CN109652377B - 一种肺癌干细胞的制备方法及应用 - Google Patents

一种肺癌干细胞的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种肺癌干细胞的制备方法及应用。该肺癌干细胞的制备方法为：步骤1)：配制含羧甲基纤维素钠的无血清DMEM/F12培养基A；其中，培养基A中羧甲基纤维素钠和无血清DMEM/F12培养基的质量体积比为0.25％以下；步骤2)：用培养基A把肺癌细胞制成单细胞悬液A，再向单细胞悬液A中加入维持肺癌干细胞干性的物质,得到混合液，将混合液在3D细胞培养条件下培养7天以上即可；或将维持肺癌干细胞干性的物质加到上述培养基A中，得到培养基B,用培养基B把肺癌细胞制成单细胞悬液B，再将单细胞悬液B在3D细胞培养条件下培养7天以上即可。本发明制备方法简单，高效稳定，肺癌干细胞干性高。

Description

一种肺癌干细胞的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种肺癌干细胞的制备方法及应用。
背景技术
肺癌干细胞对肺癌的存活、增殖、转移及复发有着重要作用。肺癌干细胞通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞的生命力，肺癌干细胞的运动和迁徙能促使肿瘤细胞的转移，肺癌干细胞可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的药物不敏感。肺癌干细胞已成为当前肿瘤研究的热点。通过培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。肺癌干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代的重要地位。
肺癌干细胞的体外培养方法一般为肺癌细胞系或者是临床肺癌组织联合采用机械和胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得到肺癌干细胞。
将肺癌细胞系或者是临床肺癌组织进行体外培养，并加入细胞因子联合培养以防止其分化，这种培养方法在贴壁培养的条件下所得的肺癌干细胞占有比例小，在肺癌组织中肺癌干细胞占有的比例就更少。用3D胶(Basement Membrane Extract(BME)，fibrinogen， I collagen，Marigel胶)培养的方法能提高肺癌细胞的干性，在体外可以培养出肺癌干细胞，但是培养完成之后需要用分离酶把细胞从3D胶中洗脱，分离酶的使用对细胞是一种伤害，对肺癌细胞的干性也有影响，最终会导致实验结果的不稳定。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种高效稳定，细胞干性高且制备方法简单的肺癌干细胞制备方法，并提供了该肺癌干细胞的应用方法。
为了实现本发明的技术效果，采用了以下技术方案予以实现：
一种肺癌干细胞的制备方法，其制备方法为：
步骤1)：配制含羧甲基纤维素钠的无血清DMEM/F12培养基A；其中，培养基A中羧甲基纤维素钠和无血清DMEM/F12培养基的质量体积比为0.25％以下；
步骤2)：包括步骤A或步骤B；
步骤A为:用培养基A把肺癌细胞制成单细胞悬液A，再向单细胞悬液A中加入维持肺癌干细胞干性的物质,得到混合液，将混合液在3D细胞培养条件下培养7天以上即可；
步骤B)为:将维持肺癌干细胞干性的物质加到上述培养基A中，得到培养基B,用培养基B 把肺癌细胞制成单细胞悬液B，再将单细胞悬液B在3D细胞培养条件下培养7天以上即可。
作为进一步的改进，培养基A中羧甲基纤维素钠和无血清DMEM/F12培养基的质量体积比为0.125％-0.25％。
作为进一步的改进，步骤2)中的培养是在超低粘附装置上培养的；培养时间为7-21 天。
作为进一步的改进，所述肺癌细胞来自于含有肺癌细胞的肺癌细胞系或者肺癌组织。
作为进一步的改进，所述单细胞悬液A中肺癌细胞的浓度为(104-105)个肺癌细胞/毫升，即每毫升单细胞悬液A中含有肺癌细胞(104-105)个；所述单细胞悬液B中肺癌细胞的浓度为(104-105)个肺癌细胞/毫升，即每毫升单细胞悬液B中含有肺癌细胞(104-105)个。
作为进一步的改进，所述维持肺癌干细胞干性的物质为EGF(表皮生长因子)和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)及B27(一种人工合成的血清替代物)的混合物。
作为进一步的改进，步骤A)向单细胞悬液A中加入维持肺癌干细胞干性的物质时，B27 的体积与单细胞悬液A的体积比为1：50；混合液中EGF的浓度为20ng/mL，bFGF浓度为20ng/mL；步骤B中，将维持肺癌干细胞干性的物质加到上述培养基A中时，B27的体积与培养基A的体积比为1：50；培养基B中EGF的浓度为为20ng/mL；bFGF的浓度为20ng/mL。
作为进一步的改进，所述步骤2)中的培养是在37℃，5％CO2饱和湿度的条件下进行体外培养的。
作为进一步的改进，步骤2)培养7天以上后，还进行了离心操作得到干细胞的步骤。
本发明还提供了上述所述的肺癌干细胞的应用，其应用方法为：当需要使用药物对肺癌干细胞进行干预时，在步骤1)的含羧甲基纤维素钠的无血清DMEM/F12培养基中还加入了所述药物；当需要对肺癌干细胞进行基因操作时，先将肺癌细胞在2D细胞培养培养条件下操作完成，再进行步骤1)的步骤。
该应用方法简单，使用方便。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明采用羧甲基纤维素钠诱导肺癌细胞转变为肺癌干细胞，最少只需要7天时间，就可以使肺癌细胞的干性大幅度的提升，满足使用的需要。
2)由于在培养过程中，不需要使用3D胶等物质，当然就不需要用分离酶把细胞从胶中洗脱，直接离心就可以获得肺癌干细胞，不仅不会伤害细胞，而且不会影响干细胞的干性，进而得到的肺癌干细胞稳定(得到的数量和质量等都稳定)，重复100次以上，每次得到的肺癌干细胞的干性等指标都能满足使用的需求，且质量稳定。
3)本发明制备方法最快只需要7天，就可以得到干性比较好的肺癌干细胞，加快了产生肺癌干细胞速度，提高了效率。
附图说明
图1是不同培养条件下，CD133，CD44，ALDH的表达情况；
图2是用imageJ软件测得的灰度值情况。
具体实施方式
实施例1
一种肺癌干细胞的制备方法，其制备方法为：
步骤1)：配制含羧甲基纤维素钠的无血清DMEM/F12培养基A；其中，培养基A中羧甲基纤维素钠和无血清DMEM/F12培养基的质量体积比为0.25％以下；即羧甲基纤维素钠的质量和无血清DMEM/F12培养基的体积比为0.25％以下，例如，无血清DMEM/F12培养基的体积为100mL；羧甲基纤维素钠的质量为0.25g以下。
步骤2)：用培养基A把肺癌细胞制成单细胞悬液A，再向单细胞悬液A中加入维持肺癌干细胞干性的物质,得到混合液，将混合液在3D细胞培养条件下培养7天以上即可；
步骤2)中的培养是在3D细胞培养条件下培养的。3D细胞培养条件是在超低粘附装置(可以是超低粘附培养板，超低粘附培养板可以购买自北京冬歌博业生物科技有限公司或BD Biosciences(San Jose，CA，USA)公司)上培养的。无血清DMEM/F12培养基可以购买是市场中，例如，购买自Gibco BRL(Grand Island,NY,USA)公司。3D细胞培养条件，一般用的是超低粘附培养板培养。3D细胞培养是能在细胞培养过程中为细胞提供一个更加接近体内生存条件的微环境的培养技术，是使细胞呈三维立体生长的培养。
优选地，步骤2)中的培养是在超低粘附装置上培养的；培养时间为7-21天。7-21天都可以得到理想的肺癌干细胞。例如7天、14天、20天等，最好为7天，培养时间更短，有利于节省时间。
优选地，所述肺癌细胞来自于含有肺癌细胞的肺癌细胞系或者肺癌组织。
优选地，所述单细胞悬液A中肺癌细胞的浓度为(104-105)个肺癌细胞/毫升。这也是细胞培养的基本方法。最好选择，105个肺癌细胞/毫升。
优选地，所述维持肺癌干细胞干性的物质为EGF和bFGF及B27的混合物。维持肺癌干细胞干性的物质EGF、bFGF和B27的混合物可以购买自Gibco BRL(Grand Island,NY,USA)公司。
优选地，向单细胞悬液A中加入维持肺癌干细胞干性的物质时，B27的体积与单细胞悬液A的体积比为1：50；混合液中EGF的浓度为20ng/mL，bFGF浓度为20ng/mL。
优选地，所述步骤2)中的培养是在37℃，5％CO2饱和湿度的条件下进行体外培养的。即培养箱中培养温度为37℃；培养箱中(二氧化碳)CO2体积百分比浓度5％；培养箱中的空气湿度为饱和湿度。
优选地，步骤2)培养7天以上(一般就培养7天)后，还进行了离心操作得到干细胞的步骤。离心即可得到肺癌干细胞，不仅制备方法简单，而且由于没有使用3D胶，不需要使用分离酶，进而不会伤害细胞，也不会影响细胞的干性。
实施例2
一种肺癌干细胞的制备方法，其制备方法为：
步骤1)：配制含羧甲基纤维素钠的无血清DMEM/F12培养基A；其中，培养基A中羧甲基纤维素钠和无血清DMEM/F12培养基的质量体积比为0.25％以下；即羧甲基纤维素钠的质量和无血清DMEM/F12培养基的体积比为0.25％以下，例如，无血清DMEM/F12培养基的体积为100mL；羧甲基纤维素钠的质量为0.25g以下。
步骤2)：将维持肺癌干细胞干性的物质加到上述培养基A中，得到培养基B,用培养基B 把肺癌细胞制成单细胞悬液B，再将单细胞悬液B在3D细胞培养条件下培养7天以上即可。
优选地，步骤2)中的培养是在超低粘附装置上培养的；培养时间为7-21天。最好为7 天，在满足肺癌干细胞干性和稳定性要求的情况下，更加节省时间。
优选地，所述肺癌细胞来自于含有肺癌细胞的肺癌细胞系或者肺癌组织。
优选地，所述单细胞悬液B中肺癌细胞的浓度为(104-105)个肺癌细胞/毫升。一般为 105个肺癌细胞/毫升。
优选地，所述维持肺癌干细胞干性的物质为EGF和bFGF及B27的混合物。
优选地，将维持肺癌干细胞干性的物质加到上述培养基A中时，B27的体积与培养基A 的体积比为1：50；培养基B中EGF的浓度为20ng/mL；bFGF的浓度为20ng/mL。
优选地，所述步骤2)中的培养是在37℃，5％CO2饱和湿度的条件下进行体外培养的。
优选地，步骤2)培养7天以上后，还进行了离心操作得到干细胞的步骤。
CD133，CD44，ALDH是检测细胞干性的指标，我们采用蛋白质印迹法即WesternBlot 方法来检测CD133，CD44，ALDH在肺癌细胞的表达情况，CD133，CD44，ALDH的表达越高，说明肺癌细胞的干性越高，借此来测定肺癌细胞的干性水平，并用imageJ软件测定CD133，CD44，ALDH表达的灰度值，来定量表达情况，灰度值越高，表达越高，干性越高，数据如图1和图2，表1是图2的具体数据。
将实施例1或实施例2的制备方法得到肺癌干细胞，测定其在2D培养条件(不加CMC)、 3D培养条件(不加CMC)、3D培养条件(加CMC浓度为0.065％)、3D培养条件(加CMC浓度为0.125％)、3D培养条件(加CMC浓度为0.25％)、3D培养条件(加CMC浓度为0.75％)、 3D培养条件(加CMC浓度为1％)下，用CD133，CD44，ALDH的灰度值，来反映肺癌细胞的干性，测试结果具体见图1。用imageJ软件测灰度值数据如表1和图2。CD133，CD44，ALDH 的灰度值越高，说明肺癌干细胞的干性越高。其中，CMC浓度是羧甲基纤维素钠和无血清DMEM/F12培养基的质量体积比。2D培养条件即2D细胞培养条件；3D培养条件即3D细胞培养条件。用实施例1或实施例2得到肺癌干细胞测定的结果相同。
表1 CD133、CD44和ALDH灰度值数据
测定指标 2D 3D 3D+0.065％CMC 3D+0.125％CMC 3D+0.25％CMC 3D+0.75％CMC 3D+1％CMC
CD133 1 2.6 5.4 5.8 4.8 0.8 1.1
CD44 1 3.6 3.8 3.2 9.5 3.5 3.3
ALDH 1 1.2 1.4 2.8 3 3 2.4
注：2D培养条件是细胞在塑料培养皿的表面培养生长；3D培养条件细胞是在超低粘附板培养生长。
从图1、图2和表1总可以看出，当加入CMC以后，CD133，CD44，ALDH的灰度值都得到了较大的提高，即细胞的干性得到了较大的提高，当培养基A中羧甲基纤维素钠和无血清DMEM/F12培养基的质量体积比为0.125％-0.25％时，灰度值更好，肺癌干细胞的干性大幅度提高，能够满足使用的需要。
在应用时，当需要使用药物对肺癌干细胞进行干预时，在步骤1)的培养基中还加入了所述药物；当需要对肺癌干细胞进行基因操作时，先将肺癌细胞在2D培养条件下操作完成，再进行步骤1)的步骤。步骤简单，使用方便。
以上所述者，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能以此限定本发明实施之范围，即大凡依本发明权利要求及发明说明书所记载的内容所作出简单的等效变化与修饰，皆仍属本发明权利要求所涵盖范围之内。此外，摘要部分和标题仅是用来辅助专利文件搜寻之用，并非用来限制本发明之权利范围。

Claims (7)

1.一种肺癌干细胞的制备方法，其特征在于，其制备方法为：
步骤1)：配制羧甲基纤维素钠的无血清DMEM/F12培养基A；其中，培养基A中羧甲基纤维素钠和无血清DMEM/F12培养基的质量体积比为0.125％-0.25％；
步骤2)：包括步骤A或步骤B；
步骤A为:用培养基A把肺癌细胞制成单细胞悬液A，再向单细胞悬液A中加入维持肺癌干细胞干性的物质,得到混合液，将混合液在3D细胞培养条件下培养7天以上即可；
步骤B为:将维持肺癌干细胞干性的物质加到上述培养基A中，得到培养基B,用培养基B把肺癌细胞制成单细胞悬液B，再将单细胞悬液B在3D细胞培养条件下培养7天以上即可；所述肺癌细胞来自于含有肺癌细胞的肺癌细胞系或者肺癌组织；所述维持肺癌干细胞干性的物质为EGF和bFGF及B27的混合物。
2.如权利要求1所述的肺癌干细胞的制备方法，其特征在于，步骤2)中的培养是在超低粘附装置上培养的；培养时间为7-21天。
3.如权利要求1所述的肺癌干细胞的制备方法，其特征在于，所述单细胞悬液A中肺癌细胞的浓度为(104-105)个肺癌细胞/毫升；所述单细胞悬液B中肺癌细胞的浓度为(104-105)个肺癌细胞/毫升。
4.如权利要求1所述的肺癌干细胞的制备方法，其特征在于，步骤A向单细胞悬液A中加入维持肺癌干细胞干性的物质时，B27的体积与单细胞悬液A的体积比为1：50；混合液中EGF的浓度为20ng/mL，bFGF浓度为20ng/mL；步骤B中，将维持肺癌干细胞干性的物质加到上述培养基A中时，B27的体积与培养基A的体积比为1：50；培养基B中EGF的浓度为20ng/mL；bFGF的浓度为20ng/mL。
5.如权利要求1所述的肺癌干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的培养是在37℃，5％CO2饱和湿度的条件下进行体外培养的。
6.如权利要求1所述的肺癌干细胞的制备方法，其特征在于，步骤2)培养7天以上后，还进行了离心操作得到干细胞的步骤。
7.一种对权利要求1-5任意一项所述的肺癌干细胞进行药物干预或基因操作的方法，其特征在于，其方法为：当需要使用药物对肺癌干细胞进行干预时，在步骤1)的含羧甲基纤维素钠的无血清DMEM/F12培养基中还加入了所述药物；当需要对肺癌干细胞进行基因操作时，先将肺癌细胞在2D细胞培养条件下操作完成，再进行步骤1)的步骤。
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小细胞肺癌细胞系H446肿瘤细胞球培养方法的优化;王正岩等;《天津医药》;20110131;第39卷(第01期);第59-61页 *

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