CN110317245B - Lag-3蛋白亲和环肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种LAG‑3蛋白的亲和环肽及其应用，该亲和环肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。本发明还提供了含所述环肽的药物组合物或试剂盒。本发明的亲和环肽能够亲和LAG‑3蛋白胞外段，阻断LAG‑3/MHC‑II类分子之间的相互作用，进而起到抗肿瘤效果。

Description

LAG-3蛋白亲和环肽及其应用

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，具体涉及LAG-3蛋白的亲和环肽及其应用。

背景技术

肿瘤的有效治疗是医学发展的一个重要热点领域，肿瘤的治疗方法经历了手术切除治疗、放射性治疗、化学药物治疗以及靶向治疗等手段。目前肿瘤治疗领域最受关注的是免疫治疗，肿瘤免疫治疗是激发机体自身的免疫机制，通过改善自身免疫能力对肿瘤细胞进行杀伤，达到抗肿瘤的目的。2013年《科学》杂志评选的十大科学突破第一位就是肿瘤的免疫治疗。广义的肿瘤免疫疗法包含抗体、疫苗和免疫调节剂等方面，这些治疗方法是通过激活和增加免疫反应来杀伤肿瘤细胞，在增加对肿瘤免疫反应的同时，也会将免疫系统激活至超过正常生理的水平，有可能增加免疫相关不良事件(irAEs)的发生，同时，过度激活的免疫反应也有可能促进肿瘤的免疫逃逸。新的肿瘤免疫治疗方法是通过阻断免疫逃逸通路治疗肿瘤，即利用阻断剂阻断免疫检查点分子，从而阻断负性共刺激信号的传递，激活被抑制的效应T细胞的功能，恢复抗肿瘤免疫能力。这种抗肿瘤方法在增加抗肿瘤效果的同时减少了irAEs的发生，是更具有优势的肿瘤免疫疗法。

绝大多数的肿瘤免疫治疗可通过T细胞发挥抗肿瘤作用。在T细胞发挥抗肿瘤的过程中，首先会被T细胞受体(TCR)介导的抗原识别信号激活，这是T细胞活化的第一个信号，然后T细胞又被多种共刺激信号和共抑制信号共同调控，这是T细胞活化的第二个信号，用来调节T细胞活化的强度，其中传递共抑制信号的分子即为免疫检查点分子，CTLA-4、PD-1、LAG-3等都是免疫检查点分子。

LAG-3蛋白是1990年发现的免疫检查点分子，与CD4高度同源，均具有细胞外免疫球蛋白(Ig)样结构域(D1-D4)，属于I型跨膜蛋白。LAG-3主要表达于活化的T细胞、B细胞、NK细胞及浆细胞样树突状细胞。许多小鼠肿瘤模型的研究为LAG-3阻断限制肿瘤生长提供了理论依据。通过对LAG-3敲除小鼠和LAG-3抗体的研究发现，单独使用LAG-3抗体、或者与PD-1阻断剂联合使用可以减少恶性细胞的生长并促进肿瘤清除。研究发现，LAG-3既可以负调节CD4⁺ T细胞，也可以负调节CD8⁺ T细胞的增殖、激活、效应功能和稳态，同时发现LAG-3在调节性T细胞(Treg)上表达，并且有助于它们的抑制功能，在体外和体内阻断Treg细胞上的LAG-3可以降低Treg细胞的抑制活性。这些发现表明LAG-3是通过直接抑制效应T细胞的杀伤并通过Treg细胞介导的免疫抑制作用来抑制机体的免疫应答。

与CD4相似，LAG-3与抗原呈递细胞(APC)上的MHC-II类分子结合。LAG-3能与CD3/T细胞受体(TCR)复合物结合，而LAG-3与MHC-II结合能力强，会阻止MHC-II与TCR和CD4结合，会直接阻碍免疫应答中的TCR信号传导。同时，LAG-3和CD3的交联可通过抑制钙离子通量而影响T细胞的增殖和细胞因子的分泌。LAG-3吸引关注的原因还有一个，就是LAG-3与其他的免疫检查点分子尤其是PD-1具有显著的相互作用。在T细胞信号传导途径中，TCR能与MHC结合引起T细胞的活化，而LAG-3和其他抑制性免疫检查点分子如CTLA-4、PD-1则表现出对TCR信号传导的协同抑制作用。LAG-3和CTLA-4均能抑制TCR信号传导通路，停滞细胞周期的S期，负调控T细胞的稳态，激活调节性T细胞的免疫抑制功能，这些相似性可能是由于它们的信号传导途径具有明显的交叉造成的。

研究表明，LAG-3可以与PD-1/PD-L1共同介导机体的免疫稳态，消除自身免疫性疾病，并增强肿瘤诱导的免疫耐受。LAG-3与PD-1在CD4⁺，CD8⁺ T细胞尤其是肿瘤浸润性T细胞上广泛共表达，在小鼠黑色素瘤、卵巢癌和结直肠癌模型模型中，LAG-3和PD-1表现出了明显的协同抑制作用，同时阻断LAG-3和PD-1能有效消除多数肿瘤，而这些肿瘤对单点阻断药物治疗有很大的抵抗能力。将LAG-3和PD-1这两个基因同时敲除可以显著延缓肿瘤生长并延长小鼠的生存时间。在病人肿瘤样品中，LAG-3和PD-1共表达能减弱CD8⁺ T细胞活化，抑制细胞因子的分泌，维持T细胞耗竭状态，同时还可以参与肿瘤细胞的免疫逃逸。在人非小细胞肺癌中，LAG-3在肿瘤浸润性T细胞上的过表达与PD-1/PD-L1的表达具有显着的相关性，LAG-3和PD-L1表达较低的病人具有较好的预后。这些证据表明LAG-3和PD-1之间存在显著的协同作用，为针对不同免疫检查点分子的组合治疗提供了基础。

现有的研究已经表明LAG-3/MHC-II类分子信号通路是CD8⁺T细胞活化过程中非常重要的负性调控通路，可以引起肿瘤免疫耐受和逃逸，因此，研究通过阻断LAG-3/MHC-II类分子负性共刺激分子所介导的信号通路，打破肿瘤细胞的免疫耐受具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容

本发明独辟蹊径，提供了一种LAG-3蛋白胞外段的亲和环肽，并经过实验证明了该亲和环肽对LAG-3蛋白胞外段的体外亲和力强，可阻断LAG-3/MHC-II类分子蛋白结合，故而具有抗肿瘤活性。

第一方面，本发明提供了一种环肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。所述环肽的各氨基酸的构型可独立地选自D型或L型，比如各氨基酸的构型均为D型或L型。

任选地，所述氨基酸序列中的首尾两个氨基酸(即两个半胱氨酸)，通过形成酰胺键或二硫键彼此相连，优选通过各自的巯基形成二硫键彼此相连而成环。

第二方面，本发明提供了含前述第一方面所述环肽的药物组合物或试剂盒。

第三方面，本发明提供了前述第一方面所述环肽在制备药物组合物或试剂盒中的应用。

第二方面或第三方面所述的试剂盒可用于检测待测物对LAG-3蛋白的亲和和/或阻断(如阻断MHC-II类分子与LAG-3的结合)能力，或，用于定性、定位或定量检测生物样品中LAG-3蛋白表达与否、表达位置或表达含量。

第二方面或第三方面所述的药物组合物可用于下述至少一种用途：

1)抗肿瘤，如结肠癌或黑色素瘤

2)阻断MHC-II类分子与LAG-3蛋白的结合

3)增强CD8⁺ T细胞分泌IFN-γ的能力。

所述LAG-3蛋白指本领域哺乳动物的LAG-3蛋白，如人或小鼠的LAG-3蛋白。

本发明的多肽可通过固相合成制得，如采用标准Fmoc方案制备。

本发明的有益效果：

本发明独辟蹊径，通过反复筛选获得了LAG-3蛋白胞外段的亲和环肽。该类环肽对LAG-3蛋白胞外段的体外亲和力强，阻断LAG-3/MHC-II类分子蛋白结合的效果好，进一步的体外刺激人PBMCs细胞中CD8⁺T细胞活化和小鼠荷瘤实验表明，亲和环肽作用目标明确，对表达MHC-II类分子蛋白的肿瘤抑制效果明显，且无明显毒副作用，因而具有较好的医疗应用前景，为肿瘤免疫治疗提供了新的选择。

附图说明

图1为亲和环肽C25刺激CD8⁺T细胞活化的实验结果图；

图2为亲和环肽C25对接种CT26的BABL/c小鼠体重变化的影响结果图；

图3为亲和环肽C25对接种CT26的BABL/c小鼠移植瘤体积变化的影响结果图；

图4为亲和环肽C25对接种CT26的BABL/c小鼠的移植瘤瘤重的影响图；

图5为亲和环肽C25对接种B16的C57BL/6J小鼠体重变化的影响结果图；

图6为亲和环肽C25对接种B16的C57BL/6J小鼠移植瘤体积变化的影响结果图；

各图中涉及的NS表示对照组，显著性分析标识*表示P<0.05，**表示P<0.01。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本发明，而不应该为限制本发明的范围。

如无特别说明，下面所用试剂、生物材料、培养基和溶液均为本领域常用、公众可以得到或市售的物品，部分示例如下：

试剂：

牛血清白蛋白(BSA)；

胎牛血清(FBS)；

二甲基亚砜DMSO；

培养基和溶液：

LB培养基、上层琼脂、LB/IPTG/X-gal平板、Protein A/G Mix Magnetic Beads、TBS缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，含有150mM NaCl)、Tris-HCl(pH9.1)中和液、PEG-8000/NaCl沉淀液、Tris-T缓冲液、洗脱液(0.2M Glycine-HCl[pH2.2]，1mg/mL BSA)、中和液(1M Tris-HCl[pH9.1])、蛋白标记试剂盒Monolith NT^TM Protein Labeling Kit RED-NHS、PBS 7.2、BSA、Tween-20、TBST洗涤液缓冲液均按照现有技术制备即可，不再详细描述；

生物材料：

ER2738菌，New England Biolabs,Inc.公司；

CT26细胞、B16细胞和THP-1细胞来源于ATCC细胞库。

实施例1

(1)测定噬菌体滴度

接种ER2738单菌落于10mL LB培养基中，摇床培养至对数期(OD_600nm值约为0.5)。用LB培养基将噬菌体进行10倍系列稀释。稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：10⁸～10¹²；未扩增的淘选洗脱物：10¹～10⁵。将已达到对数期的菌体每200μL装入一微量离心管中，然后每管加入10μL不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温孵育5min。将感染菌体加入45℃预温的上层琼脂培养管中，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上，使其均匀铺开。待平板冷却15min后，倒置于37℃培养过夜。第二天检查平板，计数有～10²个噬菌体的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10μL噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。

(2)淘选过程

①第1轮淘选：

磁珠预处理：涡旋混匀Protein A/G Mix Magnetic Beads悬液，吸取5μL置于无菌1.5mL低吸附EP管中，加入1mL无菌TBS颠倒数次进行洗涤，洗涤后将EP管置于磁力架上，待磁珠完全吸附在靠近磁力架一侧的EP管管壁上后将液体吸弃，再加入1mL无菌TBS重复洗涤1次；

磁珠封闭：洗涤后的磁珠加入1mL封闭液(TBS+1％BSA)，4℃封闭1h，封闭期间将EP管置于旋转摇床慢速颠倒混匀；

噬菌体和蛋白结合：在磁珠封闭期间，取另一只无菌1.5mL EP管，加入hLAG-3-Fc蛋白2.5μg(10μL TBS溶解)+180μL TBS+10μL环七肽库(2×10¹¹个噬菌体)，室温结合20min，期间将EP管置于旋转摇床慢速颠倒混匀；

封闭后的磁珠洗涤：含磁珠的EP管置于磁力架上，吸弃封闭液，加入1mL 0.1％TBST(TBS+0.1％Tween-20)颠倒数次进行洗涤，共洗涤4次；

蛋白和磁珠结合：将结合噬菌体后的蛋白及噬菌体混合液转移至洗去封闭液的磁珠中，室温结合20min，期间将EP管置于旋转摇床慢速颠倒混匀；

洗涤：将含磁珠的EP管置于磁力架上，吸弃液体，加入1mL 0.1％TBST颠倒数次进行洗涤，共洗涤5次；

洗脱：洗涤后的磁珠加入1mL洗脱液(0.2M Glycine-HCl[pH2.2]，1mg/mL BSA)，室温洗脱10min，期间将EP管置于旋转摇床快速颠倒混匀；

中和：将EP管置于磁力架上，收集洗脱液，加入150μL中和液(1M Tris-HCl[pH9.1])进行中和；

扩增：将洗脱中和后的噬菌体取出10μL用于滴度测定，剩余噬菌体扩增用于下一轮淘选。

②第2轮淘选：

磁珠预处理：涡旋混匀Protein A/G Mix Magnetic Beads悬液，吸取5μL置于无菌1.5mL低吸附EP管中，加入1mL无菌TBS颠倒数次进行洗涤，洗涤后将EP管置于磁力架上，待磁珠完全吸附在靠近磁力架一侧的EP管管壁上后将液体吸弃，再加入1mL无菌TBS重复洗涤1次；第2轮到第5轮淘选该步骤制备两支；

磁珠封闭：洗涤后的磁珠加入1mL封闭液(TBS+1％BSA)，4℃封闭1h，封闭期间将EP管置于旋转摇床慢速颠倒混匀；

噬菌体结合Fc蛋白：在封闭50min时，取另一只无菌1.5mL EP管，加入2.5μghIgG1-Fc蛋白和全部第1轮淘选扩增后的洗脱物(约200μL)，室温结合20min，期间将EP管置于旋转摇床慢速颠倒混匀；

封闭后的磁珠洗涤：取一只封闭过的含磁珠EP管置于磁力架上，吸弃封闭液，加入1mL0.1％TBST(TBS+0.1％Tween-20)洗涤4次；

差向Fc蛋白：将“噬菌体结合Fc蛋白”步的混合液加入磁珠中，室温结合20min，期间置于旋转摇床慢速颠倒混匀；此步骤后，结合Fc蛋白的噬菌体被固定在磁珠上除去，经磁珠分离以后获得上清液备用；

蛋白和噬菌体结合：取另一只无菌1.5mL EP管，加入上步获得的上清液，再加入hLAG-3-Fc蛋白1.5μg(10μL TBS溶解)，室温结合20min，期间置于旋转摇床慢速颠倒混匀；

洗涤：取另一只封闭过的含磁珠EP管置于磁力架上，吸弃封闭液，加入1mL 0.1％TBST(TBS+0.1％Tween-20)洗涤4次；

蛋白和磁珠结合：将结合后的蛋白和噬菌体混合液转移至磁珠中，室温结合20min，期间置于旋转摇床慢速颠倒混匀；

洗涤：含磁珠的EP管置于磁力架上，吸弃液体，加入1mL 0.2％TBST洗涤10次；

洗脱：洗涤后的磁珠加入1mL洗脱液(0.2M Glycine-HCl[pH2.2]，1mg/mL BSA)，室温洗脱10min，期间将EP管置于旋转摇床快速颠倒混匀；

中和：将EP管置于磁力架上，收集洗脱液，加入150μL中和液(1M Tris-HCl[pH9.1])进行中和；

扩增：将洗脱中和后的噬菌体取出10μL用于滴度测定，剩余噬菌体扩增用于下一轮淘选。

③第3-5轮淘选：

与第2轮淘选步骤类似，在淘选过程中，第3-5轮hLAG-3-Fc蛋白使用量分别为1.5μg、1.5μg和1.0μg；最后一次TBST洗涤磁珠时所用Tween-20浓度分别为0.3％、0.5％和0.5％。

(3)噬菌体扩增

扩增：将过夜培养后进入对数生长期的E.coli ER2738宿主菌按照1:100的体积比接种至20mL LB液体培养基中(250mL无菌三角瓶盛装)，加入终浓度为0.1％的四环素Tet及待扩增的噬菌体，置于37℃水平摇床，270rpm/min培养4.5～5h(剧烈震荡，以提供足够的氧气)；

沉淀：将扩增后的培养物转移至50mL无菌离心管中，12000g，4℃离心10min，将上清液(包含扩增后的噬菌体)转移至新的无菌50mL离心管中，弃去沉淀(E.coli ER2738菌体)，重复一次离心，尽可能除去菌体。将约80％的上清液转移至新的无菌50mL离心管中，加入其体积1/6的PEG-8000/NaCl，混合均匀后冰上沉淀1h以上，最好4℃沉淀过夜；

重悬：噬菌体经沉淀后可形成少量絮状物，12000g，4℃离心10min，弃去上清，再短暂离心，吸弃残留的上清液，将沉淀用1mL无菌TBS重悬；

再沉淀：将TBS重悬液转入1.5mL无菌EP管中，加入其体积1/6的PEG-8000/NaCl，再次冰上沉淀1h，12000g，4℃离心10min，弃上清；

重悬：沉淀用200μL无菌TBS重悬，12000g，4℃短暂离心，除去残余的不溶物，上清液即为扩增后的次级肽库，用于下一轮淘选或滴度测定。

(4)噬菌体DNA序列测定及多肽序列同源性分析

取上步噬菌体储存液进行噬菌体克隆DNA测序；根据DNA序列推导其所编码的氨基酸序列，并利用DNAMAN软件对获得的氨基酸序列进行同源性分析。结果表明，在第5轮阳性克隆中共得到多个插入环七肽序列，即特异性结合人LAG-3蛋白的环七肽序列，其中3个亲和环肽命名为C17、C19、C25，该亲和环肽C17的序列如SEQ ID NO.1所示，C19如SEQ ID NO.2所示，C25的氨基酸序列为Cys-Val-Pro-Met-Thr-Tyr-Arg-Ala-Cys(SEQ ID NO.3)；这3个肽的各氨基酸的构型均为L型，其中氨基酸序列中首尾两端的两个半胱氨酸之间形成一个二硫键S-S，将肽首尾链接成为环状。

实施例2

(1)人LAG-3蛋白标记：用标记缓冲液调整蛋白浓度至2-20μM，取100μL备用；向固体荧光染料中加入30μL 100％DMSO，涡旋混合染料；使用标记缓冲液将染料的浓度调节至蛋白质浓度的2-3倍；以体积比为1:1的比例混合蛋白质和染料，室温避光孵育30min。

(2)标记人LAG-3蛋白的纯化：取出纯化柱顶盖，倒出其中存储溶液，取下底盖并放入15mL试管，加入3mL的10％Tween-20Tris-T缓冲液平衡和洗涤纯化柱，共3次；向纯化柱中加入上步标记的蛋白，让样品完全进入柱床并丢弃流穿溶液；置于新的15mL试管中，加入600μL 10％Tween-20Tris-T缓冲液并收集洗脱液；检测标记效率后，分装标记蛋白并于-80℃保存。

(3)MST检测：准备16个200μL EP管，标记为1-16，向第1个EP管中加入20μL 200μM的亲和环肽C25溶液，然后将管1中的亲和环肽C25溶液用10％Tween-20Tris-T缓冲液倍比稀释至2-16管中；向1-16管中加入10μL标记的人LAG-3蛋白，混匀；室温孵育5min后，用毛细管吸取1-16管中的混合溶液，按照从高浓度到低浓度从上至下依次排列于毛细管板条上，并开始MST仪器检测。

MST检测亲和环肽C17、C19、C25与人LAG-3蛋白亲和力，结果显示，亲和环肽C17、C19、C25和LAG-3蛋白的结合Kd值分别为1.83μM、5.05μM、0.66μM。

实施例3

(1)将生长状态良好的THP-1细胞更换新鲜的DMEM培养基(含0.3％FBS+0.05mMβ-巯基乙醇)，置于37℃，5％CO₂培养箱培养4h后加入80ng/mL的rhIFN-γ刺激THP-1细胞，混匀后置于培养箱培养48h；

(2)阻断反应在1.5mL EP管中进行，50μL PBS(pH7.2)缓冲液的反应体系中包含梯度稀释(0，0.1，1，10，100μM)的C25环肽和400ng的hLAG-3-Fc蛋白，4℃孵育30min；

(3)在(2)步孵育的同时，收集(1)步诱导的THP-1细胞，调整细胞密度为5×10⁵细胞/样，4℃，3000rpm/min离心5min获取细胞后用4℃预冷的PBS(pH7.2)缓冲液洗涤一次，4℃，3000rpm/min离心5min，弃去上清获取细胞沉淀；

(4)将(2)步反应30min后的混合液加入(3)步获得的细胞沉淀中，轻柔涡旋混匀，4℃孵育30min，期间轻微震动避免细胞沉降到EP管底部，同时取一管细胞用50μL PBS(pH7.2)缓冲液重悬作为阴性对照；

(5)孵育结束后，所有样品管、阴性和阳性对照(反应体系中肽浓度为0μM)中加入荧光标记抗体anti-human IgG1-Fc PE，4℃避光孵育30min，期间轻微震动避免细胞沉降到EP管底部；

(6)孵育结束后，加入1mL FACS Buffer洗涤一次，4℃，3000rpm/min离心5min，弃去上清获得细胞沉淀；

(7)200μL FACS Buffer重悬细胞沉淀，经筛网过滤后转移至流式管，FACSCalibur流式上机检测，并用FlowJo软件分析数据。

(8)阻断率计算公式：(阳性对照mean值-实验组mean值)/阳性对照mean值×100％。

实验结果显示，环肽浓度为100μM时，C17、C19和C25的阻断率分别为36.4％、40.5％和55.5％；以C25为例，与阳性对照(不加亲和环肽C25)组相比，亲和环肽C25在所有浓度均对峰图偏移产生了影响，其中在10μM和100μM时，对应的峰图偏移程度较大，表明亲和环肽可以阻断LAG-3/MHC-II的结合。

实施例4

(1)使用淋巴分离液分离健康人外周血单个核细胞(PBMCs)，用IMDM完全培养基重悬细胞并计数，调整细胞浓度为1×10⁶cells/mL。

(2)将分离的PBMCs细胞铺于48孔板，每孔500μL，约5×10⁵细胞/孔；每个培养孔中加入anti-CD3(1μg/mL)和anti-CD28(0.5μg/mL)刺激性抗体，实验组加入终浓度100μM的C25环肽，阴性对照组加同体积的PBS pH7.2缓冲液；

(3)将孔板置于37℃、5％CO₂培养箱培养72h，最后4h加入0.2μL蛋白转运抑制剂BDGolgiPlug；

(4)阻断剂加入4h后收集细胞，进行胞内因子染色实验检测，细胞表面流式抗体为anti-human CD4 PerCP-Cy5.5，CD8 APC，胞内流式抗体为IFN-γPE；

(5)FACS Calibur流式上机检测，并用FlowJo软件分析数据。

亲和环肽C25体外刺激人PBMCs激活T细胞的实验结果如图1所示。从图可以得知，与阴性对照(不加亲和环肽C25)组相比，亲和环肽C25在100μM时可以明显增加分泌IFN-γ的CD8⁺ T细胞的比例，表明亲和环肽C25能够在体外刺激人PBMCs中CD8⁺ T细胞活化。

实施例5

CT26结肠癌移植瘤模型实验、B16黑色素瘤移植瘤模型实验过程均如下：

(1)于每只小鼠的右侧背部接种1×10⁵个瘤细胞，待小鼠的瘤体积达到50～80mm³时按瘤体积大小S型分组，分为2组，分别为亲和环肽C25组和生理盐水组(阴性对照组)，每组6只。

(2)瘤旁皮下给药的方式注射，亲和环肽C25组按照2mg/kg/d，共给药14天，生理盐水组(阴性对照组)同样采用瘤旁皮下注射的给药方式，注射量为0.2mL。实验期间小鼠自由进食和饮水。

(3)隔日测量小鼠体重并记录，绘制曲线，结果如图2、图5所示；隔日测量肿瘤的长(a)短(b)径及高(c)，并按公式计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线，结果如图3、图6所示，计算公示为：V＝1/2×a×b×c。

给药结束的第二天将小鼠脱颈处死取出肿瘤并称重，结果如图4所示。

尽管以用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其他的更改和修改，因此，这意味着在所述权利要求中包括本发明范围的所有变化和修改均属于本发明保护范围。

序列表

<110> 郑州大学

<120> LAG-3蛋白亲和环肽及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

Cys Asn Met His Thr Pro Met Val Cys

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Cys Asn Trp Met Ile Asn Lys Glu Cys

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

Cys Val Pro Met Thr Tyr Arg Ala Cys

1 5

Claims (9)

1.环肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，所述氨基酸序列中的首尾两个氨基酸，通过形成酰胺键或二硫键彼此相连。

2.如权利要求1所述的环肽，其特征是，所述环肽的各氨基酸的构型独立地选自D型或L型。

3.如权利要求1所述的环肽，其特征是，所述环肽的各氨基酸的构型均为D型或L型。

4.含任一在先权利要求所述环肽的药物组合物或试剂盒。

5.权利要求1-3任一权利要求所述环肽在制备药物或试剂盒中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征是，所述试剂盒用于检测待测样品中LAG-3蛋白表达与否、表达位置或表达含量。

7.如权利要求5所述的应用，其特征是，所述药物用于下述至少一种用途：

1）抗肿瘤

2）阻断MHC-II类分子与LAG-3蛋白的结合

3）增强CD8⁺ T细胞分泌 IFN-γ的能力。

8.如权利要求7所述的应用，其特征是，所述肿瘤为结肠癌或黑色素瘤。

9.如权利要求6-8任一项所述的应用，其特征是，所述LAG-3蛋白为人或小鼠的LAG-3蛋白。

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