜和海藻糖。冻干物也可以含有一种或多种辅料，如缓冲液、填充剂和张力调节剂。如以下进一步的描述，可以通过加入合适溶液或药物稀释剂复溶冻干的培养基。

在其他方面，对可溶性组分进行透析。透析是基于跨多孔膜选择性扩散分离样品成分的最常用技术之一。孔径决定了膜的截留分子量(MWCO)，其特征为膜截留90％溶质的分子量。在某些方面，根据所需的截留量考虑任何孔径的膜。典型截留量为5,000道尔顿、10,000道尔顿、30,000道尔顿和100,000道尔顿，然而所有尺寸均在考虑之内。

在一些方面，可以通过沉淀培养基中的活性成分(例如，生长因子)处理可溶性组分。沉淀可以使用各种程序，如用硫酸铵盐析或使用亲水性聚合物，例如聚乙二醇。

在其他方面，使用各种选择性过滤器对可溶性组分进行过滤。通过过滤处理可溶性组分有助于浓缩组分中存在的因子，并且也可以除去可溶性组分中使用的小分子和溶质。对特定分子量具有选择性的过滤器包括：<5000道尔顿、<10,000道尔顿和<15,000道尔顿。可以使用其他过滤器，并按照本文所述测定处理的培养基的治疗活性。示例性的过滤器和浓缩器系统包括基于中空纤维过滤器、滤盘和过滤器探针的过滤器和浓缩器系统(参见，例如，Amicon Stirred Ultrafiltration Cells)。

在仍其他方面，对可溶性组分进行色谱分析，以除去盐、杂质或分馏培养基的各种成分。可以采用各种色谱技术，如分子筛、离子交换、反相和亲和层析技术。为了处理条件培养基而不显著损失生物活性，可以使用温和的色谱培养基。非限制性示例包括葡聚糖、琼脂糖、基于聚丙烯酰胺的分离介质(例如，商品名为，如Sephadex、Sepharose和Sephacryl的那些)。

在仍其他方面，条件培养基配制为脂质体。可以将生长因子引入或包封至脂质体内腔中，用于递送和延长活性因子的寿命。如本领域所知，脂质体可以分为各种类型：多层(MLV)、稳定多层(SPLV)、小单层(SUV)或大单层(LUV)囊泡。脂质体可以由各种脂质化合物制备，这些化合物可以是合成的或天然存在的，包括磷脂酰醚和酯，如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；类固醇，如胆固醇；脑苷脂；鞘磷脂；甘油脂；和其他脂质(参见，例如美国专利第5,833,948号)。

可溶性组分可以直接使用而无需附加的添加剂，或与各种药学上可接受的辅料、溶剂或载体一起制备为药物组合物。“药物组合物”是指可溶性和/或不可溶性组分以及至少一种药学上可接受的赋形剂、载体或辅料。对于皮内、皮下或肌内给药，可以ECM组合物在水性或油性赋形剂中的无菌混悬液、溶液或乳剂中制备所述组合物。所述组合物还可以含有配制剂，如混悬剂、稳定剂或分散剂。注射用配方可以采用单位剂型，多剂量容器中的安瓿，含或不含防腐剂。或者，所述组合物可以以粉末形式提供，用合适的溶剂复溶，包括但不限于无菌无热原水、生理盐水、缓冲液或葡萄糖溶液。

在其他方面，三维组织是冷冻保存制剂，其在使用前解冻。药学上可接受的冷冻保存制剂包括甘油、糖类、多元醇、甲基纤维素和二甲基亚砜等。糖类试剂包括单糖、二糖和其他寡糖，其最大冷冻浓缩液的玻璃化转变温度(Tg)至少为-60、-50、-40、-30、-20、-10或0℃。用于冷冻保存的示例性糖是海藻糖。

在一些方面，使用前对三维组织进行处理以杀死细胞。在一些方面，沉积在支架上的ECM可以被收集和处理以用于给药(见美国专利第5,830,708和6,280,284号，通过引用并入本文)。

在其他实施方案中，可以浓缩三维组织并用药学上可接受的介质清洗，用于给药。本领域有各种浓缩组合物的技术，如离心或过滤。示例包括葡聚糖沉降和差速离心。三维组织的配方还可以涉及将混悬液的离子强度调节至等渗性(即，约0.1至0.2)和生理pH值(即，pH 6.8至7.5)。配方还可以含有润滑剂或其他辅料，以帮助细胞悬液的给药或稳定性。这些包括糖类(例如，麦芽糖)和有机聚合物，如聚乙二醇和透明质酸。各种配方制备的其他详细信息见美国专利公开第2002/0038152号，其通过引用并入本文。

如上所讨论，根据ECM组合物的预期应用和合适输送或给药，本发明的ECM组合物可以以多种方式进行处理。例如，所述组合物可以作为三维支架或植入物输送，或者所述组合物可以按上述方法配制用于注射。术语“给药”或“施用”是指向需要治疗的受试者提供本发明的化合物或药物组合物的行为。本文使用的短语“肠外给药”和“肠外地施用”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射给药，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。本文使用的短语“全身给药”、“全身地施用”、“外周给药”和“外周地施用”是指除直接进入中枢神经系统外的化合物、药物或其他物质给药，使其进入受试者的系统，从而进行代谢和其他类似过程，例如皮下给药。

如本文所用，术语“受试者”是指对其执行受试者方法的任何个体或患者。一般而言，受试者是人类，但正如本领域技术人员所理解的，受试者可以是动物。因此，其他动物，如啮齿类动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、犬、兔、农场动物(包括奶牛、马、山羊、绵羊、猪等)和灵长类动物(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)均包含在受试者的定义中。

本发明的组合物具有多种应用，包括但不限于，促进受损细胞或组织的修复和/或再生；用于补片以促进组织再生，用于组织培养系统以培养细胞，如干细胞；用于与植入式器械(例如，起搏器、支架、支架移植物、血管假体、心脏瓣膜、分流器、药物递送端口或导管)联合使用的表面涂层；促进软组织修复、增强和/或改善皮肤表面(如皱纹)；用作生物防粘连剂或在递送部位作为细胞递送或维持的生物赋形剂。

此外，本文的任何方法中所述的来自培养细胞的ECM组合物可以用于本发明的任何其他应用或方法。例如，可以使用本发明的组织培养系统培养细胞所产生的ECM组合物可以用于，例如，细胞的修复和/或再生；用于补片以促进组织再生；在组织培养系统中用于培养细胞，如干细胞；用于与植入式器械(例如，起搏器、支架、支架移植物、血管假体、心脏瓣膜、分流器、药物输送端口或导管)联合使用的表面涂层；促进软组织修复、增强和/或改善皮肤表面(如皱纹)；用作生物防粘连剂或在输送部位作为细胞输送或维持的生物赋形剂。

在各种实施方案中，本发明包括用于细胞或组织的修复和/或再生以及促进软组织修复的方法。一个实施方案包括使本发明的ECM组合物接触待修复或再生的细胞来修复和/或再生细胞的方法。所述方法可以用于包括骨软骨细胞的如本文所讨论的多种细胞的修复和/或再生。

在一个方面，所述方法考虑了修复骨软骨缺损。如本文所用，“骨软骨细胞”是指属于成软骨或成骨谱系的细胞，或根据环境信号可以分化为成软骨或成骨谱系的细胞。这一潜力可以通过已知技术进行体外或体内的检测。因此，在一个方面，本发明的ECM组合物用于修复和/或再生软骨细胞，例如能够产生软骨的细胞或自身分化为产生软骨的细胞，包括软骨细胞和自身分化为软骨细胞的细胞(例如，软骨细胞前体细胞)。因此，在另一个方面，本发明的组合物可以用于修复和/或再生结缔组织。如本文所用，“结缔组织”是指哺乳动物体内的任何一种结构组织，包括但不限于骨、软骨、韧带、肌腱、半月板、真皮、皮下、肌肉、脂肪组织、关节囊。

本发明的ECM组合物可以用于治疗动关节的骨软骨缺损，如膝、踝、肘、髋、腕、手指或脚趾的关节或颞下颌关节。这类骨软骨缺损可以是创伤性损伤(例如，运动损伤或过度磨损)或疾病(如骨关节炎)的结果。具体方面涉及本发明基质在治疗或预防骨关节炎软骨浅表病变中的用途。此外，本发明还用于治疗或预防由衰老或分娩引起的骨软骨缺损。本发明背景下的骨软骨缺损也应理解为包含在手术背景下需要修复软骨和/或骨的情况，如但不限于整容手术(例如，鼻、耳)。因此，这类缺损可以发生在身体软骨或骨形成被破坏或由于遗传缺陷导致软骨或骨受损或不存在的任何部位。

如上所讨论，诱导或刺激特定细胞生长的生长因子或其他生物制剂可以包括在本发明的ECM组合物中。生长因子的类型将取决于细胞类型和预期的组合物的应用。例如，在骨软骨细胞的情况下，可以存在其他生物活性试剂，如细胞生长因子(例如，TGF-β)、刺激软骨形成的物质(例如，刺激软骨形成的BMP，如BMP-2、BMP-12和BMP-13)、刺激基质细胞迁移至支架的因子、刺激基质沉积的因子、抗炎药(例如，非甾体抗炎药)、免疫抑制剂(例如，环孢素)。也可以包括其他蛋白，如其他生长因子(如血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、人内皮细胞生长因子(ECGF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管内皮生长因子(VEGF)、软骨源性形态发生蛋白(CDMP))、其他骨形态发生蛋白(如OP-1、OP-2、BMP3、BMP4、BMP9、BMP11、BMP14、DPP、Vg-1、60A、Vgr-1)、胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维、糖蛋白或糖胺聚糖(如硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白)。例如，研究发现生长因子(如TGF-β)与抗坏血酸盐可以触发软骨细胞分化和软骨细胞形成软骨。此外，透明质酸是软骨细胞和其他基质细胞附着的良好基质，并且可以作为支架的一部分掺入或涂覆在支架上。

此外，还可以使用影响特定细胞生长和/或活性的其他因素。例如，在软骨细胞的情况下，可以在基质中加入刺激软骨细胞产生软骨的因子(软骨素酶)，以使软骨细胞保持肥大状态，如本文引用的美国专利申请第2002/0122790号中所述。在另一个方面，本发明的方法包括存在多硫酸盐藻酸盐或其他多硫酸盐多糖，如多硫酸盐环糊精和/或多硫酸盐菊粉，或其他能够刺激结缔组织细胞产生ECM的组合物，如国际专利公开WO2005/054446号所述，其通过引用并入本文。

可以通过本文所述的任何方法，在体内或体外接触待修复和/或再生的细胞或组织。例如，可以将ECM组合物注射或植入(例如，通过ECM组织、本发明的补片或涂层器械)到受试者体内。在另一个方面，可以从受试者体内采集待修复和/或再生的组织或细胞，并在体外培养，随后使用已知的手术技术植入或施用于受试者。

如上所讨论，本发明的ECM组合物可以以多种方式进行处理。因此，在一个实施方案中，本发明包括组织培养系统。在各个方面，所述培养系统由本文所述的ECM组合物构成。本发明的ECM组合物可以以多种方式整合到组织培养系统中。例如，组合物可以作为涂层，通过浸渍本文所述的三维支架材料，或作为培养细胞的培养基的添加剂。因此，在一个方面，所述培养系统可以包括浸渍本文所述的任何ECM组合物的三维支持材料，如生长因子或胚胎蛋白。

本文所述的ECM组合物可以作为各种细胞类型生长的支持或二维或三维支持。预期了任何能够进行细胞培养的细胞类型。在一个方面，所述培养系统可以用来支持干细胞的生长。在另一个方面，干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞。

所述组织培养系统可以用于产生附加的ECM组合物，如植入式组织。因此，可以在体内或体外使用本发明的组织培养系统进行细胞培养。例如，本发明的组织培养系统可以用于产生用于注射或植入受试者的ECM组合物。所述组织培养系统产生的ECM组合物可以在本文所述的任何方法中进行处理和使用。

本发明的ECM组合物可以用作细胞递送的生物赋形剂。如本文所述，所述ECM组合物可以包括可溶性和/或不可溶性组分。因此，在本发明的另一个实施方案中，描述了在递送部位处进行细胞递送或维持的生物赋形剂，包括本发明所述的ECM组合物。本发明的ECM组合物，包括细胞和三维组织组合物，可以用于促进和/或支持体内细胞的生长。赋形剂可以用于任何合适的应用，例如，支持将细胞(如干细胞)注射到受损的心肌或用于如上所述的肌腱和韧带修复。

在植入或施用ECM组合物之前、之后或期间，可以施用合适的细胞组合物(例如，本发明的分离ECM细胞和/或附加的生物制剂)。例如，在将培养系统或生物递送赋形剂植入受试者体内之前，可以将细胞接种到给药部位、缺损部位和/或植入部位。或者，可以在之后施用合适的细胞组合物(例如，通过注射到部位)。细胞在其中发挥作用，诱导组织再生和/或细胞修复。细胞可以通过任何允许将细胞施用到缺损部位的方式接种，例如通过注射。细胞注射可以是任何维持细胞活力的方式，如通过注射器或关节镜。

ECM组合物已被描述为通过施用这类组合物促进心脏和相关组织的内皮化和血管化来促进器官和组织的血管生成。因此，在又一个实施方案中，本发明包括与器械植入受试者相关的表面涂层，其包括本文所述的ECM组合物。涂层可以用于植入或穿透受试者的任何器械，如起搏器、支架、支架移植物、血管假体、心脏瓣膜、分流器、药物输送端口或导管。在某些方面，涂层可以用于改变伤口愈合、改变炎症、改变纤维囊形成、改变组织长入或改变细胞长入。在另一个实施方案中，本发明包括用于治疗受损组织，如心脏、肠、梗死或缺血组织。下面提供的示例讨论了预期用于这类应用的ECM组合物的生成。在正常氧条件下生长的ECM组合物的制备和用途在美国专利申请第2004/0219134号中进行了描述，其通过引用并入本文。

在另一个实施方案中，本发明包括各种植入式器械和组织再生补片，包括本文所述的ECM组合物，从而允许如组织长入的益处。如本文所讨论的，所述ECM组合物可以作为医疗器械上的涂层，如补片或其他植入式器械。在各个方面，这类器械适用于创伤修补、疝修补、盆底修补(如盆腔器官脱垂)、肩袖修补等。在相关方面，涂层可以用于骨科植入物、心血管植入物、尿道吊带和起搏器吊带。

例如，疝的基本表现是腹腔内容物突入筋膜内的缺损。疝修补的手术方法的关注点在于减少疝内容物进入腹膜腔，并通过使用假体、同种异体或自体材料牢固闭合筋膜缺损。已经使用了许多技术来得到这一闭合，但是，当前产品和手术的缺点包括疝复发，其中闭合再次减弱，允许腹腔内容物返回缺损。在疝修补术中，可以使用矫正组织再生补片，如涂有ECM组合物的生物可吸收或合成网。

在本领域中，已知有多种技术将生物涂层应用于可与本发明一起使用的医疗器械表面。例如，ECM组合物可以使用光活性交联剂来涂覆，允许在通过施加紫外线辐射激活交联剂后与器械表面永久共价键合。示例性的交联剂是TriLite^TM交联剂，已证明其无细胞毒性、对生物组织无刺激性且无致敏性。ECM材料在涂覆或并入各种植入式器械之前可以不分离或分离成单个成分，如人胶原蛋白、透明质酸(HA)、纤连蛋白等。进一步地，可以加入附加的生长因子，以实现有益的植入特性，如改善的细胞浸润。

在各种相关实施方案中，本发明提供了适用于化妆品/药妆应用的方法和器械，如但不限于，抗衰老、抗皱、皮肤填充剂、保湿剂、色素增强、皮肤紧致等。因此，在一个实施方案中，本发明包括一种改善受试者皮肤表面的方法，所述方法包括在皱纹部位将本文所述的ECM组合物施用于受试者。在相关实施方案中，本发明包括在受试者中进行软组织修复或增强的方法，所述方法包括在皱纹部位将本文所述的ECM组合物施用于受试者。在各种化妆品应用中，可以酌情配制所述组合物，如注射和局部用配方。如本文所含实施例中的进一步讨论，作为局部用药的ECM组合物已被证明在各种皮肤美学应用中有效，如抗皱、抗衰老应用以及辅助剥脱性激光手术。已经显示了含局部用药物的ECM的几个有益特征。这类益处包括：1)换肤后促进再上皮化；2)减轻非剥脱性和剥脱性点阵激光换肤症状(如红斑、水肿、结痂和感觉不适)；3)产生光滑、均匀的纹理皮肤；4)产生皮肤保湿；5)减少细纹/皱纹；6)增加皮肤紧实度和柔韧性；7)减少皮肤色素沉着异常；以及8)减少皮肤发红、斑点。

本发明的组合物可以如本领域已知的方法来制备，但是采用本文所述的创新培养方法(例如，在低氧条件下培养)。在正常氧培养条件下产生的ECM组合物的制备和用于修复和/或再生细胞、改善皮肤表面和软组织修复的用途在美国专利第5,830,708号、美国专利第6,284,284号、美国专利申请第2002/0019339号和美国专利申请第2002/0038152号中进行了描述，它们通过引用并入本文。

在另一个实施方案中，本发明包括一种生物防粘连剂，其包括本文所述的ECM组合物。所述试剂可以用于如创建肠或血管吻合后使用的防粘连补片等此类应用。

本文使用的组合物或活性成分通常将以有效的量来治疗或预防正在治疗的特定疾病。所述组合物可以以治疗性地施用以达到治疗获益，也可以预防性地施用以达到预防获益。治疗获益是指根除或改善正在治疗的基础疾病或病症。治疗获益还包括阻止或减缓疾病进展，无论是否实现改善。

施用的组合物数量将取决于多种因素，包括例如，组合物类型、接受治疗的特定适应症、给药方式、预期获益是预防性还是治疗性、接受治疗的适应症的严重程度、患者的年龄和体重以及剂型的有效性。有效剂量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内

最初可以根据体外试验估计初始剂量。还可以根据体内数据(如动物模型)估计初始剂量。用于检测组合物促进毛发生长有效性的动物模型包括啮齿类动物、灵长类动物和其他哺乳动物。本领域技术人员可以通过从体外和动物数据外推来确定适合人类给药的剂量。

除其他因素外，剂量取决于条件培养基的活性、给药方式、治疗的病况和以上讨论的各种因素。可以将剂量和给药间隔单独调整到提供足以维持治疗或预防作用的水平。

在一个实施方案中，本发明提供了包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9、CD63和/或CD81阳性胞外囊泡(ECV)。在一个方面，ECV通过以下生成：在1-5％氧气的低氧条件下，于合适生长培养基中在微载体珠或三维表面上培养成纤维细胞至少2周，从而产生多能干细胞(其产生并分泌ECV到培养基中)；并收集ECV。在附加的方面，Wnt蛋白是Wnt3a、Wnt7a和/或Wnt7b。在一些方面，从可溶性组分中收集ECV。在某些方面，ECV对CD63呈阳性。

如本文所用，术语“胞外囊泡”和“ECV”是可以互换的，并且是指含有蛋白的细胞来源的囊泡。外泌体是ECV的子集。本发明的ECV可以含有Wnt蛋白和/或卵泡抑素或卵泡抑素样蛋白(例如，具有卵泡抑素活性)、CD9、CD63和CD81。Wnt和卵泡抑素蛋白如前所述。CD9、CD63和CD81是外泌体的细胞表面标记物。

CD9是一种细胞表面糖蛋白，已知其与整合素和其他跨膜4超家族蛋白复合并存在于外泌体表面。CD9调节细胞粘附和迁移，还可以触发血小板活化和聚集，促进肌肉细胞融合并支持肌管维持。

CD63是跨膜4超家族的成员，也称为四跨膜蛋白家族。这些成员大多是细胞表面蛋白，其特征是存在四个疏水结构域。这些蛋白介导在细胞发育、活化、生长和运动的调节中发挥作用的信号转导事件。CD63是一种细胞表面糖蛋白，已知其可以与整合素复合。

CD81是跨膜4超家族的成员，并且是细胞表面蛋白，其特征是存在四个疏水结构域。这一家族中的蛋白介导在细胞发育、活化、生长和运动的调节中发挥作用的信号转导事件。CD81是一种细胞表面糖蛋白，已知其可以与整合素复合，促进肌肉细胞融合，支持肌管维持并可以参与信号转导。

如本文所用，术语“生物活性片段”是保留与全蛋白(例如，卵泡抑素或Wnt蛋白)相关的生物活性的蛋白片段。

如前所述，可溶性组分包括指培养基或条件培养基，其中细胞已被培养并且细胞已经分泌活性剂到其中，并且包括未沉积在支架上的那些蛋白和生物成分。在某些方面，ECV或外泌体从可溶性组分分离和/或收集。

在附加的实施方案中，本发明提供了一种产生至少包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白的ECV的方法，所述方法包含：在在1-5％氧气的低氧条件下，于合适生长培养基中在微载体珠或三维表面上培养成纤维细胞至少2周，从而产生多能干细胞，其中所述多能干细胞在培养基中产生并分泌ECV。在特定方面，Wnt蛋白是Wnt3a、7a和/或7b。

在进一步的实施方案中，本发明提供了包含CD9阳性ECV(包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段和载体)的组合物。在一个方面，所述载体是药学上可接受的载体。

“药学上可接受的”是指载体、稀释剂或辅料必须与配方的其他成分相容，而不会对其接受者有害。药学上可接受的载体、辅料或稳定剂在本领域是众所周知的，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。药学上可接受的载体、辅料或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒性，并可以包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，如钠；金属复合物(例如，Zn蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种刺激毛发生长的方法，所述方法包括将包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9阳性ECV施用于有此需要的受试者，从而刺激毛发生长。在某些方面，毛囊与ECV接触。在特定方面，毛囊在体内或离体接触。在其他方面，Wnt蛋白是Wnt3a、7a和/或7b。

术语“给药”或“施用”是指向需要治疗的受试者提供ECV化合物或药物组合物的行为。本文使用的短语“肠外给药”和“肠外地施用”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射给药，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。

与基线相比，ECV组合物给药后，通过测定毛囊数量、总毛发计数、总终毛计数和/或毛干厚度，测量毛发生长的刺激。

在附加的实施方案中，本发明提供了一种刺激皮肤更新和/或再生的方法，所述方法包含将包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9阳性ECV施用于有此需要的受试者，从而刺激皮肤更新和/或再生。在某些方面，给药是局部给药。在某些方面，Wnt蛋白是Wnt3a、7a和/或7b。

刺激皮肤更新和/或再生可以通过以下来确定：换肤后促进再上皮化；减轻非剥脱性和剥脱性点阵激光换肤症状(如红斑、水肿、结痂和感觉不适)；产生光滑、均匀的纹理皮肤；产生皮肤保湿；减少细纹/皱纹；增加皮肤紧实度和柔韧性；减少皮肤色素沉着异常和/或减少皮肤发红、斑点。

在进一步的实施方案中，本发明提供了包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9阳性ECV在制备刺激毛发生长药物中的用途。

在一个实施方案中，本发明提供了包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9阳性ECV在制备刺激皮肤更新和/或再生药物中的用途。

在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗需要修复组织的方法，所述方法包含将包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9阳性ECV施用于有此需要的受试者，从而修复所述组织。

在一个实施方案中，本发明提供了一种包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9阳性ECV，其中所述ECV是外泌体。在某些方面，Wnt蛋白是Wnt3a、7a和/或7b。

下面提供的实施例讨论了预期用于所讨论应用的ECM组合物的生成。提供以下实施例以进一步说明本发明的实施方案，但并不意在限制本发明的范围。虽然它们是可以使用的那些，但也可以使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。

实施例1

低氧条件下ECM组合物中的差异基因表达

原代人新生包皮成纤维细胞在组织培养瓶中作为标准单层细胞培养，并与自然沉积的胎儿样ECM内的三维成纤维细胞培养物进行比较。培养物的生长如本文所述。为评估基因的差异表达，按照生产商的方案，使用Agilent全人基因组寡核苷酸微

完成总RNA样品的全基因表达(包括少于40,000个基因)。

相比之下，成纤维细胞被发现在低氧培养的自然分泌的ECM中调节三维培养物中胶原和ECM基因的表达。表3中显示了各种胶原和ECM基因表达的上调和下调。

表3.低氧三维成纤维细胞培养物中胶原蛋白和ECM的差异表达

基因	增加倍数	减少倍数
			COL4A1	17.2
COL20A1	6.88
			COL19A1	5.22
COL9A1	4.81
			COL10A1	4.45
COL6A3	3.48
			COL9A2	2.48
COL14A1	2
			SPARC	2.74
COL1A2		3.45
			COL13A1		4
COL18A1		4.76
			COL1A2		7.14

相比之下，成纤维细胞被发现在低氧培养的自然分泌的ECM中调节三维培养物中Wnt通路基因的基因表达。表4中显示了各种Wnt通路基因表达的上调和下调。

表4.低氧三维成纤维细胞培养物中Wnt的差异表达

相比之下，成纤维细胞被发现在低氧培养的自然分泌的ECM中调节三维培养物中骨形态发生蛋白(BMP)通路基因的基因表达。表5中显示了各种BMP通路基因表达的上调和下调。

表5.低氧三维成纤维细胞培养物中BMP的差异表达

相比之下，成纤维细胞被发现在低氧培养的自然分泌的ECM中调节三维培养物中附加基因的表达。表6中显示了各种附加基因表达的上调和下调。结果表明，低氧培养条件导致低氧诱导因子(HIF 1A)的mRNA表达增加了14.78倍，其各自的抑制剂减少了4.9倍。这表明低氧培养的条件培养基正在经历低氧张力环境(低氧)，因为编码蛋白翻译的HIF 1A的信使RNA上调，并且其抑制剂下调。进一步地，低氧培养条件下VEGFB(增加4.33倍)、KGF(增加11.51倍)和IL-8(增加5.81倍)水平也上调。

表6.体内成纤维细胞ECM的低氧培养导致的附加基因的表达变化

干细胞相关基因表达

基因	增加倍数	减少倍数
			Oct4	5.1
Sox2	8.2
			NANOG	4.9
KLF4	21.0
			cMyc	7.1

实施例2

使用原代人新生儿包皮成纤维细胞产生低氧ECM提供了使用原代人新生儿包皮成纤维细胞进行ECM低氧培养的两个实施例。

在存在10％的胎牛血清、含2mM左旋谷氨酰胺的90％高葡萄糖DMEM(10％的FBS/DMEM)的组织培养瓶中扩增原代人新生包皮成纤维细胞。使用0.05％胰蛋白酶/EDTA溶液对细胞进行传代培养，直至第3次传代，此时将细胞接种至Cytodex-1葡聚糖珠(0.04mg干珠/ml的培养基)(5×10⁶个细胞/10mg珠，其在装有100-120ml的125ml转瓶中)或尼龙网(25×10⁶个细胞/6×100cm²尼龙)。所有培养物均放置在正常大气环境和5％的CO₂中进行扩增和接种，此时将低氧培养物分流至密闭腔室中，所述腔室用95％的氮气/5％的CO₂充满，以便在培养基内形成低氧环境。这一系统在培养容器内维持约1-5％的氧气。将细胞充分混合至覆盖用于接种的尼龙或珠所需的最小体积中，随后在30分后混合一次，然后在加湿的37℃培养箱中静置过夜。向培养物供给10％FBS/DMEM持续2-4周，每2-3天交换50-70％培养基一次，同时进行细胞增殖，然后开始沉积ECM。使用含铁补充剂的10％小牛血清和20μg/ml抗坏血酸代替FBS，再供给培养物4-6周。开始时以15-25rpm转速混合转瓶，持续约2-4周，此时将其增加至45rpm，此后保持这一转速。4周后珠培养物形成大的无定形结构，内含宽和直径高达0.5至1.0cm的ECM，由于气体扩散和高代谢需求，因此这些培养物是低氧的。

在附加的实施例，原代人新生包皮成纤维细胞在单层培养瓶中扩增，然后在尼龙网支架上培养，以支持体外ECM的发展。在含高葡萄糖、2mM的左旋谷氨酰胺和10％(v/v)胎牛血清的DMEM中扩增成纤维细胞。培养物还补充有20μg/ml的抗坏血酸。在环境氧气(约16％-20％氧气)中培养3周后，将两份含ECM的培养物转换至密闭腔室中的低氧培养条件(1％-5％氧气)，所述密闭腔室用95％的氮气/5％的二氧化碳彻底冲洗(产品目录号：#MC-101,Billups-Rothenberg公司，加利福尼亚州德尔马)。为了确保培养基中的大气氧气耗尽，2-3小时后更换大气，以确保培养基中含有约1-3％的氧气。两组含ECM的培养物每周两次供给再生长4周，然后制备培养物进行RNA分离。根据生产商的说明书，使用市售试剂盒分离细胞总RNA(产品目录号Z3100，Promega公司)。纯化的RNA样品储存在-80℃下，然后使用Agilent全人基因组寡核苷酸微

进行基因表达微阵列分析。

在分析结果时，使用Agilent全人基因组寡核苷酸微

与低氧培养物的探针相比，从环境氧气制备的探针中检测到约5500个差异表达转录本。其中约半数(2500例)由低氧升高大于2.0倍，约半数(2500例)在低氧下降低大于2.0倍。这表明低氧导致体外基因表达发生显著变化。特别令人感兴趣的是，ECM蛋白的转录本，特别是一些胶原蛋白基因发生了上调，而一些基质降解酶的基因发生了下调。

实施例3

用于治疗应用的组织工程人胚胎胞外基质

胚胎ECM创造了有利于细胞快速增殖和愈合的环境，而不形成瘢痕或粘连。假设在血管生成前模拟早期胚胎环境的条件下(低氧和重力降低)，人新生儿成纤维细胞在三维中的生长将产生具有胎儿特性的ECM。基因芯片阵列分析显示，相较于传统组织培养条件，低氧下超过5000个基因存在差异表达。产生的ECM与胎儿间充质组织相似，在于其相对富含Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白，和糖蛋白，如纤连蛋白、SPARC，血小板反应蛋白和透明质酸。由于ECM在假定龛中结合和呈递生长因子方面也起着重要的调节作用，而所述假定龛支持具有关键生长因子的再生干细胞群，因此我们评估了培养物的胎儿样ECM发育过程中低氧对生长因子表达的影响。低氧还可以增强调节伤口愈合和器官形成的因子的表达，如VEGF、FGF-7和TGF-β，以及包括wnts2b、4、7a、10a和11在内的多种wnts。通过使用MTT测定测量酶活性增加，胚胎人ECM也刺激体外人成纤维细胞代谢活性增加。此外，我们检测到响应于人ECM的细胞数量增加。这一人ECM可以在各种治疗应用中用作生物表面涂层和组织填充物治疗，其中新组织生长和愈合，无瘢痕或粘连。

实施例4

用于再生医学应用的天然可溶性WNT活性的产生

能够再生成人组织的干细胞或祖细胞，如皮肤或血液，在一定程度上概括了胚胎发育，以完成这一再生。越来越多的研究表明，在一些情况下，胚胎形成过程中活跃的干细胞多能性和谱系特异性分化的关键调节因子在成人中重新表达。分泌型形态发生的生长发育因子的WNT家族是可以为临床提供有价值的研究工具和最终治疗方法的生长因子之一。然而，迄今为止，Wnt已经在商业规模上被证明难以用于标准的重组表达和纯化技术，并且还没有大规模产生Wnt蛋白以实现基于Wnt的产品的临床开发的报道。已经开发了在培养物中使用新生人真皮成纤维细胞在各种支架上生长胎儿样ECM的技术，以生成三维组织等同物。在这一过程中，发现这些培养物可以提供用于ECM产生的无血清条件培养基中所含生物活性WNT的商业规模来源。在此，我们提供了这一WNT候选产品的数据。

细胞的基因表达分析证明至少有3个WNT基因表达(wnt5a、wnt7a和wnt11)，也表达少量与wnt信号传导相关的基因；但其功能尚不完全清楚。将基因表达数据扩展至wnt信号传导(原代人表皮角质形成细胞中β-连环蛋白的核转位)的体外生物测定，并评价造血干细胞上的wnt活性。两种测定均显示活性与典型wnt活性一致。更进一步地，这些培养物的条件培养基在注射到小鼠皮肤时表现出wnt活性，诱导毛囊干细胞进入生长期，从而引起毛发生长。这表明在确定的无血清条件培养基内稳定的WNT活性不需要纯化。这一产品可以用于毛囊再生，并作为各种人类干细胞培养的一种有价值的研究工具。

实施例5

低氧成纤维细胞显示独特的ECM产生和生长因子表达

人新生真皮成纤维细胞在体外培养时产生ECM，与真皮非常相似，并且在伤口愈合等再生医学应用中可以替代受损的真皮。由于伤口愈合过程也概括了胚胎发育，通过模拟胚胎环境，我们假设产生的ECM将为组织再生应用提供增强的ECM。因此，人新生成纤维细胞来源的ECM在低氧条件下培养，以模拟血管生成前早期胚胎中存在的低氧。目的是在培养的组织发育过程中使用低氧条件产生具有胎儿特性的ECM。

这些低氧培养物中产生的ECM与胎儿间充质组织相似，在于相对富含Ⅲ和Ⅴ型胶原蛋白，和糖蛋白，如纤连蛋白、SPARC，血小板反应蛋白和透明质酸。由于ECM在假定龛中结合和呈递生长因子方面也起着重要的调节作用，而所述假定龛支持具有关键生长因子的再生干细胞群，因此我们评估了培养的胎儿样ECM发育过程中低氧对生长因子表达的影响。表明低氧还可以增强调节伤口愈合和器官形成的因子，如VEGF、FGF-7和TGF-β的表达。

如通过MTT测定测量酶活性增加，人ECM还刺激体外人成纤维细胞代谢活性增加。此外，检测到响应于人ECM的细胞数量增加。这些结果支持在胚胎细胞培养中这一人ECM作为涂层/支架的用途，并在各种治疗应用或医疗器械中作为生物表面涂层/填料的用途。

实施例6

人胞外基质(hECM)涂覆的生物医学材料

据报道，ECM可以创建有利于细胞快速增殖和愈合的环境，而不会形成瘢痕或粘连。使用本文所述的方法，通过在低氧和特定重力下培养新生成纤维细胞产生独特的胚胎样人ECM(hECM)。结果包括：将hECM置于绒毛尿囊膜上时的血管生成，以及将hECM涂覆在尼龙网上并植入SCID小鼠皮下区域侧腹位置时的炎性细胞迁移减少。基于这些结果，假设在聚丙烯网上涂覆我们的hECM将不正当地减少SCID小鼠皮下区域材料-生物界面的炎性细胞迁移和纤维包囊形成。

使用人源材料(hECM)生成的ECM组合物使用光活性交联剂涂覆在丙烯网上。通过UV共价键合机制(Innovative Surface Technologies(ISurTec)TriLite^TM交联剂)将hECM涂覆在6mm活检打孔聚丙烯上。使用E-Beam^TM(BeamOne LLC E-BEAM^TM)或环氧乙烷(ETO)对聚丙烯的有涂层和无涂层的hECM 6mm活检打孔器进行灭菌(由ETO Flagstaff MedicalCenter描述)。然后，将每个6mm聚丙烯圆盘分成两个对称的半圆形插入物。最后，使用无菌技术在皮下区域的侧腹位置双侧置入聚丙烯植入物。在两周和五周终点时取出样品进行组织学检查。

hECM涂覆聚丙烯网的抗纤连蛋白免疫荧光染色显示，与无涂覆网相比，ECM材料结合并在网纤维上形成均匀涂层。HECM涂覆网适用于医疗应用的植入式补片，如疝修补和盆底修补。如通过纤连蛋白抗体的免疫荧光染色显示，显示ECM材料涂覆网的单个纤维允许改善细胞长入。

将hECM植入鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)，刺激微血管反应，表现为新的微血管生长。此外，将hECM涂覆尼龙网皮下植入小鼠体内四周，与无涂覆尼龙网相比，生物相容性得到改善。具体而言，使用hECM涂覆的尼龙纤维时观察到较少的炎性细胞和较薄的纤维囊。

在植入hECM涂覆聚丙烯网后两周和五周时，使用苏木精和伊红染色样品进行生物相容性评价。对于FBGC分析，对样品进行盲法编码，使用形态测量学进行评价，分组，进行统计学评价，然后解码。检查异物巨细胞(FBGC)的数量。与无涂覆网相比，hECM涂覆聚丙烯网的FBGC明显减少。在两周时间点，确定无涂覆聚丙烯(9.20+/-2.03)每个样品的平均FBGC计数在统计学上高于hECM涂覆聚丙烯(4.53+/-0.89)(ANOVA bonferroni事后分析p<0.05)。在五周时间点，确定无涂覆聚丙烯(10.95+/-2.15)的每个样品的平均FBGC计数高于hECM涂覆聚丙烯(8.17+/-1.41)，但不具有统计学显著性。

结果表明，hECM涂覆聚丙烯可以减少纤维囊。在两周和五周时间点使用三色染色样品评价纤维包囊。对于囊分析，对样品进行盲态编码，使用形态测量学进行评价，分组，进行统计学评价，然后解码。在两周时间点，确定hECM涂覆聚丙烯(23.70+/-2.70μM)的平均纤维囊厚度在统计学上并不高于(ANOVA bonferroni事后分析p<0.05)无涂覆聚丙烯(19.70+/-3.00μM)。在五周时间点，hECM涂覆聚丙烯和无涂覆聚丙烯的平均纤维囊厚度分别为(10.40+/-1.10μM)和(12.30+/-1.20μM)。同样，hECM涂覆与无涂覆聚丙烯的差异被确定为无统计学意义。然而，当评价二至五周时间点纤维包裹的平均百分比差异时，发现了一个重要的观察结果。从两周至五周时间点，hECM无涂覆聚丙烯的纤维包囊平均减少37.6％，而hECM涂覆聚丙烯的纤维包囊平均减少56.1％。

FBGC形成的机制是巨噬细胞融合对植入式生物材料(如聚丙烯)的免疫反应的结果。这些大的多核细胞为定量评估对植入式生物材料的炎症反应提供了有效手段。在两周时间点观察到使用人ECM涂覆较非涂覆聚丙烯的每个样品的FBGC计数显著降低。这一数据表明，人ECM表面涂层可以用作各种植入式器械的应用。

历史上，植入式器械的有效性和寿命受到特定免疫反应的挑战，包括FBGC和纤维囊形成。具体而言，FBGC可以排泄降解剂(如超氧化物和自由基)，以及其他降解剂挑战了器械有效性和寿命。这些负面影响尤其显著，因为已知FBGC在植入物存在的持续时间内保持紧挨植入物。纤维囊形成是植入物周围的一种牢固的血管胶原蛋白包囊，旨在将外来植入物与宿主或宿主组织隔离。这一反应不仅可能在一些情况下引起患者不适，还可能缩短器械存活时间，甚至降低器械有效性。因此，减少FBGC和纤维包囊的涂层是植入式器械寿命和功能的非常理想的结果。

发现，在聚丙烯上涂覆hECM将减少FBGC的存在，并且材料-生物界面纤维包囊的潜在减少支持了进一步实验的需要。未来的评价可以包括更长时间的时间点，以观察hECM涂覆和无涂覆生物材料的纤维包囊厚度变化。此外，在各种体内环境中使用包括涤纶、尼龙、不锈钢和钛在内的连续生物材料进行评价，可以阐明进一步理想的hECM涂覆生物材料结果。

实施例7

胞外基质组合物在刺激毛发生长中的用途

这一实施例说明了通过施用ECM组合物刺激毛发生长。

获得人毛囊细胞和毛囊中得到的细胞，以测定本文所述ECM组合物刺激和维持毛发形成能力的能力。毛囊细胞获自Alderans Research International。在存在ECM的情况下培养细胞。培养四周和八周时的细胞分析显示类似毛囊的结构以及类似毛干的结构。连续培养两个月后，细胞仍存活并生长。

在ECM组合物存在的情况下，将培养四周的细胞移植到小鼠体内。移植四周后，如使用显微图像分析观察到的，与仅有正常数量的小休止毛囊的对照细胞相比，培养的人毛囊形成了许多大毛囊。

基于这些发现，使用人类受试者进行了体内毛发生长试验，以确定新生毛囊毛发再生。研究纳入了24例年龄在18至45岁之间的男性型脱发(MPHL)患者。研究组的所有成员既往均未接受过侵入性或微创局部头皮手术或Minoxidil^TM或Finasteride^TM局部治疗。使用了Palomar Starluz 550p激光(1540非剥脱性和2940剥脱性)。研究持续时间设计为长达12个月，用于随访、基线和5个月(单次皮下注射后)。注射后，观察了3天洗脱期，并且受试者在整个研究期间仅使用Cetaphil^TM洗发水。注射前结合使用激光和微晶换肤术。

受试者接受与hECM混合的赋形剂，所述hECM被确定具有wnt蛋白活性，并包括与对照赋形剂和生理盐水共同经皮给药的wnt7a。研究的终点包括7点临床分级系统(3名盲法毛发移植外科医生)、临床宏观摄影术(毛囊计数)、2mm钻取活检和受试者自我评估问卷。

分析了受试者的个体毛囊单位。在12周时对毛囊进行计数，并与研究开始时观察到的同一个体的基线进行比较。在接受hECM给药的受试者中观察到毛囊单位增加而无干扰。例如，在一例受试者中，治疗使得12周表观毛囊数量从基线217增加至265。受试者的毛发计数从307增加至360，总体增加约20％。在其他受试者中观察到以下毛囊计数增加：受试者009(基线毛发计数179，12周毛发计数193，5个月毛发计数201)；受试者013(基线毛发计数266.5，12周毛发计数267，5个月毛发计数294)；受试者024(基线毛发计数335.5，12周毛发计数415，5个月毛发计数433)。进一步地，研究中接受hECM给药的13例患者中，有12例(92.3％)在12周时显示疗效。在3个月时测定附加的毛发生长测量值。

在整个研究期间，分析了其他毛发参数。在12周和20周时，与基线(0周)相比分析了相对毛发计数，与基线相比分析了终毛，和与基线相比分析了毛发厚度。例如，在一例受试者中，与基线相比，治疗12周时毛发计数、终毛和毛囊厚度分别增加22.4％、27.8％和23.9％。在另一例受试者中，与基线相比，治疗12周时毛发计数、终毛和毛囊厚度分别增加了23.7％、24.2％和22.2％。在受试者009中(基线毛发计数为179，12周毛发计数为193，5个月毛发计数为201，如上所述)，与基线相比，治疗12周时毛发计数、终毛和毛囊厚度分别增加了7.8％、48.5％和19.2％；第20周时分别增加了12.9％、33.0％和21.1％。在受试者013(基线毛发计数为266.5，12周毛发计数为267，5个月毛发计数为294，如上所述)中，与基线相比，治疗12周时毛发计数、终毛和毛囊厚度分别增加了0.2％、25.0％和8.3％；20周时分别增加了10.3％、41.4％和23.0％。在受试者024(基线毛发计数335.5、12周毛发计数415、5个月毛发计数433，如上所述)中，与基线相比，治疗12周时毛发计数、终毛和毛囊厚度分别增加了23.7％、24.2％和22.2％；20周时分别增加了29.1％、5.9％和17.3％。

值得注意的是，治疗的研究成员在3个月时显示终毛数量显著增加且厚度密度增加(84.6％的患者)。此外，未观察到不良反应，观察到组织学正常，未观察到错构瘤。

结果指出了hECM在其他应用中的用途，如预防移植后患者脱发以及用于眉毛和睫毛生长。在毛发移植患者中，已知毛发会脱落，通常需要4-5个月才能恢复，因此，hECM治疗将预防移植后这类个体的毛发脱落。

实施例8

人胞外基质组合物(hECM)的生成

使用新生人成纤维细胞生成人ECM组合物。将成纤维细胞接种到用液体培养基预处理的珠状结构上。在不需要胎牛血清的情况下优化培养条件。在几天内，在本文所述的胚胎培养条件下，细胞产生了致密的胚胎样ECM。观察到Wnt家族蛋白，以及几种生长因子的分泌。

培养物生长至融汇。随后将培养物暴露于无菌水中，以诱导细胞均匀裂解。然后清洗脱细胞hECM，以确保除去所有活细胞和细胞碎片，并进行显微镜检查，以确认除去细胞碎片。接下来，将人成纤维细胞暴露于涂覆有hECM的培养瓶或铺板于未处理的培养瓶中，然后用一层厚基质覆盖。表7显示了hECM中鉴定的ECM蛋白。

表7.hECM中观察到的胞外基质蛋白

观察到hECM诱导细胞代谢活性增加，如使用MTT测定测量的酶活性增加。与小鼠ECM不同，如通过MTT测定测量，人ECM诱导细胞代谢活性呈剂量依赖性增加。观察到细胞快速均匀地浸润hECM覆盖材料。此外，如通过Pico Green测定测量，hECM诱导的细胞数量呈剂量依赖性增加。

已知的涂层、可注射和植入式基质产品通常是牛胶原蛋白、来源于肠或膀胱的猪基质蛋白、透明质酸或来源于尸体皮肤的人ECM。虽然这些产品可以通过创造一个生理上更等效的环境来提供获益，但没有一种是完全人的并含有在年轻、发育中的组织中发现的整个范围的基质蛋白。产生的hECM含有与年轻健康组织相同的ECM材料。还观察到其支持人细胞的主动增殖以及细胞的快速长入。在涉及人受试者的应用中使用hECM有几个明显的优势。例如，hECM促进宿主细胞快速整合和改善愈合(作为宿主细胞的正常支架和随后的重塑)。此外，hECM消除了对非人动物和人组织(尤其是牛组织的BSE和人组织的TSE)病毒传播的担忧。进一步地，与生物制品相比，观察到hECM的产品组合物和性能一致，尤其是人真皮和阔筋膜。此外，与合成植入物相比，hECM减少了宿主组织的侵蚀。

实施例9

用于医学美学应用的人成纤维细胞源低氧条件的胞外基质

进行了面部剥脱性激光手术后局部hECM给药的双盲、随机研究。研究纳入了41例年龄在40-60岁之间的受试者。研究组的所有成员在过去12个月内均未接受过既往侵入性或微创手术或局部抗衰老治疗。激光手术包括全点阵剥脱性激光手术、眼周、口周和全脸。使用了Palomar Starluz 550p激光(1540非剥脱性和2940剥脱性)。受试者每日一次接受局部hECM组合物(不同浓度)或安慰剂赋形剂给药，持续14天。研究的终点包括临床摄影(3名盲法评价-皮肤科医生)、经表皮水分流失(TEWL)、钻取活检以及红斑、水肿和结痂评价。

与赋形剂对照相比，10倍浓度的hECM组合物在症状方面提供了最多的临床改善(由两名美容皮肤科医生“盲法”进行评价，与任何临床研究的进行无关)。照片评价还表明，在第3、7和14天，一些患者的红斑严重程度降低。

还在激光治疗后3、7和14天评价了所有41例受试者的经表皮水分流失(TEWL)值。与赋形剂对照组相比，在第3天和第7天观察到10倍浓度的hECM组合物改善了角质层屏障功能。与赋形剂对照相比，在第7天，hECM组合物具有统计学显著性(p<0.05)。这一观察结果与以下事实相一致，即在剥脱性点阵激光治疗后第7天，有受试者出现再上皮化。

还进行了局部hECM给药抗衰老(例如，减少皱纹)的双盲、随机研究。研究纳入了26例年龄在40-65岁之间的受试者。研究组的所有成员在过去12个月内均未接受过既往侵入性或微创手术或局部抗衰老治疗。受试者每日两次接受局部hECM组合物或安慰剂赋形剂给药，持续10周。研究的终点包括临床摄影(2名盲法美容皮肤科医生)、角膜曲率计-表面水合作用、皮肤弹性测定仪-弹性、钻取活检、分子评价(表皮遗传信息检索(EGIR))。

面部区域的照片评价表明，hECM给药10周后，产生较轻的色素沉着、较平滑的皮肤纹理、色调更均匀的皮肤，且细皱纹和线条外观减少。

还对26名受试者中的22名进行了眼周区域硅复制品的三维轮廓测量图像分析。为进行分析，使准直光源与复制品平面成25°角。将复制品置于固定复制品标签位置方向的支架中，以便可以旋转复制品使标签方向与入射光方向垂直或平行。从邻近每只眼睛的鱼尾纹区域采集复制品，标签方向指向耳朵。垂直采样方向提供了对大的表达诱导线(鱼尾纹)敏感的纹理测量。平行采样方向提供了对细线敏感的纹理测量。

进行了面部剥脱性激光手术后局部hECM给药的双盲、随机研究。研究纳入了49例年龄在40-60岁之间的受试者。研究组的所有成员在过去12个月内均未接受过既往侵入性或微创手术或局部抗衰老治疗。激光手术包括全点阵剥脱性激光手术、眼周、口周和全脸。使用了Palomar Starluz 550p激光(1540-非剥脱性和2940剥脱性)。受试者每日两次接受局部hECM组合物或安慰剂赋形剂给药，持续14天。研究的终点包括临床摄影(3名盲法评价-皮肤科医生)、皮肤黑色素和血红素测试仪(mexameter)和受试者评估。

术后第1、3、5、7和14天面部区域的照片评价显示，与安慰剂相比，每个时间点的红斑明显减少。

术后评估凡士林的使用天数

研究结果表明，含局部用药物的hECM具有几个有益的特征。这类益处包括：1)换肤后促进再上皮化；2)减轻非剥脱性和剥脱性点阵激光换肤症状(例如，红斑、水肿、结痂和感觉不适)；3)产生光滑、均匀的纹理皮肤；4)产生皮肤保湿；5)减少细纹/皱纹；6)增加皮肤紧实度和柔韧性；7)减少皮肤色素沉着异常；以及8)减少皮肤发红、斑点。

实施例10

从条件培养基的可溶性组分分离ECV

当在刺激早期胚胎环境的条件下培养时，如实施例2所述，成纤维细胞，如人皮肤成纤维细胞(HDF)或原代新生成纤维细胞，产生了包含可溶性组分和不可溶性组分的组合物。可溶性组分为条件培养基。发现，CCM是ECV的来源。在此介绍了从CCM中分离和表征ECV。

按照实施例2所述制备条件培养基(CCM)。简言之，在存在10％胎牛血清、含2mM的左旋谷氨酰胺的90％高葡萄糖DMEM(10％的FBS/DMEM)的组织培养瓶中扩增人原代新生包皮成纤维细胞或人真皮成纤维细胞。使用0.05％胰蛋白酶/EDTA溶液对细胞进行传代培养，直至第3次传代，此时将细胞接种至Cytodex-1葡聚糖珠(0.04mg干珠/ml的培养基)(5×10⁶个细胞/10mg珠，其在装有100-120ml的125ml转瓶中)或尼龙网(25×10⁶个细胞/6×100cm²尼龙)。所有培养物均保持在正常大气环境和5％CO₂中进行扩增和接种，此时将低氧培养物分流至密闭腔室中，所述腔室用95％的氮气/5％的CO₂充满，以便在培养基内形成低氧环境。这一系统在培养容器内维持约1-5％的氧气。将细胞充分混合至覆盖用于接种的尼龙或珠所需的最小体积中，随后在30分后混合一次，然后在加湿的37℃培养箱中静置过夜。向培养物供给10％FBS/DMEM持续2-4周，每2-3天交换50-70％培养基一次，同时细胞增殖，然后开始沉积ECM。使用含铁补充剂的10％小牛血清和20μg/ml抗坏血酸代替FBS，再供给培养物4-6周。开始时以15-25rpm转速混合转瓶，持续约2-4周，此时将其增加至45rpm，此后保持这一转速。这一方法产生了包含可溶性CCM组分和不可溶性组分的组合物。

然后从CCM中分离ECV。最初通过在3,000x g下离心15分钟，从细胞和细胞碎片中预清除条件培养基样品。使用Original ExoQuick^TM(Systems BioScience公司(SBI))。如图1所示，在4℃下过夜孵育期间，用1ml的Original Exo Quick^TM溶液沉淀5ml的条件培养基，同时保持试管直立，无搅拌或旋转。以3,000x g离心30分钟，期间分离ECV(图1)。除去所有痕量液体，将ECV沉淀重悬于PBS中。

实施例11

分离的ECV的定量和表征

使用NanoSight^TM对分离的ECV进行纳米颗粒分析，以提供尺寸分布曲线，评价颗粒总数和每毫升颗粒的浓度，并可视化液体混悬液中的纳米颗粒。数据见图3A-B。

为了测定蛋白浓度，用200μl冰冷RIPA蛋白提取缓冲液(含新鲜加入的蛋白酶抑制剂混合物)处理ECV沉淀。按照生产商说明书，采用BCA测定(BCA蛋白检测试剂盒，PierceTM)确定外泌体中蛋白的总浓度。如图4所示，四个样品的蛋白浓度(工程批次，临床批次4.20.11、生产批次和工程+BCS4.10.12)。

BCA蛋白测定测量值纳米颗粒分析结合，用于测定各样品的颗粒/蛋白比，如图3A所示。

通过蛋白免疫印迹和免疫荧光分析检测CD9证实各提取物中ECV的存在。使用抗CD9抗体，进行蛋白免疫印迹分析后，对ECV样品进行了SDS-PAGE(SantaCruz sc-9148)(图2)。使用在各种条件(无血清培养基、RPMI、EPIL、毛乳头细胞(DPC)和毛发刺激复合物(HSC))下培养的HDF细胞进行CD9的免疫荧光检测。结果表明，培养条件可以调节细胞的ECV含量。

通过ELISA检测CD63的表达也验证了ECV的存在。使用ExoElisa Complete Kit(CD63检测)(SBI EXOEL-CD63A)对样品进行ELISA。结果证明了存在。

实施例12

ECV组合物的评价

通过蛋白免疫印迹分析检测在约1-5％的低氧条件下培养的HDF产生的可溶性CCM来源的人ECV组合物的特异性蛋白组合物。使用抗Wnt3a抗体(Santa Cruz#26358)、抗Wnt7a抗体(Santa Cruz#26361-P)和抗Wnt7b抗体(Santa Cruz#sc-26363)进行的蛋白免疫印迹分析，证明ECV中存在Wnt-3a，不存在Wnt7a和Wnt7b(图5A-C)。这一数据表明Wnt 3a分泌到CCM中，而Wnt-3a也被储存或包含并释放到ECV中。

评价ECV样品中卵泡抑素(FST)和卵泡抑素相关蛋白-1(FSTL1)蛋白的表达和活性。对ECV样品进行SDS PAGE，然后进行蛋白免疫印迹分析，以确定是否存在FST(R&DSystems AF669)和FSTL1(R&D Systems#1694)。结果表明，FST水平较低。然后对ECV样品进行基于细胞的FST活性测定。首先，将用激活素稀释至不同浓度的供试品(FST标准品或HSC)在96孔组织培养板中于37℃下孵育1小时，然后加入浓度为5000个细胞/孔的K562细胞。将细胞孵育4天，此时使用生化技术测量细胞中的血红蛋白量。由于存在含FST或FST的HSC，可以观察到与激活素抑制活性量直接相关的剂量-反应关系。K562细胞产生的血红蛋白减少表明ECV样品中存在FST活性(图6)。

尽管已经参考上述实施例对发明进行了描述，但是可以理解的是，修改和变更包含在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅受以下权利要求的限制。

Claims (12)

1.一种包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白或其生物活性片段的CD9、CD63和/或CD81阳性胞外囊泡(ECV)。

2.如权利要求1所述的ECV，其中所述ECV通过以下产生：在1-5％氧气的低氧条件下，于合适生长培养基中在微载体珠或三维表面上培养成纤维细胞至少2周，从而产生多能干细胞，所述多能干细胞产生并分泌ECV到所述培养基中；并收集所述ECV。

3.如权利要求1所述的ECV，其中所述Wnt蛋白选自Wnt3a、Wnt7a和/或Wnt7b。

4.一种产生至少包含Wnt和/或卵泡抑素蛋白的ECV的方法，所述方法包含：在1-5％氧气的低氧条件下，于合适生长培养基中在微载体珠或三维表面上培养成纤维细胞至少2周，从而产生多能干细胞，其中所述多能干细胞在所述培养基中产生并分泌胞外囊泡。

5.一种包含如权利要求1所述的胞外囊泡和载体的组合物。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述载体是药学上可接受的载体。

7.一种刺激毛发生长的方法，所述方法包含将如权利要求1所述的ECV施用于有此需要的受试者，从而刺激毛发生长。

8.一种刺激皮肤更新和/或再生的方法，所述方法包含将如权利要求1所述的ECV施用于有此需要的受试者，从而刺激皮肤更新和/或再生。

9.如权利要求1所述的ECV在制备刺激毛发生长药物中的用途。

10.如权利要求1所述的ECV在制备刺激皮肤更新和/或再生药物中的用途。

11.一种治疗需要修复组织的方法，所述方法包含将如权利要求1所述的ECV施用于有此需要的受试者，从而修复所述组织。

12.如权利要求1所述的ECV，其中所述ECV是外泌体。

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