CN106754701A - 一种nk细胞体外诱导、扩增方法 - Google Patents

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曹殿秀
李民
李一民
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Abstract

本发明公开了一种NK细胞体外诱导、扩增方法，步骤为在离心管中加入分离液，将抗凝血加入到分离液上层，进行离心；离心后取出血清与分离液之间的白层膜放入离心管中，加入细胞洗液离心，倒出上清液，得到NK细胞；将促凝血放到离心管里离心得到血清；取出含有细胞激活剂的包被瓶，在包被瓶中加入接种液，将NK细胞和血清依次放入包被瓶中，放到培养箱中培养；在此之后根据每个人细胞生长速度适当加培养液，在培养过程中需向包被瓶中加入促细胞生长剂，直到培养完成后回输到人体内。本发明的可促进NK细胞表面生长因子的释放，激活NK细胞；后期抑制T细胞生长，使NK细胞纯度更高，性能稳定，培养出的细胞扩增倍数高，细胞活率高。

Description

一种NK细胞体外诱导、扩增方法
技术领域
本发明涉及NK细胞的培育，具体是一种NK细胞体外诱导、扩增方法。
背景技术
癌症是现代社会中对人类威胁最大的疾病之一，对癌症的治疗一直是现代医学的关注点。肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法，其中自体免疫细胞(T细胞、NK细胞)治疗技术属国家卫生部首批允许临床应用的第三类医疗技术。近年来，自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)免疫治疗技术在世界范围内正在成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗且副作用小，不损伤正常组织。NK细胞于20世纪70年代进入人们的视线，至今已有近40年的发展历史。NK细胞被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，是由淋巴祖细胞分化而来，并与B淋巴细胞和T淋巴细胞构成了三大类免疫细胞，仅占外周血淋巴细胞的5-10％。NK细胞无需预先接触抗原即可杀伤靶细胞(如病毒感染的宿主细胞和肿瘤细胞)，由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，因此称为自然杀伤活性，其在免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。NK细胞的肿瘤杀伤机制包括：(1)FasL与Fas相作用，最终启动了靶细胞凋亡系统。(2)穿孔素/颗粒酶作用，激发凋亡相关酶系统致细胞发生凋亡。(3)NK细胞表面表达的CD16分子与肿瘤特异性IgG抗体发生结合，从而识别、杀伤与IgG抗体发生特异性结合的肿瘤细胞。(4)TNF-α、IFN-γ等与靶细胞表面相应受体的结合，启动靶细胞的凋亡系统。NK细胞除对靶细胞具有溶解杀伤作用外，NK细胞还在机体免疫反应中具有重要功能。NK细胞可通过对MФ、粒细胞、树突状细胞的调节作用而控制天然免疫力。NK细胞可以作用于CD4+T细胞和CD8+T细胞以强化获得性免疫。然而现在最主要的问题在于NK细胞体外扩增速度慢，同时还有大量的T细胞混杂，而且培育出的NK细胞性能较差，生物活性不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种NK细胞体外诱导、扩增方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种NK细胞体外诱导、扩增方法，包括下述步骤：
(1)在离心管中加入分离液3CS-LSR III，将抗凝血缓慢加入到分离液上层，进行离心；
(2)离心后取出血清与分离液之间的白层膜放入离心管中，向该离心管中加入细胞洗液3CS-EB III，充分震荡，离心，此步骤重复两次，倒出上清液，得到NK细胞；
(3)将促凝血放到离心管里离心得到血清，得到的血清中加入3CS-3PA-L；
(4)取出含有细胞激活剂3CS-NK-A/B的包被瓶，在包被瓶中加入接种液3CS-NKIMIII，将NK细胞和血清依次放入包被瓶中，放到培养箱中培养；
(5)在此之后根据每个人细胞生长速度适当加培养液3CS-CD707，在培养过程中需向包被瓶中加入促细胞生长剂3CS-NK-B1和3CS-NK-B2，直到16-20天回输到人体内。
作为本发明进一步的方案：细胞培养时间从完成步骤4开始计时第0天。
作为本发明再进一步的方案：步骤5中在培养过程中第2天向包被瓶中加入促细胞生长剂3CS-NK-B1和3CS-NK-B2。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：可促进NK细胞表面生长因子的释放，进而激活NK细胞；促进NK细胞和T细胞表面生长因子的释放，但是后期只有利于NK细胞的生长，进而抑制T细胞生长，使NK细胞培养的纯度更高，性能稳定，最终培养出的细胞扩增倍数高，细胞活率高。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种NK细胞体外诱导、扩增方法，包括下述步骤：
(1)在离心管中加入分离液3CS-LSR III，将抗凝血缓慢加入到分离液上层，进行离心；
(2)离心后取出血清与分离液之间的白层膜放入离心管中，向该离心管中加入细胞洗液3CS-EB III，充分震荡，离心，此步骤重复两次，倒出上清液，得到NK细胞；
(3)将促凝血放到离心管里离心得到血清，得到的血清中加入3CS-3PA-L；
(4)取出含有细胞激活剂3CS-NK-A/B的包被瓶，在包被瓶中加入接种液3CS-NKIMIII，将NK细胞和血清依次放入包被瓶中，放到培养箱中培养，计时细胞培养第0天；
(5)在此之后根据每个人细胞生长速度适当加培养液3CS-CD707，在培养过程中第2天向包被瓶中加入促细胞生长剂3CS-NK-B1和3CS-NK-B2，直到16-20天回输到人体内。
NK细胞体外诱导、扩增方法里所有涉及到的试剂全部是由弎西艾斯(苏州)生物科技有限公司研发生产。
NK细胞激活剂3CS-NK-A/B分别适合亚健康人群和肿瘤患者，就是可促进NK细胞表面生长因子的释放，进而激活NK细胞，是NK细胞培养必用试剂。促细胞生长剂3CS-NK-B1和3CS-NK-B2刚加入可同时促进NK细胞和T细胞表面生长因子的释放，但是后期只有利于NK细胞的生长，进而抑制T细胞生长，使NK细胞培养的纯度更高。NK细胞培养基3CS-CD707是化学成分限定型培养基，性能稳定，最终培养出的细胞扩增倍数高，细胞活率高。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (3)

1.一种NK细胞体外诱导、扩增方法，其特征在于，包括下述步骤：
（1）在离心管中加入分离液3CS-LSRIII，将抗凝血缓慢加入到分离液上层，进行离心；
（2）离心后取出血清与分离液之间的白层膜放入离心管中，向该离心管中加入细胞洗液3CS-EB III，充分震荡，离心，此步骤重复两次，倒出上清液，得到NK细胞；
（3）将促凝血放到离心管里离心得到血清，得到的血清中加入3CS-3PA-L；
（4）取出含有细胞激活剂3CS-NK-A/B的包被瓶，在包被瓶中加入接种液3CS-NKIM III，将NK细胞和血清依次放入包被瓶中，放到培养箱中培养；
（5）在此之后根据每个人细胞生长速度适当加培养液3CS-CD707，在培养过程中向包被瓶中加入促细胞生长剂3CS-NK-B1和3CS-NK-B2，直到16-20天回输到人体内。
2.根据权利要求1所述的NK细胞体外诱导、扩增方法，其特征在于，细胞培养时间从完成步骤4开始计时第0天。
3.根据权利要求1所述的NK细胞体外诱导、扩增方法，其特征在于，步骤5中在培养过程中第2天向包被瓶中加入促细胞生长剂3CS-NK-B1和3CS-NK-B2。
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