CN102994449A - 一种体外扩增nk细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及NK细胞的培养扩增方法，具体涉及一种体外大量扩增NK细胞的方法，a.将外周血单个核细胞接种在CD3McAb和CD226McAb预包被的培养瓶中共培养，b.加入IL-2和IL-18共培养72小时以刺激扩增NK细胞，c.将NK细胞与经致死处理的K562细胞和含有IL-2和IL-18的无血清培养基转入细胞培养袋中共培养，d.收获NK细胞，本发明将CD3McAb和CD226McAb两种抗体同时包被，促进细胞因子合成和ADCC作用，显著提高了NK细胞的杀伤毒性，仅仅通过IL-2和IL-18两种细胞因子就实现了对NK细胞的激活和扩增，即保证了NK细胞的扩增倍数和细胞毒性，又降低了细胞培养的成本。
Description
[技术领域]
本发明涉及NK细胞的培养扩增方法，具体涉及一种体外大量扩增NK细胞的方法。
[背景技术]
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是属淋巴细胞谱系，含有穿孔蛋白和粒酶颗粒的细胞毒淋巴细胞。其对靶细胞的识别无MHC限制性,无需预先致敏即可直接杀伤肿瘤细胞,也可分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能,是机体天然免疫的主要承担者,也是获得性细胞免疫的核心调节细胞,在肿瘤免疫、抗病毒感染及清除非己细胞中发挥重要作用。有研究证明自然杀伤细胞其实不仅是天然免疫系统中的重要作用成分，它同样具有获得性免疫细胞的一些特征。在免疫系统中，NK细胞反应的速度比T细胞或B细胞要快，其作用机制主要是识别靶细胞，通过释放穿孔素、颗粒酶和分泌多种细胞因子，迅速溶解某些肿瘤细胞，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。但由于NK细胞在人外周血中的含量极低及肿瘤组织中分布频率较低(<10％)，仅占单个核细胞的5%-10%，极大的限制了NK细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。多年来，人们一直尝试能在体外实现NK细胞的大量扩增，但是目前的常规技术主要是在体外培养体系中加入IL-2、IL-12、IL-15和γ-IFN等因子组合来促进NK的扩增，经过一段时间的培养后仅可以使NK细胞扩增几倍或十几倍，纯度亦不理想，因此也不能满足实际的应用。并且这种方法因子需求量较大，成本较高，培养效果不稳定，不适合体外大规模的应用。
[发明内容]
为了解决现有技术中NK细胞扩增后纯度不理想、成本较高等问题，本发明提供一种新的NK细胞的体外扩增的方法，可在体外培养条件下获得大量的、细胞纯度高、杀伤活性强的NK细胞。
为实现上述目的，设计一种体外扩增NK细胞的方法，其特征在于所述的方法由以下步骤组成：
a.将外周血单个核细胞接种在CD3McAb和CD226McAb预包被的培养瓶中共培养，
b.加入IL-2和IL-18共培养72小时以刺激扩增NK细胞，
c.将NK细胞与经致死处理的K562细胞和含有IL-2和IL-18的无血清培养基转入细胞培养袋中共培养，
d.收获NK细胞。
本发明还有如下的优化方案：
用CD3McAb和CD226McAb可用作促进IL-2和IL-18的合成和ADCC作用。
用CD226提升NK细胞中表面活化分子CD69的表达水平、细胞因子IFNγ的分泌和杀伤颗粒CD107a的表达水平。
步骤b具体为，加入IL-2和IL-18，并放入37℃、5%CO2的饱和湿环境中培养72小时。
步骤c具体为，根据细胞生长情况持续补充含有IL-2和IL-18的无血清培养基。
步骤c中，所述的NK细胞与经致死处理的K562细胞的细胞数比例为1:1。致死处理为K562细胞经100Gy剂量的γ射线照射致死。
外周血单个核细胞的浓度优选为1.5×106/ml。所述CD3 McAb的使用优选浓度为100ng/ml。所述CD226 McAb的使用浓度为优选50ng/ml~200ng/ml。所述CD226 McAb的最佳使用浓度为100ng/ml。所述IL-2使用浓度优选为500IU/ml。所述IL-18使用浓度优选为5ng/ml~50ng/ml。所述IL-18最佳使用浓度为10ng/ml。所述无血清培养基还含有人血白蛋白，人血白蛋白使用浓度为0.5%。
与常规的仅单纯向培养体系中添加多种细胞因子的NK细胞培养方法相比，本发明具有如下优点：
1.将CD3McAb和CD226McAb两种抗体同时包被，不仅CD3可促进细胞因子合成和ADCC作用，同样作为NK细胞活化受体的CD226的功能也得到证实，CD226可以引起NK细胞表面活化分子CD69的表达升高，细胞因子(IFNγ)的分泌与杀伤颗粒(CD107a，GranzymeB)的表达都明显升高，显著提高了NK细胞的杀伤毒性；
2.转袋处理：在包被的培养瓶中培养3天后，再将细胞转入细胞培养袋中，这样既可以保证NK细胞被充分激活，又避免了高浓度抗体对细胞的持续作用诱发的凋亡，并且同等条件下细胞培养袋的效果要优于细胞培养瓶；
3.仅仅通过IL-2和IL-18两种细胞因子就实现了对NK细胞的激活和扩增，IL-2可刺激NK细胞表达大量的IL-2Rα链，从而使NK细胞大量增殖，并且在IL2刺激下NK细胞表达黏附分子，使NK胞质中的颗粒增加并促进丝氨酸酯酶mRNA的表达，从而提高NK细胞的细胞毒活性；而IL-18可以诱导NK细胞分泌1FN-γ，并具有促进NK细胞的增殖、活化及Fas介导的杀伤功能，并且可通过胞内的ITAM达到促进NK细胞活化的作用。常规NK细胞培养体系中使用的因子组合中还用到了IL-12、IL-15和IFN-γ等，本发明仅在体外培养体系中使用了两种细胞因子，即保证了NK细胞的扩增倍数和细胞毒性，又降低了细胞培养的成本。
[附图说明]
图1是本发明与常规培养方法NK细胞扩增倍数的比较图；
图2是本发明方法所得NK细胞纯度图；
图3是常规培养方法所得NK细胞纯度图；
图4是本发明与常规培养方法所得NK细胞对K562细胞杀伤活性的比较图。
[具体实施方式]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一、外周血单个核细胞（PBMC）的分离和NK细胞的培养
通过血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞（PBMC），将采集的血样转至离心管；700g，离心分离10min，吸取上层血浆培养时备用；用0.9%生理盐水血样将标本还原至原体积，混匀；将稀释血缓慢加在Ficoll上，900g，离心20min；吸取分离液界面乳白色单个核细胞层；离心洗涤2次并计数；用培养基将PBMC重悬，并调整细胞浓度至1.5×10 6/ml，
转入预先用CD3McAb及CD226McAb包被的75cm2培养瓶中，加入500IU/ml 的IL-2和10ng/ml 的IL-18，培养72小时，
将细胞离心收集起来，计数，并与相同细胞数量的经100Gy剂量的γ射线照射致死的K562细胞混合，用含有0.5%人血白蛋白的无血清培养基调整细胞浓度为1×106/ml，补加IL-2和IL-18至原浓度，转入细胞培养袋中培养，以后每2-3天添加含相同浓度IL-2和IL-18的无血清培养基，维持细胞浓度在3×106/ml左右，14天后即可得到大量扩增的高纯度、高毒性的NK细胞。
二、本方法与常规方法的细胞扩增倍数的比较
分别在第0、7、14及21天从两组取培养细胞，用台盼蓝染色后计数，将计数当天的细胞总数除以培养前的细胞数（即第0天），数值即为细胞的扩增倍数。以此方法可以动态比较两组细胞的扩增情况，结果如表1和图1所示：在培养的第7、14、21天，本法的NK细胞扩增倍数均显著高于常规组P<0.01。
表1：
注：“**”指对于常规组来说，p<0.01
三、本方法与常规方法的细胞纯度的比较
在第21天分别从两组培养体系取细胞培养液，PBS洗涤两次，洗涤后调整细胞浓度为2×105/ml，加入流式抗体，4℃避光30min，洗掉多余抗体，PBS重悬上机检测或1%多聚甲醛固定。所用抗体来自美国BD公司，结果发现常规组（图3）的CD（16+56）+CD3－NK细胞占81.27±1.12%，本方法（图2）CD（16+56）+CD3－NK细胞占91.93±1.91%，两组无显著性差异（P＞0.05）。
四、本方法与常规方法所得NK细胞对A549细胞杀伤活性的比较
以处于对数生长期的A549细胞作为靶细胞，将其调整为1×105/mL，将两种方法培养21天NK细胞作为效应细胞，按1∶1和2∶1和5∶1和10:1的效靶比将效应细胞和靶细胞混合，同时设效应细胞孔、靶细胞孔，每组均设3个平行孔，每孔终体积为200μl，37℃、5%，CO2培养箱中孵育，12h后每孔加入20μlCCK-8溶液，继续孵育4h，用酶标仪检测450nm时的OD值，按以下公式计算杀伤率：
杀伤率(%)=[1-(实验孔OD值-效应孔OD值/靶细胞孔OD值)]×100%
结果如表2和图4所示，在不同效靶比，本方法所得NK细胞对A549细胞的杀伤活性均显著高于常规组（P＜0.01）。
表2：
注：“**”指对于常规组来说，p<0.01。
Claims (10)
1.一种体外扩增NK细胞的方法，其特征在于所述的方法由以下步骤组成：
a.将外周血单个核细胞接种在CD3McAb和CD226McAb预包被的培养瓶中共培养，
b.加入IL-2和IL-18共培养72小时以刺激扩增NK细胞，
c.将NK细胞与经致死处理的K562细胞和含有IL-2和IL-18的无血清培养基转入细胞培养袋中共培养，
d.收获NK细胞。
2.如权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于用CD226提升NK细胞中表面活化分子CD69的表达水平、细胞因子IFNγ的分泌和杀伤颗粒CD107a的表达水平。
3.如权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于步骤（b）为，加入IL-2和IL-18，并放入37℃、5%CO2的饱和湿环境中培养72小时。
4.如权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于步骤（c）中，根据细胞生长情况持续补充含有IL-2和IL-18的无血清培养基。
5.如权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于步骤（c）中，所述的NK细胞与经致死处理的K562细胞的细胞数比例为1:1。
6.如权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于外周血单个核细胞的浓度为1.5×106 /ml。
7.如权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于所述CD226McAb的使用浓度为50ng/ml~200ng/ml。
8.如权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于所述IL-18的使用浓度为5ng/ml~50ng/ml。
9.如权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于所述无血清培养基中含有人血白蛋白，所述人血白蛋白使用浓度为0.5%。
10.如权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于所述所述CD3McAb的使用浓度为100ng/ml。
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Application publication date: 20130327 |