CN103468641A - 一种癌性胸腹水来源的til细胞的高效扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明目的是提供一种癌性胸腹水来源的TIL细胞的高效扩增方法,本发明所制备出的TIL细胞具有增殖速度快、细胞数量大、细胞活性高等特点。本发明的主要特点是:利用层粘连蛋白和纤维连接蛋白包被的培养瓶对TIL进行培养,这两种蛋白的吸附作用可以使细胞成半贴壁状态,从而利于细胞接受各种因子的刺激,并且这两种蛋白本身就有对TIL细胞增殖的促进作用;而抗OX-40单克隆抗体的使用可以刺激TIL细胞中CD3+CD8+T细胞亚群的共刺激信号,促进细胞的活化,提高细胞穿孔素和颗粒酶的表达,增强其杀伤能力。到目前为止,仍未见有将层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗OX-40单克隆抗体联合应用于TIL细胞制备的研究报道,本发明首次提供出一种在TIL细胞制备中通过添加以上三种因子提高细胞数量和杀伤活性的方法。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养领域,具体涉及一种肿瘤侵润淋巴细胞(TumorInfiltrating lymphocyte,TIL)的培养,即利用各种细胞因子的组合来刺激胸腹水来源的淋巴细胞,使其可以高效扩增。
背景技术
肿瘤侵润淋巴细胞(Tumor Infiltrating lymphocyte,TIL)是指侵润到肿瘤组织周围的淋巴细胞,细胞表型以CD3+CD8+T和CD3+CD4+T细胞为主,另外还有少量的NKT细胞和NK细胞。由于TIL细胞多数与肿瘤细胞发生过接触,所以理论上可以对肿瘤细胞产生特异性的杀伤作用。但是,由于肿瘤微环境中,存在很强的免疫抑制因子,所以实际上TIL细胞的功能是受到极大的抑制,无法发挥对肿瘤细胞的有效杀伤作用。
上个世纪八十年代,Rosenberg教授首次分离肿瘤组织中的TIL细胞,并通过白细胞介素2的刺激接来解除其免疫抑制状态,体外扩增后,用于回输治疗黑色素瘤患者,并取得了一定的效果。
TIL细胞的来源主要有两个:1、手术切除的肿瘤组织或淋巴结;2、癌性胸腹水。从手术样品中分离TIL细胞需要经过机械剪切,多种蛋白酶的酶解等多个步骤,方法比较繁琐,而且最终能够分离并成功培养的比例不高,这很大程度上限制了手术样品来源TIL的临床应用。癌性胸腹水来源的TIL细胞,分离的方法相对简单,也容易在体外培养,所以在临床得到了较为广泛的应用。但是,由于使用传统方法,TIL在体外的扩增有限,通常20天左右的时间,细胞数量仅扩增20-50倍左右,且TIL细胞中CD3+CD8+T细胞的杀伤能力不高,极大的影响了TIL细胞临床应用的效果。
科研工作者不断探索培养TIL的新方法,比如在培养中期添加抗CD3单克隆抗体、使用炎性因子等。因此,尽早建立一种高效扩增TIL细胞的方法,已成为国内外学着研究工作的目标。
发明内容
本发明的目的是提供一种癌性胸腹水来源的TIL细胞的高效扩增方法,即使用肿瘤患者的胸腹水,分离得到TIL细胞,在体外通过多种因子的刺激作用,使TIL细胞得到大量扩增,并提高其杀伤活性。
申请人在长期的研究中发现,层粘连蛋白和纤维连接蛋白可以极大的提高TIL细胞的增殖速度;而抗OX-40单克隆抗体的添加可以有效的刺激TIL细胞的活化,上调CD3+CD8+T细胞中行使杀伤功能的穿孔素和颗粒酶的表达,提高其对肿瘤细胞的杀伤活性。申请人将层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗OX-40单克隆抗体三种因子共用引入到TIL细胞的培养中,从而促成了本发明。
本发明的TIL细胞的培养方法,包括如下的步骤:
1)将层粘连蛋白和纤维连接蛋白溶解稀释后,加入到细胞培养瓶中包被;
2)将从胸腹水分离得到的TIL细胞用培养液重悬后,接种到包被后的培养瓶中;添加IL-2刺激;
3)培养4天后,将细胞转移到透气的细胞培养袋中继续扩大培养,并添加抗OX-40单克隆抗体;
4)持续扩大培养至第20天时,完成高效TIL细胞的培养。
本发明步骤2)所述的培养液,其配方组成如下:氯化钙40mg/ml、氯化钾300mg/ml、硫酸镁120mg/ml、氯化钠5000mg/ml、磷酸二氢钾300mg/ml、碳酸氢钙1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、维生素21.4mg/ml、微量元素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰岛素8mg/ml、亚油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、双甘氨肽mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。
其中氨基酸的配比如下:8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。
维生素的配比如下:2份D-生物素、120份氯化胆碱、10份叶酸、35份硫胺素、2份维生素B2、25份维生素B1、20份D-泛酸酯。
微量元素的配比如下:85000份硫酸铁、120份硫酸铜、1500份亚硒酸钠、6份偏钒酸铵、5000份硫酸锌。
为了获得更好的培养效果,在培养液中还添加有25mg/L的小球藻生长因子(Chlorella Growth Factor,CGF)。
本发明所制备出的TIL细胞具有增殖速度快、细胞数量大、细胞活性高等特点。本发明的主要特点是:利用层粘连蛋白和纤维连接蛋白包被的培养瓶对TIL进行培养,这两种蛋白的吸附作用可以使细胞成半贴壁状态,从而利于细胞接受各种因子的刺激,并且这两种蛋白本身就有对TIL细胞增殖的促进作用;而抗OX-40单克隆抗体的使用可以刺激TIL细胞中CD3+CD8+T细胞亚群的共刺激信号,促进细胞的活化,提高细胞穿孔素和颗粒酶的表达,增强其杀伤能力。到目前为止,仍未见有将层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗OX-40单克隆抗体联合应用于TIL细胞制备的研究报道,本发明首次提供出一种在TIL细胞制备中通过添加以上三种因子提高细胞数量和杀伤活性的方法。
具体实施方法
本发明所用的材料描述如下:
抗OX-40单克隆抗体:鼠抗人OX-40单克隆抗体,购于安迪生物科技(上海)有限公司
HTB-135细胞:人胃癌细胞系,购于中科院细胞库
NCI-H596细胞:人肺癌细胞系,购于中科院细胞库
HepG2细胞:人肝癌细胞系,购于中科院细胞库
本发明的癌性胸腹水来源的TIL细胞的高效扩增方法,包括如下的步骤:
1)培养瓶的包被:分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白100微克,于20毫升的磷酸盐缓冲液中充分溶解,将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后,加入到底面积为175平方厘米的培养瓶中,室温放置3-5小时。
2)细胞接种:收集400-1000毫升的癌性胸腹水,1500转/分钟,离心10分钟。用30ml无血清培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液缓慢加入到已经添加有15ml淋巴细胞分离液的离心管。2000转/分钟,离心15分钟。取中间白色的PBMC细胞层,生理盐水洗涤2次,用60毫升的无血清培养基重悬,取样计数后,接种到去包被液的培养瓶中。添加60000单位的IL-2。
3)转移培养:接种后的细胞在培养到第5天时,转入透气的细胞培养袋中继续培养,添加无血清培养基至400毫升,添加200000单位的IL-2和4微克的抗OX-40单克隆抗体。
4)扩大培养:每隔两天根据细胞的数量和状态,添加适量的无血清培养基,并按500单位/毫升的浓度添加IL-2,持续扩大培养。
收获细胞:在培养的第20天,取1毫升的细胞悬液进行细胞计数,计算TIL细胞的增殖倍数。离心收集全部培养所得细胞,取适量细胞进行杀伤实验。
下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。
实验例1
1)培养瓶的包被:分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白100微克,于20毫升的磷酸盐缓冲液中充分溶解,将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后,加入到底面积为175平方厘米的培养瓶中,室温放置4小时。
2)细胞接种:收集600毫升的癌性腹水,1500转/分钟,离心10分钟。用30ml无血清培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液缓慢加入到已经添加有15ml淋巴细胞分离液的离心管。2000转/分钟,离心15分钟。取中间白色的PBMC细胞层,生理盐水洗涤2次,用60毫升的无血清培养基重悬,取样计数,计算细胞数为2.6×107个。将细胞悬液接种到去包被液的培养瓶中,添加60000单位的IL-2。其中无血清培养基的组份如下:氯化钙40mg/ml、氯化钾300mg/ml、硫酸镁120mg/ml、氯化钠5000mg/ml、磷酸二氢钾300mg/ml、碳酸氢钙1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、维生素21.4mg/ml、微量元素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰岛素8mg/ml、亚油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、双甘氨肽mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml、25mg/L的小球藻生长因子。
其中氨基酸的配比如下:8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。
维生素的配比如下:2份D-生物素、120份氯化胆碱、10份叶酸、35份硫胺素、2份维生素B2、25份维生素B1、20份D-泛酸酯。
微量元素的配比如下:85000份硫酸铁、120份硫酸铜、1500份亚硒酸钠、6份偏钒酸铵、5000份硫酸锌。
上述的培养基是长期优化获得的,在同样的培养时间内,本发明的培养液对细胞的增殖效果要明显好于现有的细胞培养液,细胞增殖速度可以提高约12%。
3)转移培养:接种后的细胞在培养到第5天时,转入透气的细胞培养袋中继续培养,添加无血清培养基至400毫升,添加200000单位的IL-2和4微克的抗OX-40单克隆抗体。
4)扩大培养:每隔两天根据细胞的数量和状态,添加适量的无血清培养基,并按500单位/毫升的浓度添加IL-2,持续扩大培养。
收获细胞:在培养的第20天,取1毫升的细胞悬液计数,计算细胞数为5.4×109个,增殖倍数为208倍。离心收集全部培养所得细胞,取适量细胞进行杀伤实验。高效TIL细胞在效靶比为10:1的条件下,对HTB-135、NCI-H596和HepG2细胞系的杀伤分别达到22.8%、19.4%、13.4%。
按照上述步骤,重复试验7次,高效TIL细胞增殖倍数的平均值为172倍。在效靶比为10:1的条件下,高效TIL细胞对对HTB-135、NCI-H596和HepG2细胞系杀伤的平均值为26.2%、20.7%和15.8%.
实验例2
1)培养瓶的包被:分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白100微克,于20毫升的磷酸盐缓冲液中充分溶解,将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后,加入到底面积为175平方厘米的培养瓶中,室温放置5小时。
2)细胞接种:收集400毫升的癌性胸水,1500转/分钟,离心10分钟。用30ml无血清培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液缓慢加入到已经添加有15ml淋巴细胞分离液的离心管。2000转/分钟,离心15分钟。取中间白色的PBMC细胞层,生理盐水洗涤2次,用80毫升的无血清培养基重悬,取样计数,计算细胞数为3.2×107个。将细胞悬液接种到去包被液的培养瓶中,添加80000单位的IL-2。
3)转移培养:接种后的细胞在培养到第5天时,转入透气的细胞培养袋中继续培养,添加无血清培养基至400毫升,添加160000单位的IL-2和4微克的抗OX-40单克隆抗体。
扩大培养:每隔两天根据细胞的数量和状态,添加适量的无血清培养基,并按400单位/毫升的浓度添加IL-2,持续扩大培养。
4)收获细胞:在培养的第20天,取1毫升的细胞悬液计数,计算细胞数为5.7×109个,增殖倍数为178倍。离心收集全部培养所得细胞,取适量细胞进行杀伤实验。高效TIL细胞在效靶比为10:1的条件下,对HTB-135、NCI-H596和HepG2细胞系的杀伤分别达到16.3%、27.6%、15.5%。
实验例3
1)培养瓶的包被:分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白100微克,于20毫升的磷酸盐缓冲液中充分溶解,将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后,加入到底面积为175平方厘米的培养瓶中,室温放置3小时。
2)细胞接种:收集900毫升的癌性腹水,1500转/分钟,离心10分钟。用30ml无血清培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液缓慢加入到已经添加有15ml淋巴细胞分离液的离心管。2000转/分钟,离心15分钟。取中间白色的PBMC细胞层,生理盐水洗涤2次,用80毫升的无血清培养基重悬,取样计数,计算细胞数为3.6×107个。将细胞悬液接种到去包被液的培养瓶中,添加80000单位的IL-2。
3)转移培养:接种后的细胞在培养到第5天时,转入透气的细胞培养袋中继续培养,添加无血清培养基至450毫升,添加180000单位的IL-2和4微克的抗OX-40单克隆抗体。
扩大培养:每隔两天根据细胞的数量和状态,添加适量的无血清培养基,并按400单位/毫升的浓度添加IL-2,持续扩大培养。
5)收获细胞:在培养的第20天,取1毫升的细胞悬液计数,计算细胞数为5.5×109个,增殖倍数为153倍。离心收集全部培养所得细胞,取适量细胞进行杀伤实验。高效TIL细胞在效靶比为10:1的条件下,对HTB-135、NCI-H596和HepG2细胞系的杀伤分别达到14.6%、12.9%、20.1%。
本发明所制备的高效TIL细胞在培养第20天时,增殖倍数超过150倍,是比常规TIL培养方法增殖倍数的300%以上,并且高效TIL细胞在较低的效靶比条件下,即可对常见的胃癌、肺癌和肝癌细胞系产生较高的杀伤。
Claims (6)
1.一种TIL细胞的培养方法,包括如下的步骤:
1)将层粘连蛋白和纤维连接蛋白溶解稀释后,加入到细胞培养瓶中包被;
2)将从胸腹水分离得到的TIL细胞用培养液重悬后,接种到包被后的培养瓶中;添加IL-2刺激;
3)培养4天后,将细胞转移到透气的细胞培养袋中继续扩大培养,并添加抗OX-40单克隆抗体;
4)持续扩大培养至第20天时,完成高效TIL细胞的培养。
2.如权利要求1所述的培养方法,其特征在于所述的步骤2)中的培养液,其配方组成如下:氯化钙40mg/ml、氯化钾300mg/ml、硫酸镁120mg/ml、氯化钠5000mg/ml、磷酸二氢钾300mg/ml、碳酸氢钙1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、维生素21.4mg/ml、微量元素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰岛素8mg/ml、亚油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、双甘氨肽mg/ml、次黄嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。
3.如权利要求2所述的培养方法,其特征在于所述的氨基酸的配比如下:8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。
4.如权利要求2所述的培养方法,其特征在于所述的维生素的配比如下:2份D-生物素、120份氯化胆碱、10份叶酸、35份硫胺素、2份维生素B2、25份维生素B1、20份D-泛酸酯。
5.如权利要求2所述的培养方法,其特征在于所述的微量元素的配比如下:85000份硫酸铁、120份硫酸铜、1500份亚硒酸钠、6份偏钒酸铵、5000份硫酸锌。
6.如权利要求1所述的培养方法,其特征在于所述的步骤2)中的培养液添加有25mg/L的小球藻生长因子。
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