CN117448268B - 牙髓间充质干细胞的无血清培养基及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种牙髓间充质干细胞的无血清培养基及其培养方法，涉及干细胞技术领域，该牙髓间充质干细胞的无血清培养基包括DMEM/F12无血清培养基、碱性成纤维细胞生长因子、链霉素、青霉素、维生素溶液、地塞米松、表皮细胞生长因子、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、血小板衍生因子PDGF、L‑谷氨酰胺、多聚赖氨酸、NEAA、亚硒酸钠和水；该牙髓间充质干细胞的培养方法：培养条件为37℃、5%CO2、接种密度为5000～10000个/cm2、培养时间为72±24h、收获融合度为80‑90%；本申请提供的无血清培养基不含胎牛血清FBS，降低了细胞污染概率，对牙髓间充质干细胞的扩增起到了促进作用；可实现大规模快速的培养出牙髓间充质干细胞，能使细胞活率更高，表型更稳定。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞领域技术，尤其是指一种牙髓间充质干细胞的无血清培养基及其培养方法。
背景技术
牙髓间充质干细胞来源于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织细胞。近年来，通过各项研究表明，牙髓间充质干细胞与骨髓间充质干细胞的免疫表型及细胞形态等极其相似，牙髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化的能力，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同因子的诱导，还能分化成为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。
目前，无血清牙髓间充质干细胞的大规模培养还存在着不少难题，牙髓间充质干细胞相比于脐带间充质干细胞等其它类型的干细胞更难扩增，目前的牙髓间充质干细胞的培养基通常是在脐带间充质干细胞培养基的基础上调节各营养物质而配成，不能针对性的提高牙髓间充质干细胞的扩增效果。在各类关于牙髓间充质干细胞的研究中表明，牙髓间充质干细胞培养离不开各类氨基酸及维生素，因此该发明选用了适合哺乳动物细胞生长的含丰富氨基酸成分的DMEM/F12培养基。由于牙齿长期处于非无菌环境中，在获取牙髓组织时牙髓组织极易受到污染，为降低牙髓间充质干细胞的污染概率，该发明在培养基中添加了少量的抑菌物质——链-青霉素；在专利CN113481155A发明的骨髓间充质干细胞培养基中，研究表明地塞米松的加入可促进骨髓间充质干细胞的扩增，地塞米松也被称为泼尼松，是具有糖皮质激素作用的肾上腺皮质激素剂。在骨髓和牙髓间充质干细胞培养中，地塞米松是一种常用的添加剂，可以影响细胞的信号传递途径，从而提高干细胞的存活率和生长速度。地塞米松还可以抑制牙髓间充质干细胞成骨分化；在专利CN108795855A和专利CN114807028A及专利CN113481155A中，同时添加了碱性成纤维细胞生长因子、维生素溶液、表皮细胞生长因子、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、L-谷氨酰胺等物质给牙髓间充质干细胞提供营养，其中表皮生长因子（EGF)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)是维持细胞体外培养生存、增殖和分化所必需的补充因子。生长因子是有效的促有丝分裂原，能缩短细胞群体倍增时间；重组人胰岛素是一种多肽，它能与细胞上的胰岛素受体结合形成复合物，促进RNA 、蛋白质和脂肪酸的合成，是重要的细胞存活因子；重组人转铁蛋白的作用在于受体与转铁蛋白与铁离子的复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源；L-谷氨酰胺作为能源及碳源物质能同时被细胞利用，是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡；维生素是维持细胞生长的一类生物活性物质，对细胞代谢有重大作用。牙髓间充质干细胞有了这些营养物质使细胞数量得到了有效的扩增。
目前常规的牙髓间充质干细胞培养基大多数以ɑ-men培养基、DMEM培养基或DMEM/F12培养基为基础培养基，另外添加FBS及其它生长因子来实现牙髓间充质干细胞的大规模培养，但FBS是属于动物源性物质，成分较为复杂，在临床应用上具有潜在的风险，也增加了细胞污染的概率，因此提供一种无动物源性、成分简单、组分确定、细胞增殖速率高的牙髓间充质干细胞无血清培养基以降低牙髓间充质干细胞的临床应用风险，并提高牙髓间充质干细胞的增殖效率显得尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明针对现有技术存在之缺失，其主要目的是提供一种牙髓间充质干细胞的无血清培养基及其培养方法，其通过采用本申请提供的无血清培养基及其培养方法培养出的牙髓间充质干细胞的细胞质量稳定且得率高，利于牙髓间充质干细胞的培养应用。
为实现上述目的，本发明采用如下之技术方案：
一种牙髓间充质干细胞的无血清培养基，包括如下组分：体积浓度为90%-98%的DMEM/F12无血清培养基、60-70ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、40-60μg/mL的链霉素、40-60IU/mL的青霉素、0.5-1.5%v/v的维生素溶液、5-15nM的地塞米松、10-20ng/mL的表皮细胞生长因子、10-20μg/mL的重组人胰岛素、2-8μg/mL的重组人转铁蛋白、5-15ng/mL的血小板衍生因子PDGF、1-5mML-谷氨酰胺、15-30ng/mL的多聚赖氨酸、0.5-1.5%v/v的NEAA、0.3-1ng/mL的亚硒酸钠和2-4%v/v水。
作为一种优选方案：所述无血清培养基包括95%DMEM/F12无血清培养基、65ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、50μg/mL链霉素、50IU/mL青霉素、1%v/v维生素溶液、10nM地塞米松、15ng/mL表皮细胞生长因子、15μg/mL重组人胰岛素、5μg/mL重组人转铁蛋白、10ng/mL血小板衍生因子PDGF、3mML-谷氨酰胺、20ng/mL多聚赖氨酸、1%v/v NEAA、0.5ng/mL亚硒酸钠和2.99%v/v水。
作为一种优选方案：所述DMEM/F12无血清培养基由DMEM培养基和F12培养基按照体积比为1:1混合而成。
作为一种优选方案：所述无血清培养基的制备方法包括如下步骤：
第一、将除DMEM/F12无血清培养基以外的组分按比例混合，制得营养添加组剂；
第二、将混合均匀的营养添加组剂经滤膜进行过滤；
第三、将过滤后的营养添加组剂加入至DMEM/F12无血清培养基中混合均匀得到无血清培养基。
一种牙髓间充质干细胞的培养方法，采用所述的牙髓间充质干细胞的无血清培养基；包括如下步骤：取新鲜或冻存复苏的P1代牙髓间充质干细胞制成细胞悬液进行计数，按计数结果根据所需种瓶密度计算出相应的细胞重悬体积，按重悬体积取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞接种于含牙髓间充质干细胞无血清培养基的培养瓶中，将接种好的细胞培养瓶置于37℃、5%CO2的CO2培养箱中培养；细胞融合度达到80-90%时进行细胞收获。
作为一种优选方案：所述牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞与含牙髓间充质干细胞无血清培养基的体积比为1:21。
作为一种优选方案：所述细胞收获的具体步骤为：将细胞培养瓶取出，用生理盐水清洗细胞表面，吸取掉生理盐水后加入6mL/T175瓶的胰酶消化液消化4min，后加入6mL/T175瓶培养上清终止消化；终止消化后细胞悬液用细胞滤网过滤，取过滤后的细胞悬液取样计数并检测细胞活率及细胞表型，剩余细胞离心后作冻存处理。
作为一种优选方案：所述取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞接种于含牙髓间充质干细胞无血清培养基的培养瓶中时的接种密度为5000-10000个/cm2。
作为一种优选方案：所述取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞接种于含牙髓间充质干细胞无血清培养基的培养瓶中时的接种密度为9000个/cm2。
作为一种优选方案：所述P1代牙髓间充质干细胞的培养时间为72±24h，于72±24h中观察细胞融合度至80-90%时进行细胞收获；该胰酶消化液的浓度为0.125%。
本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，由上述技术方案可知，通过采用本申请提供的牙髓间充质干细胞的无血清培养基及其培养方法，所培养的牙髓间充质干细胞的增殖能力较强；与常规的大规模牙髓间充质干细胞培养的方法相比，采用本申请培养方法培养出的细胞，细胞活率达90%以上，细胞表型（CD105、CD90、CD73、CD45、CD34）稳定且满足要求；本申请对于干细胞的规模化生产具有较高的价值，有利于推广应用；采用本申请提供的牙髓间充质干细胞无血清培养基培养出的细胞与含10%FBS培养基培养出的细胞每项检测结果均达到检测要求，其中牙髓间充质干细胞采用无血清培养基培养出的细胞内毒素检测结果略小于含10%FBS培养基培养出的细胞；本申请提供的牙髓间充质干细胞无血清培养基培养出的细胞安全性更高。
为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。
附图说明
图1为本发明之细胞成长曲线图；
图2为本发明之实施例3中无血清培养基示意图；
图3为本发明之实施例3含10%FBS培养基示意图；
图4为本发明之实施例4无血清培养基示意图；
图5为本发明之实施例4含10%FBS培养基示意图。
具体实施方式
本发明如图1至图 5 所示，一种牙髓间充质干细胞的无血清培养基，包括如下组分：体积浓度为90%-98%的DMEM/F12无血清培养基、60-70ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、40-60μg/mL的链霉素、40-60IU/mL的青霉素、0.5-1.5%v/v的维生素溶液、5-15nM的地塞米松、10-20ng/mL的表皮细胞生长因子、10-20μg/mL的重组人胰岛素、2-8μg/mL的重组人转铁蛋白、5-15ng/mL的血小板衍生因子PDGF、1-5mML-谷氨酰胺、15-30ng/mL的多聚赖氨酸、0.5-1.5%v/v的NEAA（非必需氨基酸溶液）、0.3-1ng/mL的亚硒酸钠和2-4%v/v水。
该无血清培养基包括95%DMEM/F12无血清培养基、65ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、50μg/mL链霉素、50IU/mL青霉素、1%v/v维生素溶液、10nM地塞米松、15ng/mL表皮细胞生长因子、15μg/mL重组人胰岛素、5μg/mL重组人转铁蛋白、10ng/mL血小板衍生因子PDGF、3mML-谷氨酰胺、20ng/mL多聚赖氨酸、1%v/v NEAA、0.5ng/mL亚硒酸钠和2.99%v/v水。
该DMEM/F12无血清培养基由DMEM培养基和F12培养基按照体积比为1:1混合而成。
本申请的牙髓间充质干细胞的无血清培养基是双组剂配方，其中第一组剂是基础培养基组剂,包括DMEM/F12无血清培养基:第二组剂是营养添加组剂,包括除基础培养基以外的的其他组分。
该双组剂在储存时分开各自保存,在使用前再混合均匀,配制后需置于2～8℃冰箱内保存，有效期为14天。
在一些实施方案中,该双组剂在储存时分开各自保存，其中基础培养基组剂在2～8℃的温度条件下保存,营养添加组剂在-18至-22℃；营养添加组剂使用前需在37℃的水浴锅或2～8℃冰箱内解冻。
该无血清培养基的制备方法包括如下步骤：
第一、将除DMEM/F12无血清培养基以外的组分按比例混合，制得营养添加组剂；
第二、将混合均匀的营养添加组剂经0.22μm的滤膜进行过滤；
第三、将过滤后的营养添加组剂加入至DMEM/F12无血清培养基中混合均匀得到无血清培养基。
一种牙髓间充质干细胞的培养方法，采用牙髓间充质干细胞的无血清培养基；包括如下步骤：取新鲜或冻存复苏的P1代牙髓间充质干细胞制成细胞悬液进行计数，按计数结果根据所需种瓶密度计算出相应的细胞重悬体积，按重悬体积取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞接种于含牙髓间充质干细胞无血清培养基的培养瓶中，将接种好的细胞培养瓶置于37℃、5%CO2的CO2培养箱中培养；细胞融合度达到80-90%时进行细胞收获。
该牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞与含牙髓间充质干细胞无血清培养基的体积比为1:21。
该细胞收获的具体步骤为：将细胞培养瓶取出，用生理盐水清洗细胞表面，吸取掉生理盐水后加入6mL/T175瓶的胰酶消化液消化4min，后加入6mL/T175瓶培养上清终止消化；终止消化后细胞悬液用细胞滤网过滤，取过滤后的细胞悬液取样计数并检测细胞活率及细胞表型，剩余细胞离心后作冻存处理。
该取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞接种于含牙髓间充质干细胞无血清培养基的培养瓶中时的接种密度为5000-10000个/cm2。
该取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞接种于含牙髓间充质干细胞无血清培养基的培养瓶中时的接种密度为9000个/cm2。
该P1代牙髓间充质干细胞的培养时间为72±24h，于72±24h中观察细胞融合度至80-90%时进行细胞收获；该胰酶消化液的浓度为0.125%。
实施例1：该无血清培养基包括95%DMEM/F12无血清培养基、65ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、50μg/mL链霉素、50IU/mL青霉素、1%v/v维生素溶液、10nM地塞米松、15ng/mL表皮细胞生长因子、15μg/mL重组人胰岛素、5μg/mL重组人转铁蛋白、10ng/mL血小板衍生因子PDGF、3mML-谷氨酰胺、20ng/mL多聚赖氨酸、1%v/v NEAA、0.5ng/mL亚硒酸钠和2.99%v/v水。
该牙髓间充质干细胞的培养方法，包括如下步骤：将P1代牙髓间充质干细胞进行计数检测后，按要求分到20份不同细胞数量的离心管内，每个离心管按不同范围的种瓶密度分成4组，每组细胞分5个平行实验，每个平行实验种瓶密度各不相同但均在各自的种瓶密度范围内。分好后各自标记，将细胞按300g、10min的离心参数进行离心，弃去离心完成后的上清。取1mL无血清培养基重悬细胞，将细胞悬液加入含有21mL无血清培养基的T175培养瓶中混匀铺平。将细胞培养瓶放入CO2培养箱中培养；培养72±24h后，观察细胞达到80%～90%时进行细胞收获。将收获后的细胞进行细胞活率检测、细胞表型检测及细胞数量检测，将收获时每瓶细胞的末次洗涤上清进行细菌与真菌检测；并将所有结果进行统计汇总，统计结果见表1：
表1：不同细胞密度对细胞数量的影响
结果与讨论：使用本发明的无血清培养基培养出的P2代牙髓间充质干细胞保证了无菌要求，各细胞活率、流式结果也均符合牙髓间充质干细胞流式检测要求。从每组种瓶密度的平均收获数量来看，细胞种瓶密度8000～9000/cm2优于其它种瓶密度。并且平均每T175培养瓶收获细胞数量可达1.3×107个以上。
实施例2：验证P1代牙髓间充质干细胞的培养方法所培养的间充质干细胞的增殖能力
取P1代细胞，采用胰酶消化后用无血清培养基按1x104个/mL接种于24孔板上（每板第一行和最后一行孔加入1mL生理盐水保湿，其余每孔接种细胞），每孔1mL体系；分别做5组平行实验，每组接种21孔，每隔24h取每组三孔细胞分别进行胰酶消化和细胞收集，并进行细胞计数算出三个孔细胞数量的平均值；连续进行细胞计数七天，再根据实验结果，绘制出该细胞的生长曲线，结果见图1。
其中所述无血清培养基为所述牙髓间充质干细胞的培养基；由细胞生长曲线图可知本发明所述牙髓间充质干细胞的大规模培养方法培养的牙髓间充质干细胞0-3天为适应期，4-6天为对数生长期，细胞增殖较快，第7天细胞增殖变慢，进入了平台期；表明本发明所述牙髓间充质干细胞的培养方法培养的牙髓间充质干细胞的增殖能力较强。
本发明与常规的大规模牙髓间充质干细胞培养的方法相比，依据本发明培养出的细胞，细胞活率达90%以上，细胞表型（CD105、CD90、CD73、CD45、CD34）稳定且满足要求。本发明对于干细胞的规模化生产具有较高的价值，适用于推广应用。
实施例3：将收获的P1代细胞平分两管分别取样计数，按计数结果算出种瓶密度，实例1中定容体积为1mL,种瓶密度为7524个/cm2，取1mL无血清培养基重悬细胞，将1mL细胞悬液加入在T175培养瓶的21mL无血清培养基中混匀，平铺后放入CO2培养箱中培养。取1mL含10%FBS的DMEM/F12基础培养基重悬细胞，将1mL细胞悬液加入在21mL含10%FBS的DMEM/F12基础培养基中混匀，平铺后放入CO2培养箱；96h后两瓶细胞融合度达到85%-90%，并进行细胞收获；将收获的细胞取样计数，计数结果为：无血清培养基培养的细胞总数为16.23×106个、细胞活率为95.32%；含10%FBS的DMEM/F12培养基培养的细胞总数为16.18×106个、细胞活率为94.54%；两组细胞检测结果如表2所示。
表2：检测结果
实施例4：将收获的P1代细胞分两管并分别取样计数，按计数结果算出种瓶密度，实施例2中定容体积为3.2mL,种瓶密度为9000个/cm2，取3.2mL无血清培养基重悬细胞，取其中1mL细胞悬液加入在T175培养瓶的无血清培养基中混匀，平铺后放入CO2培养箱中培养；取2mL含10%FBS的DMEM/F12基础培养基重悬细胞，将1mL细胞悬液加入在21mL含10%FBS的DMEM/F12基础培养基中混匀，平铺后放入CO2培养箱；96h后两组细胞融合度达到85%-90%，并进行细胞收获；将收获的细胞取样计数，两组计数结果分别为：无血清培养基培养的细胞总数为18.12×106个、细胞活率为93.12%；含10%FBS的DMEM/F12培养基培养的细胞总数为18.09×106个、细胞活率为92.88%；两组细胞检测结果如表3所示。
表3：两组细胞检测结果
综上，本实例的结果表明本发明的一种培养牙髓间充质干细胞的无血清培养基培养出的细胞质量优于含FBS 的培养基培养出的细胞。
实施例5：验证牙髓间充质干细胞的细胞形态
取实施例3和实施例4中两种不同培养基培养出细胞，在融合度达到80%-90%时，比较不同培养基培养的细胞的生长情况及形态变化，并记录实施例3及实施例4细胞收获时，每组细胞的平均直径。
表4：不同P2代细胞平均直径的对比：
由图2至图5可见，每组细胞形态都为梭形、成纤维状，符合间充质干细胞的特点。由表4可见，每组细胞的平均直径无太大差别,本申请提供的一种牙髓间充质干细胞的无血清培养基培养出的细胞直径小于含FBS 的培养基培养出的细胞。
实施例6：验证牙髓间充质干细胞的安全性
对实施例3和实施例4中两种不同培养基培养出的细胞进行收获，取收获的细胞进行无菌、支原体、内毒素、染色体核型分析、原癌基因和抑癌基因分析、端粒酶活性分析检测，其中无菌采用全自动微生物培养系统检测法对细胞样品进行细菌及真菌检测；支原体检测参照中国药典的直接培养法对细胞样品进行检测；内毒素检测参照中国药典规定鲎试验凝胶法对细胞样品进行检测。其余检测样本送往第三方检测机构检测，其中原癌基因及抑癌基因分析取P0代细胞作为对照细胞；检测结果如表5所示。
表5：细胞安全性检测结果
由表5可知，每组培养基培养的细胞安全性都在合格范围，本发明的牙髓间充质干细胞无血清培养基培养出的细胞与含10%FBS培养基培养出的细胞每项检测结果均达到检测要求，其中牙髓间充质干细胞无血清培养基培养出的细胞内毒素检测结果略小于含10%FBS培养基培养出的细胞；说明牙髓间充质干细胞无血清培养基培养出的细胞安全性更高。
本发明的设计重点在于，通过采用本申请提供的牙髓间充质干细胞的无血清培养基及其培养方法，所培养的牙髓间充质干细胞的增殖能力较强；与常规的大规模牙髓间充质干细胞培养的方法相比，采用本申请培养方法培养出的细胞，细胞活率达90%以上，细胞表型（CD105、CD90、CD73、CD45、CD34）稳定且满足要求；本申请对于干细胞的规模化生产具有较高的价值，有利于推广应用；采用本申请提供的牙髓间充质干细胞无血清培养基培养出的细胞与含10%FBS培养基培养出的细胞每项检测结果均达到检测要求，其中牙髓间充质干细胞采用无血清培养基培养出的细胞内毒素检测结果略小于含10%FBS培养基培养出的细胞；本申请提供的牙髓间充质干细胞无血清培养基培养出的细胞安全性更高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何细微修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种牙髓间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：包括如下组分：体积浓度为95%DMEM/F12无血清培养基、65ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、50μg/mL链霉素、50IU/mL青霉素、1%v/v维生素溶液、10nM地塞米松、15ng/mL表皮细胞生长因子、15μg/mL重组人胰岛素、5μg/mL重组人转铁蛋白、10ng/mL血小板衍生因子PDGF、3mML-谷氨酰胺、20ng/mL多聚赖氨酸、1%v/v NEAA、0.5ng/mL亚硒酸钠和2.99%v/v水。
2.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：所述DMEM/F12无血清培养基由DMEM培养基和F12培养基按照体积比为1:1混合而成。
3.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：无血清培养基的制备方法包括如下步骤：
第一、将除DMEM/F12无血清培养基以外的组分按比例混合，制得营养添加组剂；
第二、将混合均匀的营养添加组剂经滤膜进行过滤；
第三、将过滤后的营养添加组剂加入至DMEM/F12无血清培养基中混合均匀得到无血清培养基。
4.一种牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于：采用如权利要求1-3任意一项所述的牙髓间充质干细胞的无血清培养基；包括如下步骤：取新鲜或冻存复苏的P1代牙髓间充质干细胞制成细胞悬液进行计数，按计数结果根据所需种瓶密度计算出相应的细胞重悬体积，按重悬体积取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞接种于含牙髓间充质干细胞无血清培养基的培养瓶中，将接种好的细胞培养瓶置于37℃、5%CO2的CO2培养箱中培养；细胞融合度达到80-90%时进行细胞收获。
5.根据权利要求4所述的牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞与含牙髓间充质干细胞无血清培养基的体积比为1:21。
6.根据权利要求4所述的牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述细胞收获的具体步骤为：将细胞培养瓶取出，用生理盐水清洗细胞表面，吸取掉生理盐水后加入6mL/T175瓶的胰酶消化液消化4min，后加入6mL/T175瓶培养上清终止消化；终止消化后细胞悬液用细胞滤网过滤，取过滤后的细胞悬液取样计数并检测细胞活率及细胞表型，剩余细胞离心后作冻存处理。
7.根据权利要求4所述的牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞接种于含牙髓间充质干细胞无血清培养基的培养瓶中时的接种密度为5000-10000个/cm2。
8.根据权利要求7所述的牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞接种于含牙髓间充质干细胞无血清培养基的培养瓶中时的接种密度为9000个/cm2。
9.根据权利要求6所述的牙髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述P1代牙髓间充质干细胞的培养时间为72±24h，于72±24h中观察细胞融合度至80-90%时进行细胞收获；该胰酶消化液的浓度为0.125%。
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