CN107446891A - 一种以自身脐带间充质干细胞作为基质细胞扩增人类脐带血造血干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种以自身脐带间充质干细胞作为基质细胞扩增人类脐带血造血干细胞的方法。本发明提供了一种体外大量扩增CB‑HSCs的方法，即利用来自自身的脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymalstem cells，UCMSC)作为基质细胞与CB‑HSCs共培养，从而模拟CB‑HSCs在体内的生长微环境，用此方法可有效扩增CB‑HSCs，而且扩增后的细胞克服了细胞因子扩增法的易于损伤、崩解等缺陷。

Description

一种以自身脐带间充质干细胞作为基质细胞扩增人类脐带血 造血干细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种以自身脐带间充质干细胞作为基质细胞扩增人类脐带血造血干细胞的方法。
背景技术
脐血造血干细胞具有取材方便，对人类白细胞抗原(HLA)的匹配容忍度高，移植物抗宿主的反应发生率低等优点，因此，可能成为理想的骨髓干细胞移植的替代源，故而脐带血被认为是除了骨髓移植以外，治疗血液系统疾病，尤其是血液系统肿瘤的重要资源。然而由于单份脐血中造血干细胞数量较少，限制了它在临床上的广泛应用，而体外扩增脐血造血干细胞(cord blood hematopoietic stem cells,CB-HSCs)，增加其数量是提高移植效果的重要环节。
传统的脐血造血干细胞分离培养方法是单独用细胞因子刺激单个核细胞，但效果不令人满意，而且用此方法扩增的CB-HSCs易于损伤、崩解，移植后增殖能力差。
间充质干细胞是干细胞家族的又一重要成员，其来源于早期的中胚层和外胚层。体外培养(或间接体内)扩增的研究已经证明骨髓间充质细胞与脐血干细胞一同培养，可增加造血干细胞的扩增数量和速度。但骨髓细胞来自其他个体，增加了移植供体HLA差异的复杂性。脐带间充质干细胞(UCMSC) 中含大量多潜能的干细胞和前体细胞，其可以向多种细胞进行分化，如心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、成脂细胞、神经细胞等，是一个天然的干细胞来源。其与骨髓基质细胞的分化方向相似，其与造血干细胞(CB-HSCs)共同培养，可为后者营造一个很好的生长和增殖的环境，如果能够以脐带间充质干细胞为滋养细胞对来促进造血干细胞进的繁殖会给干细胞移植提供更多的选择。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种以自身脐带间充质干细胞作为基质细胞扩增人类脐带血造血干细胞的方法。本发明提供的细胞培养液用于造血干细胞的扩增效率更高。
本发明还提供了一种脐血造血干细胞的分离培养方法，包括：
以脐带间充质干细胞为滋养细胞与脐血单个核细胞共培养，14～21天后收集非粘附细胞，即为脐血造血干细胞；所述共培养培养的细胞培养液，由基础培养基、干细胞生长因子、flt3配体、促血小板生成素、IL-6、IL-3、多效生长因子和亚叶酸钙组成。
所述共培养培养的细胞培养液中，各组分的浓度为：
所述脐带间充质干细胞与脐血单个核细胞的数量比为10:1～1:1；所述脐血单个核细胞的培养密度为5×104～1×106cell/ml。
脐带间充质干细胞的制备方法中，所述脐带组织可为新鲜脐带组织也可为冻存后复苏的脐带组织。所述脐带组织与脐血优选来自同一个体。
本发明中，从新鲜脐带组织中制备脐带间充质干细胞的方法包括：
用胶原酶消化脐带组织后，离心收集细胞沉淀，培养液(MesenCultTM-ACF 培养液：MesenCultTM-ACF 5×Supplement培养液＝4：1)洗涤细胞沉淀后，以培养液(MesenCultTM-ACF培养液：MesenCultTM-ACF 5×Supplement培养液＝4：1)培养，每2～3天换一次培养液，贴壁细胞即为脐带间充质干细胞。待细胞融合度达到80％～90％时，用胰酶消化后，用培养液(MesenCultTM-ACF培养液：MesenCultTM-ACF 5×Supplement培养液＝4：1)重悬后进行传代。
所述脐带组织的冻存方法为：将脐带组织碎块在冻存液存在条件下。 -4～4℃放置30min后冷冻至-90℃，然后转移至-160℃液氮中保存。所述冻存液为含有10％二甲亚砜(DMSO)和90％商品化的无血清干细胞培养基。
冻存脐带组织复苏的方法为：将冻存管从液氮中取出，在37℃水浴中融化。
从冻存的脐带组织中制备脐带间充质干细胞的方法包括：
用胶原酶消化脐带组织后，离心收集细胞沉淀，培养液(MesenCultTM-ACF 培养液：MesenCultTM-ACF 5×Supplement培养液＝4：1)洗涤细胞沉淀后，以培养液(MesenCultTM-ACF培养液：MesenCultTM-ACF 5×Supplement培养液＝4：1)培养，每2～3天换一次培养液，贴壁细胞即为脐带间充质干细胞。当细胞融合度达到80％～90％时，加入胰酶进行消化，之后用培养液 (MesenCultTM-ACF培养液：MesenCultTM-ACF 5×Supplement培养液＝4：1) 重悬后进行传代培养。
本发明中，所述共培养可为将间充质干细胞与脐血单个核细胞混合后共同培养，也可以间充质干细胞为滋养层，实验表明，将间充质干细胞与脐血单个核细胞共同悬浮培养效果更佳。
本发明实施例中，以间充质干细胞为滋养层；所述滋养层的制备方法为：用商品化的无血清、无动物成分的人间充质干细胞培养液重悬脐带间充质干细胞种植于明胶包被的培养容器中，5％CO2，37℃培养48小时后用PBS洗一次，获得滋养层。
本发明制备滋养层采用的脐带间充质干细胞可为新鲜制得，也可为冻存后复苏获得。
本发明所述脐血单个核细胞的分离方式为：将以3倍体积PBS(含0.1％ BSA，0.6％柠檬酸，pH7.4)稀释的脐血，铺于Ficoll-Hypaque分层液上，稀释的脐血与Ficoll-Hypaque分层液的体积比为4:3；然后800g，离心30min；收集界面层细胞，用PBS洗三次；第一次，500g离心20min，收集沉淀，第二次和第三次400g离心5min，收集沉淀，获得脐血单个核细胞。
本发明培养的单个核细胞可为冻存的细胞，也可为新鲜分离的单个核细胞。冻存单个核细胞的冻存液采用混合细胞培养基(无血清培养基StemSpan TM SFEMII+StemSpanTMCD34+Expansion Supplement)加10％DMSO和 6％细胞外的冷冻保护剂羟乙基淀粉(HES)，冻存的温度为-160℃～-190℃。
本发明所述分离培养方法培养得到的造血干细胞。
本发明所述的分离培养方法培养得到的造血干细胞在疾病治疗中的用途。
本发明中所述的疾病为血液系统疾病、神经系统疾病或心血管疾病。
本发明提供的细胞培养液，由基础培养基、干细胞生长因子、flt3配体、促血小板生成素、IL-6、IL-3、多效生长因子和亚叶酸钙组成。
本发明提供的细胞培养液中各组分的浓度为：
一些实施例中，各组分的浓度为：
本发明将干细胞生长因子、flt3配体、促血小板生成素、IL-6、IL-3、多效生长因子和亚叶酸钙添加入无血清的干细胞培养基中，从而对造血干细胞的生长起到很好的促进作用，各物质相互配合，相较于其他现有配方具有更好的效果。以该培养液对脐血单个核细胞进行培养，能够在14～21天内获得大量造血干细胞。并且，采用该培养液可以省略在培养前纯化CD34+细胞的过程，避免了细胞的丢失，进一步的保证了获得细胞的数量。
本发明提供的细胞培养液中，基础培养基为无血清干细胞培养基。
本发明中，采用的无血清干细胞培养基为StemSpanTM SFEM II。
本发明提供的培养液中还包括1vol％的青霉素-链霉素。
本发明提供的细胞培养液在脐血造血干细胞分离培养中的应用。
本发明提供了一种以自身脐带间充质干细胞作为基质细胞扩增人类脐带血造血干细胞的方法。本发明所提供的方法将大大增加脐血造血干细胞 (CB-HSCs)的扩增倍数，保证CB-HSCs的细胞活性和在宿主体内的增殖能力。脐带组织取材方便，可提供大量CB-HSCs的滋养细胞。
本发明还简化了从冻存的脐带组织分离脐带间充质干细胞的方法，为 CB-HSCs与脐带间充质干细胞同步培养提供了可能。
由于移植细胞与滋养细胞来自同一供体，保持供体细胞HLA单一性，避免了由多个供体移植而增加在脐血移植时移植物抗宿主反应的机会，因此其优越于用其他骨髓基质细胞混和培养扩增脐血造血干细胞的方法。而且本方法取材容易，操作方便。
具体实施方式
本发明提供了一种以自身脐带间充质干细胞作为基质细胞扩增人类脐带血造血干细胞的方法。，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1脐带血单个核细胞收集、培养、冻存及复苏
1.脐带血的收集
采集健康正常分娩的新生儿脐带血，大约40-50ml，于8～12小时内分离单个核细胞。
2.单个核细胞的分离
用3倍体积的PBS(含0.1％BSA,0.6％柠檬酸,pH7.4)稀释脐血，并铺于Ficoll-Hypaque分层液上,20ml细胞悬液/15ml Ficoll,并离心800g,30min。收集界面层细胞，用PBS洗三次,第一次，20min 500g离心,第二和三次5min, 400g离心。重悬于无血清培养基StemSpanTM SFEMII+StemSpanTM CD34+ Expansion Supplement中，获得总脐带血细胞。为保证与脐带间充质干细胞培养同步，分离的细胞可先冻存。
3.脐带血细胞液氮冻存
脐带血细胞冻存于10％二甲亚砜(DMSO)和6％细胞外的冷冻保护剂羟乙基淀粉(HES)的混合细胞培养基(无血清培养基StemSpanTM SFEM II+ StemSpanTM CD34+Expansion Supplement)中。液氮温度-160～190℃。
4.细胞复苏：将细胞冻存管在37℃水浴融化后，迅速按1:1的比例用稀释液(2.5％人白蛋白和5％Dextran 40)稀释，室温下孵育10min。然后用上述IMDM培养基稀释并离心800g,15min。重悬细胞于上述培养基中。
实施例2脐带间充质干细胞的分离与培养
1.从新鲜组织中分离和培养脐带间充质干细胞
1)取材和处理：从医院获取正常分娩的新生儿的脐带，收集脐带血(见实施例1)。
将脐带组织用PBS洗涤3次，除去残留血液，浸入70％酒精30秒后立即用PBS清洗。无菌剪断脐带，每段2～3厘米，用灭菌的手术刀片和镊子将脐带组织切碎(大约2mm3)。
2)酶处理：将剪碎的脐带组织用胶原酶消化。将剪碎的脐带组织置于0.05％胶原酶IV(用DMEM/F-12配制，含100mM L-谷氨酰胺,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素和10％FCS)中，放置冰上30～45min。加5～10ml培养液(成分如下)重悬细胞沉淀。
3)体外培养：培养液成分：MesenCultTM-ACF培养液，无血清，无动物成分的人间充质细胞培养液(按Stemcell Technology)说明书混和MesenCultTM -ACF Basal Medium(Cat#05451)400mL和MesenCultTM-ACF 5X Supplement (Cat#05452)100mL)。将细胞种植于25ml培养瓶中，每2-3天换一次培养液。细胞培养在37℃，二氧化碳培养箱中。贴壁细胞融合形成单层后，可将细胞用胰酶重悬并在150ml培养瓶中继续培养。大约三次传代培养后(11～12 天)，利用流式细胞仪分析细胞表型，之后可用于造血干细胞共同培养或冻存。
2.从冻存组织中分离脐带间充质干细胞
(1)脐带组织的冻存
1)脐带采集
采集健康正常分娩的新生儿脐带20～30cm，在6～12小时内于实验室进行处理。
2)组织冻存前处理
组织处理同新鲜组织，首先用无菌纱布除去残余血，用70％酒精消毒，无菌刀片切脐带组织至2×2×2mm,将组织碎块转移至离心管，加5～10ml无菌生理盐水，100g离心,5min,洗一次。
3)组织冻存
将组织碎块分成几组，每组8～10块，加入冻存液后分别冻存于3.6ml冻存管内。
冻存液成分：含有10％DMSO的无血清培养基(KnockOutTM Serum Replacement，Life Technologies，Cat#10828010)，将冻存管放置冰上30min，按脐带血干细胞冻存的降温程序降温，冻存。冻存管冷冻至-90℃后，转移至 -160℃液氮中。
(2)组织复苏
结束冻存后，冻存管在37℃水浴快速融化。转移细胞悬液至15ml离心管，用过量的冷培养液(含有100mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和10％FCS的DMEM/F-12培养基)稀释并洗去冻存液，离心 100g,5min。
(3)复苏的组织中脐带间充质干细胞的分离、培养
在用培养液洗过的组织中加入含胶原酶的培养液(含0.05％胶原酶IV的 DMEM/F-12培养基，加入100mM L-谷氨酰胺,100U/ml青霉素,100μg/ml 链霉素和10％FCS)，放置冰上45～60min后用5～10ml培养液(成分如下) 重悬细胞沉淀。
(4)脐带间充质干细胞的体外扩增
用培养液洗去胶原酶，将组织块转移至35mm培养皿。铺匀，加2ml培养液(如上)，放入5％CO2,37℃培养箱中培养。扩增的MSC经用 75Gy(7500rad)gamma-射线照射后(gammaCell 1000Elite 137Cs-irradiator)，细胞用无血清冻存液MesenCultTM-ACFFreezing Medium(Stemcell Technologies， Cat#05490)。
第一次换液是在细胞分离后16～18小时。每2～3天换液一次，2周后，移去残留的组织。再过1周后用胰酶-EDTA消化，并用生理盐水重悬细胞，用新鲜培养液稀释(1：5～10)后，种植于新的培养皿或培养瓶内，待长满融合时消化、传代、扩增。大约6～7代可冻存或用于扩增脐血造血干细胞。
(5)脐带间充质干细胞的复苏培养
在与脐血干细胞共同培养两天前复苏，将5×105的gamma射线照射的脐带间充质干细胞铺于事先用0.1％明胶包被的24孔培养板(室温下放置孵育 15-20min，用真空吸管移去明胶),将细胞悬液铺于培养板内，放入5％ CO2,37℃培养箱内进行培养。48小时后用PBS洗一次，然后用于与脐血干细胞共同培养。
实施例3脐带血造血干细胞(CB-HSCs)与脐带间充质干细胞的共培养
(1)培养板(或瓶)内培养
在移植前2周复苏脐血总的有核细胞，将脐血细胞(5×104cell/ml)以表1 条件进行培养，其中滋养细胞制成滋养层：
表1培养条件
37℃，CO2孵箱中培养，每7天检测一次细胞数量，14-21天后，移出并收集非贴壁细胞，通过细胞计数仪进行计数。FACS鉴定CD34+细胞，并分选CD34+细胞，扩增的脐带血细胞用抗人的CD34抗体鉴定，分选并收集 CD34+/CD38-细胞。结果如表2：
表2：培养结果
组别 细胞扩增倍数 CD34表达 CD38表达
A 50 + -
B 145 + -
C 200 + -
D 300 + -
结果显示：本发明所用的方法即D方法可使脐血造血干细胞的扩增倍率达到300倍，C方法可使脐血造血干细胞的扩增倍率达到200倍，B方法可使脐血造血干细胞的扩增倍率达到145倍，而传统的A方法只能使脐血造血干细胞的扩增倍率达到50倍。经统计学分析，D组的扩增效果显著优于A、B、 C组，p<0.05。
(2)培养袋内扩增
脐血单个核细胞(CBT)放入含有滋养细胞的50mL培养液中，培养液配方同表1A～D，滋养细胞也同表1A～D，但不做成滋养层，滋养细胞与培养细胞一同悬浮培养。将细胞在100ml培养袋中培养，每天计数，7天后，根据细胞密度可考虑将细胞移入1L培养袋。14后收获细胞，并计数，FACS分析，并分选CD34+/CD38-细胞。
表3培养结果
组别 CBT与UCMSC的数量比 细胞扩增倍数 CD34表达 CD38表达 集落数
a CBT 80 + - 120个
b CBT：BMSC＝1：10 240 + - 230个
c CBT：UCMSC＝1：10 320 + - 350个
d CBT：UCMSC＝1：10 420 + - 480个
实验结果表明，此方法可增加扩增倍数。本发明所用的方法即d可使脐血造血干细胞的扩增倍率达到420倍，集落数为480个，c方法可使脐血造血干细胞的扩增倍率达到320倍，集落数为350个，b可使脐血造血干细胞的扩增倍率达到240倍，集落数为230个，而传统的a方法只能使脐血造血干细胞的扩增倍率达到80倍，集落数为120个。经统计学分析，在扩增倍数和形成的集落数方面，d组效果皆显著优于a、b、c组，p<0.05。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种脐带造血干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括：
以脐带间充质干细胞为滋养细胞与脐血单个核细胞共培养，14～21天后收集非粘附细胞，即为脐血造血干细胞；所述共培养的细胞培养液，由基础培养基、干细胞生长因子、flt3配体、促血小板生成素、IL-6、IL-3、多效生长因子和亚叶酸钙组成。
2.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，所述共培养的细胞培养液中，各组分的浓度为：
3.根据权利要求1～2任一项所述的分离培养方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞与脐血单个核细胞的数量比为10:1～1:1；所述脐血单个核细胞的培养密度为5×104～1×106cell/ml。
4.根据权利要求1～2任一项所述的分离培养方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的制备方法为：
用胶原酶消化脐带组织后，离心收集细胞沉淀，培养液洗涤细胞沉淀后，以培养液进行培养，每2～3天换一次培养液，贴壁细胞即为脐带间充质干细胞；胰酶消化重悬后传代；所述培养液由体积比为4:1的MesenCultTM-ACF培养液和MesenCultTM-ACF 5×Supplement培养液组成。
5.根据权利要求1～2任一项所述的分离培养方法，其特征在于，所述脐血单个核细胞的分离方法为：
将以3倍体积PBS缓冲液稀释的脐血，铺于Ficoll-Hypaque分层液上，稀释的脐血与Ficoll-Hypaque分层液的体积比为4:3；
然后800g，离心30min，收集界面层细胞；
界面层细胞用PBS洗三次后收集沉淀，获得脐血单个核细胞；
所述PBS缓冲液中含质量分数为0.1％的BSA，质量分数为0.6％的柠檬酸，pH 7.4。
6.权利要求1～5任一项所述分离培养方法培养得到的造血干细胞。
7.一种细胞培养液，其特征在于，由基础培养基、干细胞生长因子、flt3配体、促血小板生成素、IL-6、IL-3、多效生长因子和亚叶酸钙组成。
8.根据权利要求7所述的细胞培养液，其特征在于，各组分的浓度为：
9.根据权利要求7所述的细胞培养液，其特征在于，所述基础培养基为无血清干细胞培养基。
10.权利要求7～9任一项所述的细胞培养液在造血干细胞分离培养中的应用。
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