CN101597594A - 一种造血干祖细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种采用藻酸盐三维培养系统体外扩增人脐血造血干祖细胞的方法。本发明联合应用SCF、TPO和FL细胞因子支持脐血单个核细胞中造血干祖细胞的扩增，不加用其他细胞因子，采用包装在藻酸盐微球内的人脐血单个核细胞培养于三维静止培养系统和三维旋转培养系统，观察脐血单个核细胞包装于藻酸盐微球内后在旋转培养系统的扩增效果。与常规二维系统比较，本发明在低浓度细胞因子培养条件下，细胞总数上升，CD34+细胞明显增加；在三维培养体系扩增的细胞其粒巨系克隆形成细胞亦明显增多，移植NOD/SCID小鼠可在移植细胞总数少的情况下，在小鼠体内更好植活，重建造血。

Description

一种造血干祖细胞的培养方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种造血干祖细胞的培养方法，尤其涉及一种采用藻酸盐三维培养系统体外扩增人脐血造血干祖细胞的方法。

背景技术

目前体外扩增人造血干祖细胞的常规培养体系是将取自骨髓、外周血或脐血的单个核细胞或纯化的CD34+细胞以单个细胞悬浮培养的形式培养于培养皿或培养瓶中。造血干细胞通常处于相对休眠的惰性状态，常规培养体系细胞培养液中需加入较大剂量的多种细胞因子的组合来刺激造血干细胞进入增殖周期，以诱导细胞分裂扩增。研究显示，大剂量的细胞因子对造血干细胞是过于强烈的刺激信号，由此导致的结果是扩增后的细胞被诱导分化成熟，丧失了造血干细胞自我更新和重建造血的潜能，导致扩增以后的细胞无法维持长期造血(Rice，A.，Flemming，C.，Case，J.，et al.[J].Bone Marrow Transplant，1999，23(3)：211-20)。临床实践需要，体外扩增人脐血造血干祖细胞的方法应是简单、经济、安全而有效的。已报道的用于造血干祖细胞扩增的细胞因子有很多种，最为多见的是SCF、TPO、FL、GM-CSF、EPO、IL-3和IL-6等，在多种的细胞因子中，SCF、TPO和FL是对造血干祖细胞扩增最为关键的细胞因子(Hofmeister，C.C.，Zhang，J.，Knight，K.L.，et al.[J].Bone MarrowTransplant，2007，39(1)：11-23.Bhatia，M.，Wang，J.C.，Kapp，U.，et al.[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(10)：5320-5.Murray，L.J.，Young，J.C.，Osborne，L.J.，et al.[J].Exp Hematol，1999，27(6)：1019-28.Gammaitoni，L.，Bruno，S.，Sanavio，F.，et al.[J].Exp Hematol，2003，31(3)：261-70.)。常规二维培养系统中，此三种细胞因子用于造血干祖细胞扩增时的使用浓度在50~300ng/ml(Luens，K.M.，Travis，M.A.，Chen，B.P.，et al.[J].Blood，1998，91(4)：1206-15.Piacibello，W.，Sanavio，F.，Garetto，L.，et al.[J].Leukemia，1998，12(5)：718-27.Fietz，T.，erdel，W.E.，Rieder，H.，et al.[J].Bone Marrow Transplant，1999，23(11)：1109-15.Drouet，M.，Herodin，F.，Norol，F.，et al.[J].Stem Cells，2001，19(5)：436-42.Ryu，K.H.，Shin，H.Y.，Ahn，H.S.，et al.[J].Haematologica，2004，89(5)：606-7.Levac，K.，Karanu，F.，and Bhatia，M.[J].Haematologica，2005，90(2)：166-72.)。

在实验研究中，常需要多种细胞因子联合应用，称为细胞因子鸡尾酒(cytokinescocktail)。由于细胞因子非常昂贵，用于扩增造血干祖细胞培养的细胞因子种类使用的越多，剂量使用的越高，则扩增的成本就越高。改变体外培养方式是扩增造血干祖细胞的效率的策略之一。在成体体内，造血干细胞生存于骨髓微环境中。在骨髓微环境里，造血干细胞与造血干细胞之间，造血干细胞与基质细胞之间，造血干细胞与细胞外基质之间都有相互的接触并互相作用。这种互相作用，是维持造血干细胞自我更新和重建造血能力的因素之一(Verfaillie，C.M.[J].Nat Immunol，2002，3(4)：314-7.)。因此，将单个核细胞或纯化CD34+细胞培养于模拟骨髓微环境的培养体系中有可能提高扩增造血干祖细胞的效率。三维(3dimentional，3D)培养体系由此被设计用于扩增造血干祖细胞。三维培养体系是应用各种材质为基质，建立三维微网络结构的培养基质，而细胞就被培养在三维微网络结构中生长。有报道将纯化CD34+细胞放置入预先制造的胶原或“Cytomatrix”三维培养体系中(Ehring，B.，Biber，K.，Upton，T.M.，et al.[J].Cytotherapy，2003，5(6)：490-9.Kim，H.S.，Lim，J.B.，Min，Y.H.，et al.[J].Int J Hematol，2003，78(2)：126-32.)培养，取得一定的扩增造血干祖细胞的效果。但是现有技术所述的预制的三维培养体系无法保证足够的孔径和间隙让所有所加入的细胞都能进入三维培养基质内。

藻酸盐成分来自于褐藻，是线性单链多聚体，含有β-(1→4)-D-甘露糖醛酸(mannuronic acid，M)残基和α-(1→4)-L-古罗糖醛酸(guluronic acid，G)残基。藻酸盐凝胶微球形成的微网架结构的孔径为5-200纳米，可以允许大分子蛋白质和其他成分以及气体渗透和交换，从而为包装在其内的细胞提供培养液内的所有营养成分、各种细胞因子，并保证氧气和二氧化碳的交换。当钙离子被螯合剂螯合(如枸橼酸盐)，藻酸盐微球即能从固体状态重新回复到液态状态，释放并回收包装在内的细胞。基于以上特性，相当长一段时间以来，被用作食品工业凝胶基质和口服药物外包膜，是一种对人体十分安全的材料。藻酸盐三维系统此前被用于其他多种细胞的培养，但是主要着眼于贴壁生长方式的细胞，尚未有用于扩增人造血干细胞的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种造血干祖细胞的培养方法，尤其涉及一种藻酸盐三维培养系统体外扩增人脐血造血干祖细胞的方法。

本发明采用三维静止培养系统、三维旋转培养系统扩增人脐血单个核细胞内造血干祖细胞，并与传统二维培养系统的扩增效果作比较，为体外扩增人脐血造血干祖细胞提高造血干祖细胞的移植效率提供一种新的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明中，选取对造血干祖细胞最为关键的SCF、TPO和FL这三种细胞因子联合应用来支持脐血单个核细胞中造血干祖细胞的扩增，不加用其他细胞因子，以尽可能减少培养系统的成本，与传统二维培养体系所使用细胞因子浓度相比，本方法采用更为低的浓度。

本发明中，采用包装在藻酸盐微球内的人脐血单个核细胞培养于传统的培养皿中(三维静止培养系统)和旋转的生物反应器容器(美国Synthecon公司)内(三维旋转培养系统)，观察脐血单个核细胞包装于藻酸盐微球内后在旋转培养系统的扩增效果。

结果表明，常规二维培养系统中，在低浓度细胞因子水平，人脐血单个核细胞无法得到数量上的扩增，而CD34+细胞更是明显的减少；而本发明在低浓度细胞因子水平的支持下，培养在三维藻酸盐静止系统的人脐血单个核细胞却已得到扩增，而在旋转培养的三维藻酸盐微球内的脐血单个核细胞在更低浓度的细胞因子支持下能取得程度相仿的扩增；在细胞总数扩增的同时，CD34+细胞的比例增长的更为明显。

本发明中，采用评价造血干细胞最为可靠的NOD/SCID小鼠移植模型评价经过培养后的人脐血单个核细胞中的造血干细胞，结果显示三维培养系统扩增的脐血单个核细胞在移植细胞总数更低时却得到了更好的重建造血能力，提示经三维系统培养扩增后的人脐血单个核细胞内的干细胞数量更多。

本发明所述的藻酸盐三维培养系统，将细胞包装在三维微球内，能拉近细胞与细胞之间的距离，加强细胞之间的相互作用，使得在低浓度和更低浓度的支持下，反而取得了更好的体外扩增体内重建造血的效果。显现出藻酸盐三维微球培养系统在扩增人脐血单个核细胞和其中的造血干祖细胞的明显优势。

本发明的三维培养系统中，用藻酸盐溶液包装细胞以及释放回收细胞的操作过程简单快捷。

本发明中，通过造血克隆形成实验评价造血干细胞在体外培养过程中向不同系列分化的造血能力。实验结果显示，经三维静止培养系统和三维旋转培养系统培养后的人脐血单个核细胞的粒巨系造血克隆数均较培养前明显增加，与二维培养系统比较亦明显增加。同样的，移植了扩增后人脐血单个核细胞的小鼠的脾细胞和骨髓细胞的人源性粒巨系克隆的形成能力，显示三维培养组在移植的细胞数明显低于二维培养组，而三维组的人源性粒巨系克隆形成能力亦明显增加。

本发明所述的藻酸盐三维微球培养体系扩增人脐血单个核细胞的方法具备简单、经济、安全而有效的特点。通过改变人脐血单个核细胞体外培养的环境，运用三维藻酸盐包装细胞进行静止或旋转状态的培养，能达到理想的扩增人脐血造血干祖细胞的效果，具有临床应用的前景。

附图说明

图1是培养于60mm培养皿中的藻酸盐微球，显示了通过27-g针头滴入100mM CaCl₂溶液中形成的藻酸盐-细胞微球直径为1.5~2.5mm，右下方为标尺标示。

图2是三维静止培养体系扩增人脐血单个核细胞数量的不同细胞因子浓度下细胞扩增倍数，图中细胞数量增长曲线显示低浓度细胞因子组和中浓度细胞因子组的细胞数随培养时间增加而增加，无细胞因子组和极低剂量细胞因子组的细胞总数与培养前相比无明显增加，低浓度细胞因子组细胞总数增加最为理想。

图3是三维静止培养系统，低浓度细胞因子组藻酸盐微球内造血细胞克隆，图中显示，自第6天起，藻酸盐微球内出现可见的造血细胞小克隆，造血克隆随着培养时间达到第9天、第12天而逐渐增多并增大，白色箭头指示微球中的造血克隆，图中左下角示显微镜放大倍数，右下角标示标尺。

图4是三维旋转培养体系扩增人脐血单个核细胞数量的不同细胞因子浓度下细胞扩增倍数，图中细胞数量增长倍数曲线显示无细胞因子组的细胞总数与培养前相比无明显增加，低浓度细胞因子组的细胞数随培养时间增加而增加，极低浓度细胞因子组细胞平均扩增在第6天时达到最高峰，至培养第9天、第12天，低浓度细胞因子组和极低浓度细胞因子组细胞总数增加已无明显差异。

图5是三维旋转培养系统，极低浓度细胞因子组藻酸盐微球内造血细胞克隆，图中显示，与三维静止培养系统低浓度细胞因子组相仿，自第6天起，藻酸盐微球内出现可见的造血细胞小克隆，造血克隆随着培养时间达到第9天、第12天而逐渐增多并增大，白色箭头指示微球中的造血克隆，图中左下角示显微镜放大倍数，右下角标示标尺。

图6是三维藻酸盐微球内包装细胞密度对人脐血单个核细胞扩增的影响，单个微球内包装有20000~25000个细胞的在三维静止培养系统低浓度细胞因子培养下，细胞数随培养时间而明显增长，其余各组细胞数增长不明显。

图7是包装细胞加入明胶对人脐血单个核细胞扩增的影响，包装细胞时加入明胶与不加入明胶细胞增殖倍数无明显差异。

图8是不同培养系统扩增人脐血单个核细胞。

图9是流式细胞仪检测脐血单个核细胞中CD34+细胞比例，Day 0：细胞培养以前的脐血单个核细胞；Day 12-2D：常规二维培养系统培养12天回收的细胞；Day 12-3Dstatic：三维静止培养系统培养12天回收的细胞；Day 12-3D RWV：三维旋转培养系统培养12天回收的细胞

图10是二维与三维培养系统培养人脐血单个核细胞前后造血克隆形成细胞数。

图11是NOD-SICD小鼠移植人脐血单个核细胞模型，小鼠外周血人源性CD45+细胞比例，图中第一排为移植后第4周，第二排为移植后第6周，第三排为移植后第8周。实验以γ射线照射对照组数据设零。

图12是NOD-SCID小鼠移植经培养人脐血单个核细胞后8周，脾细胞和骨髓细胞中人源性造血克隆形成细胞数。

为了便于理解，以下将通过具体的实施方式对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。

具体实施方式

实施例1

①实验材料

(1)人脐血单个核细胞分离

单个核细胞分离液：Ficoll-Paque PLUS，Amersham Biosciences AB，Sweden

PBS：Gibco，Invitrogen

0.6％ACD(A)-PBS：枸橼酸钠2g，枸橼酸0.8g，葡萄糖2.23g溶于1L PBS中，Ph调至7.2，0.22μm过滤除菌。

一次性集血袋：上海输血科技公司

(2)藻酸盐三维系统包装与细胞回收

藻酸钠(alginate sodium)：Sigma-Aldrich，USA

明胶(gelatin)：Sigma-Aldrich，USA

溶解缓冲液(Dissolution buffer)：50mM枸橼酸钠，0.45％NaCl，10mM HEPES，pH调至7.2，0.22μm过滤除菌。

(3)细胞培养

培养液：IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)，Gibco Invitrogen，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)：Gibco Invitrogen

细胞因子：

SCF(stem cell factor)：重组人SCF，R&D system

TPO(thrombopoietin)：重组人TPO，R&D systems

FL(Flt-3-ligand)：重组人FL，R&D systems

(4)流式细胞仪检测

PE标记鼠抗人CD34单克隆抗体：BD Biosciences

PE标记鼠同型抗体：BD Biosciences

PerCP标记鼠抗人CD45单克隆抗体：BD Biosciences

ACK缓冲液：KHCO3 1.0g/L，EDTA-二钠0.0168g/L，NH4Cl 4.415g/L

(5)克隆形成实验(Colony forming cell assay，CFC assay)

人源性克隆形成实验半固体培养基：Methocult GF H4435，Stem Cell Technologies；Vancouver，Canada。该培养基为IMDM培养基，含1％甲基纤维素(4000cps)，30％FBS，1％牛血清白蛋白，10^-4M 2-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，以及下列人源性细胞因子：50ng/mL SCF，20ng/mLgranulocyte/macrophage-colony stimulator factor(GM-CSF)，20ng/mL interleukin-3(IL-3)，20ng/mL IL-6，20ng/mL granulocyte-colony stimulator factor(G-CSF)，and 3U/mL Erythropoietin(EPO)。

②主要实验仪器

细胞培养箱：Precision Scientific CO2 Incubator

旋转培养仪：Synthecon，Boston，TX，USA

γ射线辐照仪：Gammacell 1000Elite，MDS Nordion，Canada

离心机：Eppendorf centrifuge 5804

③实验步骤与方法

(1)人脐血单个核细胞分离收集

人脐血样本采集：取离体胎盘置高，脐静脉采集脐血。脐血依重力流入含ACD(B)或CPD2B抗凝剂的一次性使用血液采集袋(上海输血技术公司)中。所有供者捐赠前签署知情同意书。分离单个核细胞前，脐血样本始终保存于4℃的环境中。

人脐血单个核细胞分离：新鲜脐血在采集后6个小时之内进行单个核细胞的分离。分离脐血单个核细胞采取Ficoll-Paque PLUS密度梯度离心法。新鲜抗凝脐血与0.6％ACD(A)-PBS以1∶1稀释，2800g离心15分钟，缓慢加速缓慢减速，弃上清，收集富白细胞层。富白细胞层混匀，再以0.6％ACD(A)-PBS 1∶1稀释，仔细铺于Ficoll-PaquePLUS细胞分离液上，注意不破坏交界层。20℃温度下700g离心20分钟，缓慢加速缓慢减速，仔细吸取单个核细胞层，以0.6％ACD(A)-PBS洗涤细胞两次(200g，5分钟)，IMDM洗细胞一次(200g，5分钟)，计数有核细胞数量。采集后的脐血单个核细胞直接用于培养，或重悬于10％DMSO-40％FBS-IMDM冻存液，冷冻保存于液氮中以备后续培养。

(2)藻酸盐三维微球脐血单个核细胞包装及回收

脐血单个核细胞包装于藻酸盐三维微球：新鲜或解冻后的脐血单个核细胞重悬于1.1％藻酸盐溶液或1.1％藻酸盐-0.1％明胶溶液，混匀。单个核细胞-藻酸盐溶液混合物通过27-g针头逐滴滴入100mM氯化钙溶液中，固态微球即刻形成，于氯化钙溶液中旋转6至10分钟以使微球硬化成型。PBS洗微球三次，然后转移至培养液中，置于培养皿中(三维静止培养体系)或RWV容器中(三维旋转培养体系)培养。

脐血单个核细胞释放与回收：包装于藻酸盐微球内的细胞可以通过使用溶解缓冲液释放和回收。藻酸盐微球置于溶解缓冲液中缓速旋转10分钟后即可充分溶解，回复溶液状态，300g离心10分钟回收释放出的细胞。PBS洗细胞两次，IMDM洗细胞一次，均为200g离心5分钟，加入培养液重悬细胞，进行后续实验。

(3)细胞培养

三维静止培养系统：其中，包装后的三维藻酸盐人脐血单个核细胞微球培养于静止的培养皿中。细胞培养液为15％FBS-IMDM，加入下列细胞因子组合：stem cell factor(SCF，10-50ng/ml，R&D systems)，flt-3-ligand(FL，5-20ng/ml，R&D systems)，和thrombopoietin(TPO，5-20ng/ml，R&D systems)，置37℃，5％CO₂培养箱中培养。

对三维静止培养系统细胞因子组合合适的浓度进行选择，培养过程中每三天半量换液，加入全量细胞因子。包装后即刻(day 0)与培养的第3、6、9、12天各回收30个微球内的细胞，台盼蓝染色计数活细胞数。以包装后即刻回收的细胞为基数1，计算培养后第3、6、9、12天细胞扩增倍数。培养第12天回收其余所有微球内的细胞，检测CD34阳性细胞比例，接种人克隆形成实验培养基，并准备移植给NOD/SCID小鼠。

三维旋转培养系统：在三维旋转培养系统里，包装后的藻酸盐三维脐血单个核细胞微球培养于RWV 10ml容器内，安装于NASA旋转培养生物反应器，置培养箱内，37℃，5％CO₂培养。旋转生物反应器设定转速17rpm，可使微球悬浮于培养液中。培养液成分及细胞因子如上述。同上述，对三维旋转培养系统扩增人脐血造血干祖细胞所需细胞因子组合的合适浓度进行选择研究。细胞计数、CD34+细胞检测、人克隆形成实验接种和NOD/SCID小鼠移植同上。

常规二维培养系统：二维培养系统作为三维培养系统的对照，脐血单个核细胞直接培养于培养皿中，细胞呈悬浮生长模式，细胞培养液同上，本发明中，所用的细胞因子组合的浓度为三维培养系统优化后的浓度。每三天半量换液，并加入全量细胞因子。细胞初始(第0天)培养密度为2×10⁵/ml。培养后第3、6、9、12天台盼蓝染色计数活细胞数，细胞数超过1×10⁶/ml时重新接种细胞密度为2×10⁵/ml。以第0天细胞数为基数1，计算第3、6、9、12天细胞增殖倍数。培养第12天回收所有细胞，检测CD34阳性细胞比例，接种人克隆形成实验培养基，准备NOD/SCID小鼠移植。

(4)造血干祖细胞检测

流式细胞仪检测CD34+细胞：取培养前(day 0)脐血单个核细胞，于培养第12天(day 12)收集三维培养系统释放回收细胞及二维培养系统细胞各1~2×10⁵，2％FBS-PBS洗一次，加入PE标记CD34单抗10μl，4℃避光放置30~40分钟，2％FBS-PBS洗一次，加入200μl 2％FBS-PBS重悬细胞，加入4％多聚甲醛200μl(终浓度2％)，行流式细胞仪检测。实验设加入小鼠同型单克隆抗体，处理过程相同的同型对照。

克隆形成实验(Colony forming cell assay，CFC)：分别取培养前(day 0)脐血单个核细胞和培养第12天三维及二维培养系统回收细胞，重悬于2％FBS-IMDM，调整细胞至1~2×10⁵/ml。取分装冻存Methocult培养基(3ml/支)37℃水浴锅解冻，加入细胞悬液300μl，混匀，静置5分钟除去气泡。3ml注射器16-g针头吸取1.1ml细胞-培养基混合物缓慢注入一个35mm培养皿中，每个样本设2个重复培养皿，置饱和湿度、37℃、5％CO₂培养箱中培养12~14天。倒置显微镜下计数细胞数大于50个的细胞克隆(红系克隆BFU-E，粒巨系克隆CFU-G/GM)，计算每10⁵细胞内红系和粒巨系克隆数。

(5)NOD/SCID小鼠异种移植模型

NOD/SCID小鼠分组和移植：NOD/SCID小鼠购自香港中文大学，饲养于独立无菌笼内，饲以高温消毒无菌饮食，所有对小鼠的操作于超净台内完成。

移植模型设4组：

①γ射线照射对照组：3只小鼠，仅照射γ射线，不移植任何细胞；

②二维培养组(2D)：6只小鼠，γ射线照射后移植二维培养系统下培养第12天收集的细胞；

③三维静止培养组(3D static)：6只小鼠，γ射线照射后移植三维静止培养系统下培养第12天收集的细胞；

④三维旋转培养组(3D RWV)：5只小鼠，γ射线照射后移植三维旋转培养系统下培养第12天收集的细胞。

实验取6-8周雌性NOD/SCID小鼠，300-350cGy亚致死量全身照射一次。收集移植用人脐血单个核细胞，重悬于200μl 5％FBS-IMDM。照射后24小时内经小鼠尾静脉注射经培养的人脐血单个核细胞。移植后第4、6周，小鼠剪尾尖取血，流式细胞仪检测小鼠外周血人源性CD45+细胞比例。移植后第8周，小鼠摘眼球取血，流式细胞仪检测小鼠外周血人源性CD45+细胞比例，颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠脾细胞及骨髓细胞，接种于人源性CFC培养基内，检测人源性造血克隆形成能力。

NOD/SCID小鼠外周血人源性CD45+细胞检测：第4、6、8周采集的小鼠外周血经EDTA抗凝，取50μl抗凝全血，加入鼠抗人CD45单抗5μl，4℃避光放置30~40分钟，加4ml ACK缓冲液37℃水浴15分钟，200g离心5分钟，2％FBS-PBS洗2次，加入200μl2％FBS-PBS重悬细胞，加入4％多聚甲醛200μl(终浓度2％)，行流式细胞仪检测。以γ射线照射组小鼠细胞为对照组计算人CD45+细胞数，以人源性CD45+细胞＞1％为移植成功。

NOD/SCID小鼠人源性造血克隆形成实验：取小鼠脾脏置于15％FBS-IMDM中研磨，70μm滤网滤出脾脏细胞，ACK缓冲液溶去混杂红细胞，15％FBS-IMDM洗涤两次。取小鼠双侧股骨，剪去头端，1ml 15％FBS-IMDM冲洗出骨髓细胞，70μm滤网过滤，ACK缓冲液溶去混杂红细胞，15％FBS-IMDM洗涤两次。所取得小鼠脾细胞和骨髓细胞加5ml15％FBS-IMDM培养液，转移至60mm培养皿中，37℃、5％CO₂静置4-8小时。吸取悬浮细胞并计数。细胞重悬于2％FBS-IMDM，调整细胞至1~2×10⁶/ml。取分装冻存Methocult培养基(3ml/支)37℃水浴锅解冻，加入细胞悬液300μl，混匀，静置5分钟除去气泡，3ml注射器16-g针头吸取1.1ml细胞-培养基混合物缓慢注入一个35mm培养皿中，每个样本设2个重复培养皿，置饱和湿度、37℃、5％CO₂培养箱中培养14天。倒置显微镜下计数细胞数大于50个的细胞克隆(红系克隆BFU-E，粒巨系克隆CFU-G/GM)，计算每10⁶细胞内红系和粒巨系克隆数。

实验数据以SD±SEM表示。两组间比较采用t检验，组间差异采用方差分析。P＜0.05认为有统计学差异。

结果显示，

1.三维藻酸盐微球内人脐血单个核细胞的包装和释放回收实验中，人脐血单个核细胞重悬于1.1％藻酸盐溶液或1.1％藻酸盐-0.1％明胶溶液中，通过27-g的针头逐滴滴入100mM CaCl₂溶液中形成细胞-藻酸盐微球。1ml细胞-藻酸盐溶液混合物平均可以形成176个微球(范围：135~200beads/ml)。微球呈圆球形和水滴形，直径1.5~2.5mm(图1)。包装细胞单用藻酸盐溶液可以形成的微球数为173±21beads/ml，包装用藻酸盐-明胶溶液可以形成的微球数为185±12beads/ml，两组比较结果显示是否加入明胶对形成的微球数无明显影响(p＞0.05)。在一个微球内包装的细胞数不同对形成的微球数无明显影响(表1)。包装完成的藻酸盐微球在15％FBS-IMDM培养液中可以保持稳定状态超过3个月。使用溶解缓冲液可以溶解藻酸盐微球，释放包装在其中的细胞。在这部分实验中，经检测1ml溶解缓冲液10分钟时间内最高可以溶解83个微球。

表1.细胞包装密度对形成藻酸盐微球数的影响。(n＝9)

各组间差异p＞0.05。

2.三维培养体系培养条件优化

2.1.扩增人脐血单个核细胞所需细胞因子浓度

本发明中，三种培养体系均应用了3种细胞因子的组合：SCF、TPO和FL。根据现有技术的在扩增人造血干祖细胞时细胞因子使用的浓度，本实验中，对下列四组细胞因子浓度做了评价：

1)中浓度细胞因子组(med-CK group)：15％FBS-IMDM内加入SCF 50ng/ml，TPO25ng/ml，FL 20ng/ml；

2)低浓度细胞因子组(low-CK group)：15％FBS-IMDM内加入SCF 20ng/ml，TPO10ng/ml，FL 10ng/ml；

3)极低浓度细胞因子组(xlow-CK group)：15％FBS-IMDM内加入SCF 10ng/ml，TPO 5ng/ml，FL 5ng/ml；

4)无细胞因子组(no-CK group)：仅使用15％FBS-IMDM培养液培养微脐血单个核细胞。

在三维静止培养系统中，检测了以上4种不同浓度的细胞因子组合对包装在藻酸盐微球中的人脐血单个核细胞数量扩增的效果。结果显示在三维静止培养体系中，低浓度细胞因子组和中浓度细胞因子组的细胞总数均有明显扩增，而以低浓度细胞因子组的细胞扩增的最为理想(图2)。包装在藻酸盐微球中的脐血单个核细胞在低浓度细胞因子联合支持下，于培养的第3天起表现出细胞数量的增加，第6天起显微镜检可见细胞克隆出现，细胞克隆的数量及大小随培养时间延长而增加增大(图3)，回收到的细胞总数亦随培养时间延长而增加(表2)。在无细胞因子组和极低细胞因子组未能观察到微球内有细胞克隆出现。实验结果提示在三维静止培养系统内，低浓度细胞因子组为培养扩增人脐血单个核细胞的较适宜的细胞因子浓度。

表2.不同细胞因子浓度组对藻酸盐三维微球内包装的人脐血单个核细胞总数扩增倍数的影响。(n＝18)

^*与无细胞因子组比较，p＜0.05；

与常规传统培养系统相比，三维静止培养系统仅需要低浓度的SCF、TPO和FL组合支持就可获得较好的脐血单个核细胞扩增的效果。在三维旋转培养系统内，包装在藻酸盐微球内在旋转培养容器内竖直旋转，细胞培养液和培养液内的细胞因子可以得到充分的混合均匀分布，为培养在其内的细胞提供更有效的养分和气体交换。因此，根据三维静止培养系统的结果，在三维旋转培养系统，测试了下述三个细胞因子浓度组对包装在藻酸盐三维微球中人脐血单个核细胞的扩增的影响：

1)低浓度细胞因子组(low-CK group)：15％FBS-IMDM内加入SCF 20ng/ml，TPO10ng/ml，FL 10ng/ml；

2)极低浓度细胞因子组(xlow-CK group)：15％FBS-IMDM内加入SCF 10ng/ml，TPO 5ng/ml，FL 5ng/ml；

3)无细胞因子组(no-CK group)：仅使用15％FBS-IMDM培养液培养微球内脐血单个核细胞。

实验结果显示，三维旋转培养系统培养条件下，在极低浓度细胞因子组和低浓度细胞因子组，均可见到微球内有造血克隆生成(图5)。脐血单个核细胞在极低浓度细胞因子组和低浓度细胞因子组均可以得到明显扩增，与无细胞因子组相比有明显差异，与第0天时相比均有明显增加(p值均小于0.05)。极低浓度细胞因子组细胞扩增倍数于培养第3、6天较低浓度细胞因子培养组略高，至培养第9、12天与低浓度细胞因子培养组扩增倍数相似。经统计学检验，两组在第3、6、9、12的细胞扩增倍数无明显差异(p值均大于0.10)。实验结果提示在三维旋转培养系统内，极低浓度细胞因子组为培养扩增人脐血单个核细胞的较适宜的细胞因子浓度。

表3不同细胞因子浓度组对三维旋转培养系统培养藻酸盐三维微球内包装的人脐血单个核细胞总数扩增倍数的影响。(n＝18)

与无细胞因子组比较，^*：p＜0.05；^**：p＜0.01；^#示与极低浓度组p＞0.1

2.2.藻酸盐微球中包装细胞的适宜密度

本发明中，使用藻酸盐包装细胞时，首先需用藻酸盐溶液重悬需包装的细胞。根据重悬的细胞数量可以调节包装在藻酸盐微球内的细胞密度。本发明测试了不同的细胞包装密度对脐血单个核细胞扩增的影响，确定最合适的细胞包装密度。实验中检测了以下各组细胞包装密度：单个藻酸盐微球内包装有5,000、10,000、20,000、25,000、30,000、45,000、60,000个脐血单个核细胞。包装了细胞的微球培养在静止系统内，所用细胞因子浓度为低浓度组细胞因子。实验结果显示20,000和25,000细胞组的细胞随培养时间而增长，单个藻酸盐微球内包装的细胞多于30,000个或少于10,000个，细胞的增长均不明显(图6、表4)。1ml 1.1％藻酸盐溶液内重悬的脐血单个核细胞数为4~5×10⁶，则包装出来的单个藻酸盐三维微球里细胞数在20,000~25,000范围内。

表4.三维藻酸盐微球内不同包装细胞密度组培养后细胞增长倍数。(n＝9)

2.3.包装脐血单个核细胞的藻酸盐溶液中加入明胶对细胞扩增的影响

明胶(gelatin)常用于包被培养皿加强培养细胞贴壁，明胶用于藻酸盐的包装见于包装贴壁细胞。本发明评价了在藻酸盐溶液中加入0.1％明胶与否对脐血单个核细胞扩增的影响。人脐血单个核细胞分别被包装于1.1％藻酸盐和1.1％藻酸盐-0.1％明胶，微球被培养于静止培养皿中，所用细胞因子组浓度为低浓度组。实验结果显示包装细胞时加入明胶对扩增脐血单个核细胞无明显影响(见图7、表5)。

表5.包装细胞藻酸盐溶液加入与不加入0.1％明胶细胞扩增倍数。(n＝12)

各组间p＞0.05。

根据以上实验结果，本发明确定了人脐血单个核细胞培养于三维藻酸盐纳米培养系统的适宜条件：

1)细胞因子浓度：

a)三维静止培养系统：15％FBS-IMDM内加入SCF 20ng/ml，TPO 10ng/ml，FL10ng/ml；

b)三维旋转培养系统：15％FBS-IMDM内加入SCF 10ng/ml，TPO 5ng/ml，FL5ng/ml或15％FBS-IMDM内加入SCF 20ng/ml，TPO 10ng/ml，FL 10ng/ml，如考虑到经济学因素，则以15％FBS-IMDM内加入SCF 10ng/ml，TPO 5ng/ml，FL 5ng/ml为更适宜条件。

2)细胞包装密度：4~5×10⁶人脐血单个核细胞重悬于1ml 1.1％藻酸盐溶液，包装后单个微球含20,000~25,000个细胞。

3)包装细胞使用1.1％藻酸盐溶液。

3.常规二维培养系统与三维培养系统扩增人脐血单个核细胞数倍数

按确定的人脐血单个核细胞包装与藻酸盐三维微球培养系统的适宜条件后，培养人脐血单个核细胞，比较三维静止培养系统、三维旋转培养系统和常规二维培养系统下人脐血单个核细胞体外培养12天，细胞总数扩增倍数，常规二维培养系统采用的细胞因子浓度为低浓度细胞因子组(SCF 20ng/ml，TPO 10ng/ml，FL 10ng/ml)。

实验结果显示，在低浓度细胞因子支持下，常规二维培养系统培养的人脐血单个核细胞总数在逐渐减少。三维培养系统下，培养第3天起，人脐血单个核细胞开始在藻酸盐微球内扩增，细胞扩增最多可达5.887±0.723倍。三维旋转培养系统下培养第3、6、12天细胞扩增倍数与三维静止培养系统无明显差异(见图8、表6)。

实验结果表明，在低浓度的细胞因子培养支持下，常规二维培养体系无法使人脐血单个核细胞扩增，而在三维静止培养系统下即可实现细胞的明显扩增，而三维旋转培养系统在实现相仿的细胞扩增时所需的细胞因子浓度则更低。

表6.不同培养系统培养人脐血单个核细胞，细胞扩增倍数(n＝18)

^*：与二维低浓度细胞因子组比较，p＜0.05

^#：与三维静止低浓度细胞因子组比较，p＜0.05

4.常规二维培养系统与三维培养系统下人脐血单个核细胞中CD34+细胞的扩增

临床实践中常以CD34+细胞来评价移植物的造血干祖细胞比例。本发明中，经流式细胞仪检测，从脐血分离(新鲜和解冻后)的单个核细胞中平均有2.60±0.52％的CD34+细胞。培养后，常规二维培养系统下培养第12天的回收的细胞中CD34+细胞比例下降到0.45±0.17％。三维静止培养系统下第12天回收的细胞中CD34+细胞比例明显增加，达到13.27±2.65％，三维旋转培养系统下第12天回收的细胞中CD34+细胞比例亦明显增加至18.08±1.49％，与二维培养系统比较，p值均小于0.001。

5.常规二维培养系统与三维培养系统下人脐血单个核细胞造血克隆形成实验

分离获得的人脐血单个核细胞(新鲜和解冻后)的红系克隆形成细胞(BFU-E)为(1213.93±183.76)/10⁵cell，粒巨系克隆形成细胞(CFU-G/GM)为(363.34±34.47)/10⁵cell。经过12天的培养后，二维与三维培养系统培养的细胞其红系克隆形成细胞均较培养以前明显下降，二维与三维各培养系统培养后细胞的红系克隆形成细胞数之间无明显差异。经过12天培养后，二维培养系统培养后的细胞其粒巨系克隆形成细胞数与培养以前相比无明显差异，而三维培养系统培养的细胞其粒巨系克隆形成细胞数均较培养以前明显增加，其中以三维静止培养系统的增加更为明显。见图10、表7。

表7.二维与三维培养系统培养人脐血单个核细胞前后造血克隆形成细胞数。(n＝8)

^*：与培养以前相比，p＜0.05；^**：与培养以前相比，p＜0.01；

^#：与常规二维培养系统相比，p＜0.05

6.NOD-SCID小鼠移植模型

6.1.NOD-SCID小鼠移植培养后人脐血单个核细胞

NOD-SCID小鼠用于移植共分为4组，如前所述。移植人脐血单个核细胞数：1)二维培养组：移植二维培养系统低浓度细胞因子培养12天的细胞，平均每只小鼠移植单个核细胞数21.92±6.42×10⁶；2)三维静止培养组：移植三维静止培养系统低浓度细胞因子培养12天的细胞，平均每只小鼠移植单个核细胞数6.59±1.00×10⁶；3)三维旋转培养组：移植三维旋转培养系统极低浓度细胞因子培养12天的细胞，平均每只小鼠移植单个核细胞数4.17±0.27×10⁶。

移植第8周，各组小鼠存活率：1)γ射线照射对照组：2/3；2)二维培养组：2/6；3)三维静止培养组：3/6；4)三维旋转培养组：3/5。

6.2.NOD-SCID小鼠移植后外周血人源性CD45+细胞比例

由于流式细胞仪检测小鼠外周血人源性CD45+细胞比例所用的单克隆抗体为小鼠源性，为去除鼠源性抗体和小鼠血细胞的非特异性结合导致的假阳性，流式细胞仪检测以γ射线照射对照组小鼠外周血为对照，计算各实验组的人源性CD45+细胞比例。

结果显示二维和三维静止、三维旋转培养组的小鼠外周血人源性CD45+细胞比例呈现统一的趋势：移植后第4周人源性CD45+细胞均大于1％，移植后第6周人源性CD45+细胞比例均较第4周时降低，移植后第8周人源性CD45+细胞比例再次升高，二维培养组平均2.94±0.49％，三维静止培养组平均8.30±1.13％，三维旋转培养组平均11.35±2.06％。三维培养组小鼠外周血人源性CD45+细胞比例均较二维培养组明显增高。而移植所用细胞数三维培养组远远低于二维培养组(p＜0.05)。

6.3.NOD-SCID小鼠移植后脾细胞、骨髓细胞人源性造血克隆形成数

NOD-SCID移植后第8周处死取脾细胞和骨髓细胞，所取得细胞经前述贴壁过程去除贴壁细胞，将悬浮细胞接种于人源性克隆形成实验培养基，含人源性造血细胞因子。经过两周的培养，γ射线照射对照组均未见任何造血集落集簇形成，显微镜下仅见单个细胞存在于半固体培养基中。这一结果说明经过贴壁过程可以去除分泌鼠源性造血细胞因子的细胞(如骨髓基质细胞)，排除鼠源性造血干祖细胞在人源性造血克隆形成实验中生长而导致的假阳性结果。

实验结果显示，二维培养组和三维静止培养组、三维旋转培养组小鼠的脾细胞和骨髓细胞于人源性克隆形成实验培养基中培养2周后，均可见到有造血克隆形成。粒巨系克隆形成细胞数均表现为三维静止培养组最高，三维旋转培养组与二维培养组相仿。三维旋转培养组和二维培养组的脾细胞均未见红系克隆形成。骨髓细胞的红系克隆形成细胞以二维培养组为最多。三维培养两组间相仿。

表8.NOD-SCID小鼠移植人脐血单个核细胞后人源性造血克隆形成实验

^*：与γ射线照射对照组相比，p＜0.05；

NOD-SCID小鼠移植模型结果显示，经培养后的人脐血单个核细胞可以在NOD-SCID小鼠体内移植成活，并重建人源性的造血。三维静止培养系统和三维旋转培养系统扩增的人脐血单个核细胞移植细胞数量为10⁶级别，常规二维培养系统移植的细胞数为10⁷级别，相比较而言，移植后第8周，三维培养系统扩增的细胞在小鼠体内重建粒巨系集落能力强于二维系统，小鼠外周血人源性细胞比例亦明显高于二维系统。

Claims (7)

1、一种造血干祖细胞的培养方法，其特征是采用藻酸盐三维培养系统体外扩增人脐血造血干祖细胞。

2、按权利要求1所述的造血干祖细胞的培养方法，其特征是所述的培养方法是通过改变人脐血单个核细胞体外培养的环境，用三维藻酸盐包装细胞进行静止或旋转状态的培养，扩增人脐血造血干祖细胞，包括下述步骤：

1)选取SCF、TPO和FL三种细胞因子联合应用支持脐血单个核细胞中造血干祖细胞的扩增，不加用其他细胞因子；

2)将人脐血单个核细胞包装在藻酸盐微球内分别培养于三维静止培养系统或三维旋转培养系统，确定培养条件，观察脐血单个核细胞的扩增效果；

3)采用NOD/SCID小鼠移植模型评价经培养后的人脐血单个核细胞；

4)通过造血克隆形成实验评价造血干细胞在体外培养过程中向不同系列分化的造血能力。

3、按权利要求2所述的造血干祖细胞的培养方法，其特征是所述的人脐血单个核细胞培养于三维藻酸盐纳米培养系统的条件是：

细胞因子浓度：

a)三维静止培养系统：15％FBS-IMDM内加入SCF 20ng/ml，TPO 10ng/ml，FL 10ng/ml；

b)三维旋转培养系统：15％FBS-IMDM内加入SCF 10ng/ml，TPO 5ng/ml，FL 5ng/ml或15％FBS-IMDM内加入SCF 20ng/ml，TPO 10ng/ml，FL10ng/ml；

细胞包装密度：

4～5×10⁶人脐血单个核细胞重悬于1ml 1.1％藻酸盐溶液，包装后单个微球含20,000～25,000个细胞。

4、按权利要求2所述的造血干祖细胞的培养方法，其特征是所述的步骤1)的细胞因子使用浓度，以15％FBS-IMDM内加入SCF 20ng/ml，TPO 10ng/ml，FL10ng/ml为低浓度细胞因子组；以15％FBS-IMDM内加入SCF 10ng/ml，TPO 5ng/ml，FL 5ng/ml为极低浓度细胞因子组。

5、按权利要求2所述的造血干祖细胞的培养方法，其特征是所述的步骤2)的三维旋转培养系统采用旋转的生物反应器容器。

6、按权利要求2所述的造血干祖细胞的培养方法，其特征是所述步骤3)的NOD/SCID小鼠异种移植模型评价造血干细胞的方法是，采用亚致死量照射，尾静脉注射以移植培养后人源性脐血单个核细胞，移植后第8周评价小鼠外周血人源性血细胞、骨髓细胞和脾细胞人源性造血克隆形成能力，评价移植物中造血干细胞。

7、按权利要求2所述的造血干祖细胞的培养方法，其特征是所述步骤4)的造血克隆形成实验是，采用培养后的人脐血单个核细胞接种于半固体含各系列血细胞生长因子的培养基，经14天培养评价形成的克隆，评价经培养后人脐血造血干细胞继续分化的能力。

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