CN101182488A - 间充质干细胞的一种新用途 - Google Patents
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本发明公开了间充质干细胞的一种新用途,特别是涉及间充质干细胞在诱导CD34+造血干细胞向树突状细胞分化中的应用。应用方法可为先将间充质干细胞的增殖能力阻断,然后将其与CD34+造血干细胞共培养。应用方法还可为先将充质干细胞在液体培养基中培养,收集无细胞的上清液,再将所得到的上清液用于CD34+造血干细胞的培养中。结果表明:无论在cDC诱导体系还是pDC诱导体系中,间充质干细胞或培养间充质干细胞所获得的上清液均能显著的促进CD34+造血干细胞分化为更多的树突状细胞。
Description
技术领域
本发明涉及间充质干细胞的一种新用途,特别是涉及间充质干细胞在诱导CD34+造血干细胞向树突状细胞分化中的应用。
背景技术
树突状细胞(dendritic cell,DC)是功能最为强大的抗原递呈细胞(antigen-presenting cells,APC),其特点是能显著刺激初始T细胞的增殖,是机体免疫的始动者。树突状细胞并不是一个单一的细胞群体,它们由不同来源、不同表型和不同功能的细胞群体组成。树突状细胞主要分为两大类:传统树突状细胞(conventional DC,cDC)和浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid DC,pDC)。cDC表达髓系抗原,如CD11c+、CD13+、CD33+。cDC受CD40L刺激成熟后,能在24小时内分泌大量的IL-12、IL-1α、IL-1β和IL-6。IL-12能够促使Th0向Th1分化,产生IL-2和IFN-γ进而介导细胞免疫。cDC细胞可根据CD1a+表型进行筛选。pDC不表达髓系抗原,具有独特表型,如CD11c-CD4+CD123+CD45RA+HLA-DR+。pDC在CD40L刺激下,几乎不产生IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-10,而产生IL-8,诱使Th0细胞分化为Th2细胞,产生IL-4和IL-10,介导体液免疫和诱导CD8+初始T细胞分化为分泌IL-10的CD8+T细胞。pDC的前体细胞又称I型干扰素分泌细胞(Type 1interferon-producing cells,IPC),其可根据BDCA2+CD123w+表型进行筛选。IPC可以通过I型干扰素和IL-6诱导浆细胞的分化。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种广泛存在于各种成体组织内的重要细胞群体,尤其是骨髓中,它起着支持造血的重要作用。间充质干细胞有很强的集落形成和扩增能力,并且具有向成骨、脂肪、肌肉、神经、心肌和其它一些细胞多向分化潜能。最初间充质干细胞作为组织工程研究的种子细胞而成为人们关注的焦点,但随着进一步的研究发现,其还具有独特的免疫调节功能。目前已经证实间充质干细胞在体内和体外都有免疫调节作用。其中研究得最多的是骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow MSCs,bMSCs)。间充质干细胞具有低免疫原性,即不引起同种异体的T淋巴细胞的增殖,低表达或不表达MHC-I和MHC-II类分子,不表达共刺激分子CD80、CD86和CD40。对于间充质干细胞的免疫调节机制,目前的研究报道有抑制混合淋巴细胞反应中由丝裂原PHA刺激引起的T淋巴细胞的增殖,而且这种抑制作用是不受MHC限制的,并调节辅助T细胞、效应T细胞和调节T细胞的比例和功能,抑制B细胞、NK细胞的活化,及影响单核细胞来源的树突状细胞的分化、成熟及其功能。
研究发现,在体外,间充质干细胞可以直接或间接影响许多免疫细胞。其中最肯定的发现就是间充质干细胞能够通过细胞间的直接接触或者分泌如HGF和TGF-β等细胞因子抑制T细胞的增殖。这种抑制作用不受MHC分子的限制。到目前为止,几乎所有关于间充质干细胞的体外研究都是集中在间充质干细胞与外周分化成熟或基本成熟的免疫细胞之间的相互作用的。
发明内容
本发明的目的是提供间充质干细胞的一种新用途。
本发明所提供的间充质干细胞的新用途为间充质干细胞在诱导CD34+造血干细胞向树突状细胞分化中的应用。
所述CD34+造血干细胞可为骨髓CD34+造血干细胞、脐血CD34+造血干细胞和外周血CD34+造血干细胞中的任意一种。
所述树突状细胞可为传统树突状细胞和浆细胞样树突状细胞中的一种或两种。
在所述的应用中,具体的应用方法可为将所述间充质干细胞的增殖能力阻断,再将其与所述CD34+造血干细胞共培养。
应用方法还可为先将所述间充质干细胞在液体培养基中培养,收集无细胞的上清液,将所得到的上清液用于CD34+造血干细胞的培养中。
在所述应用方法中,用于诱导CD34+造血干细胞向DC分化的培养基可为现有的常规培养基,如在cDC诱导中使用含10%(体积百分含量)胎牛血清、100ng/ml人重组GM-CSF和2.5ng/ml TNF-α的RPMI-1640细胞培养基;在pDC诱导中使用含2%(体积百分含量)胎牛血清、100ng/ml人重组FLT3-L和50ng/mlTPO的RPMI-1640细胞培养基。
实验结果表明:
在cDC诱导中,直接用间充质干细胞或用培养间充质干细胞获得的上清液分别诱导CD34+造血干细胞向树突状细胞分化,结果均能得到cDC细胞;诱导培养14天后,间充质干细胞诱导组和间充质干细胞上清液诱导组平均获得的CD1a+cDC细胞数量比对照组(即CD34+造血干细胞单独培养)分别增加了2.83倍和2.86倍。
在pDC诱导中,直接用间充质干细胞或用培养间充质干细胞获得的上清液分别诱导CD34+造血干细胞向树突状细胞分化,结果均能得到BDCA2+的pDC前体细胞IPC;培养25天后,间充质干细胞诱导组和间充质干细胞上清液诱导组平均获得的BDCA2+pDC前体细胞IPC细胞数量比对照组(即CD34+造血干细胞单独培养)分别增加了44.4倍和31.7倍。
证明无论在cDC诱导体系还是pDC诱导体系中,间充质干细胞或培养间充质干细胞所获得的上清液均能显著的促进CD34+造血干细胞分化为更多的树突状细胞。
附图说明
图1为CD34+造血干细胞向树突状细胞分化的细胞计数图。
A为cDC诱导培养过程中分别在第4、7、14天时总活细胞数量;
B为pDC诱导培养过程中分别在第5、10、15、20、25天时总活细胞数量;
C为cDC诱导培养中,培养14天时获得的CD1a+cDC细胞数量;
D为pDC诱导培养中,培养25天时获得的BDCA2+pDC细胞前体IPC细胞数量。
图2为间充质干细胞单独培养、与CD34+造血干细胞共培养及用NS-398处理后再培养,分别获得上清液中PGE2的水平。
图3A为细胞诱导培养过程中活细胞计数图。诱导分为cDC和pDC两种诱导体系。
图3B为诱导所产生的DC细胞刺激T细胞增殖能力的检测图。诱导分cDC和pDC两种诱导体系。
图3C为检测诱导产生的DC细胞功能图。其中,Percentage(%)表示CD1a+cDCs中摄取FITC标记的右旋糖苷的细胞数比例。
图3D为检测诱导产生的DC细胞功能图。其中,Percentage(%)表示用ELISA检测试验组细胞因子浓度与对照组浓度的比值。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
实施例中所使用的试剂及仪器如下:
一、主要试剂
1、MCDB-201(Sigma公司);DMEM/F-12(GibcoBRL公司);1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium,ITS)(Gibco公司);1×亚油酸-牛血清白蛋白(linoleic acid-bovine serum albumin,LA-BSA)(Sigma公司);RPMI-1640(GibcoBRL公司);X-VIVO-15无血清培养基(BioWhittaker公司)。
2、D-Hanks平衡盐溶液、Ficoll(1.077g/cm3)(Pharmacia公司)。
3、胎牛血清(Hyclone公司);青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司)。
4、胰蛋白酶(GibcoBRL公司);EDTA(天津市化学试剂一厂)。
5、谷氨酰胺(GibcoBRL公司);3H-TdR(上海原子能研究所)。
6、地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、牛血清白蛋白(Sigma公司)。
7、细胞因子:
表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)Gibco公司);
血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)(Sigma公司);
粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor,GM-CSF)、FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-like tyrosine kinase 3 Ligand,Flt3-L)、人重组白介素3(recombinant human interleukin 3,rh IL-3)(Peprotech公司);
肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(Sigma公司);
人重组可溶性CD40配体(recombinant human soluble CD40 ligand,rhsCD40-L)(Bender公司)。
8、FITC标记的右旋糖酐(FITC-dextran)(Sigma公司)。
9、N-(2-环己氧基-4-硝基苯基)甲磺酸盐
(N-(2-Cyclohexyloxy-4-nitrophenyl)methanesulfonamide、NS-398)(CaymanChemicals公司)。
10、前列腺素E2(PGE2)(Sigma公司)。
11、抗体:CD1a、CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-DR(Becton Dickinson公司);
FITC标记的荧光二抗(Santa Cruz公司);
FITC标记抗人BDCA-2抗体(Miltenyi Biotec公司);
PE标记抗人CD123w抗体、CD3、CD28(BD Pharmingen公司)。
12、磁珠分选试剂盒:CD34、CD1a、BDCA-2、CD4、CD45RA(Miltenyi Biotec公司);
13、ELISA试剂盒:IL-12(Genzyme Cop公司);IL-10(BD Pharmingen公司);interferon-α(IFN-α)(Bender Burlingame公司);IL-4、interferon-γ(IFN-γ)、PGE2(R&D Systems公司)。
二、仪器
1、超净工作台(苏州净化设备厂);
2、37℃恒温、5%CO2细胞培养箱(Thermo,USA);
3、15ml离心管、50ml离心管、T-25cm2细胞培养瓶、T-75cm2细胞培养瓶(costar公司)、24孔板,96孔凹底培养板(Corning公司);
4、倒置显微镜(Olympus);
5、常温台式离心机(Heraeus sepatech);
6、低温高速离心机(Heraeus sepatech);
7、WH-2微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);
8、微量可调移液器(Eppendorf公司);
9、液氮罐,冰箱;
10、液闪计数仪liquid scintillation counter(Wallac);
11、电热恒温水温箱(厦门医疗设备厂);
12、电热恒温干燥箱(湖南长沙医用仪器厂);
13、照射源Cesum 137 Gamma cell 40(Nordin Inc)。
实施例1、用间充质干细胞诱导CD34+造血干细胞向树突状细胞分化
一、间充质干细胞的分离和培养
1、取无菌采集的健康成人骨髓5-10ml于无菌的肝素管中。
2、取一无菌的离心管,用D-Hanks液稀释骨髓。
3、取一新的离心管,分别加入恢复至室温的Ficoll和上述稀释后的骨髓,加入时勿破坏界面,二者的体积比为1∶1。
4、将上述离心管配平后放入常温台式离心机中,20℃以1800转/分钟的速度离心20分钟,取出离心管,在无菌条件下,吸取白膜层获得单个核细胞,将单个核细胞用D-Hanks液洗涤两次并计数。
5、将上述单个核细胞以1×106/cm2的密度接种于装有细胞培养基M1的25cm2的培养瓶中,然后在37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中培养;24小时后,去除悬浮细胞,补充培养基,继续培养,此后每隔三天换一次细胞培养基M1;待细胞长至70-80%汇合时,用含0.125%(g/100ml)胰蛋白酶和0.01%(g/100ml)EDTA的消化液进行消化,然后传代培养;用流式细胞仪检测第3或4代的间充质干细胞的纯度,测得间充质干细胞的纯度为85%以上,将其冻存于液氮罐备用。
所使用的细胞培养基M1的组成为:58%(体积百分含量)DMEM/F12,40%(体积百分含量)MCDB-201,2%(体积百分含量)胎牛血清(FCS),10ng/ml EGF,10ng/ml PDGF,1×胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium,ITS),1×亚油酸-牛血清白蛋白(linoleic acid-bovine serum albumin,LA-BSA),50μM β巯基乙醇,2mM L-谷氨酰胺,100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素,其余为水;所述细胞培养基M1的pH为7.2。
6、为研究间充质干细胞分泌的细胞因子对树突状细胞的影响,将长至80%融合的间充质干细胞继续培养48小时,无菌收集无细胞的上清液并冻存于-80℃冰箱中备用。
7、在前列腺素E2(PGE2)抑制实验中,间充质干细胞消化后重悬于加入PGE2抑制剂NS-398(Sigma)5μM的完全培养基M2(在M1中加入NS-398至其终浓度为5μM)中。继续培养2天,2天后收集无细胞的上清液冻存于-80℃冰箱中备用。
二、CD34+造血干细胞的分离和纯化
6%(质量百分含量)ACD-A的组成为:每升溶液中含有22.3g/L葡萄糖,22g/L枸橼酸钠,8g/L枸橼酸,其余为去离子水。
PBS缓冲溶液I:含0.6%(体积百分含量)枸橼酸-葡萄糖抗凝溶液A(anticoagulants citrate dextrose-formula A,ACD-A)的PBS缓冲溶液。
PBS缓冲溶液II:含0.5%(g/100ml)牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和0.6%(体积百分含量)ACD-A的PBS缓冲溶液;所述PBS缓冲溶液II的pH为7.2。
1、取健康新生儿的新鲜脐血,用肝素抗凝,每毫升血中加肝素20-25 U抗凝。用PBS缓冲溶液I以1∶1的体积比进行稀释。
将Ficoll与脐血以1∶2体积比分层置于离心管,勿使界面混淆,然后将离心管置于4℃水平离心机中,以1800rpm的速度离心20min,取出离心管,管内分为4层,自上而下依次为:血浆,单个核细胞层,Ficoll液,粒细胞和红细胞层。
用毛细吸管吸取单个核细胞,置入另一试管中,用PBS缓冲溶液I离心洗涤3次,每次以1000rpm的速度离心10min。用300μl PBS缓冲溶液I重悬单个核细胞。
2、检查细胞活力:取1滴细胞悬液,然后向其中加1滴2%(g/100ml)台盼蓝液,5min后检查4大格的细胞中有多少个核被染成深蓝色的细胞(死细胞),求出细胞存活率。其中,细胞存活率=(4大格有核细胞总数-4大格蓝染细胞数)/4大格的有核细胞总数。结果表明:细胞存活率大于95%。
3、将1×108个单个核细胞悬于300μl PBS缓冲溶液II中,加入100μl Fc受体阻断剂(BD PharMingen公司),再向其中加入100μl抗CD34免疫磁珠,混匀,4℃孵育30min;然后用PBS缓冲溶液II离心洗涤2次,每次以1000rpm的速度离心10min;500μl PBS缓冲溶液II重新悬浮洗涤过的细胞。
4、将分离柱固定于MACS磁场内,将标记细胞缓慢通过MiniMACS分离柱,洗脱去除CD34-细胞;将分离柱移出磁场,用1ml MACS缓冲液加压洗脱分离柱,收集CD34+细胞并计数。用流式细胞仪分析CD34+细胞纯度。结果表明该CD34+造血干细胞的纯度为96%以上。
三、间充质干细胞在诱导CD34+造血干细胞向树突状细胞分化中的应用
本实验分三个组:(一)间充质干细胞诱导组;(二)间充质干细胞上清液诱导组;(三)对照组即CD34+造血干细胞单独培养组。下面具体分述:
(一)间充质干细胞诱导组
1、取步骤一5中获得的间充质干细胞,复苏后,将其用γ射线照射30 Gy以阻断其增殖能力,并计数;在CD34+造血干细胞分离纯化前12小时,将被照射过的间充质干细胞以2×104/ml的细胞浓度接入24孔板培养,所使用的细胞培养基及培养方法均与步骤一中5所述一致。
2、按照步骤二所述方法分离纯化CD34+造血干细胞。
3、诱导培养:
将步骤1中24孔板内的细胞培养液吸除,然后向其中加入步骤2获得的CD34+造血干细胞,使CD34+造血干细胞与间充质干细胞的细胞个数比为5∶1,再加入cDC诱导培养基或pDC诱导培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。cDC诱导和pDC诱导分别接种0.5×106个CD34+造血干细胞。
培养过程中,每3-4天用新的间充质干细胞置换旧的间充质干细胞,具体方法如下:
(1)先吸出悬浮细胞,置于离心管内。
(2)用含0.125%(g/100ml)胰蛋白酶和0.01%(g/100ml)EDTA的消化液消化贴在壁上的间充质干细胞。
(3)用Ficoll法去除消化液中的死细胞和间充质干细胞。
(4)将(3)中获得的细胞和(1)中的悬浮细胞混合,洗涤后计数,再将其加入贴有是其5倍细胞数的新间充质干细胞的24孔板继续按照上述方法培养。用台盼蓝分别计数。
其中,使用cDC诱导培养基的培养体系为cDC诱导体系:所使用的cDC诱导培养基为含10%(体积百分含量)胎牛血清、100ng/ml人重组GM-CSF、2.5ng/mlTNF-α、100U/ml链霉素和100U/ml青霉素的RPMI-1640细胞培养基,pH为7.2。
使用pDC诱导培养基的培养体系为pDC诱导体系:所使用的pDC诱导培养基为含2%(体积百分含量)胎牛血清、100ng/ml人重组FLT3-L和50ng/mlTPO、100U/ml链霉素和100U/ml青霉素的RPMI-1640细胞培养基,pH为7.2。
实验共设3次重复。
结果表明:cDC诱导体系中,培养第4、7、14天时的总活细胞(因为间充质干细胞在诱导前已经被射线照过,失去了增殖能力,所以活细胞主要包括CD34+造血干细胞和诱导出的cDC细胞)数量分别为(2.01±0.29)×106,(18.39±2.24)×106,(70.55±10.21)×106(在图1A中用+MSC表示)。pDC诱导体系中,培养第5、10、15、20、25天时的总活细胞(因为间充质干细胞在诱导前已经被射线照过,失去了增殖能力,所以活细胞主要包括CD34+造血干细胞和诱导出的pDC细胞前体IPC)数量分别为(20.45±2.14)×106、(105.80±23.26)×106、(225.50±39.18)×106、(570.92±62.28)×106、(1337.75±276.97)×106(在图1B中用+MSC表示)。
4、检测细胞表型
PBS缓冲液III:含0.1%(g/100ml)叠氮钠和0.5%(g/100ml)BSA的PBS缓冲液。
cDC诱导体系中,诱导14天后结束诱导,用间接免疫荧光法检测细胞的免疫表型。具体步骤为:在诱导结束后,用Ficoll分离液收获细胞,用PBS缓冲液III将细胞洗涤2遍,再用此PBS缓冲液III重悬细胞,加入一抗4℃孵育30min(一抗为小鼠抗人的单克隆抗体CD1a,CD14,CD80,CD83,CD86,HLA-DR),并选用同种同型非相关IgG抗体作为阴性对照;然后用PBS缓冲液III离心洗涤2遍,加入异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的羊抗鼠二抗,4℃孵育30min;再用PBS缓冲液III离心洗涤3遍,最后将细胞悬浮于300μl上机液(含0.1%叠氮钠的PBS缓冲液,不含BSA)中,置于冰上待流式细胞仪检测。
pDC诱导体系中,诱导25天后结束诱导,用直接免疫荧光双标记法检测细胞的免疫表型。具体步骤为:在诱导第25天时,用Ficoll分离液收获细胞,用PBS缓冲液III将细胞洗涤2遍,再用此PBS缓冲液III重悬细胞,加入藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标的抗CD123w抗体,4℃孵育30min,在孵育结束前10min加入异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的抗BDCA2抗体;孵育结束后,用PBS缓冲液III洗涤3遍,最后将细胞悬浮于300μl上机液(含0.1%叠氮钠的PBS缓冲液,不含BSA)中,置于冰上待流式细胞仪检测。
实验设3次重复。检测结果表明:在间充质干细胞诱导组中,cDC诱导体系能产生CD1a+的cDC细胞,pDC诱导体系能产生BDCA2+CD123w+的pDC前体细胞IPC。
5、细胞分选
(1)用CD1a细胞分选试剂盒分选CD1a阳性细胞
PBS缓冲溶液IV:含2mM乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)和0.5%(g/100ml)牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBS缓冲溶液。所述PBS缓冲溶液IV的pH为7.2。将配好的缓冲溶液置于4℃。
分选步骤:
收集cDC诱导体系中诱导第14天的细胞,将其加在Ficoll分离液上,在4℃下以1800rpm的速度离心20min;用毛细吸管将白膜层细胞吸出;用PBS缓冲溶液IV离心洗涤细胞2次,每次以1000rpm的速度离心10min,然后计数细胞。
将每107细胞重悬于80μl PBS缓冲溶液IV中,再加入20μl抗CD1a免疫磁珠,混合均匀,4℃孵育15min;用PBS缓冲溶液IV离心洗涤2次,每次以1000rpm的速度离心10min;洗涤后用500μl PBS缓冲溶液IV重新悬浮细胞。
将分离柱固定于MACS磁场内,将标记细胞缓慢通过MiniMACS分离柱,洗脱去除CD1a-细胞;将分离柱移出磁场,加1ml MACS缓冲液加压洗脱分离柱,收集CD1a+细胞并计数;用流式细胞仪分析CD1a+细胞纯度。
整个操作过程要求快速,低温下进行。所有试剂和缓冲溶液都4℃预冷。
实验设3次重复。结果表明:cDC诱导体系培养14天得到的CD1a+cDC细胞数为(16.98±6.80)×106(在图1C中用+MSC表示)。用流式细胞仪分析计数得到CD1a+cDC细胞的纯度为98%。
6、BDCA-2细胞分选试剂盒分选BDCA2阳性pDC前体细胞IPC
PBS缓冲溶液IV:含2mM乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)和0.5%(g/100ml)牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBS缓冲溶液。所述PBS缓冲溶液IV的pH为7.2。将配好的缓冲溶液置于4℃
分选步骤:
收集诱导第25天的细胞,将其加于Ficoll分离液上,在4℃下以1800rpm的速度离心20min;用毛细吸管小心将白膜层细胞吸出;用PBS缓冲溶液IV离心洗涤细胞2次,每次以1000rpm的速度离心10min,然后计数细胞。
将每108细胞重悬于100μl PBS缓冲溶液IV中,加入100μl Fc受体阻断剂(BD PharMingen公司),加入100μl生物素(Biotin)标记的抗BDCA2抗体,混匀后在4℃孵育15min;加入400μl PBS缓冲溶液IV;加入150μl Fc受体阻断剂,加入200μl标记磁珠的抗生物素抗体,混匀后在4℃孵育15min;用PBS缓冲溶液IV离心洗涤2次,每次以1000rpm的速度离心10min;加500μl PBS缓冲溶液IV将细胞重新悬浮。
将分离柱固定于MACS磁场内,将标记细胞缓慢通过MiniMACS分离柱,洗脱去除BDCA2-细胞;将分离柱移出磁场,加1ml MACS缓冲液加压洗脱分离柱,收集BDCA2+细胞并计数;用流式细胞仪分析BDCA2+细胞纯度。
整个操作过程要求快速,低温下进行。所有试剂和缓冲溶液都4℃预冷。
实验设3次重复。结果表明:pDC诱导25天得到的BDCA2+pDC细胞前体IPC数目为(166.13±41.79)×106(在图1D中用+MSC表示)。用流式细胞仪分析计数得到BDCA2+pDC细胞前体IPC的纯度为98%。
(二)间充质干细胞上清液诱导组
取步骤一6中制备的间充质干细胞上清液与分离纯化的CD34+造血干细胞共培养,在培养体系中加入间充质干细胞上清液,使间充质干细胞上清液与诱导培养基的体积比为1∶1;在37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。cDC诱导和pDC诱导分别接种0.5×106个CD34+造血干细胞。
cDC诱导过程中,用台盼蓝分别计数培养第4、7、14天时的活细胞数量。实验设3次重复。结果表明:培养第4、7、14天时的总活细胞(活细胞主要包括CD34+造血干细胞和诱导出的cDC细胞)数量分别为(1.82±0.45)×106,(16.33±3.27)×106,(60.28±17.76)×106(在图1A中用+MSC sup表示)。
pDC诱导过程中,用台盼蓝分别计数培养第5、10、15、20、25天时的活细胞数量。实验设3次重复。结果表明:pDC诱导体系中,培养第5、10、15、20、25天时的总活细胞(活细胞主要包括CD34+造血干细胞和诱导出的pDC细胞前体IPC)数量分别为(17.15±2.64)×106,(83.25±11.74)×106,(186.63±21.48)×106,(417.85±42.77)×106,(1025.58±176.16)×106(在图1B中用+MSC sup表示)。
诱导结束后,检测细胞表型,检测方法如步骤(一)中4所述。实验设3次重复。检测结果表明:在间充质干细胞上清液诱导中,cDC诱导体系同样能产生CD1a+的cDC细胞,pDC诱导体系同样能产生BDCA2+CD123w+的pDC前体细胞IPC。
用CD1a细胞分选试剂盒分选CD1a阳性细胞,分选方法如步骤(一)中5所述。实验设3次重复。结果表明:cDC诱导培养14天得到的CD1a+cDC细胞数目为(17.16±9.08)×106(在图1C中用+MSC sup表示);用流式细胞仪分析计数得到CD1a+cDC细胞的纯度为97%。
用BDCA-2细胞分选试剂盒分选BDCA2阳性pDC前体细胞,分选方法如步骤(一)中6所述。实验设3次重复。结果表明:pDC诱导培养25天得到的BDCA2+pDC细胞前体IPC数目为(118.43±32.66)×106(在图1D中用+MSC sup表示),用流式细胞仪分析计数得到BDCA2+pDC细胞前体IPC的纯度为97%。
(三)对照组即CD34+造血干细胞单独培养
1、将步骤二中分离纯化得到的CD34+造血干细胞以1×105/ml的密度接种于24孔板中。用含100U/ml链霉素和100U/ml青霉素的RPMI-1640完全培养基进行培养。
2、诱导培养:
cDC的诱导:将步骤1中的CD34+造血干细胞接种于上述cDC诱导培养基中,在37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养14天;培养期间每隔4-5天补充新鲜培养基;当细胞长满80%孔底面积时将细胞分孔传代。在第4、7、14天时用台盼蓝计数活细胞数量。实验设3次重复,每次接种0.5×106个CD34+造血干细胞。培养第4、7、14天时的总活细胞(活细胞主要包括CD34+造血干细胞和诱导出的cDC细胞)数量分别为(0.7±0.19)×106、(4.6±0.16)×106、(14.8±0.18)×106(在图1A中用control表示)。
pDC的诱导:将步骤1中的CD34+造血干细胞接种于上述pDC诱导培养基中,在37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养25天;培养期间每隔4-5天补充新鲜培养基;当细胞长满80%孔底面积时将细胞分孔传代。在第5、10、15、20、25天时用台盼蓝计数活细胞数量。实验设3次重复,每次接种0.5×106个CD34+造血干细胞。结果表明:在培养第5、10、15、20、25天时的总活细胞(活细胞主要包括CD34+造血干细胞和诱导出的pDC细胞前体IPC)数量分别为(5.6±0.7)×106、(12.4±1.8)×106、(18.6±2.1)×106、(39.1±1.7)×106、(102±2.3)×106(在图1B中用contol表示)。
3、诱导结束后,检测细胞表型,检测方法如(一)中4所述。实验设3次重复。检测结果表明:在CD34+造血干细胞单独培养中,cDC诱导体系也能产生少量CD1a+cDC细胞,pDC诱导体系也能产生少量BDCA2+CD123w+的pDC前体细胞IPC。
4、细胞分选
(1)、用CD1a细胞分选试剂盒分选CD1a阳性细胞,分选方法如步骤(一)中5所述。
实验设3次重复。结果表明:cDC诱导14天所得到的CD1a+cDC细胞数目为(5.99±0.60)×106(在图1C中用contol表示);用流式细胞仪分析计数得到CD1a+cDC细胞的纯度为96%。
(2)、用BDCA-2细胞分选试剂盒分选BDCA2阳性pDC前体细胞,分选方法如步骤(一)中6所述。
实验设3次重复。结果表明:pDC诱导25天所得到的BDCA2+pDC细胞前体IPC数目为(3.74±1.51)×106(在图1D中用contol表示);用流式细胞仪分析计数得到BDCA2+pDC细胞前体IPC的纯度为96%。
cDC诱导体系的三组实验结果见表1。结果表明:培养14天后,对照组(CD34+造血干细胞单独培养)、间充质干细胞诱导组和间充质干细胞上清液诱导组,三个实验组平均获得的总活细胞(活细胞主要包括CD34+造血干细胞和诱导出的cDC细胞)数量比开始0.5×106个细胞(CD34+造血干细胞)分别增加了29.8倍,141.1倍和120.5倍;培养14天后,间充质干细胞诱导组和间充质干细胞上清液诱导组平均获得的CD1a+cDC细胞数量比对照组分别增加了2.83倍(16.98/5.99=2.83)和2.86倍(17.16/5.99=2.86)。
pDC诱导体系的三组实验结果见表2。结果表明:培养25天后,对照组(CD34+造血干细胞单独培养)、间充质干细胞诱导组和间充质干细胞上清液诱导组,三个实验组最终平均获得的总活细胞(活细胞主要包括CD34+造血干细胞和诱导出的pDC细胞前体IPC)数量比开始的0.5×106个细胞(CD34+造血干细胞)分别增加了241.2倍,2675.5倍和2051.2倍;培养25天后,间充质干细胞诱导组和间充质干细胞上清液诱导组平均获得的BDCA2+的pDC前体细胞IPC细胞数量比对照组分别增加了44.4倍(166.13/3.74=44.4)和31.7倍(118.43/3.74=31.7)。
本实施例表明无论在cDC诱导体系还是pDC诱导体系中,间充质干细胞或培养间充质干细胞所获得的无细胞上清液均能显著的促进CD34+细胞产生更多的树突状细胞。
表1 cDC诱导体系中三组实验结果
cDC诱导体系 | ||||
间充质干细胞诱导组(×106) | 间充质干细胞上清液诱导组(×106) | 单独培养CD34+造血干细胞(即对照组)(×106) | ||
活细胞总数 | 培养4天 | (2.01±0.29) | (1.82±0.45) | (0.7±0.19) |
培养7天 | (18.39±2.24) | (16.33±3.27) | (4.6±0.16) | |
培养14天 | (70.55±10.21) | (60.28±17.76) | (14.8±0.18) | |
CD1a+cDC细胞数目 | 培养14天 | (16.98±6.80) | (17.16±9.08) | (5.99±0.60) |
表2 pDC诱导体系中三组实验结果
pDC诱导体系 | ||||
间充质干细胞诱导组(×106) | 间充质干细胞上清液诱导组(×106) | 单独培养CD34+造血干细胞(即对照组)(×106) | ||
活细胞总数 | 培养5天 | (20.45±2.14) | (17.15±2.64) | (5.6±0.7) |
培养10天 | (105.80±23.26) | (83.25±11.74) | (12.4±1.8) | |
培养15天 | (225.50±39.18) | (186.63±21.48) | (18.6±2.1) | |
培养20天 | (570.92±62.28) | (417.85±42.77) | (39.1±1.7) | |
培养25天 | (1337.75±276.97) | (1025.58±176.16) | (102±2.3) | |
BDCA2+pDC前体细胞IPC细胞数目 | 培养25天 | (166.13±41.79) | (118.43±32.66) | (3.74±1.51) |
实施例2、间充质干细胞诱导CD34+造血干细胞向树突状细胞分化的机理
1、MSCs分泌较高水平的前列腺素E2(PGE2)
分别取实施例1中步骤一的第6步获得的无细胞上清液(图2中以MSC表示)、实施例1步骤一的第7步获得的无细胞上清液(图2中以+NS-398表示)、cDC诱导体系中间充质干细胞组诱导14天和pDC诱导体系中间充质干细胞组诱导25天获得的无细胞上清液。用ELISA法检测四种上清液中PGE2的水平。结果表明:间充质干细胞MSCs无论单独培养(图2中以MSC表示)还是和CD34+造血干细胞一起培养(图2中以“+CD34+Cell”表示),都能分泌较高水平的PGE2(图2)。图2中的数值是三次重复的平均值±标准差,“+CD34+Cell”表示cDC诱导体系中间充质干细胞组诱导14天和pDC诱导体系中间充质干细胞组诱导25天获得的无细胞上清液中PGE2含量的的平均值±标准差。
2、PGE2是MSCs分泌的一种重要的免疫调节因子
按照实施例1的方法分三组分别培养CD34+造血干细胞向树突状细胞分化:CD34+造血干细胞单独培养(图3和表3中以Control表示)、CD34+造血干细胞与间充质干细胞上清液共培养(图3和表3中以MSC表示)、CD34+造血干细胞与经NS-398处理后的间充质干细胞的上清液共培养(图3和表3中以MSC+NS-398表示),同时设与加入外源PGE2(15ng/ml)的经NS-398处理的间充质干细胞上清液共培养组(图3和表3中以PGE2表示)。每组培养中也分为cDC和pDC两个诱导体系。用台盼蓝分别计数在第4、7、14天(cDC诱导培养体系)的活细胞数量和在第5、10、15、20、25天(pDC诱导培养体系)时的活细胞数量。在培养结束时收获细胞,用流式细胞仪检测细胞表达CD1a、CD14、CD80、CD83、CD86及HLA-DR(cDC培养体系)的水平和BDCA2+CD123w+双阳性细胞(pDC培养体系)。实验设5次重复。结果表明:用NS-398阻断间充质干细胞的PGE2分泌,虽不影响间充质干细胞支持CD34+造血干细胞增殖的作用(图3A,其中,Cell no为总的活细胞的数量),但却能改变间充质干细胞MSCs对DCs分化的影响(表3)。
用流式细胞仪检测以上三组分别获得的CD1a+cDCs摄取FITC标记的右旋糖苷的数量来判断各组不成熟cDCs的内吞能力。用流式细胞仪进行检测分析平均荧光强度比值(MFIR)。平均荧光强度比值(MFIR)=实验组的平均荧光强度/对照组的平均荧光强度)。用ELISA法检测成熟cDCs分泌IL-12和IL-10的水平和活化后IPCs分泌IFN-α的水平。结果如图3C所示。
成熟的DCs与分选得到的异基因CD4+CD45RA+初始Th细胞以1∶1(cDCs)或4∶1(pDCs)的比例于RPMI-1640中培养7天。第七天时加入CD3抗体5μg/ml和CD28抗体1μg/ml继续培养24h。收集无细胞上清,用ELISA测其中IFN-γ,IL-4和IL-10的浓度。结果如图3D所示。结果表明:如果没有PGE2,MSCs几乎不能影响造血干细胞分化而来的DCs的功能(图3C,D)。如果在经NS-398处理的MSCs上清液中加入外源的PGE2 15ng/ml,它们的上述作用(该作用是指影响造血干细胞分化而来的DCs的功能)又都恢复了,这进一步证实了MSCs通过分泌PGE2影响CD34+细胞向DCs的分化。
收集成熟的树突状细胞,照射30Gy后作为刺激细胞,以梯度浓度刺激异基因CD4+T细胞(2×105)5天。结束前18h掺入1μCi3H-TdR,收获细胞,计数cpm值。计算各组Delta cpm值。结果如图3B所示。结果表明:用NS-398处理的MSCs上清仍然可以抑制cDC刺激T细胞增殖的能力(图3B),这提示存在其它的因子介导这个作用。
表3 cDC和pDC两个诱导体系中的细胞不同表型阳性率
phenotype | Control(%) | MSC(%) | MSC+NS-398(%) | PGE2(%) | |
cDC | CD1a | 41.73±5.41 | 28.25±8.44 | 36.55±5.56 | 24.25±9.90 |
CD14 | 30.53±6.29 | 46.85±6.40 | 34.60±6.06 | 53.48±9.15 | |
CD80 | 47.58±6.29 | 37.20±10.20 | 50.40±9.19 | 44.90±7.23 | |
CD83 | 49.08±3.58 | 36.10±3.48 | 45.00±7.55 | 30.70±11.46 | |
CD86 | 63.18±7.97 | 60.73±8.98 | 54.53±8.42 | 55.78±11.42 | |
HLA-DR | 95.90±2.91 | 80.23±5.53 | 91.08±6.29 | 75.53±5.89 | |
pDC | BDCA2+CD123w+ | 3.10±0.70 | 10.48±1.593 | 3.54±0.70 | 11.34±1.31 |
P<.05,P<.01
Claims (5)
1.间充质干细胞在诱导CD34+造血干细胞向树突状细胞分化中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述CD34+造血干细胞为骨髓CD34+造血干细胞、脐血CD34+造血干细胞和外周血CD34+造血干细胞中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述树突状细胞为传统树突状细胞和浆细胞样树突状细胞中的一种或两种。
4.根据权利要求1至3中任一所述的应用,其特征在于:所述应用方法为将所述间充质干细胞的增殖能力阻断后,再与所述CD34+造血干细胞共培养。
5.根据权利要求1至3中任一所述的应用,其特征在于:所述应用方法为先将所述间充质干细胞在液体培养基中培养,收集无细胞的上清液,将所得到的上清液用于CD34+造血干细胞的培养中。
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