CN110628708A - 一种高纯度猪肌肉干细胞的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于培养肉研究和生产的高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法。本发明的分离纯化方法包括获取无菌的肌肉组织，高效率的消化肌肉组织以得到大量的肌肉单核细胞以及最终通过流式细胞分选获得高纯度的猪肌肉干细胞。本发明进一步公开了如何高效率消化猪肌肉组织的方法，可以提高消化速度和强度，获得大量的肌肉单核细胞。应用本发明的纯化方法，可以稳定的获得纯度超过92％(以PAX7计)的猪肌肉干细胞。分离得到的猪肌肉干细胞拥有高效的分化效率，MYOSIN的表达量达到85％‑90％。应用本发明的方法，可以为培养肉研究和实际生产提供大量的种子细胞来源。

Description

一种高纯度猪肌肉干细胞的分离纯化方法

技术领域

本发明属于干细胞和动物细胞培养肉技术领域，具体地，涉及用于培养肉研究和生产的高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法。

背景技术

肉类是人类进化过程中最重要的食品成分之一。随着人们生活水平的提高，我国肉类消费需求逐年上升。而传统的畜牧业消耗了大量的自然资源，容易造成环境污染。近年来，禽流感和非洲猪瘟等问题也给现阶段的畜牧养殖业敲响警钟。培养肉是通过体外大量培养动物肌肉干细胞和脂肪干细胞等不同种细胞，并在体外分化重组为可用于食用的动物肌肉，脂肪等组织的一类肉的生产方式。该方法将肉类生产从动物水平转变到细胞水平，能够高效的利用资源，减少动物疫病的传播。培养肉(人造肉)是一项潜在的技术，它具有解决传统畜牧业问题的潜力。

肌肉干细胞(肌卫星细胞)是动物肌肉组织中的一种成体干细胞，能够帮助出生后肌肉的生长和肌肉损伤修复。肌肉干细胞经分离培养能够在体外进行增殖、分化形成肌肉组织。培养肉技术的首要难题就是在体外分离得到高纯度的肌肉干细胞。一方面，猪的生长环境决定了获取猪的无菌肌肉组织有一定难度；另一方面，猪的肌肉纤维较粗，结缔组织较多，传统的消化过程难以将肉充分消化。另外，由于肌肉组织中含有多种来源的细胞如血细胞，内皮细胞，间充质细胞等。由于肌肉干细胞也是动物体内最主要的生长成肌肉细胞的一种细胞。如何去除其他细胞，得到高纯度的肌肉干细胞用于培养肉的研究也是一个难题。

传统的猪肌肉干细胞纯化方法为贴壁法和Percoll密度梯度离心法，但这些方法纯化所得到的结果在不同的报道中也存在差异。在Percoll梯度离心获得的猪肌源性细胞中，只有一部分(小于60％)的神经细胞粘附分子(N-Cam，又称为CD56)染色呈阳性，为肌肉干细胞。而密度梯度离心的方法所获得的肌肉干细胞PAX7阳性率在20％-50％左右。这些方法没有根据猪肌肉干细胞的分子特性，获得肌肉干细胞纯度难以保证，且实验重复性较差。因此开发用于培养肉研究和生产的高纯度猪肌肉干细胞的纯化方法非常重要。

发明内容

本发明的目的是解决猪的肌肉干细胞分离纯化难题，提供一种，用于培养肉研究和生产的猪肌肉干细胞的分离纯化方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法，所述方法包括以下步骤：

S1：无菌收集猪肌肉组织，除菌处理；

S2：将S1获得的猪肌肉剪碎，置于含有1～3vol％的青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液中，将碎肌肉加入混合酶液中孵育消化，所述混合酶液包括胶原酶和中性蛋白酶，所述胶原酶和中性蛋白酶的质量比例为1:1-2:1，所述消化过程还包含采用机械方式促进消化过程；

S3：终止消化，产物离心，收集沉淀，得到含有肌肉干细胞的单核细胞群；

S4：纯化上述单核细胞群，即得到猪肌肉干细胞；所述纯化包括初步纯化和分选纯化；所述初步纯化为将S3所得沉淀滤网过滤，红细胞裂解液去除红细胞，贴壁法去除悬浮细胞；所述分选纯化方法为流式细胞分选法。

进一步的，S1所述无菌收集猪肌肉组织为肌肉活检取样或者屠宰场现杀猪肌肉采样；

优选的，从屠宰场现杀猪肌肉取样，所述现杀猪肌肉采样为从死亡30min以内的猪样品中获取猪肌肉组织；

所述除菌处理为将获得的猪肌肉组织置于70vol％乙醇溶液中1-2分钟；其作用在于，大动物由于体型较大，难以保证采集肌肉中的无菌。本发明发现，将采集的小块猪肉组织置于70vol％酒精中1-2分钟，可以有效的减少污染的概率。

优选的，将除菌处理获得的猪肌肉组织保存在含有3vol％青霉素-链霉素双抗的培养液中；更优选的，取得猪肌肉组织后，在24h以内进行下一步。

进一步的，所述S2中，为将肌肉剪碎至0.5-1.5mm³，所述含有青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液中，包括青霉素-链霉素的质量分数为3vol％，其中，青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。

进一步的，S2所述混合酶液的质量体积浓度为0.05-0.5％，碎肌肉和混合酶液的质量体积比例为1:2-1:4，碎肌肉和混合酶液在37℃孵育30～90min。

进一步的，S2所述机械方式不仅包括剪刀或手术刀片对肉进行剪切，还包括消化过程中，每隔10分钟用5-50ml的移液管和/或医用注射器吹打消化混合物；所述消化的终点为消化混合物流畅通过10ml移液管或10-20G的注射器针头；优选的，为消化混合物流畅通过10-16G的注射器针头。其作用在于，大动物的肌肉纤维较粗，传统的消化方法难以充分消化，且难以有一定的标准表明消化完全。经过多次尝试表明，在传统的酶消化过程中配合移液管或者医用针筒吹打混合物，可以极大的促进消化效率。当消化混合物能够流畅的通过10-16G的针头时，所得到的单核细胞最多。其中，幼猪可以得到约4x10⁶个细胞每克肌肉组织，成猪约2x10⁵个每克肌肉组织

进一步的，S3所述终止消化为，向S2获得的消化混合物中加入1倍体积的包括79vol％F-10、20vol％胎牛血清、1vol％青霉素-链霉素双抗的培养基以及0.5倍体积的PBS，并充分混匀。

进一步的，S3所述离心为使用50-150g离心3min，保存上清，向沉淀中加入适量PBS溶液，混合后50-150g离心3min，合并两次上清液，在500g-1500g的条件下离心5-10分钟，取沉淀，所得的细胞为含有肌肉干细胞的单核细胞群。

进一步的，S4中，所述初步纯化，为向沉淀中加入PBS，反复吹打后通过100μm的滤网过滤，500g-1500g的条件下离心5-10分钟，取下方沉淀，加入红细胞裂解缓冲液，冰上静置10min，加入10倍体积的PBS终止裂解，并通过40μm的滤网过滤，500g-1500g的条件下离心5-10分钟，去上清，所得细胞沉淀直接冻存或在胶原蛋白预处理的培养皿中铺板培养，去除不贴壁的血液类细胞，得到肌肉单核细胞，优选的，所述铺板培养为将细胞培养2-4天。

进一步的，S4中，所述分选纯化为流式细胞分选法，用于流式分选的表面标志物为CD56,CD29,CD31,CD45，所述抗体的分选策略为先选取CD31,CD45的阴性细胞，再选取CD56和CD29的阳性细胞，即为猪的肌肉干细胞。

更进一步的，所述方法还包括S5：将S4纯化得到的猪肌肉干细胞培养，进行纯度鉴定；

优选的，所述S5的具体操作为：

(1)向纯化的肌肉干细胞中加入培养基，进行细胞培养后进行PAX7蛋白的阳性率验证；

(2)细胞培养达到95％密度时，进行诱导分化实验，将培养得到的猪肌肉干细胞加入分化培养基，诱导分化成为肌管，进行肌管MyHC蛋白的阳性率验证；

进一步优选的，(1)中所述培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为包括79vol％F-10、20vol％胎牛血清、1vol％青霉素-链霉素双抗的培养基，所述添加物包括成纤维细胞生长因子2，所述成纤维生长因子2的浓度为1-10ng/ml；

更进一步优选的，(2)中所述分化培养基为包括97vol％DMEM培养基、2vol％马血清、1vol％青霉素-链霉素双抗。

本发明的第二个目的是提供前述的高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法在研究和/或生产培养肉中的应用。

本发明所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量均为10000U/ml，链霉素的含量均为10mg/ml。

本发明技术方案所实现的有益效果为：

使用本发明采用的高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法，分离过程中受污染几率小，并同时提高消化速度和强度，能够充分的消化肌肉组织，得到最大限度的单核细胞群，结合纯化步骤如滤网过滤，红细胞裂解，贴壁培养等步骤可以有效的减少非肌肉干细胞的比例，从而减少分选抗体的使用，提高分选效率；再通过流式分选的方法，得到高纯度的肌肉干细胞，为猪的肌肉干细胞研究和培养肉种子细胞提供细胞来源。

现阶段，没有稳定分离高纯度的农产动物肌肉干细胞的方法，应用我们的方法，可以在7日龄猪每克猪肉得到约8-9x10⁵个肌肉干细胞，成年猪每克得到约1x10⁴个肌肉干细胞。干细胞的纯度通过肌肉干细胞特征转录因子PAX7染色比例达到92％以上，表面标志物CD56,CD29比例为95％以上。所得的肌肉干细胞能够在体外增殖，并分化为肌管。分化的细胞表达肌肉的特异性标志物肌球蛋白重链(MyHC)超过85％。

附图说明

图1为猪肌肉干细胞的分离纯化流程图；

图2为未分选的肌肉单核细胞培养2天后肌肉干细胞标志性核转录因子PAX7的染色；

图3为成年猪的肌肉干细胞分选结果图；

图4为幼年猪的肌肉干细胞分选结果图；

图5为分选的猪肌肉干细胞培养后肌肉干细胞标志性核转录因子PAX7的染色；

图6为分选的猪肌肉干细胞培养后诱导分化，表达肌球蛋白重链MyHC的实验结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实验样品为7日龄以内的幼猪和180日龄的成年猪。

本研究发现，猪肌肉干细胞研究领域还没有获得高纯度肌肉干细胞的方法。一方面，大动物由于体型较大，难以保证采集肌肉中的无菌。本发明发现，将采集的小块猪肉组织置于70％酒精中1-2分钟，可以有效的减少污染的概率。另外，大动物的肌肉纤维较粗，传统的消化方法难以充分消化，且难以有一定的标准表明消化完全。经过多次尝试表明，在传统的酶消化过程中配合移液管或者医用针筒吹打混合物，可以极大的促进消化效率。当消化混合物能够流畅的通过10-16G的针头时，所得到的单核细胞最多。其中，幼猪可以得到约4x10⁶个细胞每克肌肉组织，成猪约2x10⁵个每克肌肉组织。后续的纯化步骤如滤网过滤，红细胞裂解，贴壁培养等步骤可以有效的减少非肌肉干细胞的比例，从而减少分选抗体的使用，提高分选效率。应用我们的方法，可以在幼猪每克猪肉得到约8-9x10⁵个肌肉干细胞，成年猪约1x10⁴个肌肉干细胞每克。干细胞的纯度通过肌肉干细胞特征转录因子达到92％以上，表面标志物CD56,CD29比例为95％以上。所得的肌肉干细胞能够在体外增殖，并分化为肌管。分化的细胞表达肌肉的特异性标志物肌球蛋白重链(MyHC)超过85％。

本发明的猪肌肉干细胞分离纯化方法，为根据猪肌肉干细胞特征性的表面标志物，应用流式细胞分选的方法获得高纯度的猪肌肉干细胞。

本发明的关键是通过对无菌处理的肌肉组织进行高效率的消化，分离得到肌肉单核细胞。再通过CD56,CD29,CD31,CD45的抗体组合，分选得到高纯度的肌肉干细胞。

实施例1猪肌肉中单核细胞的分离方法：

无菌条件下取猪股二头肌等肌肉，置于70％(体积百分比)乙醇溶液中1-2分钟；将获得的猪肌肉组织保存在含有3％(体积百分比)的青霉素-链霉素双抗培养液中；24h以内进行下一步。

在无菌条件下用剪刀剪成0.5-1.5mm³碎块，置于含有青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液，青霉素-链霉素的质量分数为3％(体积百分比)，其中，青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。将碎肌肉加入胶原酶和中性蛋白酶溶液，所述胶原酶和中性蛋白酶的比例为1:1-2:1(质量比)，碎肌肉和混合酶液体积比为0.05-0.5％(质量体积比)，在37℃消化30-90min。消化过程中先采用50ml的移液管吹打，再利用注射器吹打，每隔10分钟左右一次。消化终点判定为最后肌肉细胞消化产物能顺利通过10ml移液管和10-16G注射器针头则证明消化完全。

消化完成后，加入1倍体积的包括79％F-10、20％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗(均为体积百分比)的培养基以及0.5倍体积的PBS，并充分混匀以终止消化，后50-150g离心3分钟后取上清，沉淀再加入20mlPBS，混匀后再次50-150g离心后取上清液。将所有的上清液收集500-1500g离心5-10分钟取沉淀。所得的细胞为含有肌肉干细胞的单核细胞群。

得到的沉淀细胞加入40mlPBS重悬后再通过100μm细胞滤网，500-1500g的条件下离心5-10分钟之后，取下方沉淀细胞与4ml红细胞裂解液在冰上孵育5-10分钟，加10倍体积PBS终止裂解后，用40μm细胞滤网过滤后在500-1500g的条件下离心5-10分钟。细胞沉淀可以直接冻存或者在胶原蛋白预处理的细胞培养皿铺板培养。

取培养2天的肌肉单核细胞，用磷酸缓冲液洗2次，洗去大部分未贴壁细胞。用4％(质量体积比)多聚甲醛固定，室温15分钟。用磷酸缓冲液清洗3次，加入0.05％(体积百分比)Triton x-100，室温通透15-20分钟。磷酸缓冲液清洗3次，加入在1％(质量体积百分比)牛血清白蛋白中稀释的Pax7抗体，4℃过夜。用PBS洗三次，加入1：500(体积比)稀释的荧光标记的二抗，室温孵育1-1.5小时。用PBS洗三次，加入含有DAPI的抗猝灭剂后封片。在细胞核上表达PAX7蛋白的为阳性，反之为阴性。

所获得的肌肉单核细胞经培养两天后，肌肉干细胞的重要转录因子PAX7的表达比例在40％-60％左右(图2)。

实施例2猪肌肉单核细胞流式分选方法及纯度鉴定

复苏猪的单核细胞，在胶原蛋白预处理的细胞培养皿培养2-4天，培养基为基础培养基和添加物，基础培养基为包括79％F-10、20％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗(均为体积百分比)的培养基，所述添加物包括成纤维细胞生长因子2，所述成纤维生长因子2的浓度为1-10ng/ml。培养后可见大量细胞贴壁。同时也有大量的悬浮细胞和组织碎片。通过磷酸盐缓冲液清洗1-2次，可以去除大量悬浮细胞和组织碎片，达到初步纯化的目的。后用胰酶进行消化，并离心取细胞沉淀。将细胞重悬于含有1.5％(质量体积百分比)BSA的PBS中，用抗体组合CD31,CD45,CD56,CD29染色,4℃度孵育45分钟。染色后，细胞悬液置于350g离心5分钟收集细胞，PBS洗涤细胞两次。将细胞重悬于包括79％F-10、20％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗(均为体积百分比)的培养基中。使用流式细胞分选仪(BD AriaII)分选CD31,CD45阴性，CD56和CD29双阳性细胞的细胞，即为猪肌肉干细胞。

成猪单核细胞中肌肉干细胞的比例约为6％左右(图3)，幼猪单核细胞中肌肉干细胞比例约为20％左右(图4)。

培养分选得到的肌肉干细胞，在胶原蛋白预处理的细胞培养皿培养2-3天后用磷酸缓冲液洗1次。用4％(质量体积比)甲醛固定，室温15分钟。用磷酸缓冲液清洗3次，加入0.05％(体积百分比)Triton x-100，室温通透15-20分钟。磷酸缓冲液清洗3次，加入在1％(质量体积比)牛血清白蛋白中稀释的Pax7抗体，4℃过夜。用PBS洗三次，加入1：500(体积比)稀释的荧光标记的二抗，室温孵育1-1.5小时。用PBS洗三次，加入含有DAPI的抗猝灭剂后封片。在细胞核上表达PAX7蛋白的为阳性，反之为阴性。

所获得的肌肉单核细胞经培养两天后，肌肉干细胞的重要转录因子PAX7的表达比例超过92％(图5)。

实施例3猪肌肉干细胞诱导分化

所述的肌肉干细胞在基质胶预处理的细胞培养皿培养3-5天，培养基为基础培养基和添加物，基础培养基为包括79％F-10、20％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗(均为体积百分比)的培养基，所述添加物包括成纤维细胞生长因子2，所述成纤维生长因子2的浓度为1-10ng/ml。细胞达到95％密度时，进行诱导分化实验。将其用预热37℃的PBS清洗一次，加入分化培养基，分化培养基为包括97％DMEM培养基、2％马血清、1％青霉素-链霉素双抗(均为体积百分比)。在37℃培养3-4天后，在显微镜下观察，出现大量细胞融合的肌管则为分化完全。

获得的分化的细胞，用磷酸缓冲液洗1-2次。用4％(质量体积比)甲醛固定，室温15分钟。用磷酸缓冲液清洗3次，加入0.05％(体积百分比)的Triton x-100，室温通透15-20分钟。用PBS洗3次，加入MyHC抗体，4℃过夜。用磷酸缓冲液洗三次，每次5分钟。加入1：500(体积比)稀释的荧光标记的二抗，室温孵育1-1.5小时。用PBS洗三次，加入含有DAPI的抗猝灭剂后封片。在莱卡荧光显微镜下观察拍照。能够观察到细胞分化为成熟肌管，表达MyHC蛋白，判断为有分化潜能。没有肌管形成，不表达MyHC蛋白，判断为无分化潜能。

应用本发明分选的肌肉干细胞，第1-2代细胞体外分化效率(表达MyHC蛋白)在85-90％以上(图6)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.一种高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1：无菌收集猪肌肉组织，除菌处理；

S2：将S1获得的猪肌肉剪碎，置于含有1～3vol％的青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液中，将碎肌肉加入混合酶液中孵育消化，所述混合酶液包括胶原酶和中性蛋白酶，所述胶原酶和中性蛋白酶的质量比例为1:1-2:1，所述消化过程还包含采用机械方式促进消化过程；

S3：终止消化，产物离心，收集沉淀，得到含有肌肉干细胞的单核细胞群；

S4：纯化上述单核细胞群，即得到猪肌肉干细胞；所述纯化包括初步纯化和分选纯化；

所述初步纯化为将S3所得沉淀滤网过滤，低渗法去除红细胞，贴壁法去除悬浮细胞；所述分选纯化方法为流式细胞分选法。

2.根据权利要求1所述的高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法，其特征在于，S1所述无菌收集猪肌肉组织为肌肉活检取样或者屠宰场现杀猪肌肉采样；

优选的，为从屠宰场现杀猪肌肉取样，所述现杀猪肌肉采样为从死亡30min以内的猪样品中获取猪肌肉组织；

所述除菌处理为将获得的猪肌肉组织置于70vol％乙醇溶液中1-2分钟；

优选的，将除菌处理获得的猪肌肉组织保存在含有3vol％青霉素-链霉素双抗中；更优选的，取得猪肌肉组织后，在24h以内进行下一步。

3.根据权利要求1所述的高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法，其特征在于，所述S2中，为将肌肉剪碎至0.5-1.5mm³，所述含有青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液中，包括青霉素-链霉素的质量分数为3vol％，其中，青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。

4.根据权利要求1所述的高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法，其特征在于，S2所述混合酶液的质量体积浓度为0.05-0.5％，碎肌肉和混合酶液的质量体积比例为1:2-1:4，在37℃孵育30～90min。

5.根据权利要求1所述的高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法，其特征在于，S2所述机械方式为，消化过程中，每隔10分钟用5-50ml的移液管和/或医用注射器吹打消化混合物；

所述消化的终点为消化混合物流畅通过10ml移液管或10-20G的注射器针头；优选的，为消化混合物流畅通过10-16G的注射器针头。

6.根据权利要求1所述的高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法，其特征在于，S3所述终止消化为，向S2获得的消化混合物中加入1倍体积的包括79％vol F-10、20vol％胎牛血清、1vol％青霉素-链霉素双抗的培养基以及0.5倍体积的PBS，并充分混匀。

7.根据权利要求1所述的高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法，其特征在于，S3所述离心为使用50-150g离心3min，保存上清，向沉淀中加入适量PBS溶液，混合后50-150g离心3min，合并两次上清液，在500g-1500g的条件下离心5-10分钟，取沉淀，所得的细胞为含有肌肉干细胞的单核细胞群。

8.根据权利要求1所述的高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法，其特征在于，S4中，所述初步纯化，为向沉淀中加入PBS，反复吹打后通过100μm的滤网过滤，500g-1500g的条件下离心5-10分钟，取下方沉淀，加入红细胞裂解液，冰上静置5-10min，加入10倍体积的PBS终止裂解，并通过40μm的滤网过滤，500g-1500g的条件下离心5-10分钟，去上清，所得细胞沉淀直接冻存或在胶原蛋白预处理的细胞培养皿铺板培养，去除不贴壁的血液类细胞，得到肌肉单核细胞，优选的，所述铺板培养为将细胞培养2-4天。

9.根据权利要求1所述的高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法，其特征在于，S4中，所述分选纯化为流式细胞分选法，用于流式分选的表面标志物为CD56,CD29,CD31,CD45，所述抗体的分选策略为先选取CD31,CD45的阴性细胞，再选取CD56和CD29的阳性细胞，即为猪的肌肉干细胞。

10.根据权利要求1所述的高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法，其特征在于，所述方法还包括S5：将S4纯化得到的猪肌肉干细胞培养，进行纯度鉴定；

优选的，所述S5的具体操作为：

(1)向纯化的肌肉干细胞中加入培养基，进行细胞培养后进行PAX7蛋白的阳性率验证；

(2)细胞培养达到95％密度时，进行诱导分化实验，将培养得到的猪肌肉干细胞加入分化培养基，诱导分化成为肌管，进行肌管MyHC蛋白的阳性率验证；

进一步优选的，(1)中所述培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为包括79vol％F-10、20vol％胎牛血清、1vol％青霉素-链霉素双抗的培养基，所述添加物包括成纤维细胞生长因子2，所述成纤维生长因子2的浓度为1-10ng/ml；

更进一步优选的，(2)中所述分化培养基为包括97vol％DMEM培养基、2vol％马血清、1vol％青霉素-链霉素双抗。

11.权利要求1～10中任一项所述的高纯度猪肌肉干细胞分离纯化方法在研究和/或生产培养肉中的应用。