CN110592008A

CN110592008A - 犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法

Info

Publication number: CN110592008A
Application number: CN201910919472.XA
Authority: CN
Inventors: 曹力; 马海蓉; 沙力塔娜提·乌尔曼别克; 穆文博; 李亦丞; 谢祯子
Original assignee: First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
Priority date: 2019-09-26
Filing date: 2019-09-26
Publication date: 2019-12-20

Abstract

本发明涉及骨髓间充质干细胞培养技术领域，是一种犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，其通过将采集到的犬骨髓血直接培养等过程获得骨髓充质干细胞。本发明对培养骨髓充质干细胞的步骤进行了简化，一方面，骨髓血细胞不需经过前处理包括过滤、离心及去除脂肪细胞，其优势在于更好地保持犬骨髓原有的微环境，免受外界干扰，使所包含的基质细胞、细胞外基质成分及所分泌的分泌因子为间充质干细胞生长提供全面的营养环境；另一方面，该方法仅需要简单的培养基选择贴壁BMSCs，不需要用流式细胞或免疫分选技术分离造血干细胞；同时采用本方法的培养的骨髓间充质干细胞传代周期短，产率高。

Description

犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及骨髓间充质干细胞培养技术领域，是一种犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)是干细胞家族的重要成员，具有高度的增殖能力和多向分化潜能，在合适的诱导条件下能定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及神经细胞等多种细胞及组织。同时，BMSCs具有获取途径简单、易培养、低免疫原性、易于外源基因转染并长期表达等特点，广泛应用于基础研究(如骨关节炎、软骨、关节、韧带、神经损伤等)、临床组织器官修复(如肝脏、肾脏、骨损伤等)和多种疾病基因治疗等领域。

犬科动物有300多种疾病如骨关节炎、肿瘤、心脏病、免疫性疾病等与人类极为相似，但犬科动物BMSCs库的研究相对滞后，目前市场仍然缺乏犬科动物BMSCs库，其中大多数传统方法步骤多、程序复杂，骨髓需要通过离心、胰蛋白酶消化组织细胞等前处理步骤才能获得初选细胞(即BMSCs)，再对初选细胞进行传代培养，然而获得初选细胞的前处理操作，使BMSCs脱离了其在骨髓中原有的生长微环境，其对BMSCs细胞生长和增殖分化均产生不利影响，导致初选细胞在后续传代培养过程中，传代周期较长。

发明内容

本发明提供了一种犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，克服了上述现有技术之不足，其有效解决现有传统骨髓间充质干细胞培养技术存在的工艺复杂，传代周期长、产率低的问题。该方法操作简便快捷，可快速分离犬BMSCs,BMSCs扩增速度快、并定向诱导为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞，为骨关节炎、软骨、关节、韧带、神经损伤等疾病的治疗或肝脏、肾脏、骨损伤等临床组织器官修复和多种疾病基因治疗、临床研究提供一个技术平台。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，按下述步骤进行：第一步，培养：将离体的犬科动物骨髓加入含有α-MEM完全培养基的培养皿中混合均匀，每10mlα-MEM完全培养基加入2.0ml至3.0ml的犬科动物骨髓，然后在含有5％CO₂的气体环境中培养3天至5天后，得到以骨髓间充质干细胞为主的贴壁细胞群；第二步，消化、离心：将以骨髓间充质干细胞为主的贴壁细胞群依序进行磷酸缓冲盐溶液清洗、胰酶消化、α-MEM完全培养基中和以及室温离心后得到骨髓间充质干细胞。

下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：

上述第二步得到的骨髓间充质干细胞在α-MEM完全培养基中进行传代培养，每4天至6天按照1:3比例传代一次。

上述α-MEM完全培养基是由15％胎牛血清、1％双抗以及余量的α-MEM培养基配制而成。

上述第二步中，PBS(磷酸缓冲盐溶液)、0.25％的胰酶、α-MEM完全培养基的三者使用量均按照2.0ml至3.0ml犬科动物骨髓血，采用10ml磷酸缓冲盐溶液洗2次，2ml 0.25％的胰酶消化、消化温度为37℃、消化时间为1.5至2min，6mlα-MEM完全培养基中和。

上述第二步中，每1000g第一步得到的培养物离心10min。

本发明对培养骨髓充质干细胞的步骤进行了简化，一方面，骨髓血细胞不需经过前处理包括过滤、离心及去除脂肪细胞，其优势在于更好地保持犬骨髓原有的微环境，免受外界干扰，使所包含的基质细胞、细胞外基质成分及所分泌的分泌因子为间充质干细胞生长提供全面的营养环境；另一方面，该方法仅需要简单的培养基选择贴壁BMSCs，不需要用流式细胞或免疫分选技术分离造血干细胞；同时采用本方法的培养的骨髓间充质干细胞传代周期短，产率高。

附图说明

附图1为采用本发明所述犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法得到的犬BMSCs各个代次细胞形态图。

附图2为采用本发明所述犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法得到的犬BMSCs的多向分化能力的示意图。

附图1中，A-1:第2代；A-2：第3代；A-3:第5代。

附图2中，A-1,B-1,C-1为采用本发明所述犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法得到的犬BMSCs未加诱导培养基培养的犬BMSCs细胞；

A-2,B-2,C-2分别为A-1,B-1,C-1采用本发明所述犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法得到的犬BMSCs的诱导分化状态，A-2对应A-1,B-2对应B-1,C-2对应C-1，其中A-2:犬BMSCs向成骨细胞分化；B-2:犬BMSCs向脂肪细胞分化；C-2:犬BMSCs向软骨细胞分化。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，除现有公知技术外，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：该犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，按下述步骤进行：第一步，培养：将离体的犬科动物骨髓加入含有α-MEM完全培养基的培养皿中混合均匀，每10mlα-MEM完全培养基加入2.0ml至3.0ml的犬科动物骨髓，然后在含有5％CO₂的气体环境中培养3天至5天后，得到以骨髓间充质干细胞为主的贴壁细胞群；第二步，消化、离心：将以骨髓间充质干细胞为主的贴壁细胞群依序进行磷酸缓冲盐溶液清洗、胰酶消化、α-MEM完全培养基中和以及室温离心后得到骨髓间充质干细胞。

骨髓间充质干细胞在培养皿内贴壁生长并传代，由此形成贴壁细胞群。

实施例2：作为上述实施例的优化，第二步得到的骨髓间充质干细胞在α-MEM完全培养基中进行传代培养，每4天至6天按照1:3比例传代一次。

本发明中，α-MEM完全培养基是由15％胎牛血清、1％双抗以及余量的α-MEM培养基配制而成。

实施例3：作为上述实施例的优化，第二步中，PBS(磷酸缓冲盐溶液)、0.25％的胰酶、α-MEM完全培养基的三者使用量均按照2.0ml至3.0ml犬科动物骨髓血，采用10ml磷酸缓冲盐溶液洗2次，2ml 0.25％的胰酶消化、消化温度为37℃、消化时间为1.5至2min，6mlα-MEM完全培养基中和。

实施例4：作为上述实施例的优化，第二步中，每1000g第一步得到的培养物离心10min。

相比于传统骨髓间充质干细胞培养方法，本发明所述犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法步骤更为简化，对收集的犬骨髓(骨髓血细胞)不过滤、不离心及去除脂肪细胞，而是将收集到的犬骨髓直接采用所述培养基培养，其目的是更好地保持犬骨髓天然的微环境，免受外界干扰，使之所包含的基质细胞、细胞外基质成分及所分泌的分泌因子为骨髓间充质干细胞生长提供全面的营养环境；同时，本发明不需要采用现有流式细胞或免疫分选技术分离造血干细胞，仅需要简单的培养基选择贴壁BMSCs；因此，整个操作非常简单，收获的骨髓间充质干细胞的质量良好且产率高。

实施例5：犬骨髓从1月至4月月龄健康比格犬合犬髂骨获取。

获得临床伦审审查，选定体格检查合格对象；检查合格后，将1月至4月龄比格犬用速眠新Ⅱ注射液和舒泰(剂量100分别按0.1mL/kg体重和3mg/kg体重)肌肉注射，在监护仪监护下麻醉；以犬穿刺点为中心，用医用碘伏消毒该区域皮肤，并备皮，并用铺巾与身体其它部位隔离；提前高温高压消毒灭菌完毕的骨髓穿刺针(14至18号胸骨穿刺针)向外下方并向前旋转刺入犬髂后上嵴(一般在骨膜下0.5cm左右、刚入骨松质位置处)停止，确认穿刺针被固定于髂骨嵴上，取出针芯，接上注射器，抽取骨髓2.0至3.0mL，转移至抗凝血的采血管中，再随即取下注射器，整个拔出，用无菌纱布压紧穿刺处2至3min。

实施例6：该犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，按下述步骤进行：(1)培养：将通过实施例5获取的2.0至3.0ml骨髓全部转移到包含10ml置于冰上的α-MEM完全培养基(α-MEM培养基、15％胎牛血清及1％双抗)的无菌培养皿(直径为100mm)中，混合均匀，整个过程在30分钟内完成，然后将培养皿转移至含5％的CO2的培养箱中培养；第2天至3天时，显微镜视野下观察到贴壁的成纤维样细胞，继续培养2天，细胞成簇生长至汇合率达70％至90％时，进行传代；(2)消化、离心：所述细胞用10mlPBS(磷酸缓冲盐溶液)洗2次，然后用0.25％胰酶2ml于37℃消化1.5至2min，然后用6ml完全培养基中和，用移液管轻轻吹打后转移至15ml离心管中，1000g室温离心10min；(3)传代：将所述细胞重悬于装有30ml完全培养基的离心管中，吹打均匀转至3个培养皿中培养，每4至6天按照1:3比例传代1次。在培养过程中，不断传代增殖的BMSCs在培养皿上成簇贴壁生长。

本发明所述犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法获得的骨髓间充质干细胞的细胞形态、分化潜能、生长率如下所述：

一.细胞传代及骨髓间充质干细胞的形态特征

以采用本实施例6所述犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法进行说明。培养的第一天，少部分骨髓间充质干细胞(后续简称为细胞)刚刚贴壁，显微镜下呈现出不规则状，几乎看不见细胞克隆的成簇生长，细胞液中漂浮着红细胞及脂肪组织团；培养的第二天，显微镜下可见纺锤状细胞，并以其为中心分裂为几个细胞，周围有上皮细胞及脂肪组织团；培养的第三天，纺锤状细胞继续增加，形成漩涡状成片生长的成纤维细胞的克隆团；培养的第五天，成纤维细胞长成更大的细胞簇，其中心形成结达90％以上，可进行细胞传代。图1展示了采用本发明所述犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法得到的骨髓间充质干细胞由第2代传代至第5代细胞形态变化。

如果采用现有现有传统培养方法(先从骨髓中分离出骨髓间充质干细胞，再对骨髓间充质干细胞进行培养，培养结束后，采用流式细胞或免疫分选技术分离出造血干细胞后，获得骨髓中分离出骨髓间充质干细胞)，培养第五天的细胞融合率仅有60％至70％，培养至第7天，细胞融合率才能达90％以上，细胞才进行传代。采用本实施例6所述犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法需要2周时间获得4.5-5×10⁷至1.8-2×10⁸BMSCs细胞株；但是用现有传统培养方法获得的细胞传代，需要用3周时间才能收获上述该数量的细胞。

二.犬BMSCs分化潜能证实

采用本发明所述犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法得到的骨髓间充质干细胞传代3次且骨髓间充质干细胞株建立后，犬BMSCs保持相似的表型和分化潜力特征。通过骨髓间充质干细胞鉴定，其结果显示建立的BMSCs的CD44、CD90为强阳性；同时造血干细胞表面标记CD45、血管内皮细胞表面标记CD34为阴性。

采用本发明所述犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法获得的BMSCs细胞分化向成骨细胞潜能用Alizarin红染色显示(如图2中的A-2，本图颜色为灰度)，在成骨诱导培养基诱导21天后的矿化结节；用脂肪诱导培养基诱导14天，Oil-red-O染色显示富含脂肪的液泡生成(如图2中的B-2，本图颜色为灰度)；用软骨细胞诱导培养基诱导3周后，用甲苯胺蓝染色，结果显示阳性的酸性蛋白多糖提示类软骨细胞形成(如图2中的C-2，本图颜色为灰度)。即采用本发明所述犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法获得的BMSCs质量良好，在不同诱导培养基的诱导作用下，能分化成所需的细胞，说明根据本发明所述培养方法获得的BMSCs具有良好的多向分化能力。

三.犬BMSCs生长率

采用本发明所述培养方法培养骨髓间充质干细胞时，犬BMSCs生长率见表1。

如表1所示，BMSCs的成功的分离无犬种及性别差异。用传统方法(现有传统培养方法)和本发明方法在第0-1代均能达到70-90％汇合率；然而本发明方法从P0-P1代及从P1-P2代达到70％至90％汇合率都仅需要4天时间，获得的细胞数量细胞增殖同第一代差异不大也比传统方法获得细胞数量明显高(P＝0.025)；相比之下，传统方法从P0-P1代及从P1-P2代达到70％至90％汇合率都需要8天时间，且第一代后传统方法培养的BMSCs中约有20％细胞生长非常慢或停止生长，一个月后不能达到70％至90％，细胞内部有脂空泡，呈现出典型的老化特征。

同时，通过表1实验结果表明：本发明方法较传统方法培养的代数P0-1及P1-2细胞(×10⁶)数量高并且传代周期短，则在相同时间内，本发明方法较传统方法的产率更高，并且利用本发明方法培养犬科动物骨髓间充质干细胞成功率高达100％。

另外，本发明所用的α-MEM完全培养基没有添加任何别的生长因子成分，这样在最大程度上避免了改变骨髓间充质干细胞内蛋白的合成及细胞运输，影响BMSCs的增殖和分化潜力。

本发明所述培养方法已经在几种犬(比格犬和古牧犬)进行了测试，其年龄在1个月至4个月，性别包括雄性和雌性犬，结果表明均成功分离骨髓间充质干细胞，无种属及性别差异。

综上所述，采用本发明所述犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法获取骨髓间充质干细胞时，其步骤更为简化，对收集的骨髓血细胞不过滤、不离心及去除脂肪细胞，而是将收集到的犬骨髓直接采用所述培养基培养，其目的是更好地保持犬骨髓天然的微环境，免受外界干扰，使之所包含的基质细胞、细胞外基质成分及所分泌的分泌因子为骨髓间充质干细胞生长提供全面的营养环境；同时，本发明不需要采用现有流式细胞或免疫分选技术分离造血干细胞，仅需要简单的培养基选择贴壁BMSCs，因此，整个操作非常简单；另外收获的骨髓间充质干细胞的质量良好且产率高。

以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

表1传统方法(对照例)与本发明方法(实验例)细胞生长对比

注：P0-1：细胞分化开始到第一代；P1-2：细胞分化从第一代到第二代。

Claims

1.一种犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于按下述步骤进行：第一步，培养：将离体的犬科动物骨髓加入含有α-MEM完全培养基的培养皿中混合均匀，每10mlα-MEM完全培养基加入2.0ml至3.0ml的犬科动物骨髓，然后在含有5％CO₂的气体环境中培养3天至5天后，得到以骨髓间充质干细胞为主的贴壁细胞群；第二步，消化、离心：将以骨髓间充质干细胞为主的贴壁细胞群依序进行磷酸缓冲盐溶液清洗、胰酶消化、α-MEM完全培养基中和以及室温离心后得到骨髓间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于第二步得到的骨髓间充质干细胞在α-MEM完全培养基中进行传代培养，每4天至6天按照1:3比例传代一次。

3.根据权利要求1或2所述的犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于α-MEM完全培养基是由15％胎牛血清、1％双抗以及余量的α-MEM培养基配制而成。

4.根据权利要求1或2所述的犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于第二步中，磷酸缓冲盐溶液、0.25％的胰酶、α-MEM完全培养基的三者使用量均按照2.0ml至3.0ml犬科动物骨髓血，采用10ml磷酸缓冲盐溶液洗2次，2ml 0.25％的胰酶消化、消化温度为37℃、消化时间为1.5至2min，6mlα-MEM完全培养基中和。

5.根据权利要求3所述的犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于第二步中，磷酸缓冲盐溶液、0.25％的胰酶、α-MEM完全培养基的三者使用量均按照2.0ml至3.0ml犬科动物骨髓血，采用10ml磷酸缓冲盐溶液洗2次，2ml 0.25％的胰酶消化、消化温度为37℃、消化时间为1.5至2min，6mlα-MEM完全培养基中和。

6.根据权利要求1或2或5所述的犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于第二步中，每1000g第一步得到的培养物离心10min。

7.根据权利要求3所述的犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于第二步中，每1000g第一步得到的培养物离心10min。

8.根据权利要求4所述的犬科动物骨髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于第二步中，每1000g第一步得到的培养物离心10min。