CN107353326A - 结合pd‑1受体的非抗体结合蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种结合PD‑1受体的非抗体结合蛋白及其应用，该非抗体结合蛋白具有分子量小、可人工合成，安全性高等特点。PD‑1‑nABP284不仅能够跟细胞总蛋白中的PD‑1蛋白结合，而且能够跟活细胞表面的PD‑1蛋白分子结合；同时，还能跟淋巴结组织中PD‑1阳性细胞结合。研究发现PD‑1‑nABP284在小鼠体内会聚集在腹股沟及腋下淋巴结，而淋巴结中T细胞含量较高，说明PD‑1‑nABP284在体内可能倾向于与PD‑1阳性的T细胞结合。实验进一步显示PD‑1‑nABP284能与PD‑L1竞争性结合PD‑1受体，阻断PD‑1/PD‑L1通路，缓解PD‑L1的白介素‑2分泌抑制作用，增进iCIK淋巴细胞的肿瘤杀伤能力，发挥类似于PD‑1单克隆抗体的作用。研究还证明筛选出的PD‑1‑nABP284不影响稳定表达PD‑1的细胞株的增殖，且对细胞株没有毒性，同时在小鼠体内也没有毒性，安全性好。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种能与PD-1受体结合的非抗体结合蛋白及其 应用。
背景技术
PD-1(细胞程序性死亡受体1)是一个由288个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白，定位于 PDCD1基因，与CD28及CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)拥有约30％的同源性 序列。PD-1的结构包括胞外段免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域、疏水跨膜区及胞内段， 其中胞内段含有免疫受体络氨酸抑制结构域(ITIM)及免疫受体络氨酸转换结构域(ITSM)， 在PD-1抑制性信号通路中发挥重要作用。
PD-1表达于激活的T细胞、B细胞及NK细胞上，参与抑制外周组织中持续的免疫应答， 在防止自身免疫损伤中发挥重要作用。然而，PD-1的持续激活会影响T细胞的活化与增殖， 抑制IL-2等细胞因子的分泌，引起T细胞的衰竭，从而减弱T细胞的肿瘤杀伤能力。
PD-1的激活依赖于与配体PD-L1或PD-L2的结合，两者结合后激活下游信号通路，进而 抑制T细胞的功能。PD-L1和PD-L2高表达于多种肿瘤细胞中，如黑色素瘤、非小细胞肺癌、 乳腺癌及软组织肉瘤等。肿瘤病人的免疫系统处于抑制状态，是因为肿瘤细胞上的PD-L1和 PD-L2表达上调，与T细胞表面的PD-1相互作用，引起T细胞的衰竭，肿瘤细胞从而可以逃避T细胞的攻击。
针对PD-1的单克隆抗体能阻断PD-1/PD-L1的相互作用，从而恢复T细胞的功能，解除 肿瘤病人体内的免疫抑制状态，对如黑色素瘤、非小细胞肺癌等多种肿瘤有较好的疗效。多 项临床实验证明，PD-1治疗性单抗在黑色素瘤、非小细胞肺癌中有显著的疗效，这些肿瘤病 人体内的免疫抑制状态得到改善。
头颈部肿瘤(HNSCC)病人体内的肿瘤细胞PD-L1表达升高，提示其免疫状况与黑色素 瘤病人体内的免疫状态相似，都是处于免疫抑制的状态。HNSCC病人的外周血中CD3+，CD4+ 及CD8+的T细胞比例很低，尽管在手术治疗几年后，仍存在这个现象；头颈部肿瘤复发的 病人外周血中CD4+T细胞比例也非常低，说明免疫系统处于抑制状态。IFN-γ或者外源性 的肿瘤抗原与头颈部肿瘤细胞共孵育后，可以提高细胞毒性T细胞对头颈部肿瘤细胞的识别 杀伤能力，提示免疫治疗可以提高免疫细胞对肿瘤细胞的识别及杀伤，从而达到治疗肿瘤的 效果。手术及化疗后的HNSCC病人接受免疫细胞治疗后，总体生存率明显提高。PD-1治疗 性单抗Pembrolizumab在PD-L1阳性表达的复发性HNSCC病人的临床试验中显示出良好的 疗效。在一项招募173名HNSCC病人的I期临床实验中，总体的客观反应率在23.7％；另一 项临床实验中，60名HNSCC接受Pembrolizumab治疗，总体反应率是18％，且副作用低。以上免疫细胞治疗及PD-1单克隆抗体治疗的临床实验说明，免疫治疗在HNSCC病人中是有效的。
应用患者肿瘤浸润淋巴细胞或外周血淋巴细胞通过体外诱导扩增培养以后回输患者的过 继细胞治疗(Adoptive cell transfer ACT)显著增进了恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、肾癌、非小 细胞肺癌和头颈部肿瘤的疗效，延长了患者的生存时间。
然而，由于患者的肿瘤免疫逃逸持续存在，所以肿瘤依然容易复发和转移，长期疗效有 待进一步提高。肿瘤病人的单抗治疗也存在一定的问题。首先，PD-1单抗是鼠源性抗体，在 应用过程中将不可避免的引起人体内的人抗鼠抗体免疫应答，遗留医疗安全隐患；其次，PD-1 单抗分子量较大，实体肿瘤组织渗透性较弱，影响实体肿瘤的治疗效果；第三，PD-1单抗的 生产成本高，成功率低，生产周期较长。这些缺点也限制了PD-1抗体的应用。
发明内容
本发明为弥补现有技术的不足，提供一种能与PD-1受体结合的非抗体结合蛋白(non antibody binding protein，nABP)及其应用，该非抗体结合蛋白具有分子量小、可人工合成， 安全性高等特点。
本发明第一方面提供一种结合PD-1受体的非抗体结合蛋白，所述非抗体结合蛋白的序列 如SEQ ID NO：1所示或者为其类似物，命名为PD-1-nABP284(或nABP284)。
本发明还提供上文所述的非抗体结合蛋白的应用，所述非抗体结合蛋白在阻断PD-1通路 方面应用，或，所述非抗体结合蛋白在制备PD-1通路阻断剂中应用。
所述非抗体结合蛋白还可在制备PD-1通路信号增强的调节药物应用。
所述非抗体结合蛋白还可在制备免疫调节药物和/或抗肿瘤药物中应用。
进一步的，所述非抗体结合蛋白在制备用于体内治疗PD-L1和/或PD-L2分泌增加的疾 病的免疫调节药物中应用；或，所述非抗体结合蛋白在制备用于增进体外培养的免疫细胞的 肿瘤杀伤效应的制剂中应用。
进一步的，所述肿瘤为肿瘤细胞中PD-L1和/或PD-L2表达上调的肿瘤，例如但不限于 黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、软组织肉瘤、头颈部肿瘤，白血病和恶性淋巴瘤。
非抗体结合蛋白既可在制备用于结合PD-1分子或PD-1阳性细胞的制剂中应用，也可在 制备用于结合PD-1分子或PD-1阳性细胞的标识试剂中应用。
进一步的，所述PD-1分子来自细胞总蛋白、细胞分泌性蛋白或活细胞表面。
在一种具体实施方式中，所述PD-1阳性细胞包括白血病细胞、淋巴结组织中的PD-1阳 性淋巴细胞、T细胞、NK细胞。
本发明还提供一种制剂，该制剂可为药物制剂或细胞标识试剂，该制剂中含有上文所述 的非抗体结合蛋白。进一步的，还可以包含有药学上允许的辅料或载体，或者包含分子标识 上允许的辅料或载体。
本发明提供的非抗体结合蛋白PD-1-nABP284通过T7噬菌体文库及PD-1重组蛋白筛选 出。
体外实验证明，PD-1-nABP284不仅能够跟细胞总蛋白中的PD-1蛋白结合，而且能够跟 活细胞表面的PD-1蛋白分子结合；同时，还能跟血液和淋巴结组织中PD-1阳性淋巴细胞结 合。
通过研究还证明筛选出的PD-1-nABP284不影响稳定表达PD-1的细胞株的增殖，且对细 胞株没有毒性，同时在小鼠体内也没有毒性，安全性好，应用前景好。
通过研究发现PD-1-nABP284在小鼠体内会聚集在腹股沟及腋下淋巴结，而淋巴结中T 淋巴细胞含量较高，说明PD-1-nABP284在体内可能倾向于与PD-1阳性的T淋巴细胞结合， 阻断PD-1/PD-L1等配体结合的通路，发挥类似于PD-1单克隆抗体的作用。
通过研究发现，PD-1-nABP284与PD-L1配体竞争性结合肿瘤细胞株Jurkat表面的PD-1 受体，发挥类似于PD-1靶向单克隆抗体药物的竞争性结合作用。
通过研究发现，PD-1-nABP284结合PD-1受体可反转配体PD-L1对白介素2分泌的抑制， 说明PD-1-nABP284发挥了类似于PD-1靶向单克隆抗体药物的体液免疫调节作用。
通过研究发现，PD-1-nABP284添加到淋巴细胞与舌癌细胞株CAL27共培养的培养液中， 增加了淋巴细胞对癌细胞的杀伤作用，类似于PD-1靶向单克隆抗体药物的抗肿瘤作用。
与治疗性抗体相比，本发明的非抗体结合蛋白(也称为肽)是人工合成的，具有较低的免 疫原性，较高的体内稳定性，较好的肿瘤穿透性，增强的肿瘤积累和较低的制造成本。
通过研究发现，PD-1-nABP284与肿瘤细胞株Jurkat结合，说明PD-1-nABP284在体内可 能倾向于与PD-1阳性的肿瘤细胞结合，阻断PD-1/PD-L1通路，发挥类似于PD-1单克隆抗 体的作用。
本发明提供的非抗体结合蛋白具有诸多优点。首先，非抗体结合蛋白分子量小，渗透性 好；其次，可以人工合成，成本较低，没有动物源性，安全性高；与特定分子的结合性好， 可以发挥类似甚至优于单克隆抗体的功能。
附图说明
图1：A图为T7噬菌体文库筛选示意图；B图为噬菌体4轮筛选结果；C图为每轮筛选的回 收率；D图为筛选出的三个DNA序列的ELISA检测吸光度值。
图2：A图、B图分别为OE-Jurkat、Jurkat细胞的PD-1表达的流式细胞检测结果、荧光nABP284 与抗体免疫荧光共标记检测结果，C图、D图分别为nABP284、nABP283、nABP282与OE-Jurkat 细胞表面PD-1亲和性的流式细胞检测、免疫荧光检测结果。
图3：A图为荧光nABP284与细胞总蛋白结合后免疫沉淀荧光分析结果；B图为PD-1-nABP284与OE-Jurkat、Jurkat细胞结合性的检测结果；C图为PD-1-nABP284与PBMC、 OE-Jurkat、淋巴结中的PD-1阳性细胞结合的免疫荧光共标记检测结果。
图4为PD-1-nABP284阻断PD-1/PD-L1结合的实验检测结果。
图5为PD-1-nABP284阻断PD-1/PD-L1结合增加细胞白介素分泌功能的检测结果。
图6为PD-1-nABP284阻断PD-1/PD-L1结合增进淋巴细胞肿瘤杀伤的检测结果。
图7：A图为PD-1-nABP284的细胞毒性实验检测结果，B图为PD-1-nABP284对细胞增殖影响 的实验检测结果。
图8为PD-1-nABP284在小鼠体内代谢荧光图像。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例中所用到的主要研究方法包括T7噬菌体文库筛选、PD-1过表达慢病毒载体构建 及PD-1过表达细胞株转染及筛选、免疫沉淀荧光分析、非抗体结合蛋白与抗体免疫荧光共标 记共聚焦显微镜观察、流式细胞术、细胞增殖实验、细胞毒性实验、小鼠活体成像、免疫印 迹等。实验操作若未特别说明，均为本领域技术人员所掌握的常规实验操作。所用试剂若未 特别说明，均为商业渠道购买获得。
实施例中部分试剂说明如下：
人PD-1重组蛋白(PD1-HC214，Acrobiosystem)，T7噬菌体保种文库(D00154997，Novagen)，人PD-L1-Fc重组蛋白(10084-H02H-100，Sino Biological Inc)，鼠抗人PD-1 抗体(ab52587，abcam)，抗人PD-1抗体(130-096-166，Miltenyi Biotec)，抗人IgG-Fc-APC(409305，Biolegend)，驴抗小鼠IgG二抗(A10037，ThermoFisher)，PLX302载体(25896，addgene)，含DAPI的VECTASHIELD封固剂(H-1200，Vector laboratories)，细胞计数试 剂盒(CCK-8，DOJINDO)，RPMI1640(R6504，Sigma)，牛血清(SH30084，Hyclone)， 牛血清白蛋白(V900933，Sigma)，SDS(A600485，sangon)
实施例一、PD-1非抗体结合蛋白(PD-1-nABP)的筛选及合成
主要包括文库筛选、ELISA筛选、测序分析得到序列。
一)T7噬菌体文库筛选，按照市售T7噬菌体保种文库(T7Selector Human LungTumor cDNA Library，D00154997，Novagenor)的说明书进行，说明如下(筛选示意图参见图1A)：
1、PD-1重组蛋白包被96孔板，4℃包被过夜；
2、去离子水洗3次，5％脱脂奶粉封闭，室温(下文简称RT)，1h；
3、T7噬菌体保种文库加入到5403宿主菌(已用M9LB摇菌得到，下同)中，37℃x 4h，得到溶菌产物；
4、8000g x 10min，上清即为T7噬菌体文库
5、取上述取得的文库进行滴度测定，得到T7噬菌体文库滴度
6、按照公式“筛选所需体积＝1.2x107x单克隆重复数(100)”计算出筛选所需要T7噬 菌体文库体积
7、相应体积T7噬菌体文库与5％脱脂奶粉按照1∶1混合，加入到已包被PD-1重组蛋白的96孔板中，RT x 45min
8、0.1％TBST洗5次
9、加200ul 1％SDS进行洗脱，RT x 15min
10、充分吹打，转移洗脱液至EP管
11、取10ul洗脱液进行滴度测定，用于富集度计算
12、取5ul round 1的洗脱液，加入2ml 5403菌液中，37℃摇床x ON(过夜，下同)
13、8000g x 10min，取上清，得到round 1筛选后的扩增液
14、取10ul扩增液，加入到5403菌液中，37℃摇床3小时
15、8000g x 10min，取上清，得到round 1筛选后的2轮扩增液(2轮扩增)
16、取round 1筛选后的2轮扩增液10ul进行滴度测定
17、按照计算出的滴度，根据上述公式计算出round 2筛选所需体积
18、第二、三、四轮筛选步骤同第一轮(7-15)，得到round 4洗脱后的原液。
结果：首轮投入滴度为5.4×1010cfu的噬菌体，经过4轮筛选(图1B)，可以见到噬菌体得到明显的富集(图1C)，富集的噬菌体文库保种备用。
(二)ELISA筛选
1、round 4原液涂板过夜，挑取单克隆菌斑，加入到5403菌液中，摇菌过夜。
2、96孔板包被PD-1重组蛋白，4℃x ON
3、取1ml菌液，8000gx 10min，上清含T7噬菌体
4、100ul T7噬菌体加入50ul 3％脱脂奶粉，混匀，加入到包被了PD-1重组蛋白的96孔 板中
5、37℃x 1h
6、去掉液体，TBST洗5次
7、按照1∶2500比例稀释T7噬菌体抗体(T7tail-fiber monoclonal antibody)，100ul/孔 加到上述孔中，4℃x ON
8、去掉一抗液，TBST洗5次
9、加入1∶5000稀释的二抗(goat anti-mouse IgG)，RT x 1h
10、去掉二抗液，TBST洗5次；再加TBST，摇床x 10min
11、加100ul/孔TMB显色液，RT x 30minx避光
12、加入100ul的250mM HCI终止反应。
13、酶标仪检测450nm吸光度值。
14、选取吸光度值高的克隆进行PCR检测并测序，采用DNASTAR软件经过与T7噬菌体 自身序列比对，分析每个噬菌体插入的DNA片段，并在NCBI网站上进行BLAST，最后确定PD-1-nABP的氨基酸序列并人工合成多肽(上海强耀生物科技有限公司)。根据需要在一部分 PD-1-nABP的N末端添加FITC(绿色荧光)等荧光标签蛋白，纯度＞95％，制备PD-1-nABP荧 光试剂。
实验结果：通过ELISA检测，挑选出3个与PD-1结合能力强的单克隆噬菌体，分别命名为nABP282、nABP283及nABP284(或PD-1-nABP282、PD-1-nABP283、PD-1-nABP284)， 检测的吸光值见图1D。
其中PD-1-nABP284、PD-1-nABP282、PD-1-nABP283对应的序列见序列表中序列1-3所 示。
实施例二、PD-1过表达慢病毒载体构建，PD-1过表达细胞株转染及筛选
1、设计针对PDCD1基因CDS全长(867bp)的引物序列，合成引物；
2、提取PBMC的cDNA，利用上述引物进行PCR扩增PDCD1基因全长；
3、跑胶可见867bp位置明显条带，切胶回收(AcyRep DNA extraction kit，下同)，送 测序，序列正确，返样；
4、返样DNA进行T载体连接、转化、菌液涂板过夜、挑菌扩增，菌液PCR检测条带 位置正确，挑取10个阳性克隆测序，测序序列正确，返样；
5、pENTRY载体及返样质粒进行双酶切(Not I和Sgs I酶)，跑胶，照胶位置正确，切胶回收；
6、pENTRY载体及返样质粒回收产物用T4酶进行连接，16℃x ON
7、连接产物进行转化、菌液涂板过夜、挑菌扩增，菌液PCR检测条带位置正确，送测序，测序序列正确，返样连接产物(质粒)；
8、利用PLX302载体及上述连接产物进行LR重组反应，反应产物进行转化、菌液涂板 过夜、挑菌扩增，菌液PCR检测条带位置正确，挑取5个阳性克隆测序，测序序列正确，返样，得到PD-1过表达的慢病毒载体；
9、用293T细胞进行慢病毒包装，得到包装后的慢病毒病毒液；
10、慢病毒病毒液转染Jurkat细胞(获自中科院上海细胞库)；
11、利用嘌呤霉素进行筛选，得到稳定表达PD-1的细胞株，命名OE-Jurkat。
通过PLX302慢病毒载体的构建及Jurkat细胞转染，获得稳定表达PD-1的细胞株，命名 OE-Jurkat。流式细胞分析结果显示OE-Jurkat细胞有72％细胞表达PD-1蛋白，OE-Jurkat细 胞PD-1的表达明显上调(图2A)；细胞免疫荧光进一步证明OE-Jurkat细胞表达PD-1蛋白， 且PD-1蛋白是表达于细胞膜上(图2B)。
实施例三、PD-1-nABP284与PD-1分子结合的验证
(一)、经免疫沉淀实验，发现PD-1-nABP284能与OE-Jurkat细胞总蛋白中的PD-1蛋白结合。
免疫沉淀(IP)按照如下步骤进行：
1、收集OE-Jurkat细胞，4.5x 106/组
2、PBS洗2次，去尽上清，得到细胞沉淀
3、500ul 1xLysis buffer(已加全蛋白酶抑制剂PMSF)重悬细胞，分2组(实验组及对 照组)
4、超声破碎细胞4次，4s/次，冰上放置30min
5、10000rpm x 10min，去掉沉淀，上清即为细胞总蛋白
6、加入10％山羊血清，混匀，冰上放置1h
7、加入100ul琼脂糖磁珠(Millipore 16-266，已经用1x wash buffer清洗3次，下同)， 4℃x 1h x摇床
8、离心(14000rpm x 5s，下同)去掉珠子
9、实验组上清中加入2ul PD-1抗体(ab52587，1mg/ml，下同)，对照组加2ul 1×wash buffer，4℃x ON x摇床
10、加入20ul磁珠，4℃x 1hx摇床
11、离心，去掉上清，沉淀即为PD-1蛋白-PD-1抗体-磁珠复合物
12、500ul 1x wash buffer重悬，加入15ug/ml浓度的PD-1-nABP284，4℃x 2.5h x摇床 x避光
13、离心，去掉上清，沉淀即为284nABP-PD-1蛋白-PD-1抗体-磁珠复合物
14、1x wash buffer洗3次，去尽上清
15、加20ul sample buffer，混匀，50℃x 10min
16、离心去掉珠子，上清中加入DTT至终浓度100mM
17、荧光分光光度计(NanoDrop 3300)上机检测
通过免疫沉淀实验，利用PD-1抗体把OE-Jurkat细胞中的PD-1蛋白沉淀下来，再与PD-1- nABP284相互反应。通过荧光分光光度计检测反应物的微量荧光(图3A)，实验组的黑色 曲线荧光强度显著高于对照组，证明通过PD-1抗体沉淀下来的蛋白能够与PD-1-nABP284 结合。
(二)经免疫荧光实验，发现PD-1-nABP284能与细胞表面的PD-1蛋白结合
免疫荧光(IF)实验按照如下步骤进行：
1、收集OE-Jurkat细胞(或PBMC或淋巴结中的PD-1+细胞)，1x 106/组，1ml PBS 重悬
2、分别加入15ug/ml浓度的PD-1-nABP284，nABP282或nABP283、RT x 30min
3、PBS洗1次(1000rpm x 5min，下同)
4、4％PFA固定，RT x 20min
5、PBS洗1次
6、10％山羊血清封闭，RT x 1h
7、离心，去尽上清
8、孵育PD-1一抗(ab52587，1mg/ml，下同)，对照组加10％山羊血清封闭液， 4℃避光
9、PBS洗1次
10、孵育 二抗(rabbit anti-mouse IgG 568)，RT x 1h
11、PBS洗1次
12、防荧光淬灭封片剂封片
13、激光共聚焦显微镜观察。
免疫荧光结果显示，nABP284能与外周血单核细胞(PBMC)以及OE-Jurkat细胞中PD-1+ 的细胞结合。如图3C所示，红色荧光标记的是细胞表面的PD-1蛋白分子，绿色荧光表示的 是PD-1-nABP284，可以见到在原代培养的PBMC和OE-Jurkat细胞系上2种荧光都有重叠， 说明PD-1-nABP284与PD-1在细胞上的共定位。此外，我们还取了淋巴结的组织切片，同样能够观察到2者共定位的情况(图3C)，然而PD-1-nABP282、PD-1-nABP283不能结合外 周血单核细胞(PBMC)以及OE-Jurkat细胞。
(三)、通过流式细胞术，发现PD-1-nABP284与OE-Jurkat细胞的结合更高
流式细胞实验按照如下步骤进行：
1、收集OE-Jurkat细胞(或Jurkat细胞)，细胞计数，5x 105/组，1ml PBS重悬
2、加入15ug/ml浓度的nABP284，RT x 10min
3、PBS洗1次(1000rpm x 5min，下同)，100ul 0.5％BSA重悬；
4、加入PD-1一抗(ab52587)10ul，4℃x 10min
5、PBS洗1次
6、500ul PBS重悬，流式细胞分析仪上机检测。
结果参见图3B，通过流式细胞术可以看出PD-1-nABP284在PD-1过表达的OE-Jurkat 细胞上的结合率明显高于Jurkat细胞，说明PD-1-nABP284能与活细胞表面的PD-1蛋白结 合。
实施例五、肽结合性能比较及对PD-1/PD-L1途径阻断作用的比较
(一)肽结合测定，按照如下操作进行：
1、收集OE-Jurkat细胞，细胞计数，5x 105/组，1ml PBS重悬
2、加入15ug/ml浓度的nABP282、nABP283、nABP284，RT x 10min
3、PBS洗1次(1000rpmx 5min，下同)，100ul 0.5％BSA重悬；
4、加入PD-1流式抗体10ul，4℃x 10min
5、PBS洗1次
6、500ul PBS重悬，流式细胞分析仪上机检测。
结果参见图2C。
(二)、对于PD-1/PD-L1结合阻断测定
1、收集OE-Jurkat细胞，细胞计数，5x 105/组，1ml PBS重悬
2、加入15ug/ml浓度的nABP282、nABP283、nABP284，RT x 10min
3、PBS洗1次(1000rpm x 5min，下同)，100ul 0.5％BSA重悬
4、实验组加入人PD-L1-Fc蛋白(0.25mg/ml)10ul，RT x 20min；
5、PBS洗2次，在4℃下用抗人IgG-Fc-APC染色20分钟
6、将染色的细胞洗涤一次，500ul PBS重悬，流式细胞分析仪上机检测。
以上为实验组的操作，而对于阴性对照，仅加入抗人IgG-Fc-APC并洗涤一次；对于阳性 对照，不添加nABP。
流式细胞术分析显示，与OE-Jurkat孵育后，nABP284对OE-Jurkat具有高亲和力，而 nABP282和nABP283显示低亲和力(图2C)。免疫荧光结果与流式细胞术结果一致(图2D)。
当用nABP284和抗人PD-1抗体进行双染色时，可以在OE-Jurkat细胞的细胞膜上检测 到PE(PD-1)和FITC(nABP)信号。然而，当用抗人PD-1和nABP282/283双染色时， 只能检测到PD-1抗体PE信号。这些结果表明，nABP284对PD-1受体的亲和力高于其他两 种nABP。
如图4所示，当加入nABP284时，抗人IgG-Fc-APC染色的细胞的百分比降低并低于阳 性对照，说明nABP284减少了PD-L1-Fc蛋白与PD-1的结合，结果表明nABP284对于PD-1 /PD-L1途径具有潜在的阻断功能。
实施例六、PD-1-nABP284阻断PD-1/PD-L1结合，增加细胞白介素-2分泌的检测结果
1、按照上述流式细胞术实验方法检测舌鳞状细胞癌细胞株CAL27的PD-L1表达，结果如 图5所示，CAL27细胞均表达PD-L1；
2、取相同数量的舌鳞状细胞癌细胞株CAL27和OE-Jurkat细胞于培养皿共培养，分别加入 15ug/ml浓度的nABP282、nABP283、nABP284，对照组添加等量的PBS；
3、共培养24小时后，收集培养液上清，应用人体白介素-2ELISA试剂盒(ab46054)检测 各实验组组白介素-2的分泌水平。
如图5所示，OE-Jurkat细胞与舌鳞状细胞癌细胞株CAL27共培养以后，培养上清中的 白介素-2显著减少，而加入nABP284的实验组缓解了共培养对白介素-2分泌的抑制，说明 CAL27舌癌细胞分泌的PD-L1结合PD-1可抑制白介素-2表达，而nABP284与PD-L1竞争 性结合PD-1缓解了PD-L1的抑制作用。另一方面，与PD-1无特异性结合的nABP282和nABP283的对照组添加至培养液后，对共培养状态下白介素-2的分泌无显著影响，表明 nABP284阻断PD-1/PD-L1通路并特异性缓解该通路的体液免疫抑制作用。
实施例七、PD-1-nABP284阻断PD-1/PD-L1结合，增进淋巴细胞肿瘤杀伤效应的检测结果
1、应用梯度离心方法分离外周血单核细胞，按照改良的细胞因子诱导杀伤性细胞(improving cytokine-induced killer cell，iCIK)培养方法添加OKT3单克隆抗体(Janssen Pharmaceutical，Japan)1000U/mL rhIFN-γ(Clongamma，Shanghai，China)，500U/mL rhIL-2 (Slpharm，Beijing，China)刺激T细胞增殖24小时，每隔3天更换含有500U/mL rhIL-2的培 养液，培养10-14天采集细胞用于肿瘤杀伤实验。
2、分别按照0.16、0.31、0.62、1.25、2.5、5和10比1的iCIK细胞/CAL27舌癌细胞共培养，处理组加入PD-1-nABP284，对照组添加等量的PBS。
3、共培养24小时后，应用非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega，USA) 检测细胞乳酸脱氢酶活性(Lactate dehydrogenase，LDH)，通过490波长的吸光度测定，计算 淋巴细胞的肿瘤杀伤效应。
如图6所示，iCIK细胞与舌癌细胞CAL27共培养24小时，含有nABP284的实验组肿瘤细胞杀伤效应高于对照组，在10∶1比例条件下差异最为显著，说明CAL27舌癌细胞分泌的PD-L1结合PD-1可抑制细胞免疫反应，而nABP284与PD-L1竞争性结合PD-1可缓解肿 瘤细胞的免疫抑制作用，增进iCIK细胞的杀肿瘤效应。
实施例八、PD-1-nABP284对OE-Jurkat细胞的增殖及毒性影响
PD-1-nABP284对细胞增殖影响的实验按照如下操作进行：
1、收集OE-Jurkat细胞，细胞计数，基础培养基(RPMI1640培养基)稀释细胞 数至1x 105/ml
2、往24孔板中加入1ml步骤1所得的细胞稀释液
3、实验组加入5ug/ml 284nABP，对照组加相应量的基础培养基
4、每天进行细胞计数(3个副孔)，共计数5天
5、得到细胞计数数据，进行统计分析
PD-1-nABP284的细胞毒性实验按照如下操作进行：
1、收集OE-Jurkat细胞，细胞计数，基础培养基(RPMI1640培养基)稀释细胞 数至1x 106/ml
2、往96孔板中加入100ul步骤1所得的细胞稀释液
3、设置0、2、5、10、50及100ug/ml浓度梯度，分别加入相应量的nABP284， 混匀(每个浓度梯度设3个副孔)
4、分别培养24H和48H，加入细胞毒性检测试剂CCK-8，10ul/孔，混匀
5、37℃x 1h，可以见到培养液变黄
6、酶标仪上机检测吸光度值
7、数据进行统计分析
实验结果参见图7。通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测量nABP284对OE-Jurkat的细胞毒性，如图7A所示，在加入不同浓度(0-100ug/ml)的PD-1-nABP284后培养24h及48h 后，OE-Jurkat的活性均没有受到影响。图7B显示OE-Jurkat细胞在低血清培养条件下，培养 液中加入PD-1-nABP284，连续培养5天，实验组与对照组的细胞增殖速度无明显差异，说 明PD-1-nABP284与PD-1分子的结合并不会影响OE-Jurkat细胞的增殖。
实施例九、PD-1-nABP284在小鼠体内的代谢
1、经动物实验伦理申请，购买裸鼠小鼠1只，小鼠购自中山大学动物实验中心。
2、灭菌三级水稀释nABP284，4mg/ml，250ul体积
3、小鼠鼠尾静脉注射nABP284250ul
4、小鼠活体成像仪上机成像，仪器设定每3min一张图片，共记录1h，设立阳 性对照孔(浓度0.4mg/ml)
5、得到图像数据，利用分析软件进行光谱分离，去除非FITC光谱干扰，得到nABP284荧光在小鼠内定位及代谢图像
小鼠活体成像显示如图8，1mg带有FITC荧光标签的PD-1-nABP284通过鼠尾静脉注射到小鼠体内后，迅速经过血循环分布于小鼠全身，到30min左右可见到PD-1-nABP284聚集在小鼠体内的腹股沟及腋下淋巴结，经过60分钟体循环代谢后，检测不到绿色荧光，说明注射到小鼠体内的PD-1-nABP284在60分钟后基本被代谢完全。注射高浓度的带有FITC荧光标签的PD-1-nABP284后的小鼠生命特征平稳，说明其对小鼠无毒性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未 脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等 同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
<110> 中山大学附属口腔医院，广州一代医药科技有限公司
<120> 结合PD-1受体的非抗体结合蛋白及其应用
<160> 3
<170> Patentin version 3.3
<210> 1
<211>
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Arg Leu Lys Glu Ile Ala Asn Ser Pro Thr Gln Phe Trp Arg Met Val Ala Arg Asn Thr
1 5 10 15 20
Leu Gly Asn Gly Ala Lys Gln Ser Leu Asn Ile Glu His Ala Arg Leu
25 30 35
（SRLKEIANSPTQFWRMVARNTLGNGAKQSLNIEHARL）
<210> 2
<211>
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ser Ser Val Val Glu Ser Gly Trp Gly Gln Leu
1 5 10
(SSVVESGWGQL)
<210> 3
<211>
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ser Ser Arg Pro Arg Ser Leu Pro Gly His Gln Glu Ala Ser
1 5 10
(SSRPRSLPGHQEAS)
Claims (10)
1.结合PD-1受体的非抗体结合蛋白，其特征在于，所述非抗体结合蛋白的序列如SEQID NO：1所示或者为其类似物。
2.如权利要求1所述的非抗体结合蛋白的应用，其特征在于，所述非抗体结合蛋白在阻断PD-1通路方面应用，或，所述非抗体结合蛋白在制备PD-1通路阻断剂中应用。
3.如权利要求1所述的非抗体结合蛋白的应用，其特征在于，所述非抗体结合蛋白在制备免疫调节药物和/或抗肿瘤药物中应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述非抗体结合蛋白在制备用于体内治疗PD-L1和/或PD-L2分泌增加的疾病的免疫调节药物中应用；或，所述非抗体结合蛋白在制备用于增进体外培养的免疫细胞的肿瘤杀伤效应的制剂中应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肿瘤细胞中PD-L1和/或PD-L2表达上调的肿瘤；
优选的，所述肿瘤包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、软组织肉瘤、头颈部肿瘤、恶性淋巴癌、白血病。
6.如权利要求1所述的非抗体结合蛋白的应用，其特征在于，所述非抗体结合蛋白在制备用于结合PD-1分子或PD-1阳性细胞的标记物或制剂中应用；
或，所述非抗体结合蛋白在标记、鉴定、富集、分选或纯化PD-1阳性细胞中的应用；
或，所述非抗体结合蛋白在制备用于标记、鉴定、富集、分选或纯化PD-1阳性细胞的制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PD-1分子来自细胞总蛋白、细胞分泌性蛋白、或活细胞表面。
8.根据权利要求6或7任一项所述的应用，其特征在于，所述PD-1阳性细胞包括T细胞、NK细胞和白血病细胞。
9.一种制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的非抗体结合蛋白，所述制剂为药物或细胞标识试剂。
10.根据权利要求9所述的药物制剂，其特征在于，所述制剂为药物时，还包括药学上允许的辅料或载体；所述制剂为细胞标识试剂时，还包括分子标识上允许的载体或辅料。
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