CN106222141B - Nk细胞培养液和细胞培养方法 - Google Patents

Nk细胞培养液和细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本申请属于细胞技术领域，具体涉及细胞培养液和细胞培养方法及其应用。本发明提供的细胞培养液，包括：培养液A和培养液B，所述培养液A中包含OKT3、CD16、IL‑2、IL‑15和4‑1BBL等细胞因子，所述培养液B中包含IL‑2、IL‑15和4‑1BBL等细胞因子。本发明还提供了一种细胞培养方法，包括：将细胞接种于培养液A中培养，隔天补充所述培养液A；培养至第9天时补充培养液B继续培养，隔天补充所述培养液B。本发明优化了细胞因子组合和培养工艺流程，不仅缩短了培养周期，使培养只需14‑21天，而且培养得到的NK细胞纯度达到70％以上；本发明方法无需对NK细胞进行纯化，步骤简便，可操作性强。

Description

NK细胞培养液和细胞培养方法
技术领域
本发明属于细胞技术领域，具体涉及NK细胞培养液和细胞培养方法。
背景技术
肿瘤，又称为癌症，是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞异常增生而形成的新生物，常表现为局部肿块。肿瘤细胞具有异常的形态、代谢和功能，它生长旺盛，常呈持续性不受机体控制的生长，最终破坏机体各器官的正常功能从而导致机体死亡。肿瘤不是人类特有疾病，几乎所有动物(除个别物种)均可以形成肿瘤，甚至一部分植物也会得“癌症”，因此肿瘤是高等物种间具有通性的疾病。肿瘤具有发病率高、隐蔽性强及致死率高等特点，随着全球人口不断增长与老龄化的加剧，癌症已经成为人类健康的第一杀手。《2015全球癌症统计》数据显示，2012年全球约有1410万新发肿瘤患者，有820万肿瘤患者死亡，其中肺癌发病率为180万，占癌症发病人数的13％，是癌症中诊断率最高的病种，也是全球男性、发达国家女性癌症死亡率最高的病种。根据全国肿瘤登记中心发布的《2015年中国肿瘤登记年报》数据：2011年我国新增癌症病例约337万例，比2010年增加28万例——这相当于每分钟就有6个人得癌。
人类发现肿瘤已有三千年以上的历史，现代肿瘤治疗学先后实现了三次革命性的突破。第一次是细胞毒性化疗药物的发现，改变了肿瘤治疗依靠手术和放疗的局面；第二次是靶向治疗，提高了抗肿瘤药物的治疗指数，奠定了今日精准医疗的基础；第三次就是调动患者自身天然免疫功能的免疫疗法，从肿瘤治疗理念层面实现了深刻变革，是当下肿瘤治疗领域的焦点。
自人类首次认识肿瘤以来，就开始了艰苦卓绝的奋斗历史，先后开发了手术治疗、化疗、免疫治疗、放疗等治疗手段。手术、放疗和化疗一直是治疗肿瘤无法撼动的三大“主角”。然而进入21世纪以后，随着肿瘤学与免疫学发展不断深入，围绕人体免疫系统来治疗肿瘤逐步被各大药企与科研院所接受而成为新药研发的热门领域。2013年《Science》杂志将肿瘤免疫治疗评选为年度十大科学突破之首，标志着免疫治疗已树立其抗肿瘤的优势地位。1984年11月，美国海军女军人琳达·泰勒因晚期转移性黑色素瘤参加了一项由美国国立癌症研究院(NCI)史蒂夫·罗森伯格博士主持的用白介素2(IL-2)进行肿瘤免疫治疗的临床试验，在她之前已有80个病人参加实验，然而没有一人存活。面对癌症的挑战，罗森伯格博士决定大幅度增加剂量。她勇敢地克服了种种毒副作用，坚持完成一个月的治疗后出院，病情逐渐稳定直至肿瘤完全消失。奇迹发生了，琳达成为第一个由免疫疗法治愈的肿瘤病人，也是现代肿瘤免疫治疗学的一个历史见证人。
所谓肿瘤免疫治疗，是指在治疗过程中直接或者间接利用人体免疫系统对肿瘤患者进行有效治疗的方法，包括药物免疫治疗与细胞免疫治疗。免疫细胞治疗肿瘤技术的发展情况主要经历了3个阶段：第一个阶段是淋巴细胞因子激活的杀伤细胞(LAK)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)阶段，Elizabeth A.Grimm等学者在1981年通过IL-2培养的方式，成功将LAK与抗击肿瘤联系起来，而后在1986年肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的发现也被发表在《科学》杂志上。但是由于操作复杂和大量IL-2的使用，它们在临床上的应用受到了一定程度的限制。第二个阶段是细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、DC-CIK和CTL等阶段。1991年，Schmidt Wolf建立了经典的CIK培养方式，用此方法培养出来的细胞对肿瘤的杀伤作用比LAK增长了73倍。但是由于CIK是广谱杀伤的，针对性不强，于是在此基础上，引进了专职的抗原提呈细胞-DC，而后发展了DC-CIK和CTL的培养方法。由于这些细胞对肿瘤的杀伤作用高，针对性强而且消除了对IL-2的依赖作用，于是被广泛应用在多种肿瘤的临床试验和治疗上，在皮肤癌、肺癌、卵巢癌、肠胃癌等多种肿瘤的治疗上取得了很好的效果。然而，伴随着基因工程技术的发展，免疫细胞治疗肿瘤技术迎来了第三个阶段，特异性识别肿瘤标记物杀伤肿瘤细胞的细胞免疫治疗阶段。美国的FDA在2010年批准了一个治疗前列腺癌的新药--sipuleucel-T—就是采用基因工程的手段使得免疫细胞特异性的识别前列腺癌标记物-PSA，进而提供对癌细胞的杀伤。与此同时，据Clinicaltrial.gov注册统计，美国已有近300项相类似的临床试验在进行，这也将是免疫细胞治疗发展的趋势。本世纪初，在美国举行的“国际肿瘤生物治疗及基因治疗年会”的总结报告就已经指出“生物治疗是目前知道的唯一一种有望完全消灭癌细胞的治疗手段，21世纪是肿瘤生物治疗的世纪”。2011年10月4日，诺贝尔委员会宣布将2011年诺贝尔医学奖颁发给肿瘤免疫治疗的鼻祖斯坦曼等人，更加推动了肿瘤免疫治疗技术的发展和普及应用。
过继细胞免疫治疗(Adoptive CellTransfer Therapy，ACT)是指通过对自体免疫细胞进行体外激活和扩增，然后将其重新输回肿瘤患者体内，并辅以合适的生长因子，促使其发挥杀伤杀死肿瘤细胞的功能。目前，过继性免疫治疗已经成为肿瘤免疫治疗的主要方式之一。过继细胞免疫治疗ACT主要包括非特异性疗法LAK、CIK、DC、NK和特异性TIL、TCR、CAR等。
NK细胞是自然杀伤细胞的简称，是人体中自然免疫的一种细胞，能识别和杀伤外源性或者病变的细胞，主要分布于外周血中，占PBMC 5～10％。在淋巴结和骨髓中也存在少量NK细胞活性，但其水平较外周血低。它对靶细胞杀伤时既不需特异性抗体参加，也不需抗原预先致敏，具有快速、广谱的杀伤性。目前认为，自然杀伤细胞来源于骨髓，能立即发挥非特异性杀伤靶细胞的作用，尤其是对多种肿瘤细胞有迅速杀伤和溶解作用。因此，自然杀伤细胞对癌症的监视作用已越来越受到重视。与此同时，NK还可选择性地杀伤病毒感染的靶细胞。由T细胞或NK细胞所产生的干扰素可协同NK的抗病毒作用，而对正常细胞有保护作用。另一方面，病毒感染细胞表面的病毒抗原和其它表面分子使得其对NK的杀伤细胞作用变得更加敏感。在体外，NK可溶解疱疹病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、巨细胞病毒和流感病毒感染的靶细胞。
NK细胞具有不同的受体，主要包括4中，为：杀伤细胞活化受体(killeractivatory receptor，KAR)，KAR主要用于识别靶细胞糖类等配体启动活化信号，包括MHC型和非MHC型活化受体；杀伤细胞抑制受体(killer inhibitory receptor，KIR)，KIR配体为MHC-I类分子，传递抑制性信号，使NK细胞处于不活化状态，无杀伤效应；杀伤细胞凝集素样受体(killer lectin-like receptors，KLR)，杀伤细胞凝集素样受体产生抑制性信号和活化性信号的双重作用；Fcγ受体(CD16)。前三类受体可抑制或激活NK细胞，使之具有识别自身组织细胞与体内异常组织细胞的能力。主要通过表面活化性受体KAR与自身细胞上多糖类抗原结合产生活化信号、同时抑制性受体KIR与MHC I类分子结合，当癌细胞表面MHC I类分子发生改变或者缺失，KIR不能与之结合产生抑制信号，结果KAR的作用占主导地位，从而使NK细胞活化产生杀伤效应。
NK细胞表面具有IgG1和IgG3的低亲和力受体FcγRIII(CD16)，可与抗体Fc段结合，介导NK细胞识别被抗体包被的靶细胞。此种以IgG抗体作为中间桥梁，定向介导NK细胞对靶细胞的杀伤作用，称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)，从而杀伤与IgG抗体特异性结合的肿瘤或病毒感染细胞。
NK细胞活性与与肿瘤发病呈负相关性。NK细胞活性随着年龄的增加逐渐降低，癌症发病率随着年龄的增长而增高；NK活性低的人群组要比NK活性中、高组的癌症发病率高两倍；癌症患者体内NK细胞表现为激活性受体(KAR)表达降低，抑制性受体(KIR)表达增加，从而功能受到抑制；癌症转移病人的NK活性明显降低。
NK细胞具有较广的抗瘤谱。可杀伤同系、同种或异种肿瘤细胞，其杀伤靶细胞的机制可能是1)释放穿孔素和颗粒酶引起靶细胞坏死或凋亡；2)通过死亡受体调节诱导靶细胞凋亡；3)分泌多种效应性细胞因子对抗转移肿瘤4)激发继发肿瘤免疫反应。
NK细胞疗法可单独用于多种癌症的治疗，用于实体瘤与血液病的治疗。NK细胞疗法还可联合利妥昔单抗(美罗华)、曲妥珠单抗(赫赛汀)、西妥昔单抗(爱必妥)、尼妥珠单抗(泰欣生)等单抗使用，用于非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、肺癌、头颈癌、胰腺癌、卵巢癌等的治疗。
目前，NK细胞的培养方法主要采用磁珠分选或流式分选；或者使用x射线辐射过的K562细胞作为滋养层细胞，同时加入CD3抗体、IL-2、IL-15等细胞因子进行培养。然而，这些方法需要对NK细胞进行纯化，增加分离步骤；需要使用滋养层细胞，容易引入外源性细胞，增加了NK细胞培养失败的风险，使得培养体系不太适合于临床应用；使用x射线，花费成本高，操作难度大。
因此，研发出一种无需使用滋养层细胞、步骤简便的NK细胞的培养方法，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了细胞培养液和细胞培养方法及其应用，用于解决现有技术中需要使用滋养层细胞，容易引人外源性细胞；或者需要对NK细胞进行纯化，增加分离步骤，加大花费成本的技术缺陷。
本发明的具体技术方案如下：
细胞培养液，包括：培养液A，所述培养液A包含OKT3、CD16、IL-2、IL-15、4-1BBL和基础培养基；
其中，所述OKT3、CD16、IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液A中的终浓度依次为：0-500ng/mL、0-500ng/mL、0-1000U/mL、0-500ng/mL和0-500U/mL。
优选的，所述OKT3、CD16、IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液A中的终浓度依次为：50ng/mL、50ng/mL、100U/mL、50ng/mL和50U/mL。
优选的，本发明细胞培养液还包括：培养液B，所述培养液B包含IL-2、IL-15、4-1BBL和基础培养基；
其中，所述IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液B中的终浓度依次为：0-1000U/mL、0-500ng/mL和0-500U/mL。
优选的，所述IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液B中的终浓度依次为：100U/mL、50ng/mL和50U/mL。
优选的，上述基础培养基为NK细胞无血清培养基。
一种细胞培养方法，包括：将细胞接种于培养液A中培养，隔天补充所述培养液A；培养至第9天时补充培养液B继续培养，隔天补充所述培养液B。
优选的，所述培养液A包含OKT3、CD16、IL-2、IL-15、4-1BBL和基础培养基；所述培养液B包含IL-2、IL-15、4-1BBL和基础培养基。
优选的，所述OKT3、CD16、IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液A中的终浓度依次为：0-500ng/mL、0-500ng/mL、0-1000U/mL、0-500ng/mL和0-500U/mL；所述IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液B中的终浓度依次为：0-1000U/mL、0-500ng/mL和0-500U/mL。
优选的，所述OKT3、CD16、IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液A中的终浓度依次为：50ng/mL、50ng/mL、100U/mL、50ng/mL和50U/mL；所述IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液B中的终浓度依次为：100U/mL、50ng/mL和50U/mL。
优选的，在细胞培养过程中，通过隔天补充所述培养液A或所述培养液B维持细胞密度在1×106个/mL。
优选的，所述细胞的培养时间为14-21天。
优选的，所述细胞为淋巴细胞或单个核细胞。
优选的，所述细胞分离自外周血、淋巴结、腹水或胸水。
与现有技术相比，本发明技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明提供了细胞培养液，包含OKT3、CD16、IL-2、IL-15和4-1BBL等多因子组合；用于NK细胞的培养过程中，可以直接快速有效的使NK细胞受到信号刺激，活化NK细胞，促进NK细胞的大量增殖；代替滋养层细胞，避免引进外源性物质，降低风险；
(2)本发明直接使用外周血中的单核细胞进行培养，无需对NK细胞进行纯化，简化分离步骤，降低成本，可操作性强；
(3)在本发明培养方法中，通过隔天补充培养液，有效的避免了高浓度抗体对细胞的持续作用诱发的凋亡。
(4)本发明优化了细胞因子组合和培养工艺流程，不仅缩短了培养周期，使培养只需14-21天，而且培养得到的NK细胞纯度达到70％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例3中培养细胞的流式检测结果；
图2为对比例1中培养细胞的流式检测结果；
图3为实施例3中的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力检测结果；
图4为NK细胞增殖曲线；
图5是实施例5中两组对比实验的细胞计数结果；
图6是实施例5中第一组实验的流式检测结果；
图7是实施例5中第二组实验的流式检测结果。
具体实施方式
本发明提供的细胞培养液，包括：培养液A和培养液B。所述培养液A包含OKT3、CD16、IL-2、IL-15和4-1BBL，所述培养液B包含IL-2、IL-15和4-1BBL。其中，所述OKT3在所述培养液A中的终浓度为0-500ng/mL，优选为50ng/mL；所述CD16在所述培养液A中的终浓度为0-500ng/mL，优选为50ng/mL；所述IL-2在所述培养液A或培养液B中的终浓度为0-1000U/mL，优选为100U/mL；所述IL-15在所述培养液A或培养液B中的终浓度为0-500ng/mL，优选为50ng/mL；所述4-1BBL在所述培养液A或培养液B中的终浓度为0-500U/mL，优选为50U/mL。
本发明还提供了一种NK细胞的培养方法，具体为：首先从外周血中分离得到单个核细胞或淋巴细胞，然后将分离得到的单个核细胞接种于细胞培养瓶中，加入培养液A进行培养，利用培养液A中OKT3、CD16、IL-2、IL-15和4-1BBL的共同作用激活NK细胞，促进NK细胞的大量增殖，并在培养过程中提高NK细胞的比例；然后在培养至第7天时，转移至细胞培养袋中并隔天补充培养液B继续培养，这样既可以保证NK细胞被充分激活，又避免了OKT3和CD16持续作用对NK细胞的不良影响；在培养至14-21天时，收集细胞进行检测。在整个细胞培养过程中，通过隔天补充培养液A或培养液B以维持细胞的密度在1x106/mL左右，有效的避免了高浓度抗体对细胞的持续作用诱发的凋亡。经过细胞计数、流式细胞仪检测、杀伤肿瘤细胞实验测定，发现培养至21天的NK细胞具有较高的杀伤肿瘤细胞能力，而且培养得到的NK细胞纯度达到70％以上。
下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。
实施例1
一种用于NK细胞培养的细胞培养液，包括：培养液A和培养液B。
培养液A的配制为：往基础培养基中加入OKT3、CD16、IL-2、IL-15和4-1BBL，混匀即可；其中，OKT3、CD16、IL-2、IL-15和4-1BBL在培养液A中的终浓度依次为：50ng/mL、50ng/mL、100U/mL、50ng/mL和50U/mL。
培养液B的配制为：往基础培养基中加入IL-2、IL-15和4-1BBL，混匀即可；其中，IL-2、IL-15和4-1BBL在培养液B中的终浓度依次为：100U/mL、50ng/mL和50U/mL。
上述细胞因子和基础培养基均为市售，其中，基础培养基为北京友康生物生物生产的NK细胞无血清培养基，OKT3、CD16、IL-2、IL-15和4-1BBL购自北京同立海源生物科技有限公司。
实施例2
无菌条件下用采血袋采集正常志愿者的外周血100mL，在超净工作台下，用比例为1:1的0.9％生理盐水和外周血的混合溶液稀释，用吸管吹打均匀，得稀释血；
另取一支新的50mL离心管，加入淋巴细胞分离液，按照稀释血：淋巴细胞分离液为2:1的比例将稀释后的血液缓慢加到淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面，然后在常温下2000r/min离心20min；
取出后可见管内液体分为四层，从上至下依次为血浆(含血小板)、中间云雾层细胞(即单个核细胞)、淋巴分离液、红细胞和粒细胞，用吸管小心吸出中间云雾层细胞即单个核细胞层PBMCs，置于新的50mL离心管中；加入适量PBS溶液，将获得的PBMCs吹打混匀，再以1500r/min离心10min，洗涤2次，弃上清，得单个核细胞。
实施例3
取淋巴细胞，加入NK细胞无血清培养基悬浮细胞，并进行细胞计数，接着使用NK细胞无血清培养基调整细胞密度至2×106/mL，转移至两个细胞培养瓶中，然后加入培养液A，稀释至细胞密度在0.5×106/mL-1.5×106/mL左右，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中进行培养；
分别在细胞培养的第3、5、7天补充培养液A，维持细胞密度在0.5×106/mL-1.5×106/mL之间，在37℃、5％CO2细胞培养箱中进行培养；
在第7天补充完培养基后，将细胞转移到细胞培养袋中进行培养，接着在培养的第9、11、13、15、17、19天补充培养液B，使得细胞密度在0.5×106/mL-1.5×106/mL之间，继续在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养至第21天，收集细胞。
对比例1
取淋巴细胞，加入NK细胞无血清培养基悬浮细胞，并进行细胞计数，接着使用NK细胞无血清培养基调整细胞密度至2×106/mL，转移至两个细胞培养瓶中，然后加入含有50ng/ml CD3单克隆抗体、1000U/ml IL-2的NK细胞培养基，稀释至细胞密度在1×106/mL左右，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中进行培养；
分别在细胞培养的第3、5、7天补充含有50ng/ml CD3单克隆抗体、1000U/ml IL-2的NK细胞培养基，维持细胞密度在1×106/mL左右，在37℃、5％CO2细胞培养箱中进行培养；
在第7天补充完培养基后，将细胞转移到细胞培养袋中进行培养，接着在培养的第9、11、13、15、17、19天补充1000U/ml IL-2的NK细胞培养基，使得细胞密度在0.5×106/mL-1.5×106/mL之间，继续在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养至第21天，收集细胞。
实施例4
分别取实施例3和对比例1中收集的细胞，采用流式细胞仪检测细胞的CD3和(CD56+CD16)的比例情况。图1为实施例3中采用本发明方法培养获得细胞的流式检测结果，图2为对比例1中采用现有技术培养获得细胞的流式检测结果，如结果所示，使用现有技术和我们的技术获得的CD3-(CD56+CD16)+细胞比例分别是25.4％和77.5％，说明采用本发明技术方案培养得到的NK细胞纯度高于现有技术。
采用乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，其中，选择非小细胞肺癌细胞系A549作为靶细胞，NK细胞：肺癌细胞系A549的比例分别设置为5:1和10:1。图3为NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力检测结果，如结果所示，本发明技术方案培养得到的NK细胞对肺癌细胞株A459的杀伤能力强于采用常规技术培养得到的NK细胞。
在实施例3和对比例1的培养过程中，每一次补充培养基之前进行细胞计数，并记录数据。图4为NK细胞增殖曲线，结果如图4所示，使用现有技术和本发明技术方案所获得NK细胞的数目差别很明显，尤其是第21天的时候，细胞总数分别是0.89×109和1.5×109。
实施例5
为了考察较高浓度细胞因子组合是否会影响NK细胞的增殖及其纯度，本实施例设置了两组对比实验，其中，第一组实验中采用的试剂盒中各细胞因子在培养液A或培养液B中的终浓度和实施例3的一致，第二组实验采用的是试剂盒中各细胞因子在培养液A或培养液B中的终浓度为实施例3的2倍。然后，取实施例2中分离得到的淋巴细胞，再采用本发明的细胞培养方法进行培养，具体培养流程如实施例3所示。
在细胞培养至第21天时，收集细胞进行细胞计数，并且采用流式细胞仪检测细胞的CD3和(CD56+CD16)的比例情况。图5是两组对比实验的细胞计数结果，如结果所示，第一组实验的细胞总数为0.72×109，与第二组实验的0.65×109的相比，虽然有所增加但是其增幅无明显差别。图6是本实施例中第一组实验的流式检测结果，图7是本实施例中第二组实验的流式检测结果，如结果所示，第一组实验的CD3-(CD16+CD56)+的比例为80.6％，与第一组实验相比，约增加了3％。综合两组实验结果，发现在同等条件下，不同浓度的细胞因子对NK细胞的增殖及其纯度影响较小，说明高浓度细胞因子组合不会会影响NK细胞的增殖及其纯度。

Claims (12)

1. NK细胞培养液，其特征在于，包括：培养液A和培养液B，所述培养液A由OKT3、CD16、IL-2、IL-15、4-1BBL和基础培养基组成；所述培养液B由IL-2、IL-15、4-1BBL和基础培养基组成。
2.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述OKT3、CD16、IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液A中的终浓度依次为：0-500ng/mL、0-500ng/mL、0-1000U/mL、0-500ng/mL和0-500U/mL，且均不为0。
3.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述OKT3、CD16、IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液A中的终浓度依次为：50ng/mL、50ng/mL、100U/mL、50ng/mL和50U/mL。
4.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，
所述IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液B中的终浓度依次为：0-1000U/mL、0-500ng/mL和0-500U/mL，且均不为0。
5.根据权利要求4所述的细胞培养液，其特征在于，所述IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液B中的终浓度依次为：100U/mL、50ng/mL和50U/mL。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的细胞培养液，其特征在于，所述基础培养基为NK细胞无血清培养基。
7.一种NK细胞培养方法，其特征在于，包括：将细胞接种于培养液A中培养，隔天补充所述培养液A；培养至第9天时补充培养液B继续培养，隔天补充所述培养液B；
其中，所述培养液A由OKT3、CD16、IL-2、IL-15、4-1BBL和基础培养基组成；所述培养液B由IL-2、IL-15、4-1BBL和基础培养基组成；所述细胞为淋巴细胞或单个核细胞。
8.根据权利要求7所述的细胞培养方法，其特征在于，所述OKT3、CD16、IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液A中的终浓度依次为：0-500ng/mL、0-500ng/mL、0-1000U/mL、0-500ng/mL和0-500U/mL，且均不为0；所述IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液B中的终浓度依次为：0-1000U/mL、0-500ng/mL和0-500U/mL，且均不为0。
9.根据权利要求7所述的细胞培养方法，其特征在于，所述OKT3、CD16、IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液A中的终浓度依次为：50ng/mL、50ng/mL、100U/mL、50ng/mL和50U/mL；所述IL-2、IL-15和4-1BBL在所述培养液B中的终浓度依次为：100U/mL、50ng/mL和50U/mL。
10.根据权利要求7所述的细胞培养方法，其特征在于，在细胞培养过程中，维持细胞密度在0.5×106/mL-1.5×106/mL。
11.根据权利要求7所述的细胞培养方法，其特征在于，所述细胞的培养时间为14-20天。
12.根据权利要求7所述的细胞培养方法，其特征在于，所述细胞分离自外周血、淋巴结、腹水或胸水。
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