CN103484428B - Cape在体外培养造血干/祖细胞中的用途 - Google Patents
Cape在体外培养造血干/祖细胞中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及CAPE在体外培养造血干/祖细胞中的用途。在造血干/祖细胞体外扩增体系中添加一定浓度的CAPE，扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例明显增加，总集落数量显著提高，从而，可以有效促进造血干/祖细胞的体外扩增，提高造血干/祖细胞的体外扩增效率。
Description
技术领域
本发明涉及造血干/祖细胞体外培养领域。具体地，本发明涉及CAPE在体外培养造血干/祖细胞中的用途、细胞培养基及其在体外培养造血干/祖细胞中的用途、用于体外培养造血干/祖细胞的试剂盒及其用途、体外培养造血干/祖细胞的方法、造血干/祖细胞或其衍生物、体外培养造血干/祖细胞的系统。
背景技术
造血干/祖细胞（Hematopoietic stem cells，HSC）可分化形成所有类型的血液细胞，并具有自我更新能力，因而造血干/祖细胞移植是治疗多种血液系统疾病最为安全有效的方法，而其分化产生的各种血细胞（红细胞、白细胞、血小板等）也广泛应用临床治疗。然而，目前临床造血干/祖细胞的来源主要是骨髓及动员的外周血等，其采集数量十分有限，也会对供者产生一定的伤害。脐带血富含造血干/祖细胞，其应用可以避免伤害供者，但由脐带血获得的造血干/祖细胞数量仍然较为稀少。因此，对脐带血造血干/祖细胞进行扩增具有重要临床应用价值，若能增加造血干/祖细胞数量，便可使其发挥更强的体内造血重建功能。
目前体外培养造血干/祖细胞主要是通过添加细胞因子，较为常见的细胞因子有白介素3（IL-3）、白介素6（IL-6）、血小板生成素（TPO）、干细胞因子（SCF）、胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGF-BP2）和人FMS样酪氨酸激酶3配体（Flt-3L）等。通过添加细胞因子进行造血干细胞体外培养虽然可以实现一定规模的扩增，但在扩增的同时造血干/祖细胞分化较为严重，降低了其应用研究价值；此外，细胞因子十分昂贵，并且结构功能不够稳定，导致无法实现造血干/祖细胞体外大规模扩增。
因此，目前的造血干/祖细胞体外培养的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种体外培养造血干/祖细胞的手段。
发明人研究发现，CAPE（即咖啡酸苯乙酯）能够上调血红素加氧酶1（HO-1）和SCF的表达，上调促进造血干/祖细胞扩增的相关基因表达。在造血干/祖细胞体外扩增体系中添加一定浓度的CAPE，能够显著提高扩增后的人脐血单个核细胞及CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例、造血干/祖细胞的数量和集落形成能力，提高造血干/祖细胞的体外扩增效率。同时，CAPE为小分子化合物，具有稳定的结构功能，并且价格低廉、无异源污染，适合用于造血干/祖细胞体外大规模扩增。
因此，根据本发明的一个方面，本发明提供了CAPE在体外培养造血干/祖细胞中的用途。根据本发明的实施例，在造血干/祖细胞体外扩增体系中添加一定浓度的CAPE，扩增后的人脐血单个核细胞及CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例明显增加，总集落数量显著提高，由此，CAPE可以有效促进造血干/祖细胞的体外扩增，提高造血干/祖细胞的体外扩增效率。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种细胞培养基。根据本发明的实施例，该细胞培养基包含：基础培养基，该基础培养基为无血清Stemspan培养基或Stemline II培养基；IL-3；IL-6；TPO；SCF；Flt-3L以及CAPE。发明人发现，利用本发明的细胞培养基对分离的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行体外培养，能够有效地促进人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞的扩增，提高扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例和总集落数量，从而能够有效地提高造血干/祖细胞的扩增效率，获得干细胞性能良好的造血干/祖细胞或其衍生物。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于体外培养造血干/祖细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒中含有CAPE。发明人发现，利用本发明的用于体外培养造血干/祖细胞的试剂盒对分离的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行体外培养，人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞能够有效扩增，扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例显著提高，总集落数量明显增多，造血干/祖细胞的扩增效率显著提高。
根据本发明的再一方面，本发明提供了一种用于体外培养造血干/祖细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括本发明前面所述的培养基。根据本发明的实施例，利用本发明的用于体外培养造血干/祖细胞的试剂盒对分离的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行体外培养，能够有效地促进人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞的扩增，提高扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例和总集落数量，从而能够有效地提高造血干/祖细胞的扩增效率，获得干细胞性能良好的造血干/祖细胞或其衍生物。
根据本发明的另一方面，本发明提供了前面所述的根据本发明实施例的细胞培养基在体外培养造血干/祖细胞中的用途。由此，能够利用本发明的细胞培养基对人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行体外培养，并且获得的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例显著提高，集落形成能力明显增强。
根据本发明的又一方面，本发明提供了前面所述的根据本发明实施例的两种试剂盒在体外培养造血干/祖细胞中的用途。由此，能够利用本发明的试剂盒对人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行体外培养，有效地促进人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞的扩增，提高扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例和总集落数量，从而能够有效地提高造血干/祖细胞的扩增效率，获得干细胞性能良好的造血干/祖细胞或其衍生物。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种体外培养造血干/祖细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：利用本发明实施例的培养基，培养人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞，其中，CD34阳性细胞是从人脐血单个核细胞中分选获得的。发明人发现，利用本发明的体外培养造血干/祖细胞的方法，能够有效地对人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行体外培养，使得人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞扩增，并提高扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例及其集落形成能力，从而提高造血干/祖细胞的扩增效率。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种造血干/祖细胞或其衍生物。根据本发明的实施例，本发明的造血干/祖细胞或其衍生物是通过本发明的体外培养造血干/祖细胞的方法获得的。发明人发现，根据本发明实施例的造血干/祖细胞或其衍生物保持良好的干细胞性能，集落形成能力较强。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种体外培养造血干/祖细胞的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：分离装置，该分离装置用于从人脐血中分离人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞；以及培养装置，该培养装置与分离装置相连，并且设置有根据本发明实施例的细胞培养基，用于对所述人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行培养。发明人发现，利用本发明的体外培养造血干/祖细胞的系统，能够有效地提高扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例及其集落形成能力，从而提高造血干/祖细胞的体外扩增效率。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例，原代分离的人脐血单个核细胞（添加CAPE0μg/mL、1μg/mL）培养7d后，CD34+细胞及CD34+CD38-细胞比例的检测结果；
图2显示了根据本发明一个实施例，原代分离的CD34阳性细胞（添加CAPE0μg/mL、1μg/mL）培养7d后，CD34+细胞及CD34+CD38-细胞比例的检测结果；
图3显示了根据本发明一个实施例，原代分离的人脐血单个核细胞（添加CAPE0μg/mL、1μg/mL）培养7d后，集落培养的检测结果；
图4显示了根据本发明一个实施例，原代分离的CD34阳性细胞（添加CAPE0μg/mL、1μg/mL）培养7d后，集落培养的检测结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的一个方面，本发明提供了CAPE在体外培养造血干/祖细胞中的用途。根据本发明的实施例，在造血干/祖细胞体外扩增体系中添加一定浓度的CAPE，扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例明显增加，总集落数量显著提高，由此，CAPE可以有效促进造血干/祖细胞的体外扩增，提高造血干/祖细胞的体外扩增效率。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种细胞培养基。根据本发明的实施例，该细胞培养基包含：基础培养基，该基础培养基为无血清Stemspan培养基或Stemline II培养基；IL-3；IL-6；TPO；SCF；以及CAPE。发明人发现，利用本发明的细胞培养基对分离的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行体外培养，能够有效地促进人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞的扩增，提高扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例和总集落数量，从而能够有效地提高造血干/祖细胞的扩增效率，获得干细胞性能良好的造血干/祖细胞或其衍生物。
根据本发明的实施例，在本发明的细胞培养基中，IL-3、IL-6、TPO、SCF以及Flt-3L的浓度均不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际实验情况选择相应的浓度。根据本发明的一些具体示例，IL-3的浓度为10-100ng/mL，优选10ng/mL；IL-6的浓度为10-100ng/mL，优选20ng/mL；TPO的浓度为10-100ng/mL，优选20ng/mL；SCF的浓度为10-100ng/mL，优选25ng/mL；Flt-3L的浓度为10-100ng/mL，优选50ng/mL。由此，可以有效促进造血干/祖细胞的扩增。
根据本发明的实施例，在本发明的细胞培养基中，CAPE的浓度不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际实验情况选择相应的浓度。根据本发明的一些具体示例，CAPE的浓度为0.1μg/mL～10μg/mL，优选1μg/mL。由此，可以有效促进人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞的扩增，提高扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例和总集落数量。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于体外培养造血干/祖细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒中含有CAPE。发明人发现，利用本发明的用于体外培养造血干/祖细胞的试剂盒对分离的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行体外培养，人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞能够有效扩增，扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例显著提高，总集落数量明显增多，造血干/祖细胞的扩增效率显著提高。
根据本发明的实施例，在本发明的试剂盒中，可以进一步包含IL-3、IL-6、TPO、SCF和Flt-3L，由此，能够提供细胞培养所需要的细胞因子。根据本发明的实施例，CAPE、IL-3、IL-6、TPO、SCF和Flt-3L分别设置在不同的容器中。根据本发明的一些实施例，本发明的试剂盒可以进一步包含基础培养基，该基础培养基可以为无血清Stemspan培养基或Stemline培养基。由此，可以提供细胞培养所需要的糖类、氨基酸等营养物质。根据本发明的实施例，上述的CAPE、IL-3、IL-6、TPO、SCF和Flt-3L的至少之一溶解于所述基础培养基中。
根据本发明的实施例，在本发明的试剂盒中，IL-3、IL-6、TPO、SCF以及Flt-3L的浓度均不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际实验情况选择相应的浓度。根据本发明的一些具体示例，IL-3的浓度为10-100ng/mL，优选10ng/mL；IL-6的浓度为10-100ng/mL，优选20ng/mL；TPO的浓度为10-100ng/mL，优选20ng/mL；SCF的浓度10-100ng/mL，优选25ng/mL；Flt-3L的浓度为10-100ng/mL，优选50ng/mL。由此，可以有效促进造血干/祖细胞的扩增。
根据本发明的实施例，在本发明的试剂盒中，CAPE的浓度不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，CAPE的浓度为0.1μg/mL～10μg/mL，优选1μg/mL。由此，可以有效促进人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞的扩增，提高扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例和总集落数量。
根据本发明的再一方面，本发明提供了一种用于体外培养造血干/祖细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括本发明前面所述的培养基。根据本发明的实施例，利用本发明的用于体外培养造血干/祖细胞的试剂盒对分离的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行体外培养，能够有效地促进人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞的扩增，提高扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例和总集落数量，从而能够有效地提高造血干/祖细胞的扩增效率，获得干细胞性能良好的造血干/祖细胞或其衍生物。
根据本发明的另一方面，本发明提供了前面所述的根据本发明实施例的细胞培养基在体外培养造血干/祖细胞中的用途。由此，能够利用本发明的细胞培养基对人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行体外培养，并且获得的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞造血干/祖细胞的比例显著提高，集落形成能力明显增强。
根据本发明的又一方面，本发明提供了前面所述的根据本发明实施例的两种试剂盒在体外培养造血干/祖细胞中的用途。由此，能够利用本发明的试剂盒对人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行体外培养，有效地促进人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞的扩增，提高扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例和总集落数量，从而能够有效地提高造血干/祖细胞的扩增效率，获得干细胞性能良好的造血干/祖细胞或其衍生物。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种体外培养造血干/祖细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：利用本发明实施例的培养基，培养人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞，其中，CD34阳性细胞是从人脐血单个核细胞中分选获得的。发明人发现，利用本发明的体外培养造血干/祖细胞的方法，能够有效地对人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行体外培养，使得人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞扩增，并提高扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例及其集落形成能力，从而提高造血干/祖细胞的扩增效率。
根据本发明的实施例，所述人脐血单个核细胞是通过密度梯度离心的方法分离获得的。由此，能够有效地分离获得质量较高的人脐血单个核细胞，有利于后续的体外扩增培养。
根据本发明的实施例，CD34阳性细胞是通过磁珠分选系统，利用CD34抗体从所述人脐血单个核细胞中分选获得的。由此，分离获得的CD34阳性细胞纯度较高，利于后续的体外扩增培养。
根据本发明的实施例，本发明的体外培养造血干/祖细胞的方法中，培养人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞的设备及条件并不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，可以于5%CO2饱和湿度的37℃培养箱中培养人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞。根据本发明的实施例，培养人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞的接种密度不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，人脐血单个核细胞的接种密度为1×106个/孔，CD34阳性细胞的接种密度为2×105个/孔。由此，人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞能够在最适合的密度条件下生长、增殖，从而有效扩增。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种造血干/祖细胞或其衍生物。根据本发明的实施例，本发明的造血干/祖细胞或其衍生物是通过本发明的体外培养造血干/祖细胞的方法获得的。发明人发现，根据本发明实施例的造血干/祖细胞或其衍生物保持了良好的干细胞特性，集落形成能力较强。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种体外培养造血干/祖细胞的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：分离装置，该分离装置用于从人脐血中分离人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞；以及培养装置，该培养装置与分离装置相连，并且设置有根据本发明实施例的细胞培养基，用于对所述人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行培养。发明人发现，利用本发明的体外培养造血干/祖细胞的系统，能够有效地提高扩增后的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞中造血干/祖细胞的比例及其集落形成能力，从而提高造血干/祖细胞的体外扩增效率。
根据本发明的实施例，所述分离装置进一步包括分选组件，所述分选组件设置于所述分离装置上，适于利用CD34抗体从所分离的人脐血单个核细胞中进一步分选CD34阳性细胞。其中，需要说明的是，当所述分选装置关闭时，所述分离装置用于从人脐血中分离人脐血单个核细胞；当所述分选装置开启时，所述分离装置用于从人脐血单个核细胞中进一步分选CD34阳性细胞。
根据本发明的实施例，分选装置中的CD34抗体的种类并不受特别限制，只要便于从所述人脐血单个核细胞中进一步分选CD34阳性细胞即可，本领域技术人员可以根据具体情况进行选择。根据本发明的一些具体示例，CD34抗体可以为小鼠抗人CD34抗体-微磁珠。根据本发明的实施例，可以作为分选组件的设备型号、厂家并不受特别限制，只要该设备适于利用小鼠抗人CD34抗体-微磁珠从所分离的人脐血单个核细胞中分选CD34阳性细胞即可。根据本发明的一些具体示例，分选组件为miniMACS分离系统。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：人脐血单个核细胞和CD34阳性细胞的分离
按照以下步骤分离人脐血单个核细胞和CD34阳性细胞：
（1）人脐血单个核细胞（mononuclear cell，MNC）的分离
a.混合，沉降：将新鲜抗凝的人脐血标本一份与PBS按照1：1的体积比例混合，再加入总体积1/4的0.5%甲基纤维素，轻柔混合均匀后，室温静置，待沉降至界限分明时，小心吸出上清到50mL离心管中，于室温、1800rpm条件下离心5分钟。
b.重悬，梯度离心：弃上清，每管加入5mL PBS重悬细胞，然后取4支10mL离心管，每管小心加入预先平衡至室温的人淋巴细胞分离液5mL，再将细胞悬液加到人淋巴细胞分离液液面之上，切勿将液面分界线破坏，接着于室温、1800rpm条件下离心25分钟。
c.收集MNC：离心完毕，离心管内上层为透明液体，下层为其他细胞，中间为白色薄膜层，即MNC层，将各管MNC层细胞集中于1管，加入PBS重悬至10mL体积，然后1800rpm离心5分钟，弃去残余的淋巴细胞分离液，再用PBS清洗细胞一次，将细胞重悬至10mL取10μL计数细胞，即获得原代分离的人脐血单个核细胞。
（2）从MNC细胞中分离CD34阳性细胞
采用miniMACS分离系统，利用小鼠抗人CD34-微磁珠从上述分离获得的人脐血单个核细胞中进一步分选CD34阳性细胞，具体如下：
a.标记抗体，孵育：参照CD34+MicroBead Kit（Miltenyl Boitec公司，货号140-000-672.05）说明书，将人脐血单个核细胞按照每108个细胞重悬于300μL体积于4℃～8℃预温半小时的除气PBS，然后加入FcR阻断剂及小鼠抗人CD34-微磁珠各100μL，接着置于4℃～8℃孵育30分钟。
b.分离CD34阳性细胞：向孵育体系内加入500μL PBS，混匀，于1800rpm、4℃条件下离心5分钟，依照此方法，洗涤细胞2次，然后按照每108个细胞重悬于500μL体积细胞分离缓冲液重悬细胞，接着将MS分离柱安装于磁力架上，使用1mL细胞分离缓冲液湿润分离柱后，将人脐血单个核细胞悬液缓缓沿分离柱内壁加入，避免此过程中产生气泡，待其自然流出后，使用500μL除气细胞分离缓冲液冲洗分离柱，共4次，以便将未结合的人脐血单个核细胞冲洗出分离柱。
c.加压洗脱：将分离柱移出磁场，依次置于三个Ep管上，每管用1mL PBS加压洗脱，收集3个Ep管细胞集中于1管，重悬细胞至1mL并计数，即获得原代分离的CD34阳性细胞。
实施例2：体外培养人脐血单个核细胞和CD34阳性细胞
将上述获得的人脐血单个核细胞、CD34+细胞分别以1×106个/孔、2×105个/孔的密度接种于低吸附24孔板中，并向其中添加含10ng/mL IL-3、20ng/mL IL-6、20ng/mL TPO、25ng/mL SCF以及50ng/mL Flt-3L的无血清Stemspan培养基(Stemcell technologies，CAT09605/09600/09805/09800)，然后将CAPE用DMSO溶解稀释，按照体积比1:2000的比例添加入实验组培养基，其中，CAPE在实验组培养基中的浓度为1μg/mL，对照组培养基加入等量DMSO。接着，将两组细胞于5%CO2饱和湿度的37℃培养箱中进行培养，培养过程中，每隔两天补液或传代。由此，获得体外扩增的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞。
实施例3、造血干/祖细胞扩增结果检测
3.1流式细胞术鉴定
将培养至7天的人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行流式细胞术检测，检测指标为表面标志CD34和CD38的表达情况。具体步骤如下：
吸出孔板中的细胞，放入1.5mL的EP管中，补满PBS；
3000rpm离心5min；
吸弃上清，再次补满PBS；
再次3000rpm离心5min；
吸弃上清，加入100μL的PBS；
每管细胞加入抗CD34、CD38抗体各1μL，封好封口膜，放入4℃冰箱中的转轮上，孵育40min；
3000rpm离心5min；
PBS洗两遍，定容300-500μL，进行流式检测。
实验结果见图1和图2。由实验结果可知，相对未添加CAPE的对照组，添加一定浓度CAPE的实验组人脐血单个核细胞中CD34+和CD34+CD38-细胞的比例显著提高，CD34+细胞中早期造血干细胞、造血祖细胞和淋系祖细胞的比例也明显上升，表明CAPE能够促进造血干/祖细胞的扩增，提高造血干/祖细胞的扩增效率。
3.2集落培养鉴定
按照以下步骤将培养至7天的人脐血单个核细胞和CD34+细胞进行集落培养：
半固体集落培养基（Stemcell Technologies，CAT#04434）提前4℃过夜融化，青霉素小瓶提前高压消毒备用；
吸取2mL半固体集落培养基放入青霉素小瓶，吸取1.6×104个细胞小心注入半固体培养基，小心反复吹匀；
按照0.5mL/孔将混有细胞的半固体培养基接种在低吸附24孔板中，每个样品种3孔；
重复操作完成其它分组的集落接种；
在孔板空白和间隙处加入适量无菌PBS；
将孔板于5%CO2饱和湿度的37℃培养箱中培养至14d，进行集落计数。
实验结果见图3和图4。由实验结果可知，与未添加CAPE的对照组相比，添加一定浓度的CAPE的实验组人脐血单个核细胞和CD34+细胞的BFU-E、CFU-E、CFU-GM和CFU-GEMM类型集落的数量均显著提高，表明CAPE能促进造血干/祖细胞的扩增，提高总集落数量。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (42)
1.CAPE在体外培养造血干/祖细胞中的用途。
2.一种用于在体外培养造血干/祖细胞的培养基，其特征在于，包含：
基础培养基，所述基础培养基为无血清Stemspan培养基或Stemline II培养基；
IL-3；
IL-6；
TPO；
SCF；
Flt-3L；以及
CAPE。
3.根据权利要求2所述的细胞培养基，其特征在于，所述IL-3的浓度为10-100ng/mL。
4.根据权利要求3所述的细胞培养基，其特征在于，所述IL-3的浓度为10ng/mL。
5.根据权利要求2所述的细胞培养基，其特征在于，所述IL-6的浓度为10-100ng/mL。
6.根据权利要求5所述的细胞培养基，其特征在于，所述IL-6的浓度为20ng/mL。
7.根据权利要求2所述的细胞培养基，其特征在于，所述TPO的浓度为10-100ng/mL。
8.根据权利要求7所述的细胞培养基，其特征在于，所述TPO的浓度为20ng/mL。
9.根据权利要求2所述的细胞培养基，其特征在于，所述SCF的浓度为10-100ng/mL。
10.根据权利要求9所述的细胞培养基，其特征在于，所述SCF的浓度为25ng/mL。
11.根据权利要求2所述的细胞培养基，其特征在于，所述Flt-3L的浓度为10-100ng/mL。
12.根据权利要求11所述的细胞培养基，其特征在于，所述Flt-3L的浓度为50ng/mL。
13.根据权利要求2所述的细胞培养基，其特征在于，所述CAPE的浓度为0.1μg/mL-10μg/mL。
14.根据权利要求14所述的细胞培养基，其特征在于，所述CAPE的浓度为1μg/mL。
15.一种用于体外培养造血干/祖细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有CAPE。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，进一步包含IL-3、IL-6、TPO、SCF和Flt-3L。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述CAPE、IL-3、IL-6、TPO、SCF和Flt-3L分别设置在不同的容器中。
18.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，进一步包含基础培养基，所述基础培养基为无血清Stemspan培养基或Stemline II培养基。
19.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述CAPE、IL-3、IL-6、TPO、SCF和Flt-3L的至少之一溶解于所述基础培养基中。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，所述IL-3的浓度为10-100ng/mL。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述IL-3的浓度为10ng/mL。
22.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述IL-6的浓度为10-100ng/mL。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述IL-6的浓度为20ng/mL。
24.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述TPO的浓度为10-100ng/mL。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其特征在于，所述TPO的浓度为20ng/mL。
26.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述SCF的浓度为10-100ng/mL。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其特征在于，所述SCF的浓度为25ng/mL。
28.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述Flt-3L的浓度为10-100ng/mL。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其特征在于，所述Flt-3L的浓度为50ng/mL。
30.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述CAPE的浓度为0.1μg/mL-10μg/mL。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其特征在于，所述CAPE的浓度为1μg/mL。
32.一种用于体外培养造血干/祖细胞的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2-14任一项所述的细胞培养基。
33.权利要求2-14任一项所述的细胞培养基在体外培养造血干/祖细胞中的用途。
34.权利要求15-31任一项所述的试剂盒在体外培养造血干/祖细胞中的用途。
35.一种体外培养造血干/祖细胞的方法，其特征在于，包括：
利用权利要求2-14任一项所述的细胞培养基，培养人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞，所述CD34阳性细胞是从人脐血单个核细胞中分选获得的。
36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，所述人脐血单个核细胞是通过密度梯度离心的方法分离获得的。
37.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，通过磁珠分选系统，利用CD34抗体从所述人脐血单个核细胞中分选获得CD34阳性细胞。
38.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，按照1×106个/孔的接种密度，于5％CO2饱和湿度的37℃培养箱中将所述人脐血单个核细胞进行所述培养；
按照2×105个/孔的接种密度，于5％CO2饱和湿度的37℃培养箱中将所述CD34阳性细胞进行所述培养。
39.一种体外培养造血干/祖细胞的系统，其特征在于，包括：
分离装置，所述分离装置用于从人脐血中分离人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞；以及
培养装置，所述培养装置与所述分离装置相连，并且设置有权利要求2-14任一项所述的细胞培养基，用于对所述人脐血单个核细胞或CD34阳性细胞进行培养。
40.根据权利要求39所述的系统，其特征在于，所述分离装置中进一步包括分选组件，所述分选组件设置于所述分离装置上，适于利用CD34抗体从所分离的人脐血单个核细胞中进一步分选CD34阳性细胞。
41.根据权利要求40所述的系统，其特征在于，所述分选组件适于利用小鼠抗人CD34抗体-微磁珠从所分离的人脐血单个核细胞中进一步分选CD34阳性细胞。
42.根据权利要求40所述的系统，其特征在于，所述分选组件为miniMACS分离系统。
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