CN113881627A - 一种提高细胞外泌体产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及外泌体提取技术领域，公开了一种提高外泌体产量的方法，包括步骤一、在培养皿上接种间充质干细胞(MSC)或其他干细胞，细胞密度达到70％～80％以上后，通过胰酶将间充质干细胞从培养皿上分离；步骤二、加入细胞培养基中和胰酶，用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)或者细胞培养基清洗培养皿；步骤三、将间充质干细胞或其他干细胞种植于清洗过的培养皿，收取培养基中的上清用于提取外泌体。本发明使用这种含有细胞自己分泌的ECM的培养皿或者培养瓶，在这种3D培养环境下细胞的粘附和生长速度得到提高，外泌体的产量提高；本发明不需要额外购置ECM蛋白或者Matrigel，也不需要对培养皿进行包被处理，简单有效，且降低了成本。

Description

一种提高细胞外泌体产量的方法
技术领域
本发明涉及外泌体提取技术领域，具体涉及一种提高外泌体产量的方法。
背景技术
机体内的细胞通常处于三维(3D)环境中,细胞被细胞外基质、细胞骨架蛋白等包围并结合在一起。在塑料皿里培养细胞为二维(2D)单细胞层。在传统2D塑料培养皿中培养的细胞会失去其原有的组织结构，极性以及相互作用，而且相比体内模型往往会改变细胞的代谢、表型以及基因表达。有文献报道间充质干细胞在2D和3D培养时，其分化不一样。很多研究还表明正常组织细胞以及癌细胞在传统2D塑料培养皿中培养会失去其原有的组织结构与表现，相比体内细胞往往会进行代谢、表型和基因表达的改变，这些改变会影响到癌细胞的发展和功能因为细胞形状在培养皿表面上是伸展的,所以在诱导过度分化的塑料培养皿和细胞之间存在强相互作用。因此在塑料基板上进行的单细胞层体外实验可能无法准确表达细胞的体内行为，并且生长速度也不一样。建立在这些理论基础上，Emerman、Elsdale以及Weaver等人提出可以利用再造细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)以构成网架结构并支持和连接组织结构来构建体外3D细胞培养模型。
3D细胞培养定义为细胞、一些生长因子和再造基质蛋白以及骨架共培养，以模仿体内细胞生长环境的特性。通过模仿体内环境的特性，并利用传统的细胞培养研究工具，3D细胞培养提供了独特的视角来观察干细胞的行为、组织器官和肿瘤的发展过程。因为3D细胞培养可以利用传统的2D细胞培养研究工具，并模拟体内状态提供细胞生长支架，综合了2D细胞培养和动物模型的优点。3D细胞培养可以模拟细胞生长的微环境，模拟体内细胞和细胞基质的相互作用，准确反映细胞和间质之间作用的机理。同时，3D细胞模型营造出的细胞微环境也更适合于诱导出细胞的极性，这对组织和其产品的直接分泌是很重要的，特别是外泌体的产生。
可以运用到3D细胞培养模型中的细胞外基质蛋白包括很多种，比如:Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白以及层粘连蛋白。Ⅰ型胶原蛋白一般是从大鼠尾中分离得到，所以也常被称为鼠尾胶，用于软骨细胞、骨细胞的三维培养，血管形成试验等。针对不同类型的细胞需选择相应的细胞外基质以达到体外3D细胞培养的最佳状态。Hynda等人在1983年，从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肉瘤组织中提取到一种基底膜基质，其主要成分由层Ⅳ型胶原，粘连蛋白，硫酸肝素糖蛋白，巢蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等，此外基质后来被命名为Matrigel。Matrigel可促进多种细胞分化，比如上皮细胞、Sertoli细胞、肝细胞、血管内皮细胞、黑色素瘤细胞等。同时，Matrigel还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达，支持外周神经的新生和牛输卵管上皮细胞的分化，高浓度的Matrigel适用于研究体内血管生成和肿瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等。但是Matrigel毕竟来源于小鼠的肿瘤组织，不仅价格昂贵、量少并且制备过程复杂，还存在使用不方便等问题(温度变化易成胶)。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种提高外泌体产量的方法。
为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高外泌体产量的方法，包括以下步骤：
步骤一、在培养皿上接种间充质干细胞(MSC)或其他细胞，细胞密度达到70％～80％以上后，通过胰酶将间充质干细胞从培养皿上分离；
步骤二、加入细胞培养基中和胰酶，用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)或者细胞培养基清洗培养皿；
步骤三、将间充质干细胞或其他干细胞种植于清洗过的培养皿，收取培养基中的上清用于提取外泌体。
进一步地，步骤三中，外泌体的提取方法为：1)600g离心20分钟4℃取上清；2)1600g离心15分钟4℃取上清；3)3260g离心15分钟4℃取上清；4)1000g离心30分钟4℃取上清；5)100000g离心70分钟4℃取沉淀，将沉淀中的外泌体重悬于磷酸盐缓冲盐溶液中。
进一步地，步骤三中，将种植了干细胞的培养皿于CO2培养箱中培养，每两天换一次培养基。
优选的，所述步骤一中，在培养皿上接种0.5～2.7×104个/cm2MSC或其他细胞。
优选的，所述步骤一中，采用质量浓度0.25％的胰酶将MSC从塑料培养瓶上分离。
优选的，所述培养皿为塑料培养皿。
进一步地，所述其他细胞为脐带血造血干细胞、脂肪来源干细胞或成纤维细胞。
进一步地，所述步骤二中，细胞培养基为含有5％胎牛血清的细胞培养基。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)细胞培养过程细胞会自己分泌ECM，故培养皿上会有细胞分泌的ECM。本发明使用这种含有细胞自己分泌的ECM的培养皿或者培养瓶，在这种3D培养环境下细胞的粘附和生长速度得到提高，外泌体的产量提高。
(2)本发明不需要额外购置ECM蛋白或者Matrigel，也不需要对培养皿进行包被处理，简单有效，且降低了成本。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1外泌体粒径分布图；
图2为对比实施例1外泌体粒径分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种提高外泌体产量的方法，包括以下步骤：
步骤一、在75cm2塑料培养皿上接种1.0～2.0×106MSC或其他细胞(如脐带血干细胞，脂肪来源干细胞，成纤维细胞)，细胞密度达到70-80％以上后，将3-5mL 0.25％的胰酶将MSC从塑料培养瓶上分离；
步骤二、加入5mL细胞培养基中和胰酶，再用5mL PBS或者细胞培养基轻轻清洗塑料培养皿；
步骤三、将MSC等干细胞种植于清洗过的培养皿，于CO2培养箱中培养，每两天换一次培养基，收取培养基中的上清用于提取外泌体。
ECM组外泌体的提取方法为：1)600g 20分钟4℃取上清；2)1600g 15分钟4℃取上清；3)3260g 15分钟4℃取上清；4)1000g30分钟4℃取上清；5)100000g 70分钟4℃取沉淀，将沉淀中的外泌体重悬于PBS中。
对比实施例1
对比实施例采用全新未用过的细胞培养皿种植同样数量的MSC或者其他细胞(如脐带血干细胞，脂肪来源干细胞，成纤维细胞)，同样的培养方法，使用同样体积的培养基以及上清用于外泌体的提取。
步骤一、在75cm2塑料培养皿上接种1.0～2.0×106MSC或其他干细胞，细胞密度达到70-80％以上后，吸取上清用于外泌体的提取，再将3-5mL 0.25％的胰酶将MSC从塑料培养瓶上分离；
步骤二、将MSC等干细胞种植于全新未用过的细胞培养皿，于CO2培养箱中培养，每两天换一次培养基，收取培养基中的上清用于提取外泌体。
外泌体的提取方法为：1)600g 20分钟4℃取上清；2)1600g15分钟4℃取上清；3)3260g 15分钟4℃取上清；4)1000g 30分钟4℃取上清；5)100000g 70分钟4℃取沉淀，将沉淀中的外泌体重悬于PBS中。
通过纳米流式细胞仪，检测外泌体产量和大小，如图1和2所示，实施例1中平均粒径为66.4±10.4nm，浓度为3.88×1012个/mL，对照组平均粒径为69.5±11.2nm，浓度为1.43×1012个/mL。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (8)

1.一种提高外泌体产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、在培养皿上接种间充质干细胞或其他细胞，细胞密度达到70％～80％以上后，通过胰酶将间充质干细胞从培养皿上分离；
步骤二、加入细胞培养基中和胰酶，用磷酸盐缓冲盐溶液或者细胞培养基清洗培养皿；
步骤三、将间充质干细胞或其他干细胞种植于清洗过的培养皿，收取培养基中的上清用于提取外泌体。
2.根据权利要求1所述提高外泌体产量的方法，其特征在于，步骤三中，外泌体的提取方法为：1)600g离心20分钟4℃取上清；2)1600g离心15分钟4℃取上清；3)3260g离心15分钟4℃取上清；4)1000g离心30分钟4℃取上清；5)100000g离心70分钟4℃取沉淀，将沉淀中的外泌体重悬于磷酸盐缓冲盐溶液中。
3.根据权利要求1或2所述提高外泌体产量的方法，其特征在于，步骤三中，将种植了干细胞的培养皿于CO2培养箱中培养，每两天换一次培养基。
4.根据权利要求1所述提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述步骤一中，在培养皿上接种0.5～2.7×104个/cm2MSC或其他细胞。
5.根据权利要求1所述提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述步骤一中，采用质量浓度0.25％的胰酶将MSC从塑料培养瓶上分离。
6.根据权利要求1所述提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述培养皿为塑料培养皿。
7.根据权利要求1～6任一项所述提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述其他细胞为脐带血造血干细胞、脂肪来源干细胞或成纤维细胞。
8.根据权利要求1所述提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述步骤二中，细胞培养基为含有5％胎牛血清的细胞培养基。
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