CN111154721B - Nk细胞扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高效的NK细胞扩增方法，该扩增方法包括以下步骤：(1)分离获得单个核细胞；(2)加入无血清培养基和活化因子，培养；其中，活化因子为IL‑2和CD3单抗。本发明实施例所提供的NK细胞扩增方法在单个核细胞分离出来后直接进行体外扩增，选用特定的活化因子的组合，从而实现极为高效的NK细胞扩增，扩增倍数可达到3000倍以上，相比于现有的扩增方法提升了一个数量级，具有非常好的扩增效果，操作简单。

Description

NK细胞扩增方法
技术领域
本发明涉及NK细胞培养技术领域，尤其是涉及一种NK细胞扩增方法。
背景技术
自然杀伤(natural killer，NK)细胞是无T和B细胞特征表面特征的第三类淋巴细胞中最主要的一种，是连接先天性和特异性免疫系统的桥梁。正常情况下，机体内NK细胞大多在外周血中循环，并以未活化状态存在。NK细胞可在未经致敏情况下，快速杀灭恶变细胞和病毒感染细胞，展现出特殊的免疫调节功能和细胞毒功能。但是NK细胞在体内外周血液中所占比例很少，一般不超过淋巴细胞总数的10％，在短期内要获得大量高纯度的NK细胞比较困难。
为此，研究人员尝试通过体外扩增的方式获得NK细胞。其中最常用的是通过饲养细胞的方法来培养外周血单个核细胞中的NK细胞，这种方法虽然能够获得大量的NK细胞，但人源细胞的引入可能会带来一定的安全隐患。另有一些使用的比较广泛的方法，例如通过细胞因子来刺激NK细胞的扩增。但现有的细胞因子组合刺激NK细胞扩增的方法所提升的扩增倍数较小，一般在一两百倍左右，难以满足临床上对NK细胞的需求。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种高效的NK细胞扩增方法。
第一方面，本发明的一个实施例提供了一种NK细胞扩增方法，该扩增方法包括以下步骤：
(1)分离获得单个核细胞；
(2)加入无血清培养基和活化因子，培养；
其中，活化因子为IL-2(白细胞介素-2)和CD3单抗。
本发明实施例的NK细胞扩增方法至少具有如下有益效果：
本方案在单个核细胞分离出来后直接进行体外扩增，选用特定的活化因子的组合，实现了极为高效的NK细胞扩增，扩增倍数可达到3000倍以上，相比于现有的扩增方法提升了一个数量级，具有非常好的扩增效果，同时操作简单、成本低廉。
根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，IL-2的终浓度为300～800IU/mL，CD3单抗的终浓度为4～20ng/mL。
根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，基于无血清培养基的总体积，单个核细胞的细胞密度为0.5×106～1.0×106/mL。
根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，培养第5天全换液。
根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，全换液后，培养基内IL-2的终浓度为300～800IU/mL。
根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，全换液包括以下步骤：
在第5天离心、去上清后，加入缓冲液混匀，离心，保留沉淀；
将沉淀重悬于无血清培养基，继续培养。
根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，全换液后，每隔1～2天补加无血清培养基和终浓度为300～800IU/ml的IL-2。
根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，无血清培养基中包括1～5％体积比的自体血浆。由于现有的培养基中基本添加了人血清白蛋白，通过额外添加1～5％的自体血浆可以增加NK细胞的扩增倍数。
根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，无血清培养基选自：SCGM、X-VIVO15、AIM-V、KBM581，即可以是这些培养基中的一种或几种。
根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，单个核细胞来源于外周血、脐带血、骨髓或诱导性多能干细胞中的任一种。
根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，在培养的第14～21天收获成熟的NK细胞。
附图说明
图1是本发明的一个实施例的NK细胞扩增方法的扩增实验结果。
图2是本发明的一个实施例的NK细胞扩增方法的细胞表型检测结果。
图3是本发明的一个实施例的NK细胞扩增方法的体外杀伤活性检测结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
提供一种利用外周血单个核细胞进行NK细胞扩增的方法，包括以下步骤：
1.采集外周血：采用肝素钠抗凝管采集外周血液。
2.血浆制备：
①将外周血用移液器上下吹打混匀后，取样进行无菌检测和细胞计数；
②用巴氏吸管把4个离心管内的外周血配平，500×g、7min离心；
③离心结束后，用移液器吸取上层淡黄色血浆层，并转移到新的离心管内，剩余的液体即为浓缩的血细胞；
④将装有血浆的两个离心管用封口膜密封，标识标本编码，于56℃水浴锅内进行灭活30min；
⑤血浆灭活完成以后，900×g、10min离心；
⑥离心完毕后，取上清于2个新的50mL离心管中作为血浆备用，标识标本编码，置于冰箱2℃～8℃保存。
3.单个核细胞分离提取：
①用生理盐水稀释浓缩的血细胞；
②铺血；
③转移完毕血细胞以后，用巴氏吸管把血细胞离心管配平，盖好盖子密封，将离心管放置于离心机，680g、20min离心，离心机升降速度按升快降慢原则。
④离心完毕，将离心管从离心机里轻轻取出放在离心管架上，喷75％酒精消毒，然后移到工作台内；
⑤分离白膜层；
⑥将两个装有单个核细胞的离心管置于离心机中，500×g、6min离心；
⑦离心结束以后，弃去上清，用8mL生理盐水重悬细胞，将两管细胞悬液合并至1管，补加生理盐水至50mL混匀，410×g，6min离心。
4.NK细胞诱导活化：
①离心完成后，弃上清液，用10mL NK细胞初始培养基(SCGM无血清培养基)重悬，取500μL细胞悬液进行计数；
②根据计数结果，从细胞悬液中吸取含有2×107个细胞的细胞悬液，加入1支新离心管中，补液至20mL，用移液管混匀；
③将细胞悬液用移液管均分对2个T75培养瓶中，每瓶10mL细胞悬液。每个细胞培养瓶分别补加0.5mL自体血浆(灭活)，加入IL-2(终浓度500IU/mL)和CD3单抗(终浓度10ng/mL)；
④将培养瓶摇匀，放置于CO2培养箱中饱和湿度、37℃、5％CO2浓度培养；
⑤在培养第5天，将2个培养瓶中的细胞悬液吸出，分别转移至2个15mL离心管中，500×g，10min离心，弃上清，沉淀加入50mL PBS，轻轻吹打混匀，500×g，10min离心弃上清，将沉淀重悬于5mL NK细胞扩增培养基(SCGM无血清培养基)中，计数后补加该培养基，使细胞密度达到1.0×106/mL，加5％自体血浆。
⑥之后每隔一天加入相应体积的培养基(含5％自体血浆和终浓度500IU/mL的IL-2)，使细胞密度维持在1.0×106/mL。
⑦在第0、5、7、9、11、13、15、17、20天用细胞计数仪进行细胞计数。
⑧在第0、10、20天收集细胞进行细胞亚群流式检测，并于第20天时进行体外杀伤活性检测。具体步骤如下：
取对数期生长的K562细胞株作为靶细胞，用PBS调整细胞密度为1×106/mL，加入0.2μM calcein-AM，37℃培养箱避光孵育30min。离心，收集细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，最后无血清的1640培养基重悬，调整细胞密度为4×105/mL，分别取500μL铺于24孔培养板中。取NK细胞(调整细胞密度为8×106/mL)，分别加入到24孔培养板中，每孔加入500μL，效靶比为20:1，设3个复孔，并设置2个空白对照，放置在37℃培养箱中，共同培养16h。收集细胞，用缓冲液洗涤细胞2次，并用100μL缓冲液重悬，加入2μL的PI染色15min，流式上机检测细胞杀伤效率。
结果如图1～图3所示，其中，图1是本发明的一个实施例的NK细胞扩增方法的扩增实验结果，图2是本发明的一个实施例的NK细胞扩增方法的细胞表型检测结果，图3是本发明的一个实施例的NK细胞扩增方法的体外杀伤活性检测结果。从图1可以看出，在培养过程中，细胞总体生长状态良好，培养至两周左右时，细胞扩增至500～1000倍，培养至第20天时，三组样品的总细胞数分别扩增了4500倍、4100倍、4400倍。从图2可以看出，在培养过程中，NK细胞和NKT细胞的比例逐渐增高，三组样本培养20天后，NK细胞分别扩增了6100倍、31200倍、20800倍。从图3可以看出，培养20天后的NK细胞对K562细胞株的体外杀伤活性较高，效靶比为20：1时，三组样本的杀伤率分别为86.50％、90.95％和90.00％。
实施例2
提供一种利用外周血单个核细胞进行NK细胞扩增的方法，与实施例1的区别在于，培养过程中，加入IL-2的终浓度为700IU/mL。
实施例3
提供一种利用外周血单个核细胞进行NK细胞扩增的方法，与实施例1的区别在于，无血清培养基中，补加2％的人血白蛋白而非自体血浆。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (1)

1.一种NK细胞扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分离获得单个核细胞；
（2）加入SCGM无血清培养基使所述单个核细胞的细胞密度为1.0×106/mL，加入终浓度为500 IU/mL的IL-2、终浓度为10 ng/mL的CD3单抗和5%体积比的灭活自体血浆，培养；
（3）培养第5天全换液，所述全换液包括以下步骤：离心、去上清后，加入缓冲液混匀，离心，保留沉淀，将所述沉淀重悬于包括5%体积比的灭活自体血浆的SCGM无血清培养基，使细胞密度达到1.0×106 /mL，继续培养；
（4）每隔1天补加包括5%体积比的灭活自体血浆的所述SCGM无血清培养基和终浓度为500 IU/ml的所述IL-2，使细胞密度达到1.0×106 /mL；
（5）培养第14~21天收获NK细胞。
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